專利名稱：一種紫錐菊提取物及其制備方法和含量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物提取物及其制備方法和含量測定方法，特別是一種紫錐菊提取物及其制備方法和含量測定方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
紫錐菊屬Echinacea植物是原產(chǎn)于美洲的一類菊科植物，早在18世紀(jì)，北美印第安人首次將紫錐菊作為藥用，19世紀(jì)，北美移民也廣泛應(yīng)用，其后逐漸傳至歐洲，在該屬植物中作為藥用的有三種，即紫錐菊Echinaceapurpurea，狹葉紫錐菊Echinacea angustifolia，和白紫錐菊Echinacea pallida，作為上呼吸道感染的常用藥，并用于創(chuàng)傷、蟲蛇咬傷等癥，目前它們組成的各種制劑是當(dāng)前國際上廣泛使用的免疫增強(qiáng)劑。(劉一兵.紫錐菊屬植物制劑的化學(xué)、免疫作用與臨床.國外醫(yī)藥·植物藥分冊，2001，16(2)47～54)紫錐菊屬植物的主要成分包括三大類，咖啡酸衍生物(主要是菊苣酸、紫錐菊苷、二咖啡酸奎尼酸等)、烷酰胺類化合物和多糖，此外還含有少量的黃酮等物質(zhì)，不同種的紫錐菊植物中各種成分的含量稍有不同。目前各個(gè)國家用于控制紫錐菊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的成分不同，如美國采用咖啡酸類成分的含量，澳大利亞采用咖啡酸類化合物或烷酰胺類化合物，而在歐洲，市場上主要的紫錐菊產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)是以多糖的含量確定，我國目前尚無統(tǒng)一的紫錐菊制劑標(biāo)準(zhǔn)，這就造成了紫錐菊制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一的局面。而目前對于紫錐菊免疫增強(qiáng)作用的研究表明，紫錐菊的免疫活性并不是哪一個(gè)單獨(dú)成分提供的，而是由多種成分協(xié)同作用提供的，因此紫錐菊屬植物的提取方法變得尤為重要，方法不同，提取物中各類活性成分的含量便不同，甚至導(dǎo)致某類成分的缺失，比如國內(nèi)外廣泛采用的是用乙醇提取紫錐菊，這種方法不可避免的會(huì)導(dǎo)致提取物中多糖含量的損失，公開號為CN 1473602A的中國專利申請公開了一種紫錐菊提取物的制備方法，即用30～60％的乙醇回流提取2次，再經(jīng)過過濾除雜、濃縮、干燥得紫錐菊提取物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紫錐菊提取物及其制備方法和含量測定方法。
首先，本發(fā)明提供了一種紫錐菊提取物，其特征在于是由下述方法制備而成(a)用40～70％的含水乙醇提取紫錐菊藥材，過濾，得濾液和藥渣，濃縮濾液得浸膏；(b)用水或10～30％的含水乙醇提取步驟(a)中所得藥渣，過濾，得濾液和藥渣，棄去藥渣，濃縮濾液得浸膏；(c)合并步驟(a)和(b)中所得浸膏，混勻，干燥，得紫錐菊提取物。
其中，所述的紫錐菊藥材來源于紫錐菊屬植物紫錐菊Echinacea purpurea，狹葉紫錐菊Echinacea angustifolia，和白紫錐菊Echinacea pallida。
進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的紫錐菊提取物，其特征在于經(jīng)下列步驟制備而成(a)取紫錐菊，粉碎，加10～15倍量40～70％的乙醇回流提取1～3小時(shí)，過濾，收集濾液，濾液減壓回收乙醇，得浸膏；(b)將步驟(a)中藥渣用10～15倍量的水或10～30％的乙醇提取1～3小時(shí)，過濾，收集濾液，減壓濃縮得浸膏；(c)合并步驟(a)和(b)中所得浸膏，攪拌均勻，干燥，即得紫錐菊提取物。
更進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的紫錐菊提取物，其特征在于經(jīng)下列步驟制備而成(a)取紫錐菊加12倍量60％的乙醇回流提取1小時(shí)，過濾，收集濾液，濾液減壓回收乙醇，得浸膏；(b)將步驟(a)中藥渣用12倍量的水提取1小時(shí)，過濾，收集濾液，減壓濃縮得浸膏；(c)合并步驟(a)和(b)中所得浸膏，攪拌均勻，干燥，即得紫錐菊提取物。
其次，本發(fā)明提供了上述紫錐菊提取物中菊苣酸的含量測定方法，其特征在于包括下列步驟(a)取紫錐菊提取物50mg，精密稱定，置容量瓶中，加30～40∶30～40甲醇-水溶液25～40ml，超聲處理10min，放冷，加30～40∶30～40甲醇-水溶液稀釋至刻度，離心3min，取上清液作為供試品溶液；(b)精密稱取菊苣酸對照品適量，加甲醇-水溶液溶解并稀釋成濃度為7μg/ml的溶液，作為對照品溶液；(c)色譜條件為以十八烷基鍵合硅膠為填料，10～25∶70～75∶5～10甲醇-0.1mol/L磷酸溶液-四氫呋喃為流動(dòng)相，柱溫40℃，檢測波長327nm，理論塔板數(shù)按菊苣酸計(jì)算應(yīng)不低于4000。
(a)分別精密吸取步驟(a)和(b)中供試品溶液和對照品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算干燥品中菊苣酸的含量大于0.35％。
進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的紫錐菊提取物的含量測定方法，其特征在于包括下列步驟(a)取紫錐菊提取物50mg，精密稱定，置容量瓶中，加36∶35甲醇-水溶液35ml，超聲處理10min，放冷，加36∶35甲醇-水溶液稀釋至刻度，離心3min，取上清液作為供試品溶液；(b)精密稱取菊苣酸對照品適量，加甲醇-水溶液溶解并稀釋成濃度為7μg/ml的溶液，作為對照品溶液；(c)色譜條件為以十八烷基鍵合硅膠為填料，20∶72∶8甲醇-0.1mol/L磷酸溶液-四氫呋喃為流動(dòng)相，柱溫40℃，檢測波長327nm，理論塔板數(shù)按菊苣酸計(jì)算應(yīng)不低于4000；(d)分別精密吸取步驟(a)和(b)中供試品溶液和對照品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算干燥品中菊苣酸的含量大于0.35％。
本發(fā)明的有益效果1、與現(xiàn)有技術(shù)中紫錐菊提取物相比，本發(fā)明提取方法所得紫錐菊提取物成分中不僅含有醇溶性的咖啡酸類衍生物(菊苣酸)，而且使紫錐菊的水溶性成分多糖得以完整保留，從而保證了紫錐菊提取物各類成分共同發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用；2、本發(fā)明紫錐菊提取物的制備方法步驟簡單，成本低廉，適合于工業(yè)化生產(chǎn)；3、建立了紫錐菊提取物中菊苣酸含量的高效液相色譜測定方法，該方法靈敏度高，可控性好，為保證紫錐菊提取物的質(zhì)量穩(wěn)定、可控奠定了良好的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例的方式對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但不應(yīng)理解為是對本發(fā)明的進(jìn)一步限定，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想的前提下，做出其它多種形式的修改、替換或變更所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1紫錐菊提取物的制備與含量測定制備取紫錐菊10kg，粉碎，加10倍量40％的乙醇回流提取2小時(shí)，過濾，收集濾液，濾液減壓回收乙醇，得浸膏(相對密度為1.06)；藥渣用10倍量20％的乙醇提取1小時(shí)，過濾，收集濾液，減壓濃縮得浸膏(相對密度為1.13)；合并所得浸膏，攪拌均勻，噴霧干燥，即得紫錐菊提取物。
含量測定取紫錐菊提取物50mg，精密稱定，置容量瓶中，加36∶35甲醇-水溶液25ml，超聲處理10min，放冷，加36∶35甲醇-水溶液稀釋至刻度，離心3min，取上清液作為供試品溶液；精密稱取菊苣酸對照品適量，加甲醇-水溶液溶解并稀釋層濃度為7μg/ml的溶液，作為對照品溶液；色譜條件為以十八烷基鍵合硅膠為填料，20∶72∶8甲醇-0.1mol/L磷酸溶液-四氫呋喃為流動(dòng)相，柱溫40℃，檢測波長327nm，理論塔板數(shù)按菊苣酸計(jì)算應(yīng)不低于4000。分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算干燥品中菊苣酸的含量為0.65％。
實(shí)施例2狹葉紫錐菊提取物的制備和含量測定制備取狹葉紫錐菊10kg，粉碎，加12倍量60％的乙醇回流提取1小時(shí)，過濾，收集濾液，濾液減壓回收乙醇，得浸膏(相對密度為1.07)；藥渣用12倍量的水提取1小時(shí)，過濾，收集濾液，減壓濃縮得浸膏(相對密度為1.13)；合并所得浸膏，攪拌均勻，噴霧干燥，即得紫錐菊提取物。
含量測定取狹葉紫錐菊提取物50mg，精密稱定，置容量瓶中，加36∶35甲醇-水溶液35ml，超聲處理10min，放冷，加36∶35甲醇-水溶液稀釋至刻度，離心3min，取上清液作為供試品溶液；精密稱取菊苣酸對照品適量，加甲醇-水溶液溶解并稀釋層濃度為7μg/ml的溶液，作為對照品溶液；色譜條件為以十八烷基鍵合硅膠為填料，20∶72∶8甲醇-0.1mol/L磷酸溶液-四氫呋喃為流動(dòng)相，柱溫40℃，檢測波長327nm，理論塔板數(shù)按菊苣酸計(jì)算應(yīng)不低于4000。分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算干燥品中菊苣酸的含量為1.20％。
實(shí)施例3白紫錐菊提取物的制備和含量測定制備取白紫錐菊10kg，粉碎，加15倍量70％的乙醇回流提取3小時(shí)，過濾，收集濾液，濾液減壓回收乙醇，得浸膏(相對密度為1.08)；藥渣用15倍量的水提取1小時(shí)，過濾，收集濾液，減壓濃縮得浸膏(相對密度為1.15)；合并所得浸膏，攪拌均勻，噴霧干燥，即得紫錐菊提取物。
含量測定取白紫錐菊提取物50mg，精密稱定，置容量瓶中，加36∶35甲醇-水溶液40ml，超聲處理10min，放冷，加36∶35甲醇-水溶液稀釋至刻度，離心3min，取上清液作為供試品溶液；精密稱取菊苣酸對照品適量，加甲醇-水溶液溶解并稀釋層濃度為7μg/ml的溶液，作為對照品溶液；色譜條件為以十八烷基鍵合硅膠為填料，20∶72∶8甲醇-0.1mol/L磷酸溶液-四氫呋喃為流動(dòng)相，柱溫40℃，檢測波長327nm，理論塔板數(shù)按菊苣酸計(jì)算應(yīng)不低于4000。分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算干燥品中菊苣酸的含量為0.70％。
實(shí)施例4本發(fā)明提取物對免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響取KM種小鼠72只，♀♂各半，按體重隨機(jī)分為正常組、模型組、實(shí)施例1提取物組、實(shí)施例2提取物組、實(shí)施例3提取物組、紫錐菊醇溶性提取物組，每組12只。各組分別灌服上述相應(yīng)的藥物，正常和模型組給予等容量的蒸餾水，連續(xù)給藥14天。于第7日，除正常組外，每組小鼠按50mg/kg，0.1ml/10g腹腔注射新鮮配制的CY藥液，連續(xù)給藥3天(每天均為新鮮配制)，于第11天再次給于腹腔注射新鮮配制的CY藥液，期間繼續(xù)給予各藥物，第12天剖取脾臟，脾臟組織在無菌條件下用無血清1640培養(yǎng)基洗滌兩次，用眼科彎剪機(jī)械分離各組脾淋巴細(xì)胞，混合每組12只小鼠脾臟細(xì)胞，用氯化胺處理5min，使紅細(xì)胞充分裂解，離心收集淋巴細(xì)胞，洗滌3次，用含20％小牛血清的1640培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，按3×105/孔接種于兩個(gè)96孔培養(yǎng)板，每孔總體積為200μl，用Con A(5μg/ml)處理細(xì)胞，放置含37℃，5％CO2孵箱中恒溫培養(yǎng)。淋巴細(xì)胞培養(yǎng)72h后，用MTT法測定細(xì)胞增殖數(shù)，結(jié)果見表1。
表1本發(fā)明紫錐菊提取物對免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響((n＝12，X±S))

注與正常組比較*P＜0.05，**＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##＜0.01；與紫錐菊醇溶性提取物組比較△P＜0.05，△△＜0.01。
從表1結(jié)果可以看出，與正常組比較，模型組脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯著降低，P＜0.01，表明造模成功；與模型組比較，各藥物組脾淋巴細(xì)胞增殖能力均顯著增強(qiáng)，P＜0.01，表明本發(fā)明提取物具有增強(qiáng)免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的作用；與紫錐菊醇溶性提取物組相比，實(shí)施例2提取物組和實(shí)施例3提取物組對脾淋巴細(xì)胞增殖能力作用均優(yōu)于紫錐菊醇溶性提取物組，并有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明本發(fā)明紫錐菊提取物對免疫低下小鼠的免疫增強(qiáng)作用優(yōu)于單獨(dú)的紫錐菊醇溶性提取物組。
權(quán)利要求
1.一種紫錐菊提取物，其特征在于它是由下述方法制備而成(a)用40～70％的含水乙醇提取紫錐菊藥材，過濾，得濾液和藥渣，濃縮濾液得浸膏；(b)用水或10～30％的含水乙醇提取步驟(a)中所得藥渣，過濾，得濾液和藥渣，棄去藥渣，濃縮濾液得浸膏；(c)合并步驟(a)和(b)中所得浸膏，混勻，干燥，得紫錐菊提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫錐菊提取物，其特征在于，所述的紫錐菊藥材來源于紫錐菊屬植物紫錐菊Echinacea purpurea，狹葉紫錐菊Echinaceaangustifolia，和白紫錐菊Echinacea pallida。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的紫錐菊提取物，其特征在于它是經(jīng)下列步驟制備而成(a)取紫錐菊加10～15倍量40～70％的乙醇回流提取1～3小時(shí)，過濾，收集濾液，濾液減壓回收乙醇，得浸膏；(b)將步驟(a)中藥渣用10～15倍量的水或10～30％的乙醇提取1～3小時(shí)，過濾，收集濾液，減壓濃縮得浸膏；(c)合并步驟(a)和(b)中所得浸膏，攪拌均勻，干燥，即得紫錐菊提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的紫錐菊提取物，其特征在于經(jīng)下列步驟制備而成(a)取紫錐菊加12倍量60％的乙醇回流提取1小時(shí)，過濾，收集濾液，濾液減壓回收乙醇，得浸膏；(b)將步驟(a)中藥渣用12倍量的水提取1小時(shí)，過濾，收集濾液，減壓濃縮得浸膏；(c)合并步驟(a)和(b)中所得浸膏，攪拌均勻，干燥，即得紫錐菊提取物。
5.權(quán)利要求1所述的紫錐菊提取物的含量測定方法，其特征在于包括下列步驟(a)取紫錐菊提取物50mg，精密稱定，置容量瓶中，加30～40∶30～40甲醇-水溶液25～40ml，超聲處理10min，放冷，加30～40∶30～40甲醇-水溶液稀釋至刻度，離心3min，取上清液作為供試品溶液；(b)精密稱取菊苣酸對照品適量，加甲醇-水溶液溶解并稀釋成濃度為7μg/ml的溶液，作為對照品溶液；(c)色譜條件為以十八烷基鍵合硅膠為填料，10～25∶70～75∶5～10甲醇-0.1mol/L磷酸溶液-四氫呋喃為流動(dòng)相，柱溫40℃，檢測波長327nm，理論塔板數(shù)按菊苣酸計(jì)算應(yīng)不低于4000；(d)分別精密吸取步驟(a)和(b)中供試品溶液和對照品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算干燥品中菊苣酸的含量大于0.35％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的紫錐菊提取物的含量測定方法，其特征在于包括下列步驟(a)取紫錐菊提取物50mg，精密稱定，置容量瓶中，加36∶35甲醇-水溶液35ml，超聲處理10min，放冷，加36∶35甲醇-水溶液稀釋至刻度，離心3min，取上清液作為供試品溶液；(b)精密稱取菊苣酸對照品適量，加甲醇-水溶液溶解并稀釋成濃度為7μg/ml的溶液，作為對照品溶液；(c)色譜條件為以十八烷基鍵合硅膠為填料，20∶72∶8甲醇-0.1mol/L磷酸溶液-四氫呋喃為流動(dòng)相，柱溫40℃，檢測波長327nm，理論塔板數(shù)按菊苣酸計(jì)算應(yīng)不低于4000；(d)分別精密吸取步驟(a)和(b)中供試品溶液和對照品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算干燥品中菊苣酸的含量大于0.35％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種紫錐菊提取物及其制備方法和含量測定方法，本發(fā)明的紫錐菊提取物是由下述方法制備而成用40～70％的含水乙醇提取紫錐菊藥材，過濾，得濾液和藥渣，濃縮濾液得浸膏；用水或10～30％的含水乙醇提取所得藥渣，過濾，得濾液和藥渣，棄去藥渣，濃縮濾液得浸膏；合并兩步所得浸膏，混勻，干燥，得紫錐菊提取物。本發(fā)明的紫錐菊提取物成分完整，制備方法簡單，成本低廉。
文檔編號G01N30/00GK101032541SQ20061006184
公開日2007年9月12日 申請日期2006年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月28日
發(fā)明者劉瑜, 何民, 王曉鳳, 白紅艷, 劉忠榮, 及元喬, 李伯剛 申請人:成都地奧九泓制藥廠