專利名稱：：一種血清銅、鋅、鐵的5-Br-PADCAP勻相自動分析法及液體穩(wěn)定試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及血清銅、鋅、鐵的5—Br—PADCAP勻相自動化分析法及其液體型隱定試劑，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：銅、鋅、鐵是人體所必需的微量元素，在人體內(nèi)有多方面的生理功能。眾多的臨床資料表明，某些疾病的發(fā)生同人體內(nèi)銅、鋅、鐵的含量密切相關(guān)，如血清銅升高可見于甲狀腺機能亢進、白血病、何杰金氏病、血色沉著癥、膽汁性肝硬化、傷寒、肺結(jié)核、惡性貧血、風(fēng)濕病和惡性腫瘤等病癥，血清銅降低可見于嬰兒貧血、嬰兒營養(yǎng)不良，肝豆?fàn)詈俗冃缘燃膊?。血清鋅升高常見于工業(yè)污染引起的急性鋅中毒。血清鋅降低則見于中毒性肝硬變、肺癌、心肌梗塞、營養(yǎng)不良、惡性貧血、腸胃吸收障礙、尿毒癥、和妊娠等病癥。血清鐵增高見于溶血性貧血，再障性貧血，巨紅細胞性貧血等。血清鐵降低見于缺鐵性貧血，慢性長期失血，惡性腫瘤等。因此，準(zhǔn)確測定血清銅、鋅、鐵的含量具有重要的臨床價值。目前，臨床上測定血清銅、鋅、鐵的方法主要為原子吸收分光光度法和使用絡(luò)合劑顯色的比色法。其中原子吸收分光光度法需要專用昂貴儀器，不適于常規(guī)分析；比色法雖準(zhǔn)確、簡便，但均存在操作煩瑣，血清銅、鋅、鐵解離速度慢，顯色時間長等的缺點，有的還需去除血清蛋白，用劇毒氰化鉀掩蔽干擾離子、再用水合氯醛解蔽等步驟，只能以手上工法進行檢測。本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)的不足，通過運用一種使血清銅、鋅、鐵快速從其結(jié)合蛋白質(zhì)解離的技術(shù)和一種在蛋白質(zhì)解離劑存在下的血清蛋白穩(wěn)定技術(shù)，向臨床提供一種直接使用、無需復(fù)溶、穩(wěn)定性強、測定結(jié)果受外界干擾小，且對自動生化分析的管道無污染的勻相自動化測定技術(shù)及其相應(yīng)的液體穩(wěn)定試劑。該測定試劑置2—8'C保存可至少可穩(wěn)定12個月，提供的方法和試劑可以應(yīng)用于目前廣泛使用的監(jiān)床生化自動分析儀，從而達到大規(guī)模測定樣本的要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種基于5-Br—PADCAP為顯色劑的血清銅、鋅、鐵勻相自動化分析法及其液體型穩(wěn)定試劑，用于體液樣的蛋白質(zhì)解離劑存在下的血清蛋白穩(wěn)定技術(shù)本中銅、鋅、鐵的測定。該測定體系主要是通過微量元素和其結(jié)合蛋白的快速裂解技術(shù)及在蛋白質(zhì)解離劑存在下的血清蛋白穩(wěn)定技術(shù)的應(yīng)用，使血清中的銅、鋅、鐵在勻相條件下快速從其結(jié)合蛋白上裂解開來，并在表面活性劑的存在下與一種水溶性的吡啶偶氮染料5—Br—PADCAP發(fā)生靈敏的顯色反應(yīng)，產(chǎn)物的吸光度大小與血清中的銅、鋅、鐵含量成正比，在自動生化分析儀上以兩點終點法的測量模式實現(xiàn)對樣本中銅、鋅、鐵的含量測定。為了達到理想的檢測效果與足夠的穩(wěn)定性，本發(fā)明提供的兩點終點法血清銅、鋅、鐵勻相自動化檢測試劑，特別可以分為A、B二個組份。兩個組份的具體成份組成可表述如下。A組份緩沖液100mmol/L解離劑15mmol/L表面活性劑30ml/L穩(wěn)定劑15g/L防腐劑lg/L去干擾劑'25mmol/LB組份5—Br—PADCAP12mmol/L緩沖液120mmol/L防腐劑lg/L表面活性劑15ml/L為了提高上述測定試劑的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，消除測定結(jié)果受外界的多種干擾，所述的兩點終點法測定試劑中用于測定血清銅和鐵的緩沖液可以為GOOD'S緩沖液、甘氨酸緩沖液、醋酸一醋酸鈉緩沖液、檸檬酸一檸檬酸三鈉緩沖液、鄰苯二甲酸氫鉀一鹽酸緩沖液，特別優(yōu)選的緩沖液為醋酸一醋酸鈉緩沖液；用于血清鋅測定的緩沖液可以為GOOD，S緩沖液、Tris-HCl緩沖液、NH3H2ONH4Cl緩沖液、三乙醇胺-HCl緩沖液等，特別優(yōu)選的緩沖液為Tris-HCl緩沖劑。解離劑可以是異氰硫酸胍、鹽酸胍、尿素其中的一種或幾種的組合物。表面活性劑可以為SDS、Tween20、Tween80、Brij35、Brij98、乳化劑OP、Tritonx-100、F68、F-88等非離子型表面活性劑其中的一種或幾種的組合，測定血清銅和鐵時特別優(yōu)選的表面活性劑是Tween80，測定血清鋅時特別優(yōu)選的表面活性劑是Tritonx-100。穩(wěn)定劑可以是氯化鈉、抗生素、多元醇、牛血清白蛋白(BSA)、冠醚等。去干擾劑可以是抗壞血酸、過氧化氫、亞鐵氰化鉀、亞鐵氰化鈉、鐵氰化鉀、硫脲、焦磷酸鈉、氟化鈉、銅試劑、檸檬酸三鈉等，其中測定血清銅的試劑特別添加的去干擾劑是過氧化氫和硫脲，測定血清鐵時特別添加的去干擾劑是抗壞血酸和氟化鈉，測定血清鋅時特別添加的去干擾劑是銅試劑和檸檬酸三鈉。防腐劑可以是NaN3、PC系列防腐劑等。具體實施例方式實施例1:血清銅兩點終點法測定試劑，緩沖劑優(yōu)選為醋酸-醋酸鈉緩沖液，其中A組份中特別優(yōu)選pH3.5醋酸-醋酸鈉緩沖液，B組份中特別優(yōu)選pH5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液；解離劑特別優(yōu)選異氰硫酸胍；表面活性劑優(yōu)選為Tween80;穩(wěn)定劑優(yōu)選為氯化鈉；去千擾劑優(yōu)選為氧化氫和硫脲的組合；防腐劑優(yōu)選為PC300。在上述試劑組成中，血清銅可被pH3.5醋酸-醋酸鈉緩沖液、異氰硫酸胍共同作用而快速從血清蛋白質(zhì)中解離開來，Tween80、氯化鈉可使血清蛋白質(zhì)在血清銅快速解離的過程中保持足夠的穩(wěn)定性，避免由于蛋白質(zhì)的變性而引起測量體系吸光度的異常升高。A組份PH3.5醋酸-醋酸鈉緩沖液lOOmmol/L解離劑異氰硫酸胍50mmol/L表面活性劑Tween8050ml/L穩(wěn)定劑NaCl9g/L防腐劑PC300lg/L去干擾劑過氧化氫15ml/L硫脲25mmol/LB組份5—Br—PADCAP10mmol/LPH5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液200mmol/L防腐劑PC300lg/L表面活性劑Tween80lOml/L在實施例1的試劑用于測定樣本時，釆用的測定方法為兩點終點法，溫度為37°C，Rl:樣本R2為200:20:50，測定主/副波長為546/660nm，Rl加入樣本或標(biāo)準(zhǔn)后在測定溫度孵育300秒后讀取第1點吸光度，然后加入R2繼續(xù)孵育300秒后讀取第2點吸光度。用本法和原子吸收分光光度法同時測定了20例血清銅標(biāo)本。表1為本實例1測定值與常規(guī)原子吸收法測定值對照表，圖1根據(jù)表1數(shù)據(jù)制成。本實施例和原子吸收法的相關(guān)系數(shù)r為0.9908，兩者顯示了極好的相關(guān)性。表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2:血清鐵兩點終點法測定試劑，緩沖液優(yōu)選為醋酸-醋酸鈉緩沖液，其中A組份中特別優(yōu)選PH4.0醋酸-醋酸鈉緩沖液，B組份中特別優(yōu)選pH7.0醋酸-醋酸鈉緩沖液；解離劑特別優(yōu)選鹽酸胍；表面活性劑優(yōu)選為Tween80，穩(wěn)定劑優(yōu)選為氯化鈉，去干擾劑優(yōu)選為抗壞血酸和氟化鈉的組合，防腐劑優(yōu)選為PC800。在上述試劑組成中，用于血清鐵快速解離的組合物pH4.0醋酸-醋酸鈉緩沖液、鹽酸胍；用于保持解離過程中血清蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的組合物是Tween80、氯化鈉。A組份PH4.0醋酸-醋酸鈉緩沖液解離劑鹽酸胍表面活性劑Tween80穩(wěn)定劑NaCl防腐劑PC800去干擾劑抗壞血酸氟化鈉B組份:5—Br—PADCAPPH7.0醋酸-醋酸鈉緩沖液防腐劑PC800表面活性劑Tween80120腿ol/L50mmol/L50ml/L9g/Llg/L2g/L3Ommol/L12mmol/L120纖ol/Llg/L15ml/L實施例2的測定方法與實施例1相同，用本法和原子吸收分光光度法同時測定了20例血清鐵標(biāo)本。表2為本實施例2測定值與常規(guī)原子吸收法測定值對照表，圖2根據(jù)表2數(shù)據(jù)制成。本實施例和原子吸收法的相關(guān)系數(shù)r為0.9962,兩者顯示了極好的相關(guān)性。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>5—Br—PADCAP12mmol/LpH8.0Tris-HCl緩沖液150mmol/L防腐劑疊氮鈉0.9g/LTritonX-100lOml/L實施例3的測定方法與實施例1相同，用本法和原子吸收分光光度法同時測定了20例血清鋅標(biāo)本，測定結(jié)果如表3所示。圖3根據(jù)表3的數(shù)據(jù)制成。本發(fā)明雖然試劑組成簡單，操作簡便，但同樣顯出與常規(guī)原子吸收極好的相關(guān)性(r=0.9952)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上述實施例試劑的配制方法僅用于說明本發(fā)明的原理和其應(yīng)用，但本發(fā)明絕不局限于上述例舉的應(yīng)用范圍。圖1至圖3分別是本發(fā)明的實施例1至實施例3的測得值與原子吸收分光光度法(《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第二版所推薦)測得值的相關(guān)性示意圖。權(quán)利要求1、一種血清銅、鋅、鐵的5-Br-PADCAP勻相自動化分析法，其特征是采取一定的解離體系、蛋白穩(wěn)定體系、去干擾劑，使血清中的銅、鋅、鐵在勻相條件下快速從其結(jié)合蛋白上裂解開來，并在表面活性劑的存在下與一種水溶性的吡啶偶氮染料5-Br-PADCAP發(fā)生靈敏的顯色反應(yīng)，在自動生化分析儀上以兩點終點法的測量模式實現(xiàn)對樣本中銅、鋅、鐵的含量測定。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于采用兩點終點法檢測血清銅、鋅、鐵的5—Br^-PADCAP勻相自動化分析法液體穩(wěn);試劑，其特征是它分為二個組份(—A、B二個組份的成份組成是:A組份緩沖液解離劑表面活性劑穩(wěn)定劑防腐劑去干擾劑B組份5—Br—PADCAP緩沖液防腐劑表面活性劑10—150mmol/L25—謂mmol/L5—75ml/L5—100g/L0.1—2g/L5—50mmol/L2—30匪ol/L50~200mmol/L0.1—2g/L5——50ml/L3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清銅、鋅、鐵的5—Br—PADCAP勻相自動化分析法液體穩(wěn)定試劑，其特征是分析血清銅、鐵時所采取的蛋白穩(wěn)定體系是表面活性劑Tween80、NaCl;分析血清鋅時所采取的蛋白穩(wěn)定體系是表面活性劑TritonX—100、乙二醇。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清銅、鋅、鐵的5—Br—PADCAP勻相自動化分析法液體穩(wěn)定試劑，其特征是分析血清銅時所采取的去干擾劑為過氧化氫、硫脲的組合物；分析血清鐵時所采取的去干擾劑為抗壞血酸、氟化鈉的組合物；分析血清鋅時所采取的去干擾劑為銅試劑、擰檬酸三鈉的組合物。全文摘要本發(fā)明涉及血清銅、鋅、鐵的5-Br-PADCAP勻相自動化分析法及其液體型穩(wěn)定試劑，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。其特點是通過血清的銅、鋅、鐵和其結(jié)合蛋白的快速裂解技術(shù)及在蛋白解離劑存在下的血清蛋白穩(wěn)定技術(shù)的應(yīng)用，使血清中的銅、鋅、鐵在勻相條件下快速從其結(jié)合蛋白上裂解開來，并在表面活性劑的存在下與一種水溶性的吡啶偶氮染料5-Br-PADCAP發(fā)生靈敏的顯色反應(yīng)，在自動生化分析儀上以兩點終點法的測量模式實現(xiàn)對樣本中銅、鋅、鐵的含量測定。采用本法制備的液體型測定試劑穩(wěn)定、方便、抗干擾能力強，對自動生化分析儀管道無污染，特別適合進行血清銅、鐵、鋅的批量自動化檢測。文檔編號G01N21/78GK101097220SQ20061008667公開日2008年1月2日申請日期2006年6月28日優(yōu)先權(quán)日2006年6月28日發(fā)明者連國軍申請人:溫州醫(yī)學(xué)院