專利名稱：單核苷酸多態(tài)性試紙條快速檢測(cè)方法及其試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸序列中單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism(SNP))的檢測(cè)方法，特別是SNP的快速檢測(cè)和分型技術(shù)領(lǐng)域的核酸快速診斷技術(shù)。更具體地說，本發(fā)明涉及利用擴(kuò)增技術(shù)、單核苷酸延伸技術(shù)和核酸試紙條檢測(cè)技術(shù)快速檢測(cè)核酸序列中的單堿基突變的方法。本發(fā)明還涉及用于上述單核苷酸多態(tài)性快速檢測(cè)和分型技術(shù)領(lǐng)域的核酸快速診斷的試紙條。本發(fā)明還涉及了在快速檢測(cè)核酸序列中單核苷酸多態(tài)性的試劑盒方面的用途。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指在基因組水平上，特定核苷酸位置上存在兩種或兩種以上不同的堿基，引起DNA序列的多態(tài)性，其中任何一種等位基因在群體中的頻率不小于1％。SNP已成為繼限制性酶切片斷長度多態(tài)(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)，短串聯(lián)重復(fù)序列(ShortTandem Repeat，STR)多態(tài)標(biāo)記后的第三代分子遺傳標(biāo)記，隨著人類基因組測(cè)序工作的完成，SNP的篩選及其檢測(cè)正成為研究者們廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)。SNP的數(shù)量十分龐大，估計(jì)人類30億堿基中約有3×106個(gè)SNP位點(diǎn)。自從發(fā)現(xiàn)SNP后，研究者們就致力于其檢測(cè)技術(shù)的研究與開發(fā)。目前用于SNP檢測(cè)的方法大多以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，與熒光、質(zhì)譜法、基因芯片或直接測(cè)序等方法結(jié)合，大規(guī)模，自動(dòng)化的檢出SNP或進(jìn)行SNP初篩，已進(jìn)入SNP檢測(cè)的高通量時(shí)代。但這些方法大都操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴、檢測(cè)時(shí)間長，而且需要大型的儀器設(shè)備為前提的檢測(cè)技術(shù)，并不適合于基層醫(yī)院和醫(yī)療條件尚不完備的地區(qū)。下面就幾種現(xiàn)有SNP檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行概述。
1限制性酶切片斷長度多態(tài)(RFLP)利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶作用于同一DNA片斷，如果存在SNP位點(diǎn)，酶切片斷的長度和數(shù)量則會(huì)出現(xiàn)差異，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果就可以判斷是否有SNP位點(diǎn)以及出現(xiàn)的堿基替換的類型。該技術(shù)應(yīng)用的前提是SNP位點(diǎn)必須含有該限制內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，這就在一定程度上限制了RFLP技術(shù)在SNP位點(diǎn)篩選和分型中的應(yīng)用。
2寡核苷酸連接分析(OLA)OLA技術(shù)是通過設(shè)計(jì)兩種能與靶序列DNA精確并列雜交的寡核苷酸來完成的。寡核苷酸雜交后，DNA連接酶可使其正常配對(duì)的相鄰堿基以共價(jià)連接，而錯(cuò)配的相鄰堿基可通過調(diào)節(jié)連接酶和NaCl濃度防止其連接。連接產(chǎn)物可以通過凝膠電泳或固相印跡雜交的方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)這些檢測(cè)結(jié)果就可以進(jìn)行SNP的分型。由于連接反應(yīng)的條件很嚴(yán)格，如連接反應(yīng)體系中鹽的濃度及連接酶和DNA的比例等，所以此種分型技術(shù)很容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，造成SNP位點(diǎn)的漏檢或錯(cuò)檢。
3基因芯片基因芯片，又稱為DNA微探針陣列(Micro-array)。雖然僅用一張芯片，就可以通過芯片上密集排列的已知序列的探針，與若干靶序列進(jìn)行互補(bǔ)匹配雜交，從而達(dá)到同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的多態(tài)性的目的。但這些產(chǎn)品價(jià)格昂貴，供貨周期長，并需要專用的儀器和設(shè)備來完成SNP的檢測(cè)，費(fèi)用高和操作復(fù)雜，目前國內(nèi)基因芯片研究生產(chǎn)中用到的試劑、耗材主要依靠進(jìn)口，這也成為基因芯片研究SNP的瓶頸。
4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitive PCR)根據(jù)熒光共振的原理，利用熒光檢測(cè)裝置檢測(cè)供試者-接受者之間的熒光變化，從而進(jìn)行SNP的分型。實(shí)時(shí)熒光PCR法不需要PCR反應(yīng)后的操作過程來進(jìn)行基因分型，在PCR完成的同時(shí)即可以得到檢測(cè)結(jié)果，將PCR污染的風(fēng)險(xiǎn)降至最低，但是其對(duì)反應(yīng)試劑及反應(yīng)條件有嚴(yán)格要求，而且需要價(jià)格昂貴的特殊的檢測(cè)裝置，如7900全自動(dòng)高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀或7700熒光PCR檢測(cè)儀。
5.變性—高壓液相色譜法(DHPLC)此法應(yīng)用高效液相色譜儀來完成。其核心部分是帶正電荷的DNA分離柱，DNA將根據(jù)其雙鏈與DNA分離柱的親和力的強(qiáng)弱而被先后洗脫下來，從而達(dá)到分離的目的。目的片斷經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在部分加熱變性的條件下，由于錯(cuò)配堿基與正常堿基不能配對(duì)，形成異源雙鏈。整個(gè)系統(tǒng)溫度被維持在接近異源雙鏈DNA片斷的Tm值，所以正常配對(duì)的DNA片斷和異源雙鏈DNA片斷在進(jìn)行液相色譜時(shí)，由于異源配對(duì)DNA片斷含有錯(cuò)配堿基，發(fā)生部分解鏈，單鏈DNA所帶負(fù)電荷比雙鏈少，所以異源雙鏈DNA先被洗脫下來。SNP的有無最終表現(xiàn)為色譜峰的峰形或數(shù)目差異。
該方法的主要優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化程度較高，速度快，適合高通量篩查；靈敏度高，尤其適于大片斷DNA分析，分辨率高達(dá)1bp1～1.5kb。其缺點(diǎn)位只能檢測(cè)出樣品有無突變，而不能測(cè)出突變類型，也不能檢測(cè)出純合突變；同時(shí)DHPLC系統(tǒng)非常精密，對(duì)試劑和環(huán)境要求較高，易產(chǎn)生誤差。
6.毛細(xì)管電泳測(cè)序分型(CE)這是現(xiàn)在檢測(cè)SNP比較準(zhǔn)確的方法之一。其主要流程是PCR擴(kuò)增目的片斷→PCR產(chǎn)物純化，回收→4種熒光標(biāo)記(dNTP)測(cè)序反應(yīng)→去除多余的引物，熒光物質(zhì)及離子→測(cè)序儀上電泳并用測(cè)序軟件分析。DNA遺傳分析儀使用4種熒光染料標(biāo)記引物，進(jìn)行堿基的DNA合成，經(jīng)電泳分離后，用激光激發(fā)獲取片斷信息，可以直接測(cè)序檢測(cè)SNP的突變類型及其位置，效率達(dá)到100％，所以對(duì)一些比較小的，外顯子相對(duì)較少的基因的SNP檢測(cè)可以直接測(cè)序。但測(cè)序檢測(cè)SNP的方法需要較多的勞力，且花費(fèi)昂貴，所以對(duì)一些較大的，外顯子較多的基因不宜用測(cè)序法直接檢測(cè)，也不適用于臨床對(duì)大量的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。
7.DNA序列分析技術(shù)1)直接測(cè)序法(Sanger測(cè)序法)如果希望大規(guī)模、準(zhǔn)確、快速發(fā)現(xiàn)SNP，Sanger測(cè)序法越來越成為主流技術(shù)。由ABI公司推出的DNA遺傳分析儀使用4種熒光染料標(biāo)記引物，取代了原來的手工測(cè)序的同位素標(biāo)記，這就使得測(cè)序和分析時(shí)間大大縮短。由于最近兩年來測(cè)序的成本日益降低，而且DNA Sanger測(cè)序能夠準(zhǔn)確、直接反應(yīng)序列的差異，所以目前國際上應(yīng)用最為廣泛的還是通過直接測(cè)序法來進(jìn)行SNP的研究。但是從操作周期來看，Sanger測(cè)序法從樣品的處理到給出報(bào)告至少需要3-4天，還是不能及時(shí)地滿足一些研究者和臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)對(duì)于時(shí)間上的需要，而且價(jià)格也比較昂貴。
2)DNA焦磷酸序列分析技術(shù)(Pyrosequencing)DNA焦磷酸序列分析技術(shù)是在底物混合物(包括APS和Luciferin)存在的情況下，由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，通過其特有的計(jì)算機(jī)軟件將發(fā)出的可見光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)峰值，然后根據(jù)峰值的大小和反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目進(jìn)行SNP的分型。Pyrosequencing是一種不依賴平板或毛細(xì)管電泳，不依賴DNA的熒光標(biāo)記/激發(fā)/檢測(cè)的DNA序列分析技術(shù)，因此相應(yīng)的儀器系統(tǒng)無須熒光分子的激發(fā)和檢測(cè)裝置，所以操作簡便，花費(fèi)比Sanger測(cè)序法要小得多。但是該方法也有它的局限性，它的讀序能力小于直接測(cè)序法，一次反應(yīng)只可以達(dá)到十幾個(gè)到幾十個(gè)堿基。
8單堿基延伸法(SBE)單堿基延伸法，又稱為微測(cè)序法(Minisequencing)，是指一個(gè)寡核苷酸探針的3’端堿基緊挨于多態(tài)性堿基，探針在合適的底物ddNTP存在的情況下，延伸一個(gè)堿基，延伸上的堿基就是多態(tài)性堿基。由于ddNTP是終止單核苷酸，延伸后的探針將不能再次延伸，因此被稱為單堿基延伸法。以這種技術(shù)為平臺(tái)，根據(jù)對(duì)延伸產(chǎn)物檢測(cè)方法不同，衍生出很多檢測(cè)SNP的方法，如單堿基延伸標(biāo)簽陣列技術(shù)(Single Base Extension-Tag，SBE-Tag)，單堿基延伸結(jié)合質(zhì)譜法(Single Base Extension-mass spectrometry，SBE-MS)，單堿基延伸結(jié)合基因芯片法等等。上述幾種SBE技術(shù)，均需要特殊的檢測(cè)儀器，而且花費(fèi)高昂，技術(shù)條件要求高，不適合于一般的實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院檢驗(yàn)室應(yīng)用。
本發(fā)明利用先進(jìn)的核酸擴(kuò)增、單核苷酸延伸和核酸試紙條快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)明的一種操作簡單、時(shí)間短、價(jià)格低廉的檢測(cè)技術(shù)?？梢詮V泛地應(yīng)用于所有與單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)相關(guān)的領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
概述隨著特定種類生物基因組的全部或部分SNP的發(fā)現(xiàn)以及一些特定SNP數(shù)據(jù)庫的建成，SNP的功能研究逐步轉(zhuǎn)為科學(xué)家們研究的重點(diǎn)。特定DNA區(qū)域的特定SNP在特定群體的序列驗(yàn)證和頻率分析以及SNP與特定生理或病理狀態(tài)關(guān)系的研究成為SNP功能研究的主要方面。但上述各種方法大都需要專門的分析儀器，不僅價(jià)格昂貴，而且操作復(fù)雜，專業(yè)性強(qiáng)，所以應(yīng)用上述技術(shù)在一般的分子和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和臨床檢驗(yàn)室進(jìn)行與SNP有關(guān)的研究和檢測(cè)受到了限制。
本發(fā)明人在我們?cè)械暮怂岜∧游隹焖贆z測(cè)方法及其試紙條專利技術(shù)(申請(qǐng)?zhí)朇N200610003429.1)的基礎(chǔ)上，結(jié)合單堿基延伸技術(shù)(SBE)發(fā)明出一種新的快速SNP檢測(cè)和分型的方法——單核苷酸多態(tài)性(SNP)試紙條快速檢測(cè)方法及其試紙條。本發(fā)明的目的在于為人們提供一種操作簡單，價(jià)格低廉和檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的對(duì)已知SNP進(jìn)行檢測(cè)和分型的方法，從而使得與SNP有關(guān)的研究工作在基層科研機(jī)構(gòu)及醫(yī)院的檢驗(yàn)科順利開展。
上述發(fā)明(申請(qǐng)?zhí)朇N200610003429.1)提供了用于核酸擴(kuò)增物檢測(cè)的試紙條，其包括在帶有不干膠的襯墊7按順序有樣品墊1、有色顆粒結(jié)合物墊2、纖維膜3和吸水濾紙墊4，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上還設(shè)有檢測(cè)線5和質(zhì)控線6，其中有色顆粒結(jié)合物墊2上的有色顆粒有抗A抗體包被，檢測(cè)線5上有抗B抗體包被，質(zhì)控線6上有抗A抗體。纖維膜通常為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
核酸擴(kuò)增物檢測(cè)試紙條的基本結(jié)構(gòu)如附

圖1所示。
因此，一方面，本發(fā)明提供核酸試紙條檢測(cè)兩種多態(tài)堿基SNP的方法，其包括1)用抗A抗體包被有色顆粒；2)用抗B抗體包被纖維膜；3)根據(jù)檢測(cè)的多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針寡核苷酸鏈，探針的3’末端位于待檢SNP位點(diǎn)的前一個(gè)堿基，探針的5’末端用抗原A標(biāo)記；4)擴(kuò)增上述步驟3)的含有待檢SNP的DNA；5)將5’末端抗原A標(biāo)記的探針與擴(kuò)增物雜交，DNA聚合酶在擴(kuò)增后的探針的3’末端用抗原B標(biāo)記的雙脫氧單核苷酸以待檢SNP為模板延伸一個(gè)堿基，此時(shí)探針已被抗原A和抗原B雙重標(biāo)記；6)在檢測(cè)時(shí)，上述步驟5)得到的探針?biāo)鶐в械目乖瑼首先與顆粒表面的抗體A結(jié)合，形成探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA的有色顆粒復(fù)合物；7)上述步驟6)得到的有色顆粒復(fù)合物在溶液中通過毛細(xì)現(xiàn)象沿纖維膜向上流動(dòng)，當(dāng)復(fù)合物遇到固定于膜上的抗體B線條時(shí)，待檢的探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA復(fù)合物與線條上的抗體B結(jié)合，形成線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA的有色顆粒復(fù)合物，有色的線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的顆粒復(fù)合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；8)在步驟5)時(shí)，如果加入帶有抗原B的雙脫氧單核苷酸(ddNTP)與模板上的單核苷酸不形成互補(bǔ)，則不能發(fā)生延伸，此時(shí)探針只帶有抗原A，則在步驟6)中形成的探針抗原A-顆粒抗體A的有色復(fù)合物將不能與膜上的抗體B檢測(cè)線結(jié)合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條。此為陰性；9)如果被檢樣品為純合子，則試紙條顯示一條有色線條；如果被檢樣品為雜合子，則試紙條顯示二條有色線條。
另一方面，本發(fā)明還提供核酸試紙條檢測(cè)多種多態(tài)堿基SNP的檢測(cè)和分型方法，其包括1)用抗A抗體包被有色顆粒；2)用抗B抗體包被纖維膜將兩種以上無色特異性抗體B以線條狀固定于同一條膜上，形成兩條以上的檢測(cè)線；
3)根據(jù)檢測(cè)的多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)和標(biāo)記探針寡核苷酸鏈，探針的3’末端位于待檢SNP位點(diǎn)的前一個(gè)堿基，探針的5’末端用抗原A標(biāo)記；4)擴(kuò)增含有待檢SNP的DNA；5)將5’末端抗原A標(biāo)記的探針與擴(kuò)增物雜交，DNA聚合酶在探針的3’末端用兩種以上的抗原B-ddNTP中的一種與多態(tài)性堿基配對(duì)，以待檢SNP為模板延伸一個(gè)堿基，此時(shí)探針已被抗原A和抗原B雙重標(biāo)記；6)檢測(cè)時(shí)，上述步驟5)的探針?biāo)鶐в械目乖瑼首先與顆粒表面的抗體A結(jié)合，形成探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復(fù)合物；7)上述步驟6)得到有色顆粒復(fù)合物在溶液中通過毛細(xì)現(xiàn)象沿纖維膜向上流動(dòng)，當(dāng)復(fù)合物遇到固定于膜上的兩條以上的抗體B線條時(shí)，待檢的探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A復(fù)合物與線條上相關(guān)的抗體B結(jié)合，形成線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復(fù)合物，有色的線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA的顆粒復(fù)合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，不同的有色線條位置代表不同的堿基；8)如果被檢樣品為純合子，則試紙條顯示一條有色線條；如果被檢樣品為雜合子，則試紙條顯示二條有色線條；9)根據(jù)核酸檢測(cè)試紙條的顯色判讀結(jié)果對(duì)所檢測(cè)的SNP進(jìn)行分析和分型。
另一方面，本發(fā)明提供了用于上述檢測(cè)和分型方法的試紙條。
另一方面，本發(fā)明還提供了上述檢測(cè)和分型方法及其試紙條的用途，尤其是在以下領(lǐng)域中的應(yīng)用與SNP直接相關(guān)的人類遺傳性疾病的分子診斷、細(xì)菌和病毒等其它病原微生物耐藥基因突變的檢測(cè)、人體藥物反應(yīng)差異性的檢測(cè)與篩查、人類健康遺傳基礎(chǔ)的SNP的篩查與分型、人群中某些疾病易感基因的篩查、器官移植中供體和受體間的配對(duì)選擇(HLA分型)和法醫(yī)學(xué)中罪犯身份的鑒別及親子鑒定等。
附圖的簡要說明附圖1是關(guān)于用于本發(fā)明的核酸試紙條的基本結(jié)構(gòu)示意圖附圖2是關(guān)于本發(fā)明的核酸試紙條檢測(cè)兩種SNP方法的基本原理示意圖；附圖3是關(guān)于本發(fā)明的核酸試紙條檢測(cè)多種多態(tài)SNP方法的基本原理示意圖；附圖4顯示實(shí)施例1的ACTN3基團(tuán)R577X的SNP檢測(cè)和分型結(jié)果；附圖5是實(shí)施例2的Leber’s病線粒體DNA G11778A的SNP檢測(cè)圖；
發(fā)明內(nèi)容詳述本發(fā)明的方法及其試紙條就是在靶核酸擴(kuò)增物的基礎(chǔ)上，利用單堿基延伸技術(shù)，以核酸試紙條為檢測(cè)手段進(jìn)行SNP的檢測(cè)和分型。主要原理是根據(jù)抗原和其特異性抗體的免疫學(xué)特異性結(jié)合，將核酸片段固定在核酸檢測(cè)試紙條上，然后通過可視的呈色乳膠顆粒在試紙條上顯色而檢測(cè)出結(jié)果。
因此，本發(fā)明提供核酸試紙條檢測(cè)兩種多態(tài)堿基SNP的方法，其包括1)用抗A抗體包被有色顆粒將一種特異性抗體(抗A抗體，無色)吸附于有色顆粒，如膠體金顆粒，乳膠顆粒等，在顆粒表面形成抗體包被；2)用抗B抗體包被纖維膜將另一特異性抗體(抗B抗體，無色)以線條狀固定于膜上，形成檢測(cè)線，所述膜通常為硝酸纖維膜或尼龍膜)。
3)根據(jù)檢測(cè)的多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)和標(biāo)記相應(yīng)的探針寡核苷酸鏈探針的3’末端位于待檢SNP位點(diǎn)的前一個(gè)堿基，探針的5’末端用抗原A標(biāo)記；4)擴(kuò)增含有待檢SNP的DNA；采用PCR或其它方法擴(kuò)增含有待檢SNP的DNA片段，PCR反應(yīng)完成后，在PCR產(chǎn)物加入熱敏磷酸酶，直接降解其中未參加反應(yīng)的脫氧單核苷酸分子(dNTP)，除去dNTP對(duì)以后SBE單堿基延伸過程中的干擾；然后加熱95℃使熱敏磷酸酶熱失活，以免其降解SBE反應(yīng)中的抗原標(biāo)記的雙脫氧單核苷酸分子ddNTP；5)探針的單堿基延伸和第二次標(biāo)記將5’末端抗原A標(biāo)記的探針與擴(kuò)增物雜交，DNA聚合酶在探針的3’末端用抗原B標(biāo)記的雙脫氧單核苷酸(抗原B-ddNTP)以待檢SNP為模板延伸一個(gè)堿基，這時(shí)探針的5’和3’末端已分別標(biāo)記上抗原A和B；6)形成探針與顆粒的復(fù)合物在檢測(cè)時(shí)，上述步驟5)的探針?biāo)鶐в械目乖瑼首先與顆粒表面的抗體A結(jié)合，形成探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA的有色顆粒復(fù)合物。
7)探針顆粒復(fù)合物與檢測(cè)線的結(jié)合上述步驟6)的有色顆粒復(fù)合物在溶液中通過毛細(xì)現(xiàn)象沿纖維膜向上流動(dòng)，當(dāng)復(fù)合物遇到固定于膜上的抗體B線條時(shí)，待檢的探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA復(fù)合物與線條上的抗體B結(jié)合，形成線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA的有色顆粒復(fù)合物(雙抗體雙抗原夾心)。有色的線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的顆粒復(fù)合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性，即突變；8)在步驟5)的SBE反應(yīng)時(shí)，如果加入帶有抗原B的ddNTP(如加入ddATP)與模板上的單核苷酸(如A，G或C)不形成互補(bǔ)，不能發(fā)生延伸，此時(shí)探針只帶有抗原A，在步驟6)中形成的探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復(fù)合物將不能如步驟7)中所述與膜上的檢測(cè)線結(jié)合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性，即正常。
9)如果被檢樣品為純合子(如A/A)，則試紙條顯示一條有色線條(A線條)；如果被檢樣品為雜合子(如A/G)，則試紙條顯示二條有色線條(A和G線條)。
本發(fā)明的上述核酸試紙條檢測(cè)兩種多態(tài)堿基SNP方法的的基本步驟如附圖2中所示。
另一方面，本發(fā)明還提供了利用核酸試紙條檢測(cè)多種多態(tài)堿基SNP的檢測(cè)和分型方法，其包括1)用抗A抗體包被有色顆粒將特異性抗體(抗A抗體，無色)吸附于有色顆粒(如膠體金顆粒，乳膠顆粒等)，在顆粒表面形成抗體包被；2)用抗B抗體包被纖維膜將兩種以上，例如四種特異性抗體(抗B1，抗B2，抗B3，抗B4抗體，無色)以線條狀固定于同一條膜上，形成兩條以上，例如四條檢測(cè)線；3)根據(jù)檢測(cè)的多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)和標(biāo)記相應(yīng)探針寡核苷酸鏈探針的3’末端位于待檢SNP位點(diǎn)的前一個(gè)堿基，探針的5’末端用抗原A標(biāo)記；4)擴(kuò)增含有待檢SNP的DNA；用PCR或其它方法擴(kuò)增含有待檢SNP的DNA片段，PCR反應(yīng)完成后，在PCR產(chǎn)物加入熱敏磷酸酶，直接降解其中未參加反應(yīng)的脫氧單核苷酸分子(dNTP)，除去dNTP對(duì)以后SBE單堿基延伸過程中的干擾；然后加熱95℃使熱敏磷酸酶熱失活，以免其降解SBE反應(yīng)中的抗原標(biāo)記的雙脫氧單核苷酸分子ddNTP；5)探針的單堿基延伸和第二次標(biāo)記將5’末端抗原A標(biāo)記的探針與擴(kuò)增物雜交；在SBE反應(yīng)時(shí)，根據(jù)多態(tài)位點(diǎn)的堿基類型加入兩種以上，例如四種不同的標(biāo)記的ddNTP(如抗原B1-ddTTP，抗原B2-ddATP，抗原B3-ddGTP，抗原B4-ddCTP)，DNA聚合酶在探針的3’末端用四種抗原B-ddNTP中的一種與多態(tài)性堿基配對(duì)，以待檢SNP為模板延伸一個(gè)堿基，這時(shí)探針的5’和3’末端已分別標(biāo)記上抗原A和B；6)探針與顆粒復(fù)合物的形成檢測(cè)時(shí)，上述步驟5)的探針?biāo)鶐в械目乖瑼首先與顆粒表面的抗體A結(jié)合，形成探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA的有色顆粒復(fù)合物。
7)探針顆粒復(fù)合物與檢測(cè)線的結(jié)合上述步驟6)的有色顆粒復(fù)合物在溶液中通過毛細(xì)現(xiàn)象沿纖維膜向上流動(dòng)，當(dāng)復(fù)合物遇到固定于膜上的四條抗體B線條時(shí)，待檢的探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A復(fù)合物與線條上相關(guān)的抗體B結(jié)合，形成線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA的有色顆粒復(fù)合物(雙抗體雙抗原夾心)。有色的線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA的顆粒復(fù)合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條。不同的有色線條位置代表不同的堿基(A，T，C或G，見附圖3)。
8)如果被檢樣品為純合子(如A/A)，則試紙條顯示一條有色線條(A線條)。如果被檢樣品為雜合子(如A/G)，則試紙條顯示二條有色線條(A和G線條，見附圖3)。
9)根據(jù)核酸檢測(cè)試紙條的顯色判讀結(jié)果對(duì)所檢測(cè)的SNP進(jìn)行分析和分型。
本發(fā)明的上述核酸試紙條檢測(cè)多種多態(tài)堿基SNP的方法的基本步驟示于附圖3中。
本發(fā)明說明書及權(quán)利要求書中所使用的技術(shù)術(shù)語解釋引物DNA合成的起始物。一般為一對(duì)單鏈寡核苷酸，在與模板雜交后，DNA合成從其3’末端開始。
探針探測(cè)靶核酸(DNA或RNA)的單鏈寡核苷酸。通常有可檢測(cè)的信號(hào)分子標(biāo)記，如半抗原，熒光等。
標(biāo)記將可檢測(cè)的信號(hào)分子(如半抗原，熒光，放射性等)與單鏈寡核苷酸相偶連的方法。
雜交特指互補(bǔ)的DNA單鏈通過堿基配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
核酸脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通稱。
抗原和半抗原具備免疫原性的物質(zhì)。通常為大分子蛋白質(zhì)或細(xì)胞組分。但有些小分子也具備免疫原性，被稱為半抗原(Hapten)。半抗原常被用于標(biāo)記探針。
抗體能與抗原或半抗原特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子。
復(fù)合體由兩種或兩種以上分子特異性結(jié)成的結(jié)合物。
免疫試紙條用于快速檢測(cè)的醫(yī)學(xué)工具。又稱為呈色薄膜層析。
核酸聚合酶合成核酸長鏈的酶類。分為DNA聚合酶和RNA聚合酶兩大類。
在本發(fā)明的上述方法中，所使用的抗A抗體可選自親和素、抗地高辛抗體或抗熒光染料抗體，其中抗熒光染料抗體選自抗Cy3抗體、抗Cy5抗體、抗Tetramethylrhodamine抗體、抗AlexaFluor抗體、抗Rhodamine抗體、抗Fam抗體、抗FitC抗體等。其中優(yōu)選的抗體為親和素、抗地高辛抗體或抗FitC抗體。
在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，所使用的另一種標(biāo)準(zhǔn)的通用抗體，無色的抗B抗體可選自上述標(biāo)準(zhǔn)的通用抗體，但應(yīng)選用與抗A抗體不同的抗體。
在本發(fā)明的上述方法中，所使用的抗原A和抗原B可以是標(biāo)準(zhǔn)的通用抗原或半抗原。尤其適用于本發(fā)明方法的用于標(biāo)記探針的抗原或半抗原選自生物素、地高辛或熒光染料，其中所述熒光染料選自Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine、AlexaFluor、Rhodamine、Fam、FitC，等。優(yōu)選的抗原或半抗原為生物素、地高辛或FitC。探針的5’末端和3’末端應(yīng)選用不同的抗原或半抗原標(biāo)記。
用于吸附抗A抗體的有色顆?？梢允?，如膠體金顆粒、乳膠顆粒等。所述膜通常為硝酸纖維素膜或尼龍膜。在本發(fā)明的上述方法中，所使用的DNA聚合酶可選自Klenow DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶，或Thermo sequenase。這些DNA聚合酶在商業(yè)上可由例如美國的NewEngland Biolabs，獲得。
本發(fā)明的突出的有益效果是以核酸檢測(cè)試紙條為檢測(cè)平臺(tái)，從樣品提取開始到給出確定SNP分析和分型結(jié)果，整個(gè)操作周期短，只需要2-3個(gè)小時(shí)。判讀簡單同時(shí)又不需要任何特殊儀器，使得這種檢測(cè)方法的操作復(fù)雜性和SNP檢測(cè)成本大大降低。SNP檢測(cè)試紙條對(duì)于實(shí)驗(yàn)的條件和環(huán)境要求不高，所以在一般的分子實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院檢驗(yàn)科即可以完成全部實(shí)驗(yàn)。SNP檢測(cè)試紙條與基因芯片，基因測(cè)序的比較

SNP檢試紙條以其特異、簡單、快捷的特性可以獲得很廣泛的應(yīng)用，如1.與SNP直接相關(guān)的人類遺傳性疾病的分子診斷；2.人群中可以確定人類健康遺傳基礎(chǔ)的SNP的篩查與分型3.人體藥物反應(yīng)差異性檢測(cè)與篩查；4.人群中某種疾病易感基因的篩查；5.病原體已知耐藥基因的檢測(cè)；6.器官移植中供體和受體間的配對(duì)選擇7.法醫(yī)研究中罪犯身份的鑒別及親子鑒定8.運(yùn)動(dòng)員基因型的篩選如下實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍的任何限制。
實(shí)施例實(shí)施例1.ACTN3基因R577X單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)與分型ACTN3基因是第一個(gè)被證實(shí)與人體健康和運(yùn)動(dòng)能力表型有關(guān)的骨骼肌結(jié)構(gòu)性基因，其編碼的產(chǎn)物為α-輔肌動(dòng)蛋白-3(ACTN3)。ACTN3的577位密碼子發(fā)生了突變由野生型577R(CGA)突變?yōu)?77X(TGA)，使該基因的終止密碼子提前出現(xiàn)，導(dǎo)致人體內(nèi)α-輔肌動(dòng)蛋白-3缺乏。有證據(jù)證明ACTN3基因的577R等位基因型對(duì)于要求有力量和速度性的活動(dòng)有益，R等位基因使得機(jī)體內(nèi)表達(dá)出功能性α-輔肌動(dòng)蛋白-3蛋白，有利于肌肉進(jìn)行快速有力的收縮；而X等位基因則在某種程度上對(duì)慢速和持久性肌肉收縮提供了一個(gè)良好的分子基礎(chǔ)。
鑒于以上ACTN3基因R577X這個(gè)SNP分型的意義，本申請(qǐng)專利發(fā)明的SNP試紙條對(duì)ACTN3第577位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。具體實(shí)施如下1)取樣棉拭子取檢測(cè)者的口腔脫落細(xì)胞，然后應(yīng)用杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司所生產(chǎn)的微量DNA快速提取試劑盒進(jìn)行核酸提取。
2)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)模板被檢者基因組DNA引物 0.2微摩正向引物ACTN3PF5’GAGTGCTGGGCTGGAAGA 3’反向引物ACTN3PR5’CGGGCTGAGGGTGATGTA 3’dNTP 0.2毫摩緩沖液MgCl23毫摩KCl 50毫摩Tris-HCL(pH 9.0) 10毫摩Triton-100 1％Taq DNA聚合酶 0.8單位PCR反應(yīng)總體積微20微升。
PCR反應(yīng)程序如下 PCR產(chǎn)物大小302bp3)降解PCR反應(yīng)正剩余的dNTPPCR產(chǎn)物 20微升緩沖液Bis Tris-Propane50毫摩MgCl21毫摩ZnCl20.1毫摩熱敏磷酸酶1單位總體積微30微升反應(yīng)程序37℃，15分鐘熱敏磷酸酶滅活80℃，20分鐘4)單堿基延伸(檢測(cè)C、T和A)模板上述dNTP降解后的PCR產(chǎn)物 30微升延伸引物 0.1微摩5’FITC-AGCCACTGCCCGAGGCTGAC 3’(正向)
生物素-ddCTP，/生物素-ddTTP/生物素-ddATP 0.5微摩緩沖液Tris-HCl(pH 9.5) 26毫摩MgCl26.5毫摩熱測(cè)序酶0.5單位總體積微40微升SBE反應(yīng)程序如下95℃60秒；72℃90秒5)檢測(cè)結(jié)果將延伸產(chǎn)物全部滴于核酸試紙條上，在10分鐘判讀結(jié)果。
核酸試紙條檢測(cè)SNP和測(cè)序結(jié)果見附圖4，由附圖4的檢測(cè)結(jié)果可以看出，被檢者ACTN3577(C/T)位多態(tài)位點(diǎn)基因型為雜合型。SNP核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。
實(shí)施例2.Leber’s病線粒體DNA G11778A單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)與分型Leber’s遺傳性視神經(jīng)病(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一種母性遺傳的雙眼視神經(jīng)疾病。1988年W.allace等人首先報(bào)告線粒體DNA(mtDNA)第11778核苷酸位點(diǎn)原發(fā)性突變(G→A)可引起LHON。迄今發(fā)現(xiàn)和本病相關(guān)的mtDNA位點(diǎn)突變已有25個(gè)，在近年的報(bào)告中3460或14484等原發(fā)性位點(diǎn)突變的LHON及原發(fā)和繼發(fā)突變并存的LHON患者，其臨床表現(xiàn)類似11778位點(diǎn)突變者，臨床醫(yī)生很難根據(jù)其臨床表現(xiàn)進(jìn)行鑒別，因此分子生物學(xué)基因檢查成為鑒別不同病因的Leber’s病的首選方法。鑒于對(duì)于線粒體G11778A位點(diǎn)分型對(duì)于Leber’s遺傳性視神經(jīng)病的診斷意義，應(yīng)用本專利新發(fā)明的SNP檢測(cè)試紙條對(duì)G11778A位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。具體實(shí)施如下1)取樣被檢者外周靜脈抗凝血(凍存)5μl，應(yīng)用杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司所生產(chǎn)的微量DNA快速提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，用以基因擴(kuò)增。
2)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為排除基因組中假基因?qū)€粒體基因擴(kuò)增的干擾，需要進(jìn)行兩次擴(kuò)增，以第一擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行二次擴(kuò)增，然后利用第二次擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SBE。
引物 0.2微摩第一次擴(kuò)增引物Nd4P_out_F5’TCACTCTCACTGCCCAAAA 3’Nd4P_out_R5’GGAGAATGGGGGATAGGTGT 3’第二次擴(kuò)增引物Nd4P_in_F5’CTTCACCGGCGCAGTCATTC 3’Nd4P_in_R5’AGGCGAGGTTAGCGAGGCTT 3’dNTP0.2毫摩緩沖液MgCl23微摩KCl 50微摩Tris-HCl(PH 9.0) 10微摩氚核-100 1.0％Taq DNA聚合酶 0.8單位總體積為 20微升PCR反應(yīng)程序如下第一對(duì)引物 第二對(duì)引物 產(chǎn)物大小801bp(第一對(duì)引物)182bp(第二對(duì)引物)3)降解第二次PCR反應(yīng)中剩余的dNTP模板上述PCR產(chǎn)物 20微升緩沖液Bis Tris-Propane 50毫摩MgCl21毫摩ZnCl20.1毫摩熱敏磷酸酶 1單位總體積為30微升反應(yīng)程序37℃，15分鐘熱敏磷酸酶滅活80℃，20分鐘。
4)單堿基延伸(檢測(cè)G和A)模板上述dNTP降解后的PCR產(chǎn)物30微升延伸引物 0.1微摩5’FITC-TCAAACTACGAACGCACTCACAGTC 3’(正向)生物素-ddGTP/生物素-ddATP0.5微摩緩沖液Tris-HCL(pH 9.5)26毫摩MgCl26.5毫摩熱測(cè)序酶 0.5單位總體積為40微升SBE反應(yīng)程序如下95℃60秒72℃90秒5)檢測(cè)結(jié)果將延伸產(chǎn)物全部滴于核酸試紙條上，在10分鐘判讀結(jié)果。核酸試紙條檢測(cè)SNP結(jié)果見附圖5，由附圖5的結(jié)果可以看出，在被檢者線粒體ND4基因11778位點(diǎn)發(fā)生突變，由G轉(zhuǎn)變?yōu)锳，與測(cè)序結(jié)果一致。
權(quán)利要求
1.一種核酸試紙條檢測(cè)兩種多態(tài)堿基SNP的方法，其包括1)用抗A抗體包被有色顆粒；2)用抗B抗體包被纖維膜；3)根據(jù)檢測(cè)的多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針寡核苷酸鏈，探針的3’末端位于待檢SNP位點(diǎn)的前一個(gè)堿基，探針的5’末端用抗原A標(biāo)記；4)擴(kuò)增上述步驟3)的含有待檢SNP的DNA；5)將5’末端抗原A標(biāo)記的探針與擴(kuò)增物雜交，DNA聚合酶在擴(kuò)增后的探針的3’末端用抗原B標(biāo)記的雙脫氧單核苷酸以待檢SNP為模板延伸一個(gè)堿基，此時(shí)探針已被抗原A和抗原B雙重標(biāo)記；6)在檢測(cè)時(shí)，上述步驟5)得到的探針?biāo)鶐в械目乖瑼首先與顆粒表面的抗體A結(jié)合，形成探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA的有色顆粒復(fù)合物；7)上述步驟6)得到的有色顆粒復(fù)合物在溶液中通過毛細(xì)現(xiàn)象沿纖維膜向上流動(dòng)，當(dāng)復(fù)合物遇到固定于膜上的抗體B線條時(shí)，待檢的探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA復(fù)合物與線條上的抗體B結(jié)合，形成線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復(fù)合物，有色的線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA的顆粒復(fù)合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；8)在步驟5)時(shí)，如果加入帶有抗原B的雙脫氧單核苷酸(ddNTP)與模板上的單核苷酸不形成互補(bǔ)，則不能發(fā)生延伸，此時(shí)探針只帶有抗原A，則在步驟6)中形成的探針抗原A-顆?？贵wA的有色復(fù)合物將不能與膜上的抗體B檢測(cè)線結(jié)合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條。此為陰性；9)如果被檢樣品為純合子，則試紙條顯示一條有色線條；如果被檢樣品為雜合子，則試紙條顯示二條有色線條。
2.一種核酸試紙條檢測(cè)多種多態(tài)堿基SNP的檢測(cè)和分型方法，其包括1)用抗A抗體包被有色顆粒；2)用抗B抗體包被纖維膜將兩種以上無色特異性抗體B以線條狀固定于同一條膜上，形成兩條以上的檢測(cè)線；3)根據(jù)檢測(cè)的多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)和標(biāo)記探針寡核苷酸鏈，探針的3’末端位于待檢SNP位點(diǎn)的前一個(gè)堿基，探針的5’末端用抗原A標(biāo)記；4)擴(kuò)增含有待檢SNP的DNA；5)將5’末端抗原A標(biāo)記的探針與擴(kuò)增物雜交，DNA聚合酶在探針的3’末端用兩種以上的抗原B-ddNTP中的一種與多態(tài)性堿基配對(duì)，以待檢SNP為模板延伸一個(gè)堿基，此時(shí)探針已被抗原A和抗原B雙重標(biāo)記；6)檢測(cè)時(shí)，上述步驟5)的探針?biāo)鶐в械目乖瑼首先與顆粒表面的抗體A結(jié)合，形成探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA的有色顆粒復(fù)合物；7)上述步驟6)得到有色顆粒復(fù)合物在溶液中通過毛細(xì)現(xiàn)象沿纖維膜向上流動(dòng)，當(dāng)復(fù)合物遇到固定于膜上的兩條以上的抗體B線條時(shí)，待檢的探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A復(fù)合物與線條上相關(guān)的抗體B結(jié)合，形成線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆?？贵wA的有色顆粒復(fù)合物，有色的線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的顆粒復(fù)合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，不同的有色線條位置代表不同的堿基；8)如果被檢樣品為純合子，則試紙條顯示一條有色線條；如果被檢樣品為雜合子，則試紙條顯示二條有色線條；9)根據(jù)核酸檢測(cè)試紙條的顯色判讀結(jié)果對(duì)所檢測(cè)的SNP進(jìn)行分析和分型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中用于標(biāo)記探針的抗原A和抗原B是標(biāo)準(zhǔn)的通用抗原或半抗原，其選自生物素、地高辛或熒光染料，其中所述熒光染料選自Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine、AlexaFluor、Rhodamine、Fam或FitC；探針的5’末端和3’末端應(yīng)選用不同的抗原或半抗原標(biāo)記；所使用的抗A抗體和無色的抗B抗體是標(biāo)準(zhǔn)通用抗體，其可選自親和素、抗地高辛抗體或抗熒光染料抗體，所述抗熒光染料抗體選自抗Cy3抗體、抗Cy5抗體、抗Tetramethylrhodamine抗體、抗AlexaFluor抗體、抗Rhodamine抗體、抗Fam抗體或抗FitC抗體；抗B抗體應(yīng)選用與抗A抗體不同的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述抗原或半抗原為生物素、地高辛或FitC；所述抗體為親和素、抗地高辛抗體或抗FitC抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述DNA聚合酶可選自Klenow DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、BstDNA聚合酶或Thermo sequenase。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中用于吸附抗A抗體的有色顆粒是膠體金顆?；蛉槟z顆粒，所述的膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
7.權(quán)利要求1-6之一所述的方法在與SNP直接相關(guān)的人類遺傳性疾病的分子診斷、細(xì)菌和病毒等其它病原微生物耐藥基因突變的檢測(cè)、人體藥物反應(yīng)差異性的檢測(cè)與篩查、人類健康遺傳基礎(chǔ)的SNP的篩查與分型、人群中某些疾病易感基因的篩查、器官移植中供體和受體間的配對(duì)選擇和法醫(yī)學(xué)中罪犯身份的鑒別及親子鑒定中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種核酸試紙條檢測(cè)兩種多態(tài)堿基SNP的方法。本發(fā)明還公開了一種核酸試紙條檢測(cè)多種多態(tài)堿基SNP的檢測(cè)和分型方法。此外，本發(fā)明還公開了上述檢測(cè)方法在與SNP直接相關(guān)的人類遺傳性疾病的分子診斷、細(xì)菌和病毒等其它病原微生物耐藥基因突變的檢測(cè)、人體藥物反應(yīng)差異性的檢測(cè)與篩查、人類健康遺傳基礎(chǔ)的SNP的篩查與分型、人群中某些疾病易感基因的篩查、器官移植中供體和受體間的配對(duì)選擇和法醫(yī)學(xué)中罪犯身份的鑒別及親子鑒定中的用途。
文檔編號(hào)G01N33/544GK1847852SQ20061007870
公開日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月10日
發(fā)明者尤其敏, 胡林, 王宏瑩, 徐高連 申請(qǐng)人:杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司