專利名稱：免疫產(chǎn)品及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種實(shí)驗(yàn)室裝置以及采用該裝置檢測印跡膜中所含物質(zhì)的位置或存在/不存在的方法。更尤其是，其涉及將試劑和洗液施加于印跡膜上從而通過真空或正壓完成快速檢測的一種技術(shù)。
背景技術(shù)：
使用凝膠電泳目前是分離生物材料的一種普遍技術(shù)。(非生物材料也可以采用凝膠或其他層析支撐物來分離，但是關(guān)于生物材料所做的工作更多)。典型的應(yīng)用包括在測定序列、檢測多態(tài)性中分離不同大小的核酸片段；或者在其他情況下確定大小。其它常見的應(yīng)用為分離蛋白質(zhì)和糖蛋白，以及采用凝膠進(jìn)行分離以確定均勻性或純度。
在所有這些過程中，將生物實(shí)體的混合樣品施加于電泳凝膠，對凝膠施加電場從而分離組分。不論凝膠的展開方式如何，但是必須以某種方式檢測樣品中所含物質(zhì)所得到的遷移圖形。
為了進(jìn)行檢測，典型地將凝膠支撐物與印跡膜接觸，將物質(zhì)轉(zhuǎn)移至印跡膜上，其轉(zhuǎn)移圖形與凝膠上的圖形相同。然后最低限度地用蛋白或去污劑溶液封閉膜，以減少非特異性結(jié)合(否則其將導(dǎo)致高噪聲以及低檢測水平)，從而檢測“點(diǎn)”。典型的封閉劑包括酪蛋白、小牛蛋白血清(BSA)、脫脂奶粉的TBS-T或PBS-T溶液(通常大約1％)。然后將所述生物實(shí)體與對膜上的抗原具有特異性的抗體一起孵育。將膜徹底清洗，以除去任何污染物(例如凝膠殘余物)、未結(jié)合的封閉蛋白或抗體等。然后用對上述第一抗體特異的與酶、放射性同位素、熒光、或生物素綴合的第二抗體處理并孵育所述膜。再次將膜清洗干凈，以除去任何未結(jié)合的第二抗體。然后施加檢測試劑，通常為生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性或抗生物素蛋白鏈霉素標(biāo)記的材料，其與酶綴合物結(jié)合，或者為酶綴合物的底物。最后，采用適當(dāng)?shù)臋z測裝置檢測生物實(shí)體的存在、不存在、位置、量等。根據(jù)所選擇的試劑之間的反應(yīng)速度、膜和生物實(shí)體，最后六步通常需要3-6小時(shí)至過夜，而且該方法要求將膜在搖動(dòng)平臺(tái)上孵育多個(gè)時(shí)間階段。大多數(shù)研究人員都不喜歡上述費(fèi)時(shí)且消耗(浪費(fèi))大量試劑的方法。
有些研究人員建議利用吸收材料的毛細(xì)管作用，例如放置在膜下的濾紙，吸收剩余液體使其通過膜，提高該方法的速度，尤其是洗滌步驟的速度。
US 5155049提及了一個(gè)稱為Hybrid-EaseTM雜交腔室的系統(tǒng)，由HoeferScientific Instruments出售。該腔室包括兩個(gè)格柵，其中夾著膜。柵板卡合在環(huán)繞膜的位置，注射器位于由所述格柵產(chǎn)生的開口空隙中。一個(gè)注射器用于施加試劑和清洗，另一個(gè)用于除去多余物。所述系統(tǒng)要求大量的液體進(jìn)行操作，在使用上較為笨重，同時(shí)也相當(dāng)耗時(shí)。其還提及了在小體積孔(例如96孔微滴定板)的某些特定檢測中，例如ELISA檢測，在洗滌步驟中，其他人采用真空吸取液體通過一個(gè)或多個(gè)膜。然而，由于其只適用于小體積應(yīng)用中，而且仍是不可控的，因此，他們對所述工作持懷疑態(tài)度。相反，他們提出，更好的辦法是采用具有位于濾紙上的膜和覆蓋層的人工擠壓裝置，將膜擠壓在兩塊板之間從而擠壓液體通過膜并進(jìn)入紙中。
顯然，需要一種更為有效的檢測位于印跡膜上的生物材料或?qū)嶓w的方法。本發(fā)明允許對位于印跡膜上的生物實(shí)體進(jìn)行更為有效的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種快速、有效、方便的檢測位于印跡膜上一種或多種生物實(shí)體的方法。該檢測可以涉及生物物質(zhì)在一個(gè)或多個(gè)膜上的位置、性質(zhì)或量。本發(fā)明的方法涉及選自正壓或真空輔助系統(tǒng)的壓力輔助系統(tǒng)，用于提供并除去試劑，采用極少量液體將污染物從位于膜中的待檢測物質(zhì)中清洗去除。該方法能夠在大約30-45分鐘內(nèi)完成封閉、洗滌和抗體結(jié)合步驟，而不損害印跡質(zhì)量。
因此，一方面，本發(fā)明涉及一種使液體通過一個(gè)或多個(gè)膜的方法，所述液體例如是抗體溶液、檢測試劑或洗液，而所述膜上具有一種或多種生物物質(zhì)。所述膜可以例如對應(yīng)于在電泳凝膠上進(jìn)行分離的樣品的遷移圖形。所述膜還可以是測定特異性結(jié)合的固體支撐物。
該方法尤其適用于經(jīng)印跡凝膠支撐物而得到的膜，而所述凝膠支撐物已被用于對樣品中的材料進(jìn)行電泳分離或者驗(yàn)證純度。
另一方面，本發(fā)明涉及一種用于實(shí)施本發(fā)明方法的裝置。所述裝置包括若干層，其中包括位于一層或多層印跡膜下方的多孔支撐層，位于所述印跡膜上的流動(dòng)分配器，以及位于所述流動(dòng)分配器上包含至所希望區(qū)域的液體并允許具有較小起始體積的所述液體的孔。優(yōu)選地，所述流動(dòng)分配器為非結(jié)合的或低結(jié)合的多孔膜，例如0.22微米的膜。
所述裝置具有位于流動(dòng)分配器和支撐物之間的一個(gè)或多個(gè)印跡膜，并將所述裝置放置于具有適當(dāng)尺寸的真空歧管上或其中，或者將壓力腔室放置于流動(dòng)分配器頂部的上方。然后在需要的步驟之間采用真空或正壓以實(shí)施所述方法，使液體通過膜。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種進(jìn)行真空輔助的免疫測定的裝置，所述裝置包括多孔支撐物、位于所述多孔支撐物頂部上的流動(dòng)分配器以及位于所述流動(dòng)分配器頂部之上的一個(gè)或多個(gè)試劑孔。
本發(fā)明的另一目的是提供一種進(jìn)行正壓輔助的免疫測定的裝置，所述裝置包括多孔支撐物、位于所述多孔支撐物頂部上的流動(dòng)分配器以及位于所述流動(dòng)分配器頂部之上的一個(gè)或多個(gè)試劑孔。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用于真空輔助的免疫測定的裝置，所述裝置包括真空歧管、位于所述真空歧管上的多孔支撐物、位于所述多孔支撐物頂部上的流動(dòng)分配器以及位于所述流動(dòng)分配器頂部之上的一個(gè)或多個(gè)試劑孔。
本發(fā)明的另一目的是提供一種進(jìn)行正壓輔助的免疫測定的裝置，所述裝置包括歧管、位于所述歧管上的多孔支撐物、位于所述多孔支撐物上的一個(gè)或多個(gè)印跡膜、位于所述一個(gè)或多個(gè)膜頂部上的流動(dòng)分配器、位于所述流動(dòng)分配器頂部之上的一個(gè)或多個(gè)試劑孔、可拆卸地位于所述流動(dòng)分配器頂部之上的正壓裝置。
本發(fā)明的另一目的是提供一種真空輔助的免疫測定方法，包括以下步驟a.提供真空歧管、位于所述真空歧管上的多孔支撐物、含有一個(gè)或多個(gè)待測生物實(shí)體的一個(gè)或多個(gè)膜，所述膜位于所述多孔支撐物上，位于所述膜頂部上流動(dòng)分配器、以及位于所述流動(dòng)分配器頂部之上的一個(gè)或多個(gè)孔，
b.將一種或多種試劑加入所述一個(gè)或多個(gè)孔中，然后施加真空，使所述試劑進(jìn)入所述膜中，以及c.將一種或多種洗劑加入所述一個(gè)或多個(gè)孔中，然后施加真空，使所述洗劑和任何未結(jié)合的試劑通過所述流動(dòng)分配器、膜和多孔支撐物進(jìn)入所述真空歧管中，d.根據(jù)要求或需要重復(fù)步驟(b和c)一次或多次。
本發(fā)明的另一目的是提供一種真空輔助的免疫測定方法，包括以下步驟a.提供真空歧管、位于所述真空歧管上的多孔支撐物、含有一個(gè)或多個(gè)待測生物實(shí)體的一個(gè)或多個(gè)膜，所述膜位于所述多孔支撐物上，位于所述膜頂部上的流動(dòng)分配器、以及位于所述流動(dòng)分配器頂部之上的一個(gè)或多個(gè)孔。
b.將一種或多種試劑加入所述一個(gè)或多個(gè)孔中，然后施加真空，使所述試劑進(jìn)入所述膜中，以及c.將一種或多種洗劑加入所述一個(gè)或多個(gè)孔中，然后施加真空，使所述洗劑和任何未結(jié)合的試劑通過所述流動(dòng)分配器、膜和多孔支撐物進(jìn)入所述真空歧管中，d.重復(fù)步驟(b和c)一次或多次。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使洗液或含有試劑的液體通過印跡膜的方法，所述印跡膜含有一種或多種生物實(shí)體，其中至少一種實(shí)體是待檢測的，其中所述方法包括a.提供真空歧管、位于所述真空歧管上的多孔支撐物、流動(dòng)分配器、及位于所述流動(dòng)分配器頂部之上的一個(gè)或多個(gè)孔，b.將所述含有一種或多種生物實(shí)體的一個(gè)或多個(gè)印跡膜放置于所述多孔支撐物上；c.將所述流動(dòng)分配器放置在所述印跡膜上，d.將液體加入所述流動(dòng)分配器的所述孔中，然后施加真空，使所述液體通過所述流動(dòng)分配器、印跡膜和多孔支撐物進(jìn)入所述歧管中。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使洗液或含有試劑的液體通過一個(gè)或多個(gè)印跡膜的方法，所述印跡膜含有一種或多種生物實(shí)體，其中至少一種實(shí)體是待檢測的，其中所述方法包括a.提供歧管、位于所述歧管上的多孔支撐物、流動(dòng)分配器、及位于所述流動(dòng)分配器頂部之上的一個(gè)或多個(gè)孔，b.將所述含有一種或多種生物實(shí)體的一個(gè)或多個(gè)印跡膜放置于所述多孔支撐物上；c.將所述流動(dòng)分配器放置在所述印跡膜上，d.將液體加入所述流動(dòng)分配器的所述孔中，向所述流動(dòng)分配器施加正壓，使所述液體通過所述流動(dòng)分配器、印跡膜和多孔支撐物進(jìn)入所述歧管中。


附圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的裝置的第一實(shí)施例的橫截面圖。
附圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的裝置的第二實(shí)施例的橫截面圖。
附圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的裝置的第三實(shí)施例的橫截面圖。
附圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的裝置的第四實(shí)施例的橫截面圖。
附圖5A-5C顯示了根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施例的框圖。
附圖6顯示了根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)和本發(fā)明的經(jīng)處理的印跡例子的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
為了完成本發(fā)明，采用了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)裝置。如附圖1所示，裝置2包括多孔支撐物4。優(yōu)選地，所述支撐物具有設(shè)計(jì)安裝在歧管8(以下描述)內(nèi)或之上的邊緣6或安裝部件。將一層或多層印跡膜10放于支撐物4頂部上。然后將流動(dòng)分配器12放置或安裝在印跡膜10上。如果需要，所述流動(dòng)分配器可以具有一個(gè)或多個(gè)連接在流動(dòng)分配器12之頂表面16上的孔14(在該實(shí)施例中顯示一個(gè))，或者其可以為簡單地連接或放置在流動(dòng)分配器12頂部上的獨(dú)立部件(未顯示)。
如附圖1所示，該實(shí)施例中的歧管8為真空歧管，具有連接至真空源20的端口18。另外，也可以采用正壓(以下進(jìn)一步描述)以代替真空驅(qū)動(dòng)過濾/洗滌過程。端口18位于多孔支撐物4的下方。廢物收集裝置22在該例中為一容器，安裝在歧管下方，或者如果需要安裝在歧管中(未示出)，以收集通過裝置2的液體。另外，該廢物收集裝置可以為廢物排放管或其他本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉的類似裝置。
流動(dòng)分配器12為一多孔結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施例中(所顯示的)，其整個(gè)結(jié)構(gòu)是多孔的。在附圖2所示的另一實(shí)施例中，流動(dòng)分配器12A僅僅在孔14內(nèi)的區(qū)域24中為多孔的。可以通過以下方式在分配器12上提供無孔的區(qū)域17在區(qū)域17的孔中填充無孔材料，例如塑料或膠水，或通過加熱和/或加壓和/或本領(lǐng)域公知的溶劑使區(qū)域17中的孔塌陷，或形成與孔14的外部大小相匹配的分配器12，并沿著外部尺寸將分配器12不透液體地密封在孔14的底部。
流動(dòng)分配器12可以是任意的多孔結(jié)構(gòu)，使液體在其表面上均勻地分布，而且其足夠多孔從而允許在真空的影響下易于移動(dòng)，其還能夠從液體中濾出附聚物、顆粒和其它碎片。
所述流動(dòng)分配器可以具有任意所需的大小。凝膠的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大小為面積大約7cm×8cm至20cm×20cm。
所述材料包括但不限于紡織、無紡以及纖維多孔過濾器，例如TYVEK或TYPAR紙，纖維素材料，例如來自馬薩諸塞州Billerica的Millipore公司的MILISTAK+過濾器，膜，例如微孔膜、燒結(jié)膜，例如POREX過濾器等。優(yōu)選的是膜，尤其是塑料微孔膜。
所述膜的優(yōu)選孔徑為大約0.1至大約0.65微米，優(yōu)選0.2至大約0.45微米，最優(yōu)選為大約0.22微米。
此外，所述優(yōu)選的過濾器或膜對使用的試劑具有低結(jié)合特性，其目的是使使用量降至最低。更優(yōu)選的是，由于其通常與生物材料一起使用，其是親水的，并具有低蛋白結(jié)合特性。一種所述分配器為由PVDF構(gòu)成的、來自馬薩諸塞州Billerica的Millipore公司的親水DURAPORE膜。另一種是來自馬薩諸塞州Billerica的Millipore公司的Millipore EXPRESS親水PES膜。
所述多孔支撐物4可以是簡單的篩子、格柵或燒結(jié)的多孔結(jié)構(gòu)，例如POREX膜，或粗孔或大孔微孔過濾器，例如無紡紙、聚丙烯或聚乙烯布或1-10微米的微孔過濾器。所述支撐物可以由聚合物、陶瓷或包括但不限于金屬的金屬材料構(gòu)成，例如不銹鋼、鋼、鋼合金、鋁等，所述聚合物例如聚乙烯、聚丙烯、聚砜、苯乙烯、尼龍等。
附圖3顯示了采用標(biāo)準(zhǔn)真空歧管30的實(shí)施例。在該例中，所述歧管具有多孔支撐結(jié)構(gòu)32，例如塑料或金屬格柵或多孔的燒結(jié)塑料片或金屬片或其他真空領(lǐng)域公知的類似裝置。所述印跡膜34也放置于支撐物32的頂部上，被上述附圖1和2之實(shí)施例中描述的流動(dòng)分配器36和孔結(jié)構(gòu)38覆蓋。
附圖4顯示了可以用于本發(fā)明中的正壓系統(tǒng)。在該實(shí)施方案中，與附圖1-3中相同的元件采用相同的附圖標(biāo)記。
如附圖4中所示，裝置2A包括多孔支撐物4。優(yōu)選地，所述支撐物形成有設(shè)計(jì)配合入歧管8之內(nèi)或之上的邊緣6或安裝部件。一層或多層印跡膜10(顯示一個(gè))位于支撐物4的頂部上。然后將流動(dòng)分配器12放置或安裝在印跡膜10的頂部上。所述流動(dòng)分配器可以具有一個(gè)或多個(gè)連接在流動(dòng)分配器12頂表面16的孔14(在該實(shí)施例中顯示一個(gè))，或者其可以為簡單地連接或放置在流動(dòng)分配器12頂部上的獨(dú)立部件(未顯示)。一正壓歧管或覆蓋物13位于孔14和/或流動(dòng)分配器12上，優(yōu)選可拆卸地固定在孔14和/或流動(dòng)分配器12上。所述正壓歧管13具有通過管17與正壓源連接的端口15。正壓可以來自泵、高壓氣體源(罐、筒等)、以及實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)上公知的其他來源。
如附圖4中所示，歧管8簡單地為一收集歧管，其具有可以用于排出過多壓力的端口18。如果需要，其可以含有空氣過濾器，以防止污染物的進(jìn)入。所述端口18位于多孔支撐物4之下。廢物收集裝置22，在該例中為容器，位于歧管下方，或者如果需要，位于歧管內(nèi)(未示出)以收集通過裝置2的液體?；蛘?，所述廢物收集裝置可以為廢物排放管或者本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉的其它類似裝置。
在本發(fā)明中可以采用不同的方法。關(guān)鍵因素在于它們均依賴于真空或正壓驅(qū)動(dòng)的液體過濾，而不是過去的靜態(tài)擴(kuò)散。
最簡單的方法是簡單地采用本發(fā)明以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)洗滌周期。典型地，每個(gè)洗滌周期包括一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟。通常，每周期使用2-5個(gè)步驟。
另一方法是在每個(gè)需要將液體從印跡膜中除去的步驟中采用本發(fā)明，例如在孵育抗體之后或者在洗滌步驟中。
在所有這些方法中，可以采用適于將液體從裝置中除去并進(jìn)入歧管的任意壓力。根據(jù)選擇用于印跡的膜和流動(dòng)分配器、采用的歧管、需要的過濾速度以及可以提供給研究者的真空源或正壓源，所述壓力可以改變。
通常，可用的真空可以為100至760mmHg(133毫巴和1013毫巴)?？梢圆捎瞄y、壓力限制器等使真空保持在所采用膜的允許范圍內(nèi)。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的優(yōu)選真空歧管為STERICUP裝置真空基底，采用的真空為大約100mmHg。其它適當(dāng)?shù)恼婵掌绻馨ǖ幌抻隈R薩諸塞州Billerica的Millipore公司的MULTISCREENTM和MULTISCREENHTS真空歧管。
通常，正壓由壓力為大約2psi至大約15psi的空氣管提供。也可以采用閥、壓力限制器等使所述壓力保持在所采用膜的允許范圍內(nèi)。所述壓力系統(tǒng)包括但不限于馬薩諸塞州Billerica的Millipore公司的Amicon攪拌單元裝置和馬薩諸塞州Hopkinton的Caliper Life Sciences的正壓過濾單元。
附圖5A-C中以框圖顯示了典型的過程。
在附圖5A中，提供一種根據(jù)本發(fā)明的裝置，步驟50中，其與真空歧管和真空源連接。步驟52中，所述印跡膜放置在該裝置的適當(dāng)位置上。優(yōu)選地，步驟52中的印跡膜預(yù)先被濕潤(未示出)。在步驟54中打開真空，并將液體例如洗液放于一個(gè)或多個(gè)孔中。在步驟56中，繼續(xù)所述真空，直至所述液體被吸取通過所述裝置，然后關(guān)閉真空。當(dāng)采用多于一個(gè)的印跡膜時(shí)，它們可以順序地位于各自的頂部，在一個(gè)處理步驟中，含有同樣的所需試劑的足量液體可以輕易地通過所述多層膜。當(dāng)采用多層時(shí)，通常優(yōu)選的是采用2至10層，更優(yōu)選的是一次采用2至5層?；蛘?，可以采用具有多個(gè)孔的流動(dòng)分配器，以及采用相互平行的多于一個(gè)的印跡膜，每個(gè)膜在流動(dòng)分配器上均具有各自的孔，每個(gè)均具有其特定目的所要求的各自一組試劑。如果需要，可以在相鄰孔中采用多層。
在附圖5B中，刪除了步驟54，在步驟58中關(guān)閉真空加入液體，并進(jìn)行孵育，例如需要與第一抗體或第二抗體孵育。然后在步驟60中打開真空。
在附圖5C中，55A和55B的步驟結(jié)合為連續(xù)步驟。可以根據(jù)需要重復(fù)任一步驟或兩個(gè)步驟，或者根據(jù)需要以不同順序?qū)嵤┻m當(dāng)?shù)奶幚怼?br> 可選地，如果希望，可以將一盤子或單個(gè)孔裝置放于膜支撐物下方，優(yōu)選位于歧管內(nèi)。然后可以收集可能比較昂貴而且可以在以后的測定中重復(fù)使用的單個(gè)未結(jié)合試劑?？蛇x地，其可以分為兩個(gè)或多個(gè)小盤。
其它方法也可以采用本發(fā)明的裝置。
盡管根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以改變抗體濃度，但是對于標(biāo)準(zhǔn)方法來說10-1000ng/mL為典型的范圍。封閉、抗體反應(yīng)以及洗滌所需的溶液體積典型地分別為0.1mL/cm2、0.03mL/cm2和1.0mL/cm2。
所述膜的孔隙中含有一種或多種待測物質(zhì)。通常，這些物質(zhì)通過電泳或色譜的固體支撐物印跡至或直接施加至孔隙中，通常用于檢測特定類型材料的存在、不存在或量，例如抗體或特定蛋白質(zhì)-即上述的Dot-Blot(點(diǎn)印跡)類型測定。雖然膜的定義并不局限于這些例子，但是適用于一個(gè)或多個(gè)膜的孔隙中含有一種或多種待測物質(zhì)的情況。預(yù)想可以用于本發(fā)明的膜類型包括通常用于印跡電泳凝膠的膜，例如硝酸纖維素；尼龍；或者各種其它聚合物膜，例如聚偏氟乙烯(PVDF)，例如馬薩諸塞州Billerica的Millipore公司出售的immobilonTM膜。
可以采用大量材料以再現(xiàn)本領(lǐng)域知曉的各種樣品所得到的電泳凝膠結(jié)果。最常見的是，所述樣品含有生物物質(zhì)，例如各種蛋白質(zhì)、抗體、核酸、寡核苷酸、復(fù)雜的碳水化合物等，但是該技術(shù)的應(yīng)用并不局限于這些物質(zhì)。本發(fā)明的技術(shù)適用于其中含有待測物質(zhì)的任意膜，而不需考慮膜或靶物質(zhì)的化學(xué)組成。
當(dāng)采用代表電泳結(jié)果的復(fù)制品的膜時(shí)，可以通過對凝膠進(jìn)行電洗脫、電印跡或半干印跡，采用含有轉(zhuǎn)移緩沖液的膜將待測物質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上。轉(zhuǎn)移的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，在此處不構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
提供的液體可以含有檢測試劑或簡單地可以為洗液。當(dāng)然，檢測試劑的性質(zhì)依賴于待檢測的物質(zhì)。典型地，蛋白質(zhì)通過抗原和抗體之間的免疫反應(yīng)或者其免疫活性部分進(jìn)行檢測；典型地，核酸片段的存在通過適當(dāng)?shù)墓押塑账崽结槞z測。如果需要，與待測物質(zhì)發(fā)生即時(shí)或特異反應(yīng)的檢測物質(zhì)可以進(jìn)而配備標(biāo)記物，可能需要檢測試劑的多種應(yīng)用一例如，一方案可以包括通過提供標(biāo)記有酶的抗體來檢測抗原，所述酶例如常見的辣根過氧化物酶，然后通過提供該酶的底物來檢測所述結(jié)合。在使用試劑時(shí)，雖然不是優(yōu)選，但是可以僅僅采用正壓供體基質(zhì)以將膜的該組分暴露一指定時(shí)間階段。
最方便地是在室溫下實(shí)施本發(fā)明方法，但是也可以用于較高和較低的溫度。其可以通過加熱所述裝置或其周圍環(huán)境(例如在加熱箱或冷卻箱中)來實(shí)現(xiàn)。
在本裝置和方法中，將之前已經(jīng)結(jié)合的抗體從印跡中抽提出來，之后與抗體或其它對靶蛋白特異的探針孵育，從而順序地采用多個(gè)抗體或探針對印跡進(jìn)行分析。所述抽提過程破環(huán)了抗原-抗體之間的結(jié)合，并將抗體溶解于周圍的緩沖液中。其通常通過去污劑和熱的結(jié)合或者暴露于高pH或低pH來實(shí)現(xiàn)。所述裝置與流動(dòng)分配器結(jié)合能夠采用高pH或低pH法來抽提印跡。接下來的直接或存儲(chǔ)后對印跡的再檢測可以采用與初始檢測相同的方案。適當(dāng)?shù)挠糜诔樘嵊≯E的試劑盒有來自Chemicon Intemational Inc的商品名為ReBlot Plus試劑盒(目錄號(hào)#2500)、Re-Blot Plus-Mild溶液(目錄號(hào)#2502)以及Re-Blot Plus-Strong溶液(目錄號(hào)#2504)。
在標(biāo)準(zhǔn)的western印跡中，抗原或靶轉(zhuǎn)移至一個(gè)或多個(gè)膜支撐物上，并且用適當(dāng)?shù)奶结樔缈贵w、蛋白質(zhì)(例如蛋白A)或凝集素(與碳水化合物部分結(jié)合的蛋白或糖蛋白)進(jìn)行檢測。在某些應(yīng)用中，采用反向模式(例如反向陣列)，其中將抗體或其它探針點(diǎn)樣于一個(gè)或多個(gè)膜上或者其它支撐物(典型地以陣列形式)上，將抗原或靶呈遞于固定在陣列上的抗體。可以通過標(biāo)記抗原或靶或者采用靶特異性的第二抗體來視覺觀察靶-探針結(jié)合的發(fā)生。反向陣列通常采用靶的混合物，例如標(biāo)記有不同熒光顏色基團(tuán)的溶解產(chǎn)物，從而能夠平行處理。反向測定也可以用于本發(fā)明。
實(shí)施例制備附圖1的裝置，其中采用STERICUP裝置(獲自馬薩諸塞州Billeria的Millipore公司)的基底作為真空歧管，Porex的多孔塑料片作為多孔支撐物，0.22微米孔徑的Durapore親水膜(GVPP)作為流動(dòng)分配器，以及聚苯乙烯條孔(典型地，比膜的尺寸大4mm，例如，相對于72mm×82mm為76mm(L)×86mm(W)×25mm(H))，將所述條彎成90°以形成四個(gè)角，采用Loctite的3211光固粘結(jié)劑，將條的端部相互密封起來，從而形成所述孔。采用所述Loctite的3211光固粘結(jié)劑將所述孔粘貼至膜表面。
通過真空端口將上述基底連接至帶閥的真空管線。
將預(yù)先濕潤(在100％甲醇中預(yù)濕，然后在水預(yù)濕)的、含有小牛肝臟溶解樣品的印跡膜(馬薩諸塞州Billeria的Millipore公司的IMMOBILIONTMWestem印跡膜)放置于基底上，除去基底和膜之間的所有汽泡。將流動(dòng)分配器放置在印跡膜的頂部上。除去基底和膜之間的所有汽泡。施加100mmHg的真空，然后向孔中加入10ml封閉液(TBS-T(Tris緩沖鹽和Tween-20表面活性劑20mMTris-Cl，PH7.6，0.8％氯化鈉，0.1％Tween-20表面活性劑)中的1％酪蛋白)。然后關(guān)閉真空。將1ml經(jīng)稀釋的兔抗-ERK第一抗體(用TBS-T中的1％酪蛋白以1∶2000稀釋)加入孔中，在沒有真空的條件下孵育10分鐘。施加100mmHg的真空以過濾剩余的抗體液體。真空下加入30ml TBS-T洗液，并過濾(直至干燥)。在真空下順序加入洗液三次，每次30ml TBS-T洗液，并過濾。然后關(guān)閉真空，將1ml經(jīng)稀釋的第二抗體(結(jié)合堿性磷酸酶的羊抗兔IgG抗體)(用TBS-T中的1％酪蛋白以1∶1000稀釋)加入孔中，并在沒有真空的條件下孵育10分鐘。然后施加100mmHg的真空使剩余的第二抗體液體過濾通過流動(dòng)分配器。在真空下順序加入洗液四次，每次30ml TBS-T洗液，并過濾，然后關(guān)閉真空。將底物(ImmobilonTMWestemAP試劑)加入孔中并進(jìn)行檢測。將膜暴露于X射線膠片1分鐘，用膠片顯影劑處理所述膠片。
在3小時(shí)以上的時(shí)間內(nèi)實(shí)施比較例，其中采用傳統(tǒng)的方法，以及相同類型的膜、蛋白(ERK)和試劑。
1.用1％酪蛋白/TBS-T封閉膜一小時(shí)(0.1mL/cm2膜)；2.加入抗ERK抗體(用TBS-T中的1％酪蛋白以1∶10000稀釋)，孵育1小時(shí)(0.1mL/cm2膜)；3.在5分鐘內(nèi)用TBS-T洗滌四次(1.0mL/cm2膜)；4.加入第二抗體(抗兔IgG-堿生磷酸酶綴合物，經(jīng)TBS-T中的1％酪蛋白以1∶5000稀釋)，孵育1小時(shí)(0.1mL/cm2膜)；5.在5分鐘內(nèi)用TBS-T洗滌四次(1.0mL/cm2膜)；6.加入ImmobilonTMWesternAP試劑，孵育5分鐘(0.05mL/cm2膜)；7.暴露于X線膠片1分鐘，然后顯影。
附圖6顯示了比較例和根據(jù)本發(fā)明裝置和方法的實(shí)施例。該圖顯示了在僅僅30分鐘內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的檢測。另外，與傳統(tǒng)方法相比，在本發(fā)明的方法中所使用的抗體量減少了一半，而傳統(tǒng)例子的十分之一體積的濃度增加了5倍。其不僅使研究者能夠進(jìn)行更多的試驗(yàn)，同時(shí)還減少了試劑用量，并得到了高質(zhì)量的結(jié)果。而且與傳統(tǒng)方法相比，背景噪音顯著減少。
權(quán)利要求
1.一種進(jìn)行免疫測定的裝置，包括多孔支撐物、位于所述多孔支撐物頂部上的流動(dòng)分配器、以及位于所述流動(dòng)分配器上的一個(gè)或多個(gè)試劑孔。
2.一種進(jìn)行真空輔助免疫測定的裝置，包括真空歧管、多孔支撐物、位于所述多孔支撐物頂部上的流動(dòng)分配器、以及位于所述流動(dòng)分配器頂部上的一個(gè)或多個(gè)試劑孔。
3.一種進(jìn)行真空輔助免疫測定的裝置，包括多孔支撐物，含有一種或多種待測定生物實(shí)體的一個(gè)或多個(gè)膜，所述一個(gè)或多個(gè)膜位于所述多孔支撐物的頂部上，還包括位于所述一個(gè)或多個(gè)膜頂部上的流動(dòng)分配器，以及位于所述流動(dòng)分配器頂部上的一個(gè)或多個(gè)試劑孔。
4.一種進(jìn)行壓力輔助免疫測定的裝置，包括收集歧管，多孔支撐物，含有一種或多種待測定生物實(shí)體的一個(gè)或多個(gè)膜，所述一個(gè)或多個(gè)膜位于所述多孔支撐物的頂部上，還包括位于所述一個(gè)或多個(gè)膜頂部上的流動(dòng)分配器，位于所述流動(dòng)分配器頂部上的一個(gè)或多個(gè)試劑孔，可拆卸地密封在所述一個(gè)或多個(gè)試劑孔頂部上的壓力蓋，所述蓋具有通向其內(nèi)部的進(jìn)口，所述進(jìn)口與正氣壓源連接。
5.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述流動(dòng)分配器和所述一個(gè)或多個(gè)試劑孔為一體單元。
6.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述流動(dòng)分配器為一膜，而所述流動(dòng)分配器和一個(gè)或多個(gè)試劑孔為一體單元。
7.一種進(jìn)行真空輔助免疫測定的方法，包括以下步驟a.提供一真空歧管，位于該真空歧管上的多孔支撐物，位于所述多孔支撐物上含有一種或多種待測生物實(shí)體的一個(gè)或多個(gè)膜，位于所述一個(gè)或多個(gè)膜頂部上的流動(dòng)分配器，以及位于流動(dòng)分配器頂部上的一個(gè)或多個(gè)孔，b.將一種或多種試劑加入所述一個(gè)或多個(gè)孔中，然后施加真空，從而使試劑進(jìn)入所述一個(gè)或多個(gè)膜，以及c.將一種或多種洗劑加入所述一個(gè)或多個(gè)孔中，然后施加真空，從而使所述洗劑和任何未結(jié)合的試劑通過所述流動(dòng)分配器、一個(gè)或多個(gè)膜以及多孔支撐物，進(jìn)入所述真空歧管。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中重復(fù)步驟(b)和(c)一次或多次。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，進(jìn)一步包括檢測所述一種或多種生物實(shí)體的步驟(d)。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，進(jìn)一步包括通過選自放射機(jī)構(gòu)和比色機(jī)構(gòu)的檢測裝置檢測所述一種或多種生物實(shí)體的步驟(d)。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟(b)中的試劑為抗體，在不施加真空的情況下，其在所述一個(gè)或多個(gè)印跡膜上/其內(nèi)孵育一段時(shí)間。
12.一種使洗液或含有試劑的液體由含有一種或多種生物實(shí)體的一個(gè)或多個(gè)印跡膜中通過的方法，所述一種或多種生物實(shí)體中的至少一種是待檢測的，其中所述方法包括a.提供真空歧管，位于所述真空歧管上的多孔支撐物，流動(dòng)分配器，位于所述流動(dòng)分配器上的一個(gè)或多個(gè)孔，b.將所述含有一種或多種生物實(shí)體的一個(gè)或多個(gè)印跡膜放于所述多孔支撐物上，c.將所述流動(dòng)分配器放于所述一個(gè)或多個(gè)印跡膜的頂部上，向所述流動(dòng)分配器的孔中加入液體，以及d.施加真空，從而吸取所述液體通過所述一個(gè)或多個(gè)印跡膜。
13.一種使洗液或含有試劑的液體通過含有一種或多種生物實(shí)體的印跡膜的方法，所述一種或多種生物實(shí)體中的至少一種是待檢測的，其中所述方法包括a.提供一裝置，所述裝置包括收集歧管、多孔支撐物、位于所述多孔支撐物頂部上的流動(dòng)分配器、位于所述流動(dòng)分配器頂部上的一個(gè)或多個(gè)孔、可拆卸地連接至所述一個(gè)或多個(gè)孔上的壓力蓋，所述蓋具有通向其內(nèi)部的進(jìn)口，所述進(jìn)口與正氣壓源連接，b.將所述含有一種或多種生物實(shí)體的一層或多層印跡膜放于所述多孔支撐物上，c.將所述流動(dòng)分配器放于所述一層或多層印跡膜的頂部上，向所述流動(dòng)分配器的一個(gè)或多個(gè)孔中加入液體，以及d.通過所述進(jìn)口向所述蓋施加正壓，從而使所述液體從所述孔經(jīng)所述一層或多層印跡膜進(jìn)入所述歧管中。
14.如權(quán)利要求1所述的裝置，進(jìn)一步包括位于夾持器下方用于回收試劑的收集盤。
15.如權(quán)利要求1所述的裝置，進(jìn)一步包括位于夾持器下方用于回收試劑的收集盤，其中所述盤分為兩個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立的小盤。
全文摘要
本發(fā)明提供一種快速、有效、方便地檢測位于印跡膜上的一種或多種生物實(shí)體的方法。本發(fā)明的方法涉及壓力輔助的方法以提供和除去試劑，并允許用極少體積的液體將污染物從膜上的待測物質(zhì)中洗去。在另一方面，本發(fā)明提供一種用于實(shí)施本發(fā)明方法的裝置，其包括若干層，包括位于印跡膜下方的多孔支撐物，位于印跡膜上方的流動(dòng)分配器，以及位于流動(dòng)分配器上使液體至所希望區(qū)域的孔，并允許使用較少起始體積的所述液體。優(yōu)選地，所述流動(dòng)分配器為非結(jié)合或低結(jié)合的親水多孔膜，例如0.22微米的膜。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1979163SQ20061006477
公開日2007年6月13日 申請日期2006年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者馬淵雅治, 木村廣子, 馬克·埃梅里克, 菲利普·克拉克, 庫爾特·格里尼茲恩 申請人:米利波爾公司