專利名稱：一種用于毛細管電泳的微體積試樣引入裝置及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的領域為毛細管電泳分析，特別是涉及一種用于毛細管電泳的微體積試樣引入裝置及其使用方法。
背景技術：
毛細管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)是目前分析科學中發(fā)展最迅速的分離分析技術之一，具有分析效率高、速度快、試樣和溶劑消耗少等優(yōu)點，因而被廣泛應用于化學、環(huán)境、生命科學等領域，特別是在DNA測序、蛋白質分離和單細胞分析等研究中具用非常重要的作用。
CE的傳統(tǒng)進樣方法有電動進樣、壓力進樣和擴散進樣。電動進樣是依據電泳和電滲原理而被普遍應用于CE進樣的一種方法。該方法僅需要高壓電源提供進樣的動力，即可實現完全的自動化操作。但電動進樣對試樣中的不同組分存在“歧視效應”，即電遷移速度大的組分進樣量多，電遷移速度小的組分進樣量少甚至不進樣。壓力進樣，是利用毛細管兩端的壓力差作為進樣動力，驅動管中液體流動，從而將試樣帶入管內。壓力進樣沒有試樣歧視效應，設備簡單。擴散進樣是根據分子擴散原理，當毛細管進口端插入試樣溶液時，試樣分子因管口界面的濃度差向管內擴散，從而實現進樣。擴散進樣可得到較窄的試樣區(qū)帶，但是進樣時間長，而且擴散系數不同的試樣組分進樣量也有差別。
自發(fā)進樣(Spontaneous Injection或Ubiquitous Injection)是指當進樣電壓為零或壓力差為零時，仍會有少量試樣進入毛細管的反?，F象。1994年Zare等研究了自發(fā)進樣的成因(Fishman，H.A.；Amudl，N.M.；Lee，T.T.et.al.Anal.Chem.1994，662318-2329)，發(fā)現當毛細管進口端從試樣溶液中垂直的拔出時，會有試樣液滴殘留在管口，并在表面張力的作用下迅速進入毛細管內。他們將自發(fā)進樣初步應用于CE進樣，但認為該進樣方法不能靈活的改變進樣量，應用范圍有限。
上世紀90年代興起的高速毛細管電泳技術(High-Speed Capillary Electrophoresis或FastCapillary Electrophoresis，HSCE或Fast-CE)，通過縮短毛細管長度和增大分離場強，將分析時間進一步縮短至秒級甚至毫秒級。CE的常規(guī)進樣方法已不能滿足HSCE對快速和皮升級進樣的要求。1991年Jorgenson等提出了光門進樣法(Monning，C.A.；Jorgenson，J.W.Anal.Chem.1991，63802-807)，在高壓狀態(tài)下讓試樣不斷流過毛細管，利用控制一束功率較強的激光開閉使得大部分熒光標記的試樣被漂白，僅允許寬度很窄的試樣區(qū)帶通過；電泳分離后用激光誘導熒光技術(Laser Induced Fluorescence，LIF)檢測。該方法得到的試樣區(qū)帶寬度很窄，但它本質上也屬于電動進樣，因此仍存在進樣歧視效應，而且熒光漂白需要大功率激光器，由于漂白不完全也會造成背景基線升高和漂移。1993年Jorgenson等又提出流動門進樣法(Lemmo，A.V.；Jorgenson，J.W. Anal.Chem.1993，651576-1581)，引入試樣的毛細管與電泳分離毛細管相距一小段距離，當泵開啟時，試樣毛細管流出的試樣被流動的緩沖液沖走，不能進入分離毛細管；當泵關閉時，試樣由電動進樣進入分離毛細管。該方法裝置簡單，易于搭建，可與各種檢測器配合使用，但由于泵的開關需要一定時間，所以試樣引入量比光門進樣法有所增加。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種簡單實用的應用于毛細管電泳的微體積試樣引入裝置及其使用方法。該裝置既可以應用于毛細管電泳分析中試樣的微量引入、貯存和更換，也可以用作液相色譜、微流控分析芯片和其他領域的進樣系統(tǒng)，以及毛細管電泳與液相色譜、微流控分析芯片聯用的接口部分。
本發(fā)明用于毛細管電泳的微體積試樣引入裝置，由毛細管、試樣管、緩沖液管、廢液池、電泳分離裝置組成，其特征是至少一個試樣管和至少一個緩沖液管固定在可移動的試樣引入平臺上組成試樣管-緩沖液管列陣，至少一個插入緩沖液管的導電電極與對應插入廢液池的導電電極構成電泳分離裝置，緩沖液管和試樣管的管壁上有供毛細管出入的缺口，毛細管進口端通過緩沖液管的缺口或試樣管的缺口進入或脫離緩沖溶液或試樣溶液，毛細管的出口端插入廢液池。
根據本發(fā)明，所使用的毛細管1的材質為石英，或者玻璃，或者硅，或者高分子材料(如聚乙烯，聚苯乙烯，聚四氟乙烯，聚碳酸酯，聚二甲基硅氧烷，聚甲基丙烯酸甲酯，硅橡膠等)，或者無機和有機復合材料；毛細管1的長度范圍為1毫米至100厘米，毛細管通道8橫截面的形狀為圓形，或者橢圓形，或者矩形，或者其它多邊形，毛細管通道8橫截面的內徑范圍，或者長度和寬度范圍，為10納米至1毫米。所用毛細管1的進口端12為平整截面結構，要求截面盡可能平整光潔，盡量沒有突出的毛刺或缺口，截面與毛細管的軸線的夾角在30°至150°之間?；蛘邔⒚毠?的進口端12采用各種方法加工成錐形尖端，有利于減小試樣溶液在進口端的殘留，降低試樣引入量。加工成錐形尖端的方法有，采用機械研磨方法加工成錐形尖端，或者采用化學刻蝕方法加工成錐形尖端，或者采用加熱拉制的方法加工成錐形尖端。毛細管1進口端12的截面的表面，經過憎水化或者親水化處理，或者經過表面拋光處理，目的是減小試樣溶液在進口端的殘留，降低試樣引入量。電泳時毛細管水平放置，有利于控制毛細管進出口端液面高度一致。
根據本發(fā)明，所使用的緩沖液管和試樣管的管壁上加工有供毛細管出入的缺口9，缺口9的寬度大于毛細管1的外徑，最大不超過10毫米，缺口9的長度范圍為0.1毫米至20毫米，缺口9的深度范圍為0.1毫米至50毫米。
根據本發(fā)明，所使用的可移動的試樣引入平臺為手動控制的平移臺，或者由計算機控制的步進電機精密平移臺，至少可在一維方向上進行平移運動，移動的方向和速度可控。
根據本發(fā)明，將所使用的導電電極固定在緩沖液管內，以防止電極在隨毛細管移動時，電極與管壁間有溶液殘留。毛細管進口端緩沖液管內的電極接電源正極，毛細管出口端廢液池內的電極接電源負極，或者毛細管進口端緩沖液管內的電極接電源負極，毛細管出口端廢液池內的電極接電源正極。
根據本發(fā)明，所述的用于毛細管電泳的微體積試樣引入裝置的使用方法是(1)在常溫常壓條件下，在毛細管1通道8內充滿緩沖液10；(2)在試樣管2內加入一定體積的試樣溶液11；(3)在緩沖液管3內加入一定體積的緩沖液10；在廢液池5內加入一定體積的緩沖液10；(4)移動試樣引入平臺4，使毛細管1的進口端12通過缺口9進入試樣管2中的試樣溶液11中；(5)移動試樣引入平臺4，使試樣管2中的試樣溶液11脫離毛細管1的進口端12，完成試樣引入；(6)移動試樣引入平臺4，使毛細管1的進口端12通過缺口9進入緩沖液管3中的緩沖溶液10中；(7)在緩沖液管3的導電電極6和廢液池5的導電電極7之間施加電壓進行電泳分離。
根據本發(fā)明，在試樣引入過程中的(5)步驟中，當試樣管中的試樣溶液脫離毛細管進口端的瞬間，有一滴試樣溶液附著在進口端的截面上，該試樣液滴在表面張力作用下，逐漸進入毛細管內，暴露在毛細管進口端外的液滴體積逐漸減小，直至液滴全部進入管內，完成進樣過程。
根據本發(fā)明，在試樣引入過程中，由于試樣管移出毛細管進口端的速度不同，或是移出毛細管進口端的角度不同，或是毛細管進口端插入試樣管內試樣溶液的深度不同，均會造成殘留在毛細管進口端截面的試樣溶液液滴體積的變化，使得通過自發(fā)進樣過程而進入毛細管內的試樣量不同。通過控制上述因素，可以控制毛細管內試樣的引入量(即試樣區(qū)帶的初始寬度)。
在試樣管移出毛細管進口端的角度和毛細管進口端插入試樣管內試樣溶液的深度保持不變的條件下，試樣管移出毛細管進口端的速度越慢，殘留在進口端截面上的試樣液滴的體積越小，通過自發(fā)進樣過程進入毛細管內的試樣量越少，試樣區(qū)帶的初始寬度越窄。當試樣管移出毛細管進口端的速度在1微米/秒至10厘米/秒范圍內時，可獲得低于100微米初始寬度的試樣區(qū)帶。
當試樣管移出毛細管進口端的速度和毛細管進口端插入試樣管內試樣溶液的深度保持不變時，試樣管移出毛細管進口端的角度(指試樣管移動方向與毛細管中軸線指向出口端的方向之間的夾角)越大，殘留在進口端截面的試樣液滴的體積越小，進入毛細管內的試樣量越少，試樣區(qū)帶的初始寬度越窄。在實際操作中，試樣管的移動方向與毛細管的軸線的夾角范圍在0°至180°之間，當兩者的夾角范圍在60°至150°之間時，引入的試樣初始區(qū)帶較窄，可獲得寬度小于100微米的試樣區(qū)帶。
當試樣管移出毛細管進口端的速度和角度均保持不變時，毛細管插入試樣管內試樣溶液的深度越深，殘留在進口端管口的試樣液滴的體積越小，進入毛細管內的試樣量越少，試樣區(qū)帶的初始寬度越窄。在實際操作中，毛細管進口端插入試樣管的深度范圍控制在0.1毫米至20毫米范圍內。
根據本發(fā)明，在試樣引入過程中，毛細管出口廢液池中的液位高度應等于或者稍高于試樣管中的液位高度，兩者之間的差異范圍是0至10厘米。毛細管出口廢液池中的液位高度應稍高于試樣管中的液位高度的目的是，抑止在試樣引入過程中，試樣由試樣管向毛細管進口端的擴散效應。
本發(fā)明的優(yōu)點是，可實現毛細管電泳分析的微體積試樣引入；通過調節(jié)試樣管移出毛細管進口端的速度和角度，以及毛細管進口端插入試樣管的深度，可準確和方便地控制進樣量；進樣量在皮升至納升級；試樣管-緩沖液管陣列的移動方向和速度可精確控制；進樣系統(tǒng)結構簡單，容易搭建，操作簡便，手動或自動化控制均可，便于推廣應用。
以下參照附圖詳細描述本發(fā)明。


圖1是本發(fā)明的試樣引入裝置側視結構示意圖。
圖2是本發(fā)明的試樣引入原理示意圖。
圖3是本發(fā)明的裝置進行毛細管電泳分析的結果記錄圖。
圖4是本發(fā)明的實施例2的側視結構示意圖。
圖5是本發(fā)明的實施例3的側視結構示意圖。
圖6是本發(fā)明的實施例3的俯視結構示意圖。
圖中毛細管1，試樣管2，緩沖液管3，平臺4，廢液池5，導電電極6，導電電極7，毛細管通道8，缺口9，緩沖液10，試樣溶液11，進口端12，指示方向13，液膜14，毛細管外壁15，毛細管截面16，箭頭所示方向表面張力17，試樣區(qū)帶18，試樣液滴19，廢液液滴20，不同試樣溶液21，2具體實施方式
參照附圖，以下將詳細描述根據本發(fā)明的優(yōu)選實施例。
實施例1參見圖1，試樣管2、緩沖液管3和廢液池5由200微升的離心管加工而成，在離心管的管壁上切割出一條寬1毫米、深2毫米的取樣缺口9。導電電極6、7分別固定在緩沖液管3和廢液池5內，其中緩沖液管3內的導電電極6接高壓電源正極，廢液池5內的導電電極7接電源負極。試樣管2和緩沖液管3水平并排放置，固定在可移動的試樣引入平臺4上。在緩沖液管3、廢液池5和試樣管2中分別加入等量的緩沖液10或試樣溶液11，使液面位于取樣缺口9的范圍內并且緩沖液10浸沒導電電極6、7。實驗中采用長3厘米、內徑50微米、外徑375微米的石英毛細管1進行毛細管電泳分離操作，毛細管1水平放置。毛細管1的出口端水平插入廢液池5內溶液深度約1.5毫米。廢液池5中的液位高度高于試樣管2中的液位高度1-2毫米。進樣時，沿指示方向13平移固定試樣管2-緩沖液管3陣列的平臺4，使試樣管2緩慢移出毛細管1的進口端12，在自發(fā)進樣作用下實現試樣引入；進樣完成后，固定試樣管2-緩沖液管3陣列的平臺4繼續(xù)移動，使毛細管1的進口端12移入緩沖液管3內，開始電泳分離。
參見圖2。如圖2A所示，將毛細管1進口端12外壁15上的聚酰亞胺涂層去除3毫米長，并進行硅烷化處理。進口端12的截面16與毛細管1軸線方向垂直。在毛細管1內充滿緩沖液10，水平放置。進樣時，試樣管2沿指示方向13進行一維移動，速度為50微米/秒，毛細管1的進口端12穿過管壁上的缺口9進入試樣管2，其進口端12浸入試樣管2內試樣溶液11中深度約1.5毫米；試樣管2繼續(xù)移動，毛細管1的進口端12穿過另一側管壁上的缺口9，此時試樣管2缺口9與進口端12之間形成一液膜14，該液膜14浸潤進口端12的外壁15以及截面16；試樣管2繼續(xù)移動，毛細管1的進口端12繼續(xù)脫離該試樣管2，此時試樣管2缺口9與進口端12之間的液膜14斷裂，殘留的一滴試樣溶液11附著在進口端12的截面16上。如圖2B所示，該試樣溶液11液滴在如箭頭所示方向17的表面張力作用下，漸漸進入毛細管1內，進口端12殘留的液滴體積逐漸減小。如圖2C所示，當試樣溶液11液滴完全進入毛細管1內時，形成的試樣區(qū)帶18的初始寬度為50微米，自發(fā)進樣完成。
圖3是根據本發(fā)明的優(yōu)選實施例1的裝置進行毛細管電泳分析的結果記錄圖。實驗中采用激光誘導熒光檢測系統(tǒng)，激發(fā)光波長473納米，熒光檢測波長520納米，檢測點距毛細管進口端12約1.5厘米。利用該裝置，在21秒內實現了異硫氰酸酯熒光素(FITC)和熒光素(Fluorescence)的基線分離。
實施例2參見圖4，緩沖液管3和廢液池5由200微升的離心管加工而成，在離心管的管壁上切割出一條寬1毫米，深2毫米的取樣缺口9。導電電極6、7分別固定在緩沖液管3和廢液池5內，其中緩沖液管3內的導電電極6接高壓電源正極，廢液池5內的導電電極7接電源負極。在緩沖液管3和廢液池5中分別加入等量的緩沖液10，使液面位于取樣缺口9的范圍內并且緩沖液10浸沒導電電極6、7。采用與流動注射分析儀相連的聚四氟乙烯管作為試樣管2，其內徑為0.5毫米。該聚四氟乙烯管將試樣溶液11引入試樣管2頂端，形成一試樣液滴19。試樣管2和緩沖液管3水平并排放置，固定在可移動的試樣引入平臺4上。實驗中采用長3厘米、內徑50微米、外徑375微米的石英毛細管1進行毛細管電泳分離操作，毛細管1水平放置。毛細管1出口端水平插入廢液池5內溶液深度約1.5毫米。進樣時，沿指示方向13平移固定試樣管2-緩沖液管3陣列的平臺4，使試樣液滴19緩慢移出毛細管1的進口端12，在自發(fā)進樣作用下實現試樣引入。進樣完成后，固定試樣管2-緩沖液管3陣列的平臺4繼續(xù)移動，使毛細管1進口端12移入緩沖液管3內，開始電泳分離；同時，試樣管2內后續(xù)的試樣溶液11將前一次的試樣液滴19沖走，落下的廢液液滴20流入廢液池。
實施例3參見圖5和圖6，試樣管2、緩沖液管3和廢液池5由200微升的離心管加工而成，在離心管的管壁上切割出一條寬0.8毫米、深2毫米的取樣缺口9。導電電極6、7分別固定在緩沖液管3和廢液池5內，其中緩沖液管3內的導電電極6接高壓電源正極，廢液池5內的導電電極7接電源負極。多個試樣管2和緩沖液管3間隔水平并排放置，固定在可移動的試樣引入平臺4上。實驗中采用長3厘米、內徑50微米、外徑375微米的石英毛細管1進行毛細管電泳分離操作，毛細管1出口端12利用機械研磨方法加工成錐形尖端結構，毛細管1水平放置。毛細管1出口端水平插入廢液池5內溶液深度約1.5毫米。在緩沖液管3和廢液池5中分別加入等量的緩沖液10，使液面位于取樣缺口9的范圍內并且緩沖液10浸沒導電電極6、7；在不同的試樣管2中分別加入等量的不同試樣溶液11，21，22，使液面位于取樣缺口9的范圍。進行多個試樣溶液的引入操作時，沿指示方向13平移固定試樣管2-緩沖液管3陣列的平臺4，使毛細管1進口端12依次進出各個試樣管2內的試樣溶液11，21，22，完成多個試樣溶液的引入操作。試樣引入平臺4帶動試樣管2一維平移的速度為1毫米/秒至10毫米/秒。
權利要求
1.一種用于毛細管電泳的微體積試樣引入裝置，其特征在于，由毛細管、試樣管、緩沖液管、廢液池、電泳分離裝置組成，至少一個試樣管和至少一個緩沖液管固定在可移動的試樣引入平臺上組成試樣管-緩沖液管列陣列陣，平臺移動的方向和速度可控，至少一個插入緩沖液管的導電電極與對應插入廢液池的導電電極構成電泳分離裝置，緩沖液管和試樣管的管壁上有供毛細管出入的缺口，毛細管進口端通過緩沖液管的缺口或試樣管的缺口進入或脫離緩沖溶液或試樣溶液，毛細管的出口端插入廢液池。
2.根據權利要求1所述的微體積試樣引入裝置，其特征在于，所述的毛細管(1)的材質為石英，或者玻璃，或者硅，或者高分子材料，或者無機和有機復合材料；毛細管(1)的長度范圍為1毫米至100厘米；毛細管通道(8)橫截面的形狀為圓形，或橢圓形，或矩形，或多邊形；毛細管通道橫截面的內徑范圍，或長度和寬度范圍為10納米至1毫米。
3.根據權利要求1所述的微體積試樣引入裝置，其特征在于，所述的毛細管(1)的進口端(12)為平整截面結構，或錐形尖端結構，進口端(12)的截面，經過憎水化，或親水化處理，或拋光處理。
4.根據權利要求1所述的微體積試樣引入裝置，其特征在于，所述的緩沖液管(3)和試樣管(2)的缺口(9)的寬度大于毛細管(1)的外徑，最大不超過10毫米，缺口(9)的長度范圍為0.1毫米至20毫米，深度范圍為0.1毫米至50毫米。
5.根據權利要求1所述的用于毛細管電泳的微體積試樣引入裝置的使用方法是●在常溫常壓條件下，在毛細管(1)通道(8)內充滿緩沖液(10)；●在試樣管(2)內加入一定體積的試樣溶液(11)；●在緩沖液管(3)內加入一定體積的緩沖液(10)；在廢液池(5)內加入一定體積的緩沖液(10)；●移動試樣引入平臺(4)，使毛細管(1)的進口端(12)通過缺口(9)進入試樣管(2)中的試樣溶液(11)中；●移動試樣引入平臺(4)，使試樣管(2)中的試樣溶液(11)脫離毛細管(1)的進口端(12)，完成試樣引入；●移動試樣引入平臺(4)，使毛細管(1)的進口端(12)通過缺口(9)進入緩沖液管(3)中的緩沖溶液(10)中；●在緩沖液管(3)的導電電極(6)和廢液池(5)的導電電極(7)之間施加電壓進行電泳分離。
6.根據權利要求5所述的用于毛細管電泳的微體積試樣引入裝置的使用方法，其特征在于，在試樣引入過程中，試樣管(2)的移動方向與毛細管(1)的中軸線的夾角在0°至180°之間。
7.根據權利要求6所述的用于毛細管電泳的微體積試樣引入裝置的使用方法，其特征在于，在試樣引入過程中，當試樣管(2)的移動方向與毛細管(1)的軸線的夾角在60°至150°之間，在毛細管(1)進口端(12)，獲得寬度小于100微米的試樣引入區(qū)帶。
8.根據權利要求5所述的用于毛細管電泳的微體積試樣引入裝置的使用方法，其特征在于，在試樣引入過程中，控制試樣引入平臺(4)帶動試樣管(2)移出毛細管(1)進口端(12)的移動線速度在1微米/秒至10厘米/秒之間。
9.根據權利要求5所述的用于毛細管電泳的微體積試樣引入裝置的使用方法，其特征在于，在試樣引入過程中，毛細管(1)的進口端(12)插入試樣管(2)內試樣溶液(11)的深度范圍控制在0.1毫米至20毫米之間。
10.根據權利要求5所述的用于毛細管電泳的微體積試樣引入裝置的使用方法，其特征在于，在試樣引入過程中，出口廢液池(5)中液位的高度等于或高于試樣管(2)中的液位高度，兩者之間的液位高度差異范圍為0至10厘米。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應用于毛細管電泳的微體積試樣引入方法及其使用裝置，該裝置由毛細管和可移動的試樣管－緩沖液管陣列組成，通過調節(jié)試樣管移出毛細管進口端的速度和角度，以及調節(jié)毛細管進口端插入試樣溶液的深度，可方便地控制進樣量，實現微體積試樣引入。本發(fā)明的優(yōu)點是可實現毛細管電泳分析的微體積試樣引入，試樣區(qū)帶寬度小于100微米，系統(tǒng)可在較短的分離時間內獲得較高的分離效率，該裝置結構簡單，易實現分析過程的自動化操作。
文檔編號G01N27/447GK1904604SQ20061005273
公開日2007年1月31日 申請日期2006年8月1日 優(yōu)先權日2006年8月1日
發(fā)明者方群, 張婷, 杜文斌, 劉軍 申請人:浙江大學