專利名稱：一種用于快速鑒定蛋白質(zhì)及其n端序列的新方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的測序方法。具體的說，涉及蛋白質(zhì)N端序列的質(zhì)譜測定方法。本發(fā)明還涉及用于該方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
眾所周知，蛋白質(zhì)的N端測序?qū)Φ鞍踪|(zhì)的鑒定及功能分析都非常重要。一方面，蛋白質(zhì)的N端序列標簽具有很高的特異性。據(jù)統(tǒng)計，43％至83％的蛋白質(zhì)具有獨特的N端4殘基標簽(依物種而異)[Wilkins，M.R.，Gasteiger，E.，Tonella，L.，Ou，K.et al，J.Mol.Biol.1998，278，599-608.]。另一方面，蛋白質(zhì)的N端序列有助于確證蛋白質(zhì)的N端加工，如信號肽的去除、N端蛋氨酸殘基的切除等。目前，最常用的測定蛋白質(zhì)N端序列的方法是Edman降解法。雖然也可以實現(xiàn)自動化，但它對樣品的純度要求很高，很耗時，方法的通量也很低。
本發(fā)明提供了一種簡單快速、既可進行蛋白質(zhì)N端測序，又可同時對其它肽段進行分析以鑒定蛋白質(zhì)的高通量方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過在蛋白質(zhì)的N端氨基上引入同系物標記，既有利于在一級質(zhì)譜圖中確定蛋白質(zhì)的N端肽段，又有利于在二級質(zhì)譜中區(qū)分其y離子和b離子，有利于N端肽段的質(zhì)譜測序。本發(fā)明還涉及用于方便實施本方法的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種簡單有效、用于快速測定蛋白質(zhì)N端序列的新方法和試劑盒。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過在蛋白質(zhì)的N端引入同系物標記，既有利于在一級質(zhì)譜圖中確定蛋白質(zhì)的N端肽段，又有利于在二級質(zhì)譜中區(qū)分其y離子和b離子，有利于N端肽段的質(zhì)譜測序。具體的說，該方法涉及蛋白質(zhì)氨基的修飾、還原烷基化和胰酶酶切、酶切肽段的質(zhì)譜分析、N端肽段的質(zhì)譜識別與測序，步驟包括(1)對蛋白質(zhì)的側(cè)鏈氨基進行修飾，以提高修飾反應的選擇性和酶切產(chǎn)生的N端肽段的長度；(2)用一對或多對同系物酰化試劑衍生蛋白質(zhì)的N端氨基，以引入同系物標記。
(3)用還原劑打開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，破壞其高級結(jié)構(gòu)；用烷基化試劑封閉巰基，防止其重新形成二硫鍵；(4)用化學消化或酶消化法對蛋白質(zhì)進行消化，產(chǎn)生適于質(zhì)譜分析的肽段；(5)用質(zhì)譜技術(shù)確定蛋白質(zhì)N端肽段，并進行其序列分析。
其特征在于所述步驟(2)的處理方法為
(a)用酸酐類或活化羧酸酯類同系物試劑對蛋白質(zhì)的末端氨基進行化學修飾，使其帶上同系物標記；(b)用一種或多種含游離氨基的化學試劑，對蛋白質(zhì)的修飾反應進行終止。
其中，步驟(a)所述同系物試劑選自乙酸酐/丙酸酐，丁二酸酐/戊二酸酐，乙酸琥珀酰亞胺酯/丙酸琥珀酰亞胺酯，苯甲酸琥珀酰亞胺酯/甲基苯甲酸琥珀酰亞胺酯。
該方法通過在蛋白質(zhì)的N端氨基上引入同系物標記，使其N端肽在蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖中表現(xiàn)為質(zhì)量數(shù)相差14Da的一對雙峰，明顯區(qū)別于非N端肽的單峰，從而可以快速確定蛋白質(zhì)的N端肽，然后通過質(zhì)譜技術(shù)實現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定及N端測序。加在蛋白質(zhì)N端肽段上的同系物標記，既有利于在一級質(zhì)譜圖中確定N端肽，又有利于在二級質(zhì)譜圖中確定y離子和b離子從而有助于其序列分析。
利用本方法，大大提高了蛋白質(zhì)N端測序的速度和通量化水平，二級質(zhì)譜圖的質(zhì)量明顯改善，可根據(jù)二級質(zhì)譜圖對蛋白質(zhì)末端肽進行從頭測序。
本發(fā)明還提供了一種用于快速測定蛋白質(zhì)N端序列的試劑盒，該試劑盒含有(a)一對或多對可對蛋白質(zhì)N端氨基進行修飾，使其帶上質(zhì)量標記的同系物試劑對；(b)一種或多種含游離氨基的化學試劑；其中組分(a)所述試劑優(yōu)選乙酸酐/丙酸酐；組分(b)所述化學試劑優(yōu)選三羥乙基氨基甲烷或賴氨酸。
為方便使用，該試劑盒還可包含以下組分中的一種或多種用于打開蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)和三羧乙基膦(TCEP)；封閉巰基防止其重新形成二硫鍵的烷基化試劑，如碘乙酰胺和碘乙酸；蛋白質(zhì)消化劑，如胰蛋白酶；側(cè)鏈氨基保護試劑，如O-甲基異脲；此外還可含有國家行政機關(guān)批準的使用說明等。
本發(fā)明的新方法和試劑盒適用于蛋白質(zhì)的鑒定與N端序列的快速測定，適用于生物學、醫(yī)學、藥物學研究和應用領(lǐng)域中蛋白質(zhì)的鑒定和N端測序，特別適合于基因工程重組產(chǎn)品或藥物的N端序列分析及質(zhì)量控制，與二維電泳技術(shù)相結(jié)合也適用于對蛋白質(zhì)進行規(guī)?；腘端測序。
本發(fā)明的方法和試劑盒具有廣泛的實用性。用途包括但不限于在醫(yī)學、藥學、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)等領(lǐng)域進行各種動植物和微生物的蛋白質(zhì)研究。


圖1.經(jīng)N端同系物標記后，雞溶菌酶的肽質(zhì)量指紋圖(質(zhì)荷比相差14Da的一對峰為N端肽)圖2.同系物標記后，雞溶菌酶N端肽的串聯(lián)質(zhì)譜圖(#K*VFGR，1-5)圖3.經(jīng)N端同系物標記后，重組人生長激素的肽質(zhì)量指紋圖(質(zhì)荷比相差14Da的一對峰為N端肽)圖4.同系物標記后，重組人生長激素N端肽的串聯(lián)質(zhì)譜圖(#FPTIPLSR，1-8)具體實施方式
下面的實施例將對本發(fā)明作進一步的解釋，但是本發(fā)明并不僅僅局限于這些實施例，這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在權(quán)利要求的范圍內(nèi)所做出的某些改變和調(diào)整也應認為屬于本發(fā)明的范圍。
實施例1雞溶菌酶的N端測序1.1取0.1mg雞溶菌酶，溶于0.1mL 0.2M pH 8的硼酸鹽溶液(含0.1％SDS)，加入0.1mL 1M pH 12的O-甲基異脲溶液，37℃反應2小時。調(diào)pH至8后，加入20mM的乙酸酐和丙酸酐的混合溶液，室溫反應1小時，加入100mM pH 8的Tris/HCl終止反應。再加入10mM二硫蘇糖醇(DTT)，37℃反應1小時后加入2ug胰蛋白酶，37℃酶切8小時。
1.2質(zhì)譜分析在裝備了氮激光器(337nm)的4700Proteomics Analyzer質(zhì)譜儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)上進行。將樣品與基質(zhì)溶液(5mg/mLα-氰基-4-羥基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)等量混合后，取0.6uL點在樣品靶上，自然揮干后進行質(zhì)譜分析。用肽標準物進行外部質(zhì)量校準，質(zhì)量測量的準確度通常為±0.2Da。先采集一級質(zhì)譜圖，可見N端肽表現(xiàn)為質(zhì)荷比相差14Da的一對峰(690.4/704.4)，而其它肽為單峰(見圖1)。然后選擇相應肽的[M+H+]+離子作為母離子進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可觀察到質(zhì)量很好的二級質(zhì)譜圖。比較兩種標記N端肽的二級質(zhì)譜圖，可見兩種N端肽的C端碎片離子(y離子)相同，而N端碎片離子(b離子)質(zhì)荷比相差14Da(見圖2)。
實施例2不同來源的重組人生長激素的N端測序與序列比較2.1取重組人生長激素0.1mg，溶于0.1mL 0.2M pH 8的硼酸鹽溶液(含0.1％SDS)，加入0.1mL 1M pH 12的O-甲基異脲溶液，37℃反應2小時。調(diào)pH至8后，加入20mM的乙酸酐和丙酸酐的混合溶液，室溫反應1小時，加入100mM pH 8的Tris/HCl終止反應。再加入10mM二硫蘇糖醇(DTT)，37℃反應1小時后加入2ug胰蛋白酶，37℃酶切8小時。
2.2質(zhì)譜分析在裝備了氮激光器(337nm)的4700Proteomics Analyzer質(zhì)譜儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)上進行。將樣品與基質(zhì)溶液(5mg/mLα-氰基-4-羥基肉桂酸，用含0.1％TFA的50％乙腈配制)等量混合后，取0.6uL點在樣品靶上，自然揮干后進行質(zhì)譜分析。用肽標準物進行外部質(zhì)量校準，質(zhì)量測量的準確度通常為±0.2Da。先采集一級質(zhì)譜圖，可見N端肽表現(xiàn)為質(zhì)荷比相差14Da的一對峰(972.6/986.6)，而其它肽為單峰(見圖3)。然后選擇相應肽的[M+H+]+離子作為母離子進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可觀察到質(zhì)量很好的二級質(zhì)譜圖。比較兩種標記N端肽的二級質(zhì)譜圖，可見兩種N端肽的C端碎片離子(y離子)相同，而N端碎片離子(b離子)質(zhì)荷比相差14Da(見圖4)。
權(quán)利要求
1.一種用于快速測定蛋白質(zhì)N端序列的方法，該方法包括(1)對蛋白質(zhì)的氨基進行化學修飾(2)用還原劑打開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，破壞其高級結(jié)構(gòu)；用烷基化試劑封閉巰基，防止其重新形成二硫鍵；(3)用化學消化或酶消化法對蛋白質(zhì)進行消化，產(chǎn)生適于質(zhì)譜分析的肽段；(4)用質(zhì)譜分析技術(shù)分析蛋白質(zhì)末端肽段，使其裂解產(chǎn)生碎片離子的質(zhì)譜圖；其特征在于所述步驟(1)的處理方法為(a)用酸酐類或活化羧酸酯類同系物試劑對蛋白質(zhì)的末端氨基進行化學修飾，使其帶上同系物標記；(b)用一種或多種含游離氨基的化學試劑，對蛋白質(zhì)的修飾反應進行終止。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)所述同系物試劑對選自乙酸酐/丙酸酐，丁二酸酐/戊二酸酐，乙酸琥珀酰亞胺酯/丙酸琥珀酰亞胺酯，或苯甲酸琥珀酰亞胺酯/甲基苯甲酸琥珀酰亞胺酯。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(b)所述化學試劑選自三羥乙基氨基甲烷或賴氨酸。
4.一種用于快速測定蛋白質(zhì)N端序列的試劑盒，其特征在于該試劑盒含有(a)一對或多對可對蛋白質(zhì)N端氨基進行修飾，使其帶上質(zhì)量標記的同系物試劑對；(b)一種或多種含游離氨基的化學試劑；
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于(a)所述同系物試劑對選自乙酸酐/丙酸酐，丁二酸酐/戊二酸酐，乙酸琥珀酰亞胺酯/丙酸琥珀酰亞胺酯，或苯甲酸琥珀酰亞胺酯/甲基苯甲酸琥珀酰亞胺酯。
6.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于(b)所述化學試劑選自三羥乙基氨基甲烷或賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于快速測定蛋白質(zhì)N端序列的新方法和試劑盒。該方法涉及蛋白質(zhì)氨基的修飾、還原烷基化和胰酶酶切、酶切肽段的質(zhì)譜分析、N端肽段的質(zhì)譜識別與測序。通過對N端氨基的選擇性同系物標記，在質(zhì)譜上既容易確定N端肽段，又可以很方便地進行測序，主要用于確證蛋白質(zhì)，尤其是基因工程產(chǎn)品的N端序列。本發(fā)明還描述了便于該方法實施的試劑盒。
文檔編號G01N1/28GK101055267SQ20061007259
公開日2007年10月17日 申請日期2006年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
發(fā)明者錢小紅, 周春喜, 劉新, 張養(yǎng)軍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所