專利名稱：集成二維凝膠電泳的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用二維凝膠電泳分離復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的電泳組件或一次性裝置，和使用二維凝膠電泳分離復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的方法。
本發(fā)明涉及改進(jìn)的一次性裝置和加工所述裝置的方法；提供在基于二維凝膠電泳的蛋白質(zhì)組分析中，用于分離復(fù)雜蛋白樣品的普遍接受的人工執(zhí)行步驟的簡(jiǎn)便和有效的集成方法，從而補(bǔ)充和拓展之前的EP申請(qǐng)1712903的范圍，該申請(qǐng)中也介紹了一種新方法。
背景技術(shù)：
二維平板凝膠電泳仍是蛋白質(zhì)組學(xué)的最常用方法，盡管替代的層析法正越來(lái)越流行，如果經(jīng)過(guò)多年的改進(jìn)，解決了現(xiàn)在存在的其它限制，這種情況可能仍會(huì)持續(xù)多年。具體來(lái)說(shuō)，它仍然是耗時(shí)且工作繁重的過(guò)程，需要訓(xùn)練有素的人員，結(jié)果質(zhì)量主要取決于這些人員之手。正是因?yàn)樯婕霸S多人工工作，確實(shí)很難做到再現(xiàn)性，然而另一方面凝膠絕大多數(shù)都是用來(lái)比較的。雖然運(yùn)行情況可以完全再現(xiàn)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)正確地啟動(dòng)和電源這些是可以控制的，并且新緩沖系統(tǒng)增強(qiáng)了凝膠穩(wěn)定性和性能，但是由保持在控制下的各種參數(shù)的變化產(chǎn)生精確性和一致性的問(wèn)題。某些問(wèn)題是例如，就樣品量而言的樣品加載和再水化，就勻質(zhì)性、灌制和反應(yīng)速度、尤其是粒度而言的膠條損失和勻質(zhì)性、具有損壞和污染風(fēng)險(xiǎn)的膠條處理、膠條與凝膠的不精確或緩慢偶聯(lián)、凝膠灌制和聚合、空氣敏感度、運(yùn)行開(kāi)始前完成的時(shí)間、隨后還導(dǎo)致場(chǎng)不連續(xù)的膠條氣泡風(fēng)險(xiǎn)、運(yùn)行期間溫度升高、pH和粘度變化、緩沖容量的損失。
詳細(xì)描述整個(gè)方法超出了本發(fā)明范圍，因?yàn)榭蓮奈墨I(xiàn)中檢索到許多綜述。然而為了幫助理解，在下文中將給出簡(jiǎn)單回顧。
通常第一維分離由等電聚焦(IEF)組成，其中在長(zhǎng)而窄的具有條形并以此命名的支撐凝膠中，蛋白質(zhì)根據(jù)它們的等電點(diǎn)在pH梯度中分離，通常是固定的。市售的膠條通常是以半干燥狀態(tài)提供的，在分析之前它們必須用樣品溶液再水化。該操作需要幾個(gè)小時(shí)到填充的過(guò)夜，通常在礦物油下進(jìn)行以防止樣品溶液中存在的尿素的干燥和結(jié)晶?；谙嗤脑颍琁EF也在礦物油下在相同或不同的盤中進(jìn)行，膠條與兩側(cè)的兩個(gè)電極接觸，在這兩個(gè)電極之間施加高電壓。IEF之后，必須平衡膠條，這意味著聚焦到膠條中的蛋白質(zhì)必須先被烷基化，然后與正十二烷基硫酸鈉(SDS)化合，以隨后轉(zhuǎn)移到第二維凝膠中并根據(jù)大小分離。還原/烷基化可以由各種試劑實(shí)現(xiàn)，可以選擇在再水化之前的樣品制備期間執(zhí)行這個(gè)步驟，雖然這有可能導(dǎo)致等電點(diǎn)的移動(dòng)。然而SDS平衡只能在IEF之后進(jìn)行，因此膠條在包含SDS的平衡溶液中精確清洗幾分鐘。然后將其放置在頂部，與預(yù)聚合SDS聚丙烯酰胺凝膠接觸，通過(guò)在膠條上灌注熱瓊脂糖溶液實(shí)現(xiàn)連接。這通常在兩個(gè)相互夾緊的玻璃板之間完成，然后放入裝有緩沖液的盒中，在盒中跨凝膠施加電壓。可形成具有孔隙率梯度的凝膠，以增強(qiáng)第二維中的分辨率。在這完成之后，取出凝膠、固定、染色，并且在與隨后的步驟(如切出斑點(diǎn)、消化和質(zhì)譜分析)最終處理之前除去背景染料。
在理想情況下，希望的是在裝載樣品之后不需要進(jìn)一步人工干預(yù)，裝載樣品的方法類似于儀器色譜方法，色譜方法的主要強(qiáng)項(xiàng)是真正自動(dòng)化和更好的再現(xiàn)性。基于凝膠的方法中的步驟自動(dòng)化和集成是其它人已經(jīng)面臨的挑戰(zhàn)。US6554991 B1中描述了集成的、完全自動(dòng)化的系統(tǒng)逐步模擬人工的方法，也包括樣品制備和條灌制。然而其背后的自動(dòng)化機(jī)械、操作的復(fù)雜性和投資需要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其實(shí)際和廣泛應(yīng)用，特別是在較小的研究實(shí)驗(yàn)室中。US2003/0127331公開(kāi)了一種系統(tǒng)，其中一旦在兩個(gè)平板形成的垂直模的底部灌制，膠條不需要在IEF之后移動(dòng)。應(yīng)該了解，膠條可以用平衡溶液處理，顯然僅從一側(cè)，隨后通過(guò)將凝膠溶液灌注到模具中直接與膠條接觸或在瓊脂糖層的頂部，與第二維凝膠相連。然而在SDS從一側(cè)擴(kuò)散到膠條內(nèi)部所需的效率和/或平衡時(shí)間，以及能否保留第一維中獲得的分辨率方面仍存在疑問(wèn)。因?yàn)闆](méi)有提到聚合方法，傳統(tǒng)方法需要的長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)分辨率損耗的關(guān)注。而且形成膠條和添加樣品的方式可重復(fù)性差，模具底部的密封標(biāo)簽必須在結(jié)束時(shí)除去的事實(shí)是不現(xiàn)實(shí)的。在EP 0366897中提出首先通過(guò)非導(dǎo)電相變材料的方式將膠條與預(yù)聚合凝膠分離，所述材料通過(guò)升高溫度在IEF之后熔化，將其除去并用其它凝膠介質(zhì)代替。然而關(guān)于平衡步驟沒(méi)有提及，并且溫度對(duì)蛋白質(zhì)和凝膠的作用仍然是此時(shí)開(kāi)啟和閉合模具頂部有關(guān)的問(wèn)題。其它膠條和凝膠之間的阻隔方法在WO02/084273A1中提出。其中報(bào)道的第一個(gè)實(shí)施例利用滑動(dòng)固體屏障當(dāng)然不是最有利的，因?yàn)樾纬傻哪z可能被這個(gè)動(dòng)作破壞。更為有趣的解決方法是使用由軟的可膨脹材料形成的充氣輔助閥門，其將膠條與優(yōu)選預(yù)灌制的凝膠分離。閥門占據(jù)的空間后來(lái)由瓊脂糖填充用于連接。在第三個(gè)實(shí)施例中，膠條側(cè)的半壁用作襯墊，可對(duì)其按壓也用作凝膠支撐的箔，這樣通過(guò)改變相對(duì)于對(duì)面剛性表面的位置來(lái)開(kāi)啟和封閉膠條室。在這種情況下，優(yōu)選在第一維完成時(shí)開(kāi)啟膠條室之后引入和聚合凝膠溶液，或者凝膠可以預(yù)灌制，很難想象箔需要移動(dòng)。雖然要求了有可能在某個(gè)步驟中用凝膠溶液浸泡膠條，再次優(yōu)選使用瓊脂糖。平衡溶液可以通過(guò)裝置的剛性部分達(dá)到膠條。在不久的將來(lái)，納克斯特基因科學(xué)(Nextgen Sciences)會(huì)最終將基于這個(gè)原理的自動(dòng)化系統(tǒng)商業(yè)化。然而在這個(gè)系統(tǒng)中依然存在弱點(diǎn)，第一個(gè)表現(xiàn)為與實(shí)施例無(wú)關(guān)的樣品固定體積。實(shí)際上，在完全再水化膠條之上需要額外的空間，從而允許第一維之后平衡溶液的流動(dòng)，因此在再水化膠條時(shí)，需要過(guò)量的樣品填充該縫隙。同樣的，IEF期間過(guò)量液體留在膠條上的事實(shí)可導(dǎo)致聚焦干擾和水平?jīng)_擊，如果除去會(huì)導(dǎo)致膠條的干燥。而且，IEF之后灌制凝膠時(shí)，可預(yù)期由于長(zhǎng)時(shí)間等待凝膠聚合而造成的分辨率損失和由于丙烯酰胺單體滲入膠條而造成的有害效應(yīng)，因?yàn)槌酥付ǖ膫鹘y(tǒng)方法之外，沒(méi)有要求或甚至提及聚合凝膠溶液的方法。這必定是在任何情況下都優(yōu)選使用瓊脂糖的原因。然而瓊脂糖會(huì)帶來(lái)新的困擾，例如在熔化之前需要煮沸，以及一旦開(kāi)始凝膠，將它從所有管和裝置中除去的困難。并且還要關(guān)注保持平坦的非形變箔形狀的效率，這對(duì)保證均勻的凝膠厚度很重要。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提出基于二維電泳用于樣品分離的電泳組件或一次性裝置，一旦樣品被加載到裝置，其僅要求最少的或優(yōu)選不要人工干預(yù)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提出運(yùn)行所述裝置的自動(dòng)化操作步驟。所提出的是根據(jù)權(quán)利要求1中的語(yǔ)句，使用二維電泳進(jìn)行樣品分離的電泳組件或一次性裝置。
本發(fā)明將證實(shí)即使按照上述傳統(tǒng)方法并仍然在凝膠電泳的一次性裝置中使用閥門，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)，提供更廉價(jià)、更簡(jiǎn)單、更快捷、同等集成的解決方法，其分別以一次性裝置和處理系統(tǒng)的形式，如下文中所述和所附權(quán)利要求中所要求的。

發(fā)明內(nèi)容
參考以下的附圖，在下文中給出了本發(fā)明系統(tǒng)和方法的實(shí)例的簡(jiǎn)單描述，重點(diǎn)指出可要求保護(hù)的與現(xiàn)有技術(shù)的不同以及優(yōu)點(diǎn)。
系統(tǒng)二維電泳系統(tǒng)包括通過(guò)軟件控制儀器進(jìn)行一系列自動(dòng)化操作步驟的一次性核心部分，軟件控制儀器的組件也是本發(fā)明的一部分，其與方法、一次性形式及其功能結(jié)合。根據(jù)術(shù)語(yǔ)儀器，理解用于操作一次性裝置的組件包括緩沖液儲(chǔ)器、冷卻模塊、電極、裝管、UV燈泡等。包括至少一個(gè)閥門的電泳裝置主體是例如應(yīng)用二元模制技術(shù)注射模制的，這表示在兩個(gè)部件之間不需要組裝，從而減少了制造費(fèi)用。因此這意味著它可以是一次性的，并且從現(xiàn)在開(kāi)始將它稱之為一次性的。主體材料優(yōu)選選自PMMA、PC、PE、PET、PP或COC，注意材料是UV透明的，其特殊的意圖在于將從一個(gè)或多個(gè)集成在儀器中的燈泡的適當(dāng)波長(zhǎng)照射光直接通過(guò)它們，允許凝膠溶液的UV起始快速聚合。閥門軟部件的材料優(yōu)選選自與之前選擇的主體材料兼容的TPE(熱塑性人造橡膠)，如PTS-Thermoflex(Plastic TechnologyService Ltd，Salisburg SP5 4BZ，UK)或Santoprena(Advanced ElestomerSystems，LP，Akron，Ohio，USA)。這也是UV透明的，模鑄成傳統(tǒng)平片狀，直接與一次性裝置的內(nèi)表面連接。通過(guò)在緊鄰下方放置的膠條區(qū)域留下兩個(gè)通過(guò)一次性主體的裂縫，彈性軟部件可通過(guò)由儀器進(jìn)行的外部剛性動(dòng)作拉伸，從而通過(guò)按壓膠條/凝膠載體(如凝膠附著的箔或玻璃板)使膠條陷入封閉的密封環(huán)境。類似地如果需要，可將裂縫設(shè)計(jì)在其它位置，以將凝膠室分割成間隔，或者簡(jiǎn)單封閉任何最終的開(kāi)放邊緣。
另一個(gè)軟部件集成在一次性裝置中作為凝膠區(qū)域周圍的襯墊桿或環(huán)，位于主體內(nèi)表面和載體箔之間以?shī)A層排列。這可以同時(shí)、按照相同的流程、最后使用與上述相同的材料模鑄，發(fā)現(xiàn)另一個(gè)重要功能，允許兩個(gè)相對(duì)表面在施加外部壓力時(shí)的距離變化。這個(gè)距離優(yōu)選對(duì)應(yīng)于再水化和IEF時(shí)的約0.7mm，在平衡、凝膠灌制、聚合和第二維分離時(shí)的約1.0mm。
在聚合期間交聯(lián)到凝膠的載體箔也例如層壓到一次性裝置上，可在本發(fā)明程序之后由用戶撕下。
另外，一次性裝置的外部尺寸優(yōu)選按照ANSI SBS(美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局，生物分子篩選學(xué)會(huì)127.76±0.25mm×85.48±0.25mm)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，從而有利于自動(dòng)化操作。
還有一個(gè)選擇是集成由例如石墨組成的廉價(jià)一次性電極，用于第一維分離?；蛘?，電極棒(例如鉑制成)穿過(guò)一次性裝置主體中的孔在末端處與膠條相連，可為儀器的一部分而不是一次性的。優(yōu)選集成到儀器中的是第二維的電極，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間插入一次性裝置的緩沖液儲(chǔ)器中。另一個(gè)選擇是具有至少一個(gè)集成到一次性裝置中的廉價(jià)電極，例如在陰極，那里氧化還原反應(yīng)和電極消耗較不重要。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，為了使一次性裝置更簡(jiǎn)單和更緊湊，第二維的緩沖液儲(chǔ)器也可為儀器的一部分，在需要時(shí)使用襯墊和外部壓力的簡(jiǎn)單方法夾緊到一次性裝置上。為了防止小儲(chǔ)器和小緩沖體積相關(guān)的緩沖能力損失，緩沖液可從上游較大的儲(chǔ)器中新鮮循環(huán)。許多方法可以避免整個(gè)電路保持在施加的電壓下，例如使用“停止和開(kāi)始”間斷方法間隔地?cái)嚅_(kāi)電路，置換緩沖液，或者限制大儲(chǔ)器和小儲(chǔ)器之間的溝通管道，最終還有通過(guò)液體通道分配作為絕緣體的氣泡?；蛘?，緩沖液容量的限制可以通過(guò)再循環(huán)陰極緩沖液和陽(yáng)極緩沖液來(lái)克服，反之亦然。通過(guò)這種方法，緩沖液儲(chǔ)器可保持很小，并且在運(yùn)行期間不需要其它的緩沖液。
為了保持載體箔的平整和平坦，尤其重要的是保證凝膠的均勻性和有效的冷卻(這兩者對(duì)于再重復(fù)性都是基本的)，一次性裝置幾何與其在幾何方面相配的儀器冷卻模塊可由多孔陶瓷、金屬或其它導(dǎo)熱合金制造，通過(guò)它們可施加真空吸力。同時(shí)這代表將一次性裝置穩(wěn)定固定到儀器中的有利方法，從而可在凝膠灌制時(shí)通過(guò)冷卻模塊的機(jī)械旋轉(zhuǎn)可以將其旋轉(zhuǎn)90°。
一次性裝置一般不包含IEF膠條，因此為操作員留下插入具有所需pH范圍的膠條的自由，避免在冷卻溫度運(yùn)載和存儲(chǔ)帶有膠條的整個(gè)一次性裝置的需要。因?yàn)樘峁┝酥笇?dǎo)細(xì)節(jié)，所以不會(huì)發(fā)生例如關(guān)閉閥門的錯(cuò)誤放置，而電極也可用于保持膠條在所需位置上。然而有可能，特別是如果一次性裝置如上面所建議的做得更簡(jiǎn)單、更緊湊時(shí)，膠條已經(jīng)集成到一次性裝置，使得可以訂購(gòu)包含不同膠條的各種一次性裝置。另一種可能是將膠條附著在箔上，箔與一次性裝置主體分開(kāi)單獨(dú)運(yùn)輸。在這種情況下，用戶需要在例如定位孔的幫助下將這兩部分組裝在一起。又一個(gè)選擇是引導(dǎo)膠條穿過(guò)覆蓋箔中的開(kāi)口，該開(kāi)口在之后用帶狀裝置封閉。
另一個(gè)可以應(yīng)用到帶閥門實(shí)施方案中的組件是在凝膠/緩沖液界面使用膜或葉片。要求保護(hù)的是疏水、最終支撐膜的使用，該膜具有材料、厚度、孔尺寸的正確組合，由PET、PE、PP或PES制成，其功能是在平坦垂直灌制時(shí)作為液體凝膠溶液的屏障，但是允許聚合凝膠與含SDS緩沖液之間的液體和正常電接觸。一個(gè)工作實(shí)施例是Schleicher&Schuell，Einbeck，DE，(Watman)的通常用于過(guò)濾和生物應(yīng)用的UltranPES(聚醚砜)5KD膜，但是也可以使用其它的膜，或多或少有效地取決于凝膠是否包含SDS的事實(shí)。為了使得一次性裝置盡可能的簡(jiǎn)單，可以想象凝膠/緩沖液界面的裂縫僅在凝膠聚合之后產(chǎn)生，為沿著模制一次性裝置主體的較薄集成襯套的縱向切口形式，或通過(guò)集成到儀器中的葉片穿過(guò)硬部件中的裂縫切割軟部件材料的方法。當(dāng)以任何方式使用閥門封閉膠條時(shí)，較簡(jiǎn)單的方法可能是使用與一次性裝置主體一起注射模制的軟部件，使用與封閉膠條室相同的辦法，在灌制和聚合時(shí)基于外部促動(dòng)封閉凝膠室的開(kāi)口端。另一個(gè)簡(jiǎn)單方法是使帶跨過(guò)裂縫，帶在完成與緩沖液的接觸后立即除去。所有解決方法中最簡(jiǎn)單的是膠條在底部的情況下灌制凝膠，僅剩下膠條側(cè)的外部閥門封閉。


下面參考以下附圖給出本發(fā)明的系統(tǒng)和流程實(shí)例的簡(jiǎn)單說(shuō)明，重點(diǎn)是要求保護(hù)的與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別以及權(quán)益。
在圖中圖1a和圖1b概要和非比例的顯示了具有封閉閥門和兩個(gè)可變厚度的二元一次性裝置核心部分，厚度分別是一個(gè)厚度在再水化和IEF期間，第二個(gè)厚度在平衡期間，圖2a和2b概要和非比例的顯示了第二維凝膠灌制期間的二元一次性裝置核心部分的兩個(gè)可能的實(shí)施方案，
圖3指出使用合適膜或帶密封的凝膠/緩沖液界面處的裂縫，圖4指出僅在凝膠灌制和聚合之后，在凝膠/緩沖界面通過(guò)集成到儀器的葉片功能產(chǎn)生裂縫的可能方法，圖5概要的顯示了一個(gè)可能的實(shí)施方案，其中第二維的緩沖液儲(chǔ)器不集成到一次性裝置中，而是在需要時(shí)被儀器夾緊，緩沖液從上游較大的儲(chǔ)器中新鮮循環(huán)，以防止與小儲(chǔ)器和小存儲(chǔ)體積相關(guān)的緩沖能力損失。
具體實(shí)施例方式
方法的步驟是自動(dòng)化執(zhí)行的，通過(guò)參照

如下1.除非膠條已經(jīng)集成在封閉的一次性裝置1中，否則將第一凝膠條7插入或?qū)в心z條7的箔5組裝到一次性裝置1中。一個(gè)可能的替代方案是在設(shè)置在兩端的兩個(gè)閥門9和10是關(guān)閉的情況下，原位灌制IEF膠條7。閥門通過(guò)插入物12和14促動(dòng)，它們作為儀器一部分(未顯示)用于操作一次性裝置。
2.在再水化溶液中裝載樣品，膠條7兩側(cè)的兩個(gè)閥門9和10是關(guān)閉的，箔5和覆蓋一次性裝置主體3內(nèi)表面的軟部件閥門材料11之間的距離為例如0.7mm，直到填滿如此產(chǎn)生的膠條室。
3.將冷卻模塊的溫度設(shè)為例如30-35℃，等待再水化至少一個(gè)小時(shí)。
4.運(yùn)行IEF，在集成的或此時(shí)由處理儀器插入的兩個(gè)電極(未顯示)之間施加斜坡高電壓，此處控制溫度設(shè)置在例如20℃。
5.通過(guò)釋放裝置施加到儀器上的壓力，將箔5和內(nèi)表面11之間的圖1a所示的距離a(0.7mm)增加到圖1b所示的距離b(1.0mm)，同時(shí)在外部插入物12和14的協(xié)助下進(jìn)一步伸長(zhǎng)軟部件閥門9和10，保持膠條7的室的關(guān)閉。從圖1a的距離a增加到圖1b的距離b可由集成襯墊17擴(kuò)展還原為其原始形狀來(lái)實(shí)現(xiàn)，其由彈性軟部件材料制成。在圖1a所示的組件中，通過(guò)施加外部壓力將一次性裝置主體3向下壓向箔5，這個(gè)壓力在圖1b的組件中被移去。
6.將烷基化/SDS平衡溶液倒入在膠條7頂部生成的例如0.3mm深的通道23，在最后傾空。
7.將整個(gè)一次性裝置1旋轉(zhuǎn)90°，使它處在圖2a和圖2b所示的垂直位置。這個(gè)移動(dòng)可通過(guò)旋轉(zhuǎn)冷卻模塊(未顯示)實(shí)現(xiàn)，通過(guò)如上提議的幾何配件和通過(guò)多孔材料的真空將一次性裝置穩(wěn)定的固定在冷卻模塊上。
圖2a顯示在垂直位置的圖1b所示的一次性裝置的設(shè)計(jì)，膠條7一側(cè)的閥門10處于關(guān)閉狀態(tài)，而閥門9開(kāi)啟。
8.除非凝膠緩沖界面的裂縫13和15還沒(méi)有形成或者如果它們由軟部件層11或圖3所示的附加膜21和22封閉，在底部具有膠條7的圖2a實(shí)施方案的閥門10必須保持封閉，直到凝膠溶液被灌制和聚合。作為圖2b的替代方案，在頂部具有凝膠條7的附加外部閥門27放在一次性裝置1的對(duì)側(cè)(將箔5和覆蓋盤3之間隔開(kāi)至例如1mm，其為圖1b的距離)。
9.通過(guò)一次性裝置主體3中的孔(未顯示)，灌制凝膠溶液以形成第二維分離的凝膠，從而同時(shí)獲得與膠條7的連接，并通過(guò)快速UV引發(fā)反應(yīng)的聚合在例如少于5分鐘內(nèi)完成，由于UV透明一次性裝置主體3和層11這是可能的。如果需要，也可灌制梯度凝膠。
10.打開(kāi)圖2a組件中的閥門10或者由圖2b組件中的插入物26激活的閥門27，使得運(yùn)行緩沖液可與凝膠接觸進(jìn)行第二維分離，或者作為替代產(chǎn)生裂縫13和/或15(如果這些仍未由圖4所示的葉片功能32產(chǎn)生)。另一種可能是如果裂縫13和15被額外的膜21和22封閉，如圖3所示，則立即進(jìn)行下一個(gè)步驟。
11.如果使用開(kāi)口緩沖液儲(chǔ)器，最后將組件旋轉(zhuǎn)回水平位置，其它情況下旋轉(zhuǎn)回原位置不是絕對(duì)必須的。如果儲(chǔ)器是儀器的一部分，這表示沒(méi)有集成到一次性裝置中，它們現(xiàn)在可以參考圖5所示連接在一起，表示為參考號(hào)41和42。
12.引入運(yùn)行的緩沖液，最終循環(huán)運(yùn)行緩沖液，通過(guò)在兩個(gè)儲(chǔ)器之間施加電壓，在受控溫度(例如20℃)下開(kāi)始第二維運(yùn)行，電極集成到一次性裝置或儀器中。
13.在第二維運(yùn)行完成之后將一次性裝置1從儀器中移去，打開(kāi)以通過(guò)撕掉凝膠附著的箔5除出凝膠。
參考附圖的上述方法當(dāng)然是適合描述本發(fā)明的實(shí)例，而完全不是限制本發(fā)明。用于生產(chǎn)一次性裝置(包括閥門的軟部件、箔、壓縮部分等)的材料類型可以以適當(dāng)?shù)姆绞礁淖?。?yōu)選在一次性裝置中使用UV或光透明材料，使得UV或第二凝膠的光引發(fā)聚合是可能的，但是這不應(yīng)是本發(fā)明的限定性因素。另外，可能使用兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)閥門。本發(fā)明的一個(gè)重要特點(diǎn)當(dāng)然是一次性裝置主體內(nèi)表面和第一凝膠條附著的箔之間的距離是可變的，這表示第一維分離之后，距離可以由于設(shè)置的彈性襯墊而擴(kuò)大。
圍繞膠條的閥門以及覆蓋箔和一次性裝置內(nèi)表面之間的距離(例如第一維和第二維分別是0.7mm和1.0mm)的組合使閥門的允許位置數(shù)目從兩個(gè)增加到三個(gè)，與現(xiàn)有技術(shù)相比提供了重要的有利之處。首先，因?yàn)橛砷y門產(chǎn)生的膠條室體積對(duì)應(yīng)再水化膠條的體積，因此不需要或需要最少的過(guò)量樣品來(lái)再水化膠條。這樣，IEF也運(yùn)行在最佳條件下而沒(méi)有液體超過(guò)膠條的頂部。僅在IEF之后在膠條頂部形成空間，引入流動(dòng)的平衡溶液，從而也提供了最佳的平衡條件。最后因?yàn)樾枰谀z條之上具有小空間的較厚凝膠，以達(dá)到正確的連接，在場(chǎng)均勻性、2D分辨率和可重復(fù)性方面進(jìn)行良好第二維分析，因此在隨后的步驟中也提供最佳條件。
不像現(xiàn)有技術(shù)，UV引發(fā)快速聚合也適用于二維凝膠電泳的領(lǐng)域，選擇暴露于光源之前在丙烯酰胺凝膠溶液中穩(wěn)定的引發(fā)劑，該光源的波長(zhǎng)范圍包含引發(fā)劑的吸收光譜。閥門僅用于在密封環(huán)境中封閉膠條，而不是作為凝膠和膠條之間的屏障，因?yàn)榈谝痪S之后凝膠可快速聚合，不需要預(yù)灌制。因此，化學(xué)物質(zhì)、存儲(chǔ)時(shí)間和條件以及IEF聚合后或聚合前的等待時(shí)間不再是一個(gè)問(wèn)題。如在先的EP申請(qǐng)1 712 903中公開(kāi)的，正是因?yàn)榫酆峡焖龠M(jìn)行，也可以取消使用連接凝膠如瓊脂糖等。凝膠溶液現(xiàn)在可以完全填滿模具，接觸、覆蓋和封閉膠條，而這用傳統(tǒng)方法，使用過(guò)硫酸銨(APS)和N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)分別作為自由基聚合的引發(fā)劑和催化劑是不可能的。實(shí)際上這些試劑必須在最后時(shí)刻加入并混合，因?yàn)樗鼈冊(cè)诠嘀破陂g立即開(kāi)始聚合，從而已導(dǎo)致制備問(wèn)題，而且因?yàn)榉磻?yīng)緩慢進(jìn)行，一般需要超過(guò)一小時(shí)才能完成，第一維期間獲得的分辨率損失和丙烯酰胺單體擴(kuò)散到膠條中，造成與蛋白質(zhì)的可能交聯(lián)，成為其它重要的問(wèn)題?；谕瑯拥脑颍嘀铺荻饶z時(shí)，快速UV聚合顯得特別方便。
參考文獻(xiàn)[1]Herbert et al.Electrophoresis 2001，22，2046-205權(quán)利要求
1.一種使用二維凝膠電泳分離復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的電泳組件或一次性裝置，包含載體，例如膜或箔或玻璃板(5)，其具有用于第一維凝膠條(7)的區(qū)域和用于第二維凝膠的區(qū)域(16)，所述兩個(gè)區(qū)域彼此直接接觸，二元主體，由與載體(5)的距離可變的硬部件(3)和薄的彈性軟部件層(11)組成，進(jìn)一步包含至少一個(gè)裂縫或開(kāi)口，用于至少一個(gè)閥門的外部促動(dòng)，其中在通過(guò)所述裂縫外部促動(dòng)所述軟部件時(shí)，所述閥門表現(xiàn)為沿與所述裂縫一致的載體方向上的可逆性伸展。
2.如權(quán)利要求1所述的組件或一次性裝置，其特征在于一次性裝置主體至少是部分對(duì)UV透明的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的組件或一次性裝置，其特征在于通過(guò)與所述裂縫對(duì)應(yīng)的所述硬部件(3)中的至少一個(gè)裂縫進(jìn)行外部促動(dòng)時(shí)，位于一次性裝置主體內(nèi)表面的軟部件層(11)可朝凝膠載體(5)向下拉伸。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的組件或一次性裝置，其特征在于硬部件(3)包含可用于軟部件層的外部促動(dòng)的至少兩個(gè)裂縫或開(kāi)口，作為第一維凝膠條(7)區(qū)域兩側(cè)的閥門(9，10)和/或在適當(dāng)位置作為第二維凝膠的閥門。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組件或一次性裝置，其特征在于一次性裝置主體與凝膠載體之間的距離變化可以通過(guò)至少一個(gè)彈性可壓縮/可膨脹密封件或襯墊的方式來(lái)獲得，所述密封件或襯墊在所述一次性裝置主體與載體之間為夾層布置，優(yōu)選沿著第二維凝膠區(qū)域的周界，并且是所述一次性裝置的一部分。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的組件或一次性裝置，其特征在于硬部件(3)進(jìn)一步包含孔或連接配件，用于樣品裝載、平衡溶液的流動(dòng)、凝膠溶液的灌制或通風(fēng)。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的組件或一次性裝置，其特征在于硬部件(3)優(yōu)選選自PMMA、PC、PE、PET、PP或COC(環(huán)烯-共聚物)。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的組件或一次性裝置，其特征在于軟部件(11)優(yōu)選選自與硬部件材料兼容的熱塑性彈性體如PTS-Thermoflex或Santoprene，以便可進(jìn)行二元注射模制，使得第二維凝膠不能粘附于其上。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的組件或一次性裝置，其特征在于一次性裝置(1)進(jìn)一步包括第一維和/或第二維的電極和/或用于外部引入電極的結(jié)構(gòu)。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的組件或一次性裝置，其特征在于一次性裝置主體進(jìn)一步包含在第二維凝膠和運(yùn)行緩沖液之間界面處的裂縫。
11.如權(quán)利要求10所述的組件或一次性裝置，其特征在于第二維凝膠和運(yùn)行緩沖液之間界面處的裂縫由附加膜(21，22)密封。
12.如權(quán)利要求11所述的組件或一次性裝置，其特征在于附加膜(21，22)具有厚度、孔尺寸和材料的正確組合，其功能是在灌制期間作為液體凝膠溶液的屏障，但允許聚合凝膠和含SDS緩沖液之間的液體正常電接觸。(例如PET、PE、PP或PES)
13.如權(quán)利要求11或12所述的組件或一次性裝置，其特征在于膜是PES(聚醚砜)如Ultran5KD。
14.如權(quán)利要求10所述的組件或一次性裝置，其特征在于第二維凝膠和運(yùn)行緩沖液之間界面處的裂縫僅在凝膠聚合之后通過(guò)葉片功能的方式產(chǎn)生。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的組件或一次性裝置，其特征在于所述一次性裝置的外部尺寸優(yōu)選根據(jù)ANSI SBS(AmericanNational Standards Institute，The Society of Biomolecular Screening127.76±0.25mm×85.48±0.25mm)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，以有利于自動(dòng)化操作。
16.如權(quán)利要求9-15中任一項(xiàng)所述的組件，包括至少一個(gè)大的外部緩沖液儲(chǔ)器，用于第二維分離的運(yùn)行緩沖液可從所述大的儲(chǔ)器新鮮供應(yīng)到較小緩沖液儲(chǔ)器和/或從較小緩沖液儲(chǔ)器再循環(huán)，所述較小儲(chǔ)器與一次性裝置集成或在一次性裝置的外部，對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求9或10的孔、裂縫或開(kāi)口。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的組件，其特征在于一次性裝置在幾何方面與冷卻模塊上的外部載體側(cè)相配，并優(yōu)選與其穩(wěn)定固定，冷卻模塊由多孔材料如陶瓷、金屬或其它導(dǎo)熱合金制成，通過(guò)多孔材料可以施加真空吸力。
18.在如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的組件或一次性裝置中使用二維凝膠電泳分離復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的方法，其特征在于樣品在再水化溶液中裝載到第一維凝膠條上，所述膠條設(shè)置在載體上，膠條兩側(cè)的閥門關(guān)閉，載體和一次性裝置主體之間的距離大致對(duì)應(yīng)于再水化膠條的厚度，并且再水化和第一維分離之后，載體和一次性裝置主體之間的距離增大，同時(shí)進(jìn)一步向下拉伸膠條兩側(cè)的閥門，從而保持膠條環(huán)境密封，因此產(chǎn)生膠條上面的自由空間或通道，以允許平衡溶液的流動(dòng)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于第二維分離凝膠的凝膠溶液在膠條至少一側(cè)的一個(gè)閥門開(kāi)啟的情況下引入，并且載體和一欠性裝置主體之間的距離增加，從而同時(shí)實(shí)現(xiàn)與膠條的連接，隨后是UV引發(fā)的聚合。
20.如權(quán)利要求18或19所述的方法，其特征在于通過(guò)使一次性裝置在大致垂直位置上來(lái)執(zhí)行第二維凝膠的凝膠溶液的灌制。
21.如權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于為了進(jìn)行分離樣品的連續(xù)分析，載體、優(yōu)選具有凝膠附著性質(zhì)的箔或膜與附著的凝膠一起從一次性裝置上撕掉。
全文摘要
一種使用二維凝膠電泳分離復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的電泳組件或一次性裝置，包含具有第一維凝膠條(7)的區(qū)域和第二維凝膠的區(qū)域(16)的載體，例如膜或箔或玻璃盤(5)，其中所述兩個(gè)區(qū)域彼此直接接觸。組件或一次性裝置進(jìn)一步包含二元主體，由硬部件(3)和薄的彈性軟部件層(11)組成，其與載體之間的距離可變，載體進(jìn)一步包含用于至少一個(gè)閥門(9，10)的外部制動(dòng)的至少一個(gè)裂縫或開(kāi)口，其中所述閥門由與所述至少一個(gè)裂縫(圖1a)相一致的所述軟部件材料表示。
文檔編號(hào)G01N27/447GK101017150SQ200610063648
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2006年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日
發(fā)明者M·科普, R·桑多茨, M·庫(kù)爾西奧, M·格勞瑟 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司