專利名稱：一種檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)布魯氏菌的試紙，特別涉及一種檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙，還涉及其制備方法。
背景技術(shù)：
布魯氏病是一種人畜共患的傳染病，它廣泛地分布在世界各地。目前已發(fā)現(xiàn)布魯氏菌屬(Brucella)有6個(gè)種，包括馬爾他布魯氏菌(Br.Militensis)、流產(chǎn)布魯氏菌(Br.abotus)、豬布魯氏菌(Br.suis)、羊布魯氏菌(Br.ovis)、木鼠布魯氏菌(Br.neotomae)和狗布魯氏菌(Br.canis)，其中馬爾他布魯氏菌、流產(chǎn)布魯氏菌、豬布魯氏菌和羊布魯氏菌對(duì)人致病。布魯氏菌(Brucella spp)是革蘭氏陰性短桿菌或球桿菌，營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，生長(zhǎng)緩慢，初次分離培養(yǎng)需要7天甚至更長(zhǎng)時(shí)間才可長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)菌落。脂多糖抗原是布魯氏菌的表面抗原，也是布魯氏菌屬中不同種布魯氏菌的共同抗原。
1943年美國(guó)開(kāi)始研究進(jìn)攻性生物戰(zhàn)劑，并在Camp Detrick進(jìn)行戰(zhàn)劑的生產(chǎn)，首次研究并生產(chǎn)的生物戰(zhàn)劑的種類包括炭疽桿菌、鼠疫菌、土拉熱菌、豬布魯氏菌、霍亂弧菌、傷寒沙門菌、Q熱立克次體、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、肉毒毒素和B型葡萄球菌腸毒素等。1954年美國(guó)在新建的Pine Bluff兵工廠中第一個(gè)武器化的生物戰(zhàn)劑即是布魯氏菌。迄今為止，布魯氏菌仍作為經(jīng)典的生物戰(zhàn)劑，被列入《國(guó)際禁止生物武器公約》生物戰(zhàn)劑清單?！?.11”恐怖事件以后，布魯氏菌在美國(guó)國(guó)家反恐預(yù)案中又被列為可引起生物恐怖的烈性病原微生物。
布魯氏菌可通過(guò)氣溶膠高度傳染，10～100個(gè)菌足以使人發(fā)病。因此，布魯氏菌快速檢測(cè)新技術(shù)的研究是防生物戰(zhàn)和反生物恐怖襲擊的需要。
由于布魯氏菌生長(zhǎng)緩慢，在應(yīng)對(duì)由布魯氏菌引起的生物危害突發(fā)事件中，病原體的快速檢測(cè)顯得尤為重要。布魯氏菌的快速檢測(cè)主要包括特異性抗原的檢測(cè)和特異性核酸片段的檢測(cè)，抗原檢測(cè)常用的是免疫熒光試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，核酸檢測(cè)常用的是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，這些方法的使用已有許多文獻(xiàn)報(bào)道[Hamdy ME，Amin AS.Detection of Brucella species in the milk of1nfected cattle，sheep，goats and camels by PCR.Vet J 2002，163(3)299-305；Morata P，Queipo-Ortuno MI.Development and evaluationof a PCR-enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of humanbrucellosis.J Clin Microbiol 2003，41(1)144-148]。
但是在實(shí)踐中，這些方法的使用暴露出一些共同的劣勢(shì)，例如實(shí)驗(yàn)必須在專門的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行；需要電源和特殊的儀器；操作人員必須經(jīng)過(guò)專門培訓(xùn)；試劑需要冷藏；實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)不容易標(biāo)準(zhǔn)化，為使結(jié)果可信，需要進(jìn)行多次預(yù)試驗(yàn)和設(shè)立多項(xiàng)對(duì)照；試驗(yàn)操作步驟繁瑣，至少需要2小時(shí)以上。因此，生物危害突發(fā)事件現(xiàn)場(chǎng)條件和對(duì)時(shí)間的要求使免疫熒光試驗(yàn)、ELISA和PCR等方法的使用受到限制。
到目前為止，尚未見(jiàn)到免疫膠體金技術(shù)用于檢測(cè)布魯氏菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙(Immuno-Chromatographic Assay，ICA試紙)。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙(ICA試紙)，包括樣品墊、緊密連接于所述樣品墊一端的含有布魯氏菌抗體標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜(NC膜)和緊密連接于所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線為抗布魯氏菌特異性抗體，優(yōu)選為兔抗體，所述質(zhì)控線為抗兔抗抗體。
為了使用更加方便，所述吸水墊的下面還緊密連接有背板。背板的材料可以是多種多樣的，如塑料、樹(shù)脂等。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備上述檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙的方法。
本發(fā)明所提供的制備上述檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)布魯氏菌特異性抗體可按下述方法制備皮下多點(diǎn)注射免疫福氏完全佐劑布魯氏菌菌體。每只注射2×108cfu菌/ml，共注射3次。玻片凝集試驗(yàn)檢測(cè)血清效價(jià)達(dá)到1∶1280以上采血。
將布魯氏菌特異性抗體噴到纖維膜上，包被NC膜的一個(gè)區(qū)域，得到檢測(cè)線；將抗兔抗抗體的抗抗體溶液噴到纖維膜上，包被NC膜的另一區(qū)域，得到質(zhì)控線；37℃干燥2.5-3.5小時(shí)，然后將其一端粘貼在吸水紙墊上；2)制備含有布魯氏菌特異性抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針溶液；取5～5.5ml，加入0.5～0.55g蔗糖充分溶解，將玻璃纖維或聚脂膜浸入該免疫膠體金探針溶液，-20℃～-50℃放置10-12小時(shí)，凍干機(jī)抽干即得到金標(biāo)墊，將其粘貼在步驟1)得到的纖維膜的靠近所述檢測(cè)線的一端；3)在步驟2)中的金標(biāo)墊上面再貼樣品墊，得到檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙。
為了使用更加方便，所述吸水墊的下面還粘貼背板。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙及其制備方法中，所述抗布魯氏菌特異性抗體標(biāo)記膠體金探針可由下述方法制備1)將HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入1.6ml的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，繼續(xù)加熱煮沸10-12分鐘，直到液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液，冷卻后用水恢復(fù)至原體積；2)用K2CO3或HCl調(diào)pH值為8.5-9.5，按30μg/ml加入布魯氏菌特異性抗體，攪拌25-35分鐘，配制布魯氏菌特異性抗體的免疫膠體金探針溶液。然后加入10％BSA 5ml，攪拌20-30分鐘，加1ml 10％PEG20000，攪拌20-30分鐘，20,000-23,500g離心25-35分鐘，棄上清，收集沉淀用四硼酸鈉保存液收集，得到膠體金標(biāo)探針。
所述調(diào)節(jié)pH值的K2CO3的濃度可為0.15-0.25M，優(yōu)選為0.2M；所述調(diào)節(jié)pH值HCl的濃度可為0.08-0.12mol/L，優(yōu)選為0.1mol/L。
免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)布魯氏菌的基本原理是用抗布魯氏菌表面抗原的抗體包被硝酸纖維素(NC)膜，用以捕捉標(biāo)本中的布魯氏菌或布魯氏菌抗原，然后用標(biāo)記了特異性抗體的免疫膠體金探針檢測(cè)。標(biāo)本中的布魯氏菌或布魯氏菌抗原經(jīng)過(guò)5分鐘左右的紙層析后，即出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀線。該技術(shù)與其它方法比較，優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本處理簡(jiǎn)單，不需要專門儀器和人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說(shuō)明書(shū)即可操作，并可迅速觀察結(jié)果，很適合突發(fā)事件現(xiàn)場(chǎng)和基層使用。
本發(fā)明的免疫層析試紙采用雙抗體夾心法，將抗布魯氏菌特異性抗體包被在硝酸纖維素膜上，用于捕捉標(biāo)本中的布魯氏菌抗原，然后用布魯氏特異性抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的試紙可用于臨床標(biāo)本、污染物和環(huán)境中布魯氏菌的檢出，也可用于純培養(yǎng)布魯氏菌的鑒定。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本處理簡(jiǎn)單，不需要專門儀器和人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說(shuō)明書(shū)即可操作，并可迅速觀察結(jié)果，很適合突發(fā)事件現(xiàn)場(chǎng)和基層使用。


圖1為布魯氏菌免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。免疫層析試紙由吸水墊4、硝酸纖維膜3、金標(biāo)墊2和玻璃纖維膜樣品墊1四部分組成；硝酸纖維膜3上包被有檢測(cè)線5和質(zhì)控線6。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一、檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙的制備1主要材料氯金酸(HAuCl4)，購(gòu)自Sigma公司，1g/瓶包裝。
硝酸纖維膜(NC膜)、樣品墊和吸水濾紙，購(gòu)自Millipore公司。
塑料背板，北京燕華公司。
流產(chǎn)(牛)布魯氏菌株(保藏號(hào)210105)，引自北京生物制品檢定所現(xiàn)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院全軍微生物檢驗(yàn)研究中心菌種庫(kù)保藏。
2方法下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
2.1布魯氏菌特異性抗體的制備2.1.1布魯氏菌抗原的制備流產(chǎn)(牛)布魯氏菌(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所菌種庫(kù)保臧，保藏號(hào)210105)接種在胰酶大豆血瓊脂(5％羊血)平板上，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)，觀察平板上菌落形態(tài)，挑取典型的單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)種胰酶大豆血瓊脂斜面，37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)48-50小時(shí)。將培養(yǎng)的斜面用無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔，收集菌液，沸水浴10-15分鐘，冷卻至室溫，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)菌濃度為2×108cfu菌/ml，即為布魯氏菌菌體抗原，4℃保存。
2.1.2布魯氏菌特異性抗體的制備選用體重2kg健康雌性大耳白家兔(購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)，皮下多點(diǎn)注射免疫福氏完全佐劑布魯氏菌菌體抗原2×108cfu菌/1ml/只，分別于初次免疫后的第20日、第30日、第40日追加免疫水劑1針，追加劑量和途徑與初次相同，末次免疫后10天試血，玻片凝集試驗(yàn)檢測(cè)血清效價(jià)達(dá)到1∶1280以上采血。
采用常規(guī)的飽和硫酸銨鹽析法，33％飽和硫酸銨鹽析2次，透析脫鹽后收集抗體。
3制備免疫膠體金探針3.1制備膠體金溶液采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，具體方法為將HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸騰，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入1.6ml的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，即得到膠體金溶液。冷卻后用蒸餾水恢復(fù)至原體積，制成顆粒直徑為25nm的膠體金顆粒。
3.2確定膠體金偶聯(lián)抗體飽和濃度用0.2M K2CO3或0.1M HCl調(diào)節(jié)膠體金溶液pH8.5-9.5，準(zhǔn)備5支潔凈試管，分別加入1ml膠體金溶液。將經(jīng)純化的抗布魯氏菌特異性抗體稀釋為1mg/ml，分別向4支試管中加入10μl、15μl、25μl、35μl，另一支為對(duì)照，混勻后于室溫下放置5分鐘，加入10％NaCl水溶液，混勻，靜置10-20分鐘后觀察液體顏色。膠體金溶液顏色不變時(shí)所含最少抗體量，即為穩(wěn)定1ml膠體金所需抗體的最適濃度，以此為基礎(chǔ)增加20％抗體量，即為膠體金偶聯(lián)抗體飽和濃度。結(jié)果表明維持膠體金溶液顏色不變的抗體量為25μl，即25μg/ml，選擇偶聯(lián)抗體濃度為30μg/ml。
3.3金標(biāo)墊2的制備按上述方法配制含有濃度為30μg/mL的抗布魯氏菌特異性抗體的免疫膠體金探針溶液50ml，攪拌25-35分鐘，加10％BSA 5ml，攪拌20-30分鐘，加1ml 10％PEG20000，攪拌20-30分鐘，20,000～23,500g離心25-30分鐘，棄上清，沉淀用四硼酸鈉洗滌一次后用四硼酸鈉保存液收集沉淀5ml。取金標(biāo)探針5ml加入0.5g蔗糖，充分溶解均勻加在玻璃纖維膜上，-20℃～-50℃放置10-12小時(shí)，凍干機(jī)抽干，得到金標(biāo)墊2。
4、布魯氏菌快速檢測(cè)試紙的制備如圖1所示，檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙由吸水墊4、硝酸纖維膜3、金標(biāo)墊2和玻璃纖維膜樣品墊1四部分組成；硝酸纖維膜3上包被有檢測(cè)線5和質(zhì)控線6。
4.1NC膜3的包被
用0.01M pH7.2PB緩沖液(NaH2PO4.2H2O 0.39g，Na2HPO41.07g，去離子水1000ml)稀釋抗布魯氏菌特異性抗體，濃度為4mg/ml，用于包被檢測(cè)線。用0.01M pH 7.2的PBS(NaH2PO4.2H2O 0.39g，Na2HPO41.07g，NaCl 8.5g，去離子水1000ml)稀釋抗兔抗抗體，濃度為4mg/ml，用于包被質(zhì)控線。用BIODOT公司XYZ3000噴膜機(jī)分別噴于2.5mm厚硝酸纖維素膜上，形成相互分離的檢測(cè)線5和質(zhì)控線6，37℃干燥2.5-3.5h。
4.2布魯氏菌快速檢測(cè)試紙的制備將吸水墊4用雙面膠粘貼在包被的硝酸纖維膜3的一端；將包被的NC膜3用雙面膠粘貼在步驟2中制備的金標(biāo)墊2的一端；在金標(biāo)墊2上用雙面膠粘貼玻璃纖維膜樣品墊1；再最后將它們用雙面膠粘貼在塑料背板上，按所需大小切割，即為檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙，加干燥劑后密封保存。
5檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試劑盒的制備為了方便使用，將步驟3制備的布魯氏菌快速檢測(cè)的免疫層析試紙的下面再緊密連接一塑料背板，再將該帶有背板的試紙裝入試劑盒中，加干燥劑后密封保存。該試劑盒對(duì)應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有點(diǎn)樣口，對(duì)應(yīng)于對(duì)照帶和測(cè)試帶的部位設(shè)有觀測(cè)窗。
6布魯氏菌快速檢測(cè)試紙的使用方法和原理測(cè)定時(shí)將試紙條樣品墊1浸入液體標(biāo)本中，樣品墊1即吸取液體向上端移動(dòng)，流經(jīng)金標(biāo)墊2時(shí)使干片上的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動(dòng)其向硝酸纖維膜3滲移。若標(biāo)本中有待測(cè)特異抗原，其可與免疫金復(fù)合物的抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至檢測(cè)線5即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條。過(guò)剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至質(zhì)控線6與固相抗兔抗抗體結(jié)合，而顯出紅色質(zhì)控線條。反之，陰性標(biāo)本則無(wú)反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。
實(shí)施例二、布魯氏菌的檢測(cè)及與其它相關(guān)細(xì)菌的交叉試驗(yàn)1布魯氏菌的檢測(cè)1.1由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所微生物檢驗(yàn)研究中心提供、濃度為1×106cfu/ml的3株布魯氏菌，包括牛布魯氏菌210105株、羊布魯氏菌210301株和豬布魯氏菌210401株，菌懸液作為樣品檢測(cè)液備用。
1.2經(jīng)實(shí)施例一制備的包被布魯氏菌特異性抗體和抗兔抗抗體的免疫層析試紙檢測(cè)均為陽(yáng)性結(jié)果。
2其他相關(guān)細(xì)菌的交叉試驗(yàn)2.1由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所微生物檢驗(yàn)研究中心提供、濃度為1×108cfu/ml的土拉熱菌410062株和鼠疫菌410050株，菌懸液作為樣品檢測(cè)液備用。
2.2經(jīng)實(shí)施例1制備的包被布魯氏菌特異性抗體和抗兔抗抗體的免疫層析試紙檢測(cè)均為陰性結(jié)果。
實(shí)施例三、實(shí)驗(yàn)室考核1樣品制備實(shí)驗(yàn)共使用細(xì)菌44株，其中布魯氏菌33株、鼠疫菌、土拉熱菌、假結(jié)核耶爾氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾氏菌、嗜肺軍團(tuán)菌、大腸埃希氏菌、痢疾志賀氏菌、沙門氏菌、變形桿菌、綠膿桿菌和霍亂弧菌各1株。33株布魯氏菌包括牛布魯氏菌15株、羊布魯氏菌12株、豬布魯氏菌6株。將上述細(xì)菌分別接種各自適宜的培養(yǎng)基，并在不同的條件下培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌苔后用無(wú)菌生理鹽水洗下，比濁法配制布魯氏菌菌懸液1×106cfu/ml、1×107cfu/ml和1×108cfu/ml，其它細(xì)菌菌懸液1×108cfu/ml，作為檢測(cè)液備用。
2實(shí)驗(yàn)方法取布魯氏菌抗原快速檢測(cè)試劑，分別于樣品墊上加入上述樣品檢測(cè)液3滴(約150μl)，2分鐘后開(kāi)始觀察結(jié)果，15分鐘觀察終止。結(jié)果報(bào)告質(zhì)控線處出現(xiàn)1條沉淀線為陰性，即無(wú)布魯氏菌抗原檢出；檢測(cè)線和質(zhì)控線處出現(xiàn)2條沉淀線為陽(yáng)性，即有布魯氏菌抗原檢出。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果布魯氏菌抗原快速檢測(cè)試劑實(shí)驗(yàn)室考核結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 布魯氏菌抗原快速檢測(cè)試劑(膠體金法)實(shí)驗(yàn)室考核

從表1可以看出，一種檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙可以檢出1×106cfu/ml牛、羊和豬布魯氏菌，不與1×108cfu/ml鼠疫菌、土拉熱菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、嗜肺軍團(tuán)菌、大腸埃希氏菌、痢疾志賀氏菌、沙門氏菌、綠膿假單胞菌和霍亂弧菌發(fā)生交叉反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙，包括樣品墊(1)、緊密連接于所述樣品墊一端的含有布魯氏菌特異性抗體標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊(2)、與所述金標(biāo)墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜(3)和緊密連接于所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊(4)；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測(cè)線(5)和質(zhì)控線(6)，所述檢測(cè)線為布魯氏菌特異性抗體，所述質(zhì)控線為抗兔抗抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙，其特征在于布魯氏菌特異性抗體優(yōu)選為兔抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙，其特征在于所述質(zhì)控線為抗兔抗抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙，其特征在于所述樣品墊、吸水墊、金標(biāo)墊均由吸水材料制成；所述吸水墊的下面還緊密連接有背板。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙，其特征在于所述布魯氏菌特異性抗體標(biāo)記膠體金探針由下述方法制備5、一種制備檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)制備布魯氏菌特異性抗體，將布魯氏菌特異性抗體噴到纖維膜上，包被NC膜的一個(gè)區(qū)域，得到檢測(cè)線；將抗兔IgG的抗抗體溶液噴到纖維膜上，包被NC膜的另一區(qū)域，得到質(zhì)控線；37℃干燥2.5-3.5小時(shí)，然后將其一端粘貼在吸水紙墊上；2)制備膠體金標(biāo)探針，將HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸，攪動(dòng)下加入1.6ml的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱煮沸10-12分鐘，冷卻后用水恢復(fù)至原體積，用K2CO3調(diào)pH值為8.5-9.5，按30ug/ml加入布魯氏菌特異性抗體，攪拌25-35分鐘，然后加入10％BSA5ml，攪拌20-30分鐘，加1ml 10％PEG20000，攪拌20-30分鐘，20,000g-23,500g離心25-35分鐘，吸出上清，沉淀用四硼酸鈉保存液收集，得到膠體金標(biāo)探針。3)制備含有布魯氏菌特異性抗體標(biāo)記免疫膠體金探針溶液；取5-5.5ml，加入0.5-0.55g蔗糖充分溶解，將玻璃纖維或聚脂膜浸入該免疫膠體金探針溶液，-20℃～-50℃放置10-12小時(shí)，凍干機(jī)抽干即得到金標(biāo)墊，將其粘貼在步驟1)得到的纖維膜的靠近所述檢測(cè)線的一端；4)在步驟2)中的金標(biāo)墊上面再貼樣品墊，得到檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述布魯氏菌特異性抗體的濃度為4mg/ml；抗兔抗抗體的濃度為4mg/ml；所述吸水墊的下面還粘貼有背板；所述調(diào)節(jié)pH值的K2CO3的濃度為0.15-0.25M。
7.含有權(quán)利要求1-4中任一所述的檢測(cè)布魯氏菌的免疫層析試紙的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)布魯氏菌抗原的免疫層析試紙及其制備方法。該免疫層析試紙，包括樣品墊1、緊密連接于所述樣品墊一端的含有布魯氏菌特異性抗體標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊2、與所述金標(biāo)墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜(NC膜)3和緊密連接于所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊4；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測(cè)線5和質(zhì)控線6，所述檢測(cè)線為布魯氏菌特異性抗體，所述質(zhì)控線為抗兔抗抗體。本發(fā)明用于臨床標(biāo)本、污染物和環(huán)境中布魯氏菌抗原的檢出，也可用于純培養(yǎng)布魯氏菌的鑒定。
文檔編號(hào)G01N33/558GK1834652SQ20061007670
公開(kāi)日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2006年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月18日
發(fā)明者端青, 檀華, 朱虹, 何君 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所