專(zhuān)利名稱(chēng)：利用液相色譜法檢測(cè)、分離純化天然除蟲(chóng)菊酯有效成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種天然除蟲(chóng)菊酯有效成分的檢測(cè)、分離方法，特別是涉及一種利用液相色譜法檢測(cè)、分離純化天然除蟲(chóng)菊酯有效成分的方法。其分離純化的有效成分可用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、生物農(nóng)藥、食品衛(wèi)生安全等多個(gè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
除蟲(chóng)菊(pyrethrum)是一種菊科多年生草本植物，是目前世界上唯一集約化種植的殺蟲(chóng)植物。至今已有165年的栽培和使用歷史。我國(guó)大量種植的地區(qū)是云南，其他地區(qū)也有少量種植。天然除蟲(chóng)菊酯(pyrethrins)是從除蟲(chóng)菊中提取出來(lái)的殺蟲(chóng)有效成分。除蟲(chóng)菊殺蟲(chóng)活性物質(zhì)主要包括除蟲(chóng)菊酯I、除蟲(chóng)菊酯II，瓜葉菊酯I、瓜葉菊酯II和茉酮菊酯I、茉酮菊酯II六種殺蟲(chóng)有效成分。其高效、低毒、廣譜、低殘留的殺蟲(chóng)特性，對(duì)人、溫血?jiǎng)游锖铜h(huán)境沒(méi)有危害，深受人們的廣泛歡迎。經(jīng)過(guò)研究表明除蟲(chóng)菊酯被認(rèn)為是世界上最安全、最有效的天然殺蟲(chóng)劑，它在綠色食品生產(chǎn)中的地位越來(lái)越受到重視。
我國(guó)對(duì)天然除蟲(chóng)菊酯的研究較少，僅對(duì)天然除蟲(chóng)菊組織培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、除蟲(chóng)菊的提取有一些研究，目前只有一篇文獻(xiàn)報(bào)道了國(guó)內(nèi)幾家企業(yè)生產(chǎn)天然除蟲(chóng)菊酯六種有效成分含量的初步研究結(jié)果(黃修柱，2004)，而對(duì)天然除蟲(chóng)菊酯六種有效成分分離純化的研究還未見(jiàn)報(bào)道。
國(guó)外分離純化、檢測(cè)天然除蟲(chóng)菊酯六種有效成分使用正相高效液相色譜法(normal-phase HPLC)、毛細(xì)管電色譜法(Pol等，2003；Essig等，2001a；Essig等，2001b；Henry III等，2001)。在國(guó)外的幾篇研究文獻(xiàn)中都曾報(bào)道了利用反相高效液相色譜不能有效分離得到純化的上述除蟲(chóng)菊酯六種有效成分(Essig等，2001a；Essig等，2001b)。
眾所周知，對(duì)于正相高效液相色譜法，其色譜柱具有不易獲得，流動(dòng)相價(jià)格高，消耗較高的缺點(diǎn)，而相對(duì)于正相高效液相色譜法和毛細(xì)管電色譜法，反相高效液相色譜具有色譜分離柱比較普及，流動(dòng)相易得，消耗低，操作簡(jiǎn)單、快速，分離效果好等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用反相液相色譜法檢測(cè)、分離純化天然除蟲(chóng)菊酯有效成分的方法。這種方法的設(shè)備要求低、純化費(fèi)用低。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種利用液相色譜法檢測(cè)、分離純化天然除蟲(chóng)菊酯有效成分的方法，其特征在于所采用的液相色譜法是反相高效液相色譜法；液相色譜條件NUCLEODUR(閃電)C18色譜柱，流動(dòng)相乙腈-水溶液，A液為水，B液為90％乙腈，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。
上述檢測(cè)、分離方法中，先將天然除蟲(chóng)菊酯的有機(jī)溶劑提取物，用丙酮、乙腈有機(jī)溶劑進(jìn)行稀釋如濃度為70％的除蟲(chóng)菊酯原藥∶丙酮∶乙腈＝1∶5∶94進(jìn)行稀釋?zhuān)⒊闉V得樣品。
上述所得樣品，對(duì)其中的六種有效成分進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其液相色譜條件具體為色譜柱長(zhǎng)250mm×內(nèi)徑4.6～16mm，填料粒度5～7μm；流動(dòng)相的流速1～12mL/min；進(jìn)行梯度洗脫或等度洗脫。
上述所得樣品，對(duì)其中六種有效成分進(jìn)行制備時(shí)，其色譜條件具體為色譜柱長(zhǎng)250mm×內(nèi)徑10～50mm，填料粒度5～10μm；流動(dòng)相的流速10～100mL/min；進(jìn)行梯度洗脫或等度洗脫。
上述等度洗脫條件為A相∶B相＝35％∶65％。
上述梯度洗脫條件為0～30分鐘，B相60％；30～65分鐘B相增加到70％；65～85分鐘B相減少到65％；85～90分鐘，B相增加到85％；90～100分鐘，B相減少到60％。
采用上述反相高效液相色譜條件可成功地分離純化出天然除蟲(chóng)菊酯的六種有效成分，得到的產(chǎn)品純度與正相高效液相色譜分離除蟲(chóng)菊酯的效果一致，純度也達(dá)到99％。這種分離方法相對(duì)于正相高效液相色譜法和毛細(xì)管電色譜法具有如下優(yōu)點(diǎn)色譜分離柱比較普及，流動(dòng)相易得，消耗低，操作簡(jiǎn)單、快速，分離效果好等優(yōu)點(diǎn)。
而且至今為止，尚無(wú)天然除蟲(chóng)菊酯六種單一組分的純品出售，本發(fā)明利用反相高效液相色譜法制備的天然除蟲(chóng)菊酯純品具有很好的產(chǎn)業(yè)前景，可以作為天然除蟲(chóng)菊酯標(biāo)準(zhǔn)品并廣泛應(yīng)用于除蟲(chóng)菊研究、食品檢測(cè)、進(jìn)出口商品檢測(cè)等領(lǐng)域。


圖1.梯度分離天然除蟲(chóng)菊酯有效成分的高效液相色譜圖。
圖中a是瓜葉菊酯II的色譜峰圖，b是除蟲(chóng)菊酯II的色譜峰圖，c是茉酮菊酯II的色譜峰圖，d是瓜葉菊酯I的色譜峰圖，e是除蟲(chóng)菊酯I的色譜峰圖，f是茉酮菊酯I的色譜峰圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，但本發(fā)明并不僅限于此。
實(shí)施例11.儀器和試劑高效液相色譜儀配帶紫外檢測(cè)器。二元泵。手動(dòng)進(jìn)樣器。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)。氮吹儀。超聲波脫氣機(jī)。色譜純乙腈、丙酮和氯化鈉均為分析純。試驗(yàn)水為二次蒸餾水。
2.色譜條件2.1分析檢測(cè)及半制備色譜條件色譜柱NUCLEODUR(閃電)C18柱(長(zhǎng)250mm×內(nèi)徑4.6～16mm，填料粒度5～7μm)；流動(dòng)相乙腈水溶液，A液為水，B液為90％乙腈，流速1～12mL/min。梯度洗脫條件為0～30分鐘，B相60％；30～65分鐘B相增加到70％；65～85分鐘B相減少到65％；85～90分鐘，B相增加到85％；90～100分鐘，B相減少到60％。柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)235nm；進(jìn)樣量10～120μL。
2.2制備色譜條件色譜柱NUCLEODUR(閃電)C18柱(長(zhǎng)250mm×內(nèi)徑10～50mm，填料粒度5～10μm)；流動(dòng)相乙腈水溶液，A液為水，B液為90％乙腈，流速10～100mL/min。梯度洗脫條件為0～30分鐘，B相60％；30～65分鐘B相增加到70％；65～85分鐘B相減少到65％；85～90分鐘，B相增加到85％；90～100分鐘，B相減少到60％。柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)235nm；進(jìn)樣量1～10mL。
3.樣品前處理按常規(guī)，將天然除蟲(chóng)菊酯的有機(jī)溶劑提取物，用丙酮、乙腈等有機(jī)溶劑進(jìn)行適當(dāng)稀釋(如濃度70％的除蟲(chóng)菊酯原藥，按原藥∶丙酮∶乙腈＝1∶5∶94進(jìn)行稀釋)，抽濾后裝入棕色瓶中，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 4.反相高效液相色譜分離天然除蟲(chóng)菊酯六種成分梯度洗脫程序的確定通過(guò)等度(A相∶B相＝35％∶65％)和梯度程序分離試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)梯度程序比等度運(yùn)行的運(yùn)行時(shí)間短(至少短30min)、分離效果好，六種組分均能達(dá)到基線分離。確定梯度洗脫條件為0～30分鐘，B相60％；30～65分鐘B相增加到70％；65～85分鐘B相減少到65％；85～90分鐘，B相增加到85％；90～100分鐘，B相減少到60％。檢測(cè)結(jié)果如附圖1。
5.反相高效液相色譜收集六種成分時(shí)間的確定收集時(shí)間的準(zhǔn)確性，關(guān)系到收集的六種成分的純度，即必須準(zhǔn)確地確定收集時(shí)間。收集時(shí)間計(jì)算如下溶液從檢測(cè)池流到檢測(cè)器出口大約需要1/12min，然后從檢測(cè)器出口至收集瓶中的時(shí)間需要(根據(jù)管子長(zhǎng)度來(lái)計(jì)算流量，管子流量為0.2ml，流速為1min/L，即消耗時(shí)間為1/3min)1/3min，加上檢測(cè)池洗脫時(shí)間，總共需要5/12min?？紤]到存在計(jì)算誤差，確定從出峰開(kāi)始計(jì)算1/2min后開(kāi)始收集六種洗脫液。
6.純度計(jì)算通過(guò)附圖1a-f的峰高比可以計(jì)算出六種成分的純度，其純度都達(dá)到了99％。
7.六種組分的鑒定通過(guò)GC-MS分析，與圖譜庫(kù)中的圖進(jìn)行比較對(duì)照，得出結(jié)果如下第一個(gè)峰(附圖1-a)是瓜葉菊酯II，第二個(gè)峰(附圖1-b)是除蟲(chóng)菊酯II，第三個(gè)峰(附圖1-c)是茉酮菊酯II，第四個(gè)峰(附圖1-d)是瓜葉菊酯I，第五個(gè)峰(附圖1-e)是除蟲(chóng)菊酯I，第六個(gè)峰(附圖1-f)是茉酮菊酯I。
8.反相高效液相色譜六種有效成分的損失率計(jì)算通過(guò)峰面積比可以計(jì)算出六種成分的損失率，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 除蟲(chóng)菊酯六種物質(zhì)的損失率

實(shí)施例2將本發(fā)明所述方法應(yīng)用于檢測(cè)天然除蟲(chóng)菊酯六種有效成分和半制備方案將天然除蟲(chóng)菊酯樣品按照實(shí)施例1步驟3處理后，上反相高效液相色譜，采用實(shí)施例1所給出的分析檢測(cè)及半制備色譜條件下，我們以出峰順序?yàn)槔軌蛴行Х蛛x純化這六種組分。
在35.78min出第一個(gè)峰，37.94min第一峰結(jié)束，推遲1/2min收集第一個(gè)峰，直到峰出完后推遲1/3min結(jié)束收集；在39.68min出第二個(gè)峰，42.16min第二峰結(jié)束；在51.40min出第三個(gè)峰，53.28min第三峰結(jié)束；在71.22min出第四個(gè)峰，73.96min第四峰結(jié)束；在74.98min出第五個(gè)峰，78.46min第五峰結(jié)束；在89.00min出第六個(gè)峰，90.46min第六峰結(jié)束；后面五種物質(zhì)與第一峰收集方式、結(jié)束收集時(shí)間程序一樣。把收集到的六種溶液，經(jīng)過(guò)NaCl鹽析，氮吹儀吹干，得到六種固體物質(zhì)，再用丙酮將其分別溶解后，加乙腈稀釋到與鹽析前同樣的溶液體積，再進(jìn)液相，從圖譜可以看到出峰情況，只有單一峰，通過(guò)峰面積(或峰高)百分比可以看到其純度達(dá)到99％。利用GC-MS確定其分子結(jié)構(gòu)，與圖譜庫(kù)中圖比較得出第一個(gè)峰是瓜葉菊酯II，第二個(gè)峰是除蟲(chóng)菊酯II，第三個(gè)峰是茉酮菊酯II，第四個(gè)峰是瓜葉菊酯I，第五個(gè)峰是除蟲(chóng)菊酯I，第六個(gè)峰是茉酮菊酯I。
實(shí)施例3將本發(fā)明所述方法應(yīng)用于天然除蟲(chóng)菊酯六種有效成分的制備采用實(shí)施例1給出的制備型液相色譜條件，本發(fā)明可以進(jìn)行除蟲(chóng)菊酯精油產(chǎn)品的分離純化，制備出除蟲(chóng)菊酯各種單體物質(zhì)。
參考文獻(xiàn)[1]黃修柱.2004.天然除蟲(chóng)菊素母藥中主要成分質(zhì)譜分析研究[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，25(4)6～9. Pol J，Wenclawiak BW.2003.Direct on-line continuous supercriticalfluid extraction and HPLC of aqueous pyrethrins solutions[J].Analytical chemistry，751430-1435. Essig K，Zhao Z.2001a.Method development and validation of ahigh-performance liquid chromatographic method for pyrethrumextract[J].Journal of Chromatographic Science，12(39)473-480. Essig K，Zhao Z.2001b.Preparation and characterization of a pyrethrumextraction standard[J].LCGC(www.chromatographyonline.com)，7(19)722-730. Henry III CW，McCarroll ME，Warner IM.2001.Separation of theinsecticidal pyrethrin esters by capillary electrochromatography[J].Journal of Chromatography A，905317-327.
權(quán)利要求
1.一種利用液相色譜法檢測(cè)、分離純化天然除蟲(chóng)菊酯有效成分的方法，其特征在于所采用的液相色譜法是反相高效液相色譜法；色譜條件NUCLEODUR閃電C18色譜柱，流動(dòng)相乙腈-水溶液，A液為水，B液為90％乙腈，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。
2.如權(quán)利要求1所述的利用液相色譜法檢測(cè)、分離純化天然除蟲(chóng)菊酯有效成分的方法，其特征在于所述經(jīng)處理過(guò)的天然除蟲(chóng)菊酯樣品進(jìn)行檢測(cè)或小量分離時(shí)，其液相色譜條件為色譜柱長(zhǎng)250mm×內(nèi)徑4.6～16mm，填料粒度5～7μm；流動(dòng)相的流速1～12mL/min；進(jìn)行梯度洗脫或等度洗脫。
3.如權(quán)利要求1所述的利用液相色譜法檢測(cè)、分離純化天然除蟲(chóng)菊酯有效成分的方法，其特征在于所述經(jīng)處理過(guò)的天然除蟲(chóng)菊酯樣品進(jìn)行分離制備其六種有效成分純品時(shí)，其液相色譜條件為色譜柱長(zhǎng)250mm×內(nèi)徑10～50mm，填料粒度5～10μm；流動(dòng)相的流速10～100mL/min；進(jìn)行梯度洗脫或等度洗脫。
4.如權(quán)利要求2所述的利用液相色譜法檢測(cè)、分離純化天然除蟲(chóng)菊酯有效成分的方法，其特征在于所述檢測(cè)、分離時(shí)所用的梯度洗脫條件為0～30分鐘，B相60％；30～65分鐘B相增加到70％；65～85分鐘B相減少到65％；85～90分鐘，B相增加到85％；90～100分鐘，B相減少到60％；所述檢測(cè)、分離時(shí)所用的等度洗脫條件為A相∶B相＝35％∶65％。
5.如權(quán)利要求3所述的利用液相色譜法檢測(cè)、分離純化天然除蟲(chóng)菊酯有效成分的方法，其特征在于所述分離制備其六種有效成分純品所用的梯度洗脫條件為0～30分鐘，B相60％；30～65分鐘B相增加到70％；65～85分鐘B相減少到65％；85～90分鐘，B相增加到85％；90～100分鐘，B相減少到60％；所述分離制備其六種有效成分純品所用的等度洗脫條件為A相∶B相＝35％∶65％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用反相液相色譜法檢測(cè)、分離純化天然除蟲(chóng)菊酯有效成分的方法，其色譜條件為NUCLEODUR (閃電)C18色譜柱，流動(dòng)相乙腈－水溶液，A液為水，B液為90％乙腈，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。采用本發(fā)明能夠成功地分離純化天然除蟲(chóng)菊酯六種有效成分，得到的產(chǎn)品純度達(dá)到99％。這種分離方法具有如下優(yōu)點(diǎn)色譜分離柱比較普及，流動(dòng)相易得，消耗低，操作簡(jiǎn)單、快速，分離效果好。其分離純化的有效成分可以作為標(biāo)準(zhǔn)品并廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、生物農(nóng)藥、食品衛(wèi)生安全等多個(gè)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)G01N30/88GK1815217SQ20061005410
公開(kāi)日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2006年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日
發(fā)明者李正國(guó), 段偉, 王國(guó)民, 夏玉先, 楊迎伍 申請(qǐng)人:重慶大學(xué), 重慶重大生物技術(shù)發(fā)展有限公司