專利名稱：用作腎毒性標記物的甲狀腺素運載蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及作為腎毒性生物標記物的甲狀腺素運載蛋白在腎皮質(zhì)中的積累。
甲狀腺素運載蛋白是一種不在腎臟中表達的血漿蛋白質(zhì)，并且在血漿中檢測到甲狀腺素運載蛋白與例如某些腫瘤、營養(yǎng)不良或胰腺炎的存在相關。
本發(fā)明涉及甲狀腺素運載蛋白積累的原位檢測，其中在發(fā)生退化改變的腎皮質(zhì)區(qū)域內(nèi)鑒定甲狀腺素運載蛋白的積累。因此，根據(jù)本發(fā)明，對腎皮質(zhì)中甲狀腺素運載蛋白積累的檢測可用于評價腎毒性。
本申請證實，當施用慶大霉素時受調(diào)節(jié)的生物標記物之一被鑒定為甲狀腺素運載蛋白(前白蛋白)，它是一個13kDa的血液轉運蛋白。然后，通過Western印跡證實了該結果，這表明該蛋白質(zhì)在來自慶大霉素處理大鼠的腎臟中比來自對照大鼠的腎臟中明顯更多。
在藥物研制過程中所測試的候選藥物副作用之一是腎毒性。
腎毒性的特征在于近端小管的明顯退化/再生(4級)，其在用100mg/kg/天的慶大霉素處理7天的大鼠內(nèi)明顯可見，因此證實慶大霉素處理誘導了腎毒性。因此，慶大霉素處理被用作鑒定腎毒性的新標記物。通過MAIDL IMS分析大鼠腎薄切片。分析所得到的譜圖并將峰分等級。將質(zhì)量m/z 12959的峰歸為皮質(zhì)中的第一位的等級，其在慶大霉素處理的大鼠腎臟中的平均信噪比為5，并且在對照中完全缺乏。
從皮質(zhì)區(qū)域微抽提皮質(zhì)蛋白質(zhì)，并通過反相色譜分級分離。含有質(zhì)量m/z 12959處峰的級分經(jīng)串聯(lián)MS鑒定為甲狀腺素運載蛋白。
在原位以及在HPLC級分中證明了甲狀腺素運載蛋白的存在。同樣，也證明了通過串聯(lián)質(zhì)譜鑒定為甲狀腺素運載蛋白S28-Q146(甲狀腺素運載蛋白的一種加工形式)的m/z種類12959僅僅存在于慶大霉素處理樣品的原位質(zhì)譜中和HPLC級分D10質(zhì)譜中。
因此，本發(fā)明提供一種評價腎毒性的方法，其包括以下步驟a)提供來自懷疑患有腎毒性的受試者的腎樣品；b)確定與健康受試者相比甲狀腺素運載蛋白在懷疑患有腎毒性的受試者腎皮質(zhì)中的積累；其中，與健康受試者相比，甲狀腺素運載蛋白在懷疑患有腎毒性的受試者腎皮質(zhì)中的積累增加指示存在腎毒性。
所述受試者可以是哺乳動物。所述哺乳動物可以是非人哺乳動物。所述非人哺乳動物可以是大鼠。
甲狀腺素運載蛋白在腎皮質(zhì)中的積累可以通過任何適宜方法確定。此類方法之一是免疫組織化學，其使用甲狀腺素運載蛋白特異的且適合免疫組織化學的抗體。開展免疫組織化學的方法是本領域技術人員眾所周知的。另一種方法是對腎皮質(zhì)提取物進行電泳以及隨后通過例如使用甲狀腺素運載蛋白特異抗體的Western印跡或質(zhì)譜對甲狀腺素運載蛋白的檢測。檢測腎皮質(zhì)中甲狀腺素運載蛋白積累的優(yōu)選方法是腎切片的MALDI成像質(zhì)譜(IMS)。這使得可以在損傷腎皮質(zhì)中檢測和定位標記物的加工形式。
附圖簡述

圖1腎薄切片上的基質(zhì)點樣方案。
圖2對照對慶大霉素處理大鼠腎臟皮質(zhì)中7個最明顯區(qū)別特征的聚類分析。
圖3對照和慶大霉素處理大鼠腎臟皮質(zhì)中m/z 12959的平均信號。
圖4鑒定方案。
圖5m/z 12959的串聯(lián)質(zhì)譜分析A)完整質(zhì)譜圖。B)簡潔(Deconvulated)質(zhì)譜圖。C)解析的串聯(lián)質(zhì)譜圖。
圖6數(shù)據(jù)庫檢索結果。
圖7A)來自腎皮質(zhì)和HPLC級分D10的胞質(zhì)部分的Western印跡分析。B)大鼠腎皮質(zhì)和HPLC級分的MALDI MS分析，D10G/C慶大霉素/對照的HPLC級分D10；G/C慶大霉素/對照的腎胞質(zhì)部分。
圖8來自對照和慶大霉素處理大鼠腎的免疫組織化學檢查。來自處理大鼠(A)和對照大鼠(B)的整個腎臟切片的掃描數(shù)字圖像顯示在處理的腎皮質(zhì)內(nèi)有高水平的甲狀腺素運載蛋白免疫反應性。來自皮質(zhì)(C、E)對髓質(zhì)(D、F)的高放大倍數(shù)顯微照片顯示了TTR免疫反應性在處理腎臟皮質(zhì)小管中的具體位置。通過二氨基聯(lián)苯胺-Ni灰色沉淀和甲酚紫復染顯示TTR免疫反應性。
實施例實施例1腎毒性的模型系統(tǒng)實施例1a)動物處理從當?shù)毓芾頇C構獲得動物研究許可，并且所有研究方案都遵守動物福利指南。大約12周齡的雄性HanBrlWistar大鼠(300g±20％)獲自BRL，F(xiàn)üllinsdorf，瑞士。這些動物單獨圈養(yǎng)在20℃及50％相對濕度的墊有木刨花的Macrolone籠中，12小時光照/黑暗循環(huán)，自由飲水和攝食Kliba 3433嚙齒動物飼料(Provimi Kliba AG，Kaiseraugst，瑞士)。
用100mg/kg/天量的慶大霉素(溶于鹽水)或媒介物皮下注射(sc)動物，連續(xù)處理7天，最后一次施用后24小時通過吸入CO2處死。在處死前立即在異氟烷麻醉下從眼后竇收集終末血樣用于臨床化學研究。
實施例1b)組織學典型腎臟樣品在10％中性緩沖福爾馬林中固定。所有樣品均使用常規(guī)方法處理并用Paraplast包埋。切成約2-3微米的組織切片，并用蘇木精-伊紅(HE)或高碘酸-希夫反應(PAS)染色。
實施例2慶大霉素處理大鼠腎皮質(zhì)的MALDI-IMS研究腎臟區(qū)域內(nèi)(皮質(zhì)、髓質(zhì)、乳頭)的差異蛋白質(zhì)表達以便研究在組織病理學上所觀察到的慶大霉素的毒性是否與通過IMS得到的結果相關聯(lián)。當施用慶大霉素時，皮質(zhì)區(qū)內(nèi)的幾個蛋白質(zhì)峰受到明顯的調(diào)節(jié)。
在用100mg/kg/天的慶大霉素處理7天的大鼠內(nèi)清楚地觀察到近端小管的明顯退化/再生(4級)。該發(fā)現(xiàn)與通過MALDI IMS對大鼠腎臟薄切片的分析相關。如下所述，將9個對照和9個慶大霉素處理大鼠腎臟薄切片(來自3個動物，每個動物3片；如圖1所示將基質(zhì)點樣于該薄切片上)進行質(zhì)譜分析。
實施例2a)MALDI IMS樣品制備切下大鼠腎臟，在干冰上迅速冷凍，并在進一步處理之前保存在-80℃。用冰凍切片機(LEICA CM 3000，Leica Microsystems)于-18℃切成12μm切片，貼于ITO-包被的傳導載玻片上(氧化銦錫，50×75×0.9mm，Delta Technologies)。根據(jù)已公開的方法(Schwartz，S.A.，Reyzer，M.L.和Caprioli，R.M.(2003)Journal of Mass Spectrometry 38，699-708)進行樣品制備。然后將組織切片浸沒于乙醇浴中固定，并在真空下干燥30分鐘。在所有過程中，這些切片盡可能儲存在真空中。用移液器將MALDI基質(zhì)手工點樣。200nL新鮮制備的芥子酸溶液(以20mg/ml濃度溶于1∶1的水/乙腈、0.1％三氟乙酸中的3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸，F(xiàn)luka)點在組織上。結晶后，在斑點上覆蓋另外200nL的芥子酸溶液，并且將基質(zhì)室溫干燥。如果不立即通過質(zhì)譜分析，則將樣品置于真空下。
實施例2b)質(zhì)譜使用帶有標準337nm N2激光(在50Hz下工作且激光光斑大小為50μm)的UltraFlex MALDI ToF/ToF設備(Bruker Daltonics)獲得MALDIMS譜圖。在正線性模式(2kDa-30kDa)中以恒定激光功率操作設備。對于每個手工點樣的基質(zhì)滴平均進行總共8次的100次激光脈沖。使用蛋白質(zhì)校準標準溶液(胰島素、泛蛋白I、細胞色素C、肌球蛋白；BrukerDaltonics)對譜圖進行外部校準。在獲得后使用來自譜圖的過量的已知峰(血紅蛋白α-鏈、胸腺素β-4、細胞色素c氧化酶多肽VIIa L、泛蛋白、細胞色素c氧化酶多肽VIb)進行內(nèi)部校準。
實施例2c)數(shù)據(jù)分析聯(lián)合使用商業(yè)可得的工具和Vanderbilt大學內(nèi)部開發(fā)的工具對圖譜進行處理。使用ProTS-Date軟件(Efeckta Technologies公司)進行基線扣除、歸一化、峰檢測和光譜調(diào)整。對所有譜圖進行基線校準以去除化學噪聲對信號的影響。該步驟可通過局部估計基線并從原始數(shù)據(jù)中扣除基線譜圖來實現(xiàn)。對于本數(shù)據(jù)集，將軟件進行設置，認為不同m/z區(qū)域分辨率的差異是因為窗口寬度是峰寬的10倍。通過按比例換算成一般總離子流，將基線校準的譜圖在強度上進行歸一化。使用ProTS-Date進行峰檢測，并且選出一列13個共有峰作為使用二次校準功能的內(nèi)部調(diào)整點。選擇共有峰的標準是該峰必須在大于80％的待調(diào)整譜圖中出現(xiàn)，必須沒有干擾峰或重疊峰，并且這些峰具有小于7個質(zhì)量單位的所觀察矩心值標準偏差。為了避免出現(xiàn)在調(diào)整步驟中由外推所造成的誤差，要在跨過從2500至15000質(zhì)量單位的整個目的質(zhì)量范圍內(nèi)選擇調(diào)整峰。包含矩心值和歸一化強度的峰表輸出為單獨文件。
使用Vanderbilt大學內(nèi)部開發(fā)的程序，根據(jù)峰的m/z值，將峰表歸類(bin)。使用遺傳算法并行檢索策略(Yanagisawa，K.，Shyr，Y.，Xu，B.J.，Massion，P.P.，Larsen，P.H.，White，B.C.，Roberts，J.R.，Edgerton，M.，Gonzales，A.，Nadaf，S.，Moore，J.H.，Caprioli，R.M.，和Carbone，D.P.(2003)The Lancet 362，433-439)，將輸出的MALDI-TOF MS峰對樣品進行調(diào)整。簡言之，將峰歸類在一起，這樣使來自不同樣品的峰數(shù)目最大化，同時來自同一樣品的峰數(shù)目最小化。產(chǎn)生一系列質(zhì)量窗口或峰類，使得相似峰從眾多譜圖中分開。為了使用加權靈活混合共變量方法(WeightedFlexible Compound Covariate Method)(WFCCM)確定用于慶大霉素誘導腎毒性的相關生物標記物，根據(jù)觀察到的差異程度把譜圖特征分等級。由Shyr，Y.等人(Shyr，Y.和KyungMann，K.(2003)A Practical Approach toMicroarray Data Analysis，D.Berrar編)描述的該策略使用了6個不同統(tǒng)計學檢驗的組合，以便計算基于在處理和對照之間所觀察到差異的等級。
可以使用單一數(shù)據(jù)聚類分析成功區(qū)分對照和處理情況。如所期望，在皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了大多數(shù)的能區(qū)分對照和處理的峰。表1顯示了經(jīng)統(tǒng)計學鑒定為在對照皮質(zhì)對處理樣品皮質(zhì)中上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)。圖2顯示了使用最高的7個等級的峰基于WMA、最大平均S/N和p值得到的簇。
表1在皮質(zhì)中的譜形按照1)WMA、2)最大平均S/N、3)p值歸類的用于慶大霉素誘導腎毒性的生物標記物等級
在該數(shù)據(jù)表中，在質(zhì)量m/z 12959處的峰定為皮質(zhì)中的第一位的等級，其在慶大霉素處理大鼠腎臟中的平均信噪比為5，并且在對照中完全缺乏(圖3)。在m/z 6480上的雙電荷種類顯示具有相似行為。
實施例3微洗脫在皮質(zhì)區(qū)域進行液體微抽提。
通過在腎臟皮質(zhì)區(qū)域直接上下吹吸1μl溶劑(1∶1的水/乙腈、0.1％三氟乙酸)幾秒鐘進行蛋白質(zhì)微抽提。在幾個樣品上重復該過程幾次，得到約20μl體積的混合樣品。然后，該樣品在真空離心干燥儀中干燥，并重溶于95∶5的水/乙腈、0.1％三氟乙酸。
所得到的蛋白質(zhì)混合物通過反相液相色譜分級分離。
使用配備1mm內(nèi)徑聚合柱(219TP5110，Vydac)的標準Agilent 1100系列HPLC(Agilent Technologies)以50μl/分鐘流速進行蛋白質(zhì)分級分離。溶劑A為溶于水的0.1％三氟乙酸，溶劑B為溶于乙腈的0.1％三氟乙酸。使用下列程序洗脫蛋白質(zhì)5％的B溶液5分鐘之后，在7分鐘內(nèi)梯度上升至35％的B溶液，然后在34分鐘內(nèi)梯度上升至60％的B溶液，接著在0.5分鐘內(nèi)增加至90％的B溶液并維持10分鐘。從剛開始運行至48分鐘每30秒收集一次級分，級分直接收集于96孔微量滴定板內(nèi)(Greinerbio-one)。如果需要，樣品可經(jīng)幾輪HPLC分級分離，然后合并相應的級分用以分析。
將1μl級分與1μl的溶于90∶10的水/乙腈、0.1％TFA中的1g/L芥子酸點在384MALDI錨定靶(Bruker Daltonics)上，通過MALDI-TOF MS測定所得到的LC級分。
通過比較IMS產(chǎn)生譜圖和LC分級分離譜圖，確定目的峰的存在。
實施例3a)蛋白質(zhì)的鑒定然后，包含目的蛋白質(zhì)種類的級分通過納-ESI質(zhì)譜進一步分析，并且目的蛋白質(zhì)通過串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。
為了鑒定蛋白質(zhì)，含有目的質(zhì)量的HPLC級分在真空離心干燥儀中干燥，并重溶于含1％甲酸的水/乙腈(1∶1)中，使用Applied Biosystems Q-StarPulsar在納-電噴霧模式中的標準操作條件下進行蛋白質(zhì)鑒定。選擇目的質(zhì)量中的多電荷種類之一進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，記錄其串聯(lián)質(zhì)譜圖并人工解析。使用Mascot MS/MS離子檢索程序(Matrix Science，http//www.matrixscience.com)利用SwissProt數(shù)據(jù)庫(版本46.6)及0.1Da的片段和前體質(zhì)量容限進行蛋白質(zhì)鑒定。
鑒定該峰所采取的策略圖解于圖4。蛋白質(zhì)從皮質(zhì)區(qū)域微抽提，并通過反相色譜分級分離。m/z 12959的蛋白質(zhì)存在于級分D10中，并可以成功地與在從組織樣品直接記錄的譜圖中檢測到的種類進行對比。將該級分干燥，并在50％乙腈、1％甲酸中重構用于串聯(lián)質(zhì)譜分析(圖5)。產(chǎn)生的質(zhì)譜可以與甲狀腺素運載蛋白(swTTHY_RAT)的第28位Ser至第146位Gln成功匹配(圖6)。
實施例4組織提取物和HPLC級分的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡分析當施用慶大霉素時受調(diào)節(jié)的生物標記物之一被鑒定為甲狀腺素運載蛋白(前白蛋白)，它是一個13kDa的血液轉運蛋白。通過使用對該蛋白質(zhì)高度特異的抗體進行Western印跡證實了該結果，這表明該蛋白質(zhì)在來自慶大霉素處理大鼠的腎臟中比來自對照大鼠的腎臟中明顯更多(圖7)。
在含有250mM蔗糖和蛋白酶抑制劑(Roche Complete)的10mMTris-HCl pH7.6中將一片皮質(zhì)勻漿，從而得到對照和處理大鼠腎臟的組織提取物。該組織提取物于4℃下連續(xù)離心三次(680g，10分鐘；10000g，10分鐘；100000g，1小時)，同時棄去沉淀，保留最后離心步驟的上清作為腎胞質(zhì)組分。
將1μl腎胞質(zhì)組分和相應HPLC級分在4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠(Invitrogen)上電泳，并且隨后將蛋白質(zhì)轉移到PVDF膜上。印跡膜在5％的奶粉(溶于含0.1％Tween 20的PBS)中封閉1小時，并用綿羊抗前白蛋白抗體(Abcam)(溶于含5％奶粉和0.1％Tween 20的PBS)室溫孵育過夜。用含有0.1％Tween 20的PBS洗滌后，印跡膜與辣根過氧化物酶綴合的抗綿羊IgG抗體(Silenus Laboratories)孵育1小時。使用ECL western印跡試劑(Amersham)檢測抗體結合。
同樣，通過串聯(lián)質(zhì)譜鑒定為甲狀腺素運載蛋白S28-Q146的m/z種類12959僅僅存在于慶大霉素處理樣品的原位質(zhì)譜中和HPLC級分D10的質(zhì)譜中。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>用作腎毒性標記物的甲狀腺素運載蛋白<130>case 23145<160>2<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>147<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>甲狀腺素運載蛋白<222>(1)..(147)<223>swissprot基因座TTHY_RAT，登錄號P02767<400>1Met Ala Ser Leu Arg Leu Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Leu Ile Phe1 5 10 15Ala Ser Glu Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu20 25 30Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Val Asp Val35 40 45Ala Val Lys Val Phe Lys Lys Thr Ala Asp Gly Ser Trp Glu Pro Phe50 55 60Ala Ser Gly Lys Thr Ala Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr65 70 75 80Asp Glu Lys Phe Thr Glu Gly Val Tyr Arg Val Glu Leu Asp Thr Lys85 90 95Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu Tyr Ala Glu100 105 110Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly His Arg His Tyr Thr Ile Ala115 120 125Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Ser Asn
130 135 140Pro Gln Asn145<210>2<211>120<212>PRT<213>褐家鼠<220>
<221>Ser 28至Gln 146的加工形式<222>(1)..(120)<400>2Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser1 5 10 15Pro Ala Val Asp Val Ala Val Lys Val Phe Lys Lys Thr Ala Asp Gly20 25 30Ser Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr Ala Glu Ser Gly Glu Leu35 40 45His Gly Leu Thr Thr Asp Glu Lys Phe Thr Glu Gly Val Tyr Arg Val50 55 60Glu Leu Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe65 70 75 80His Glu Tyr Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly His Arg85 90 95His Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr100 105 110Ala Val Val Ser Asn Pro Gln Asn115 120
權利要求
1.一種評價腎毒性的方法，其包括以下步驟a)提供來自懷疑患有腎毒性的受試者的腎樣品；b)確定與健康受試者相比甲狀腺素運載蛋白在懷疑患有腎毒性的受試者腎皮質(zhì)中的積累，其中，與健康受試者相比，甲狀腺素運載蛋白在懷疑患有腎毒性的受試者腎皮質(zhì)中的積累增加指示存在腎毒性。
2.權利要求1所述的方法，其中所述受試者是非人哺乳動物。
3.權利要求2所述的方法，其中所述非人哺乳動物是大鼠。
4.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述確定包括通過MALDI-IMS測定甲狀腺素運載蛋白在腎皮質(zhì)中的積累。
全文摘要
甲狀腺素運載蛋白被鑒定為一種評價腎毒性的新標記。在腎毒性中，甲狀腺素運載蛋白在腎皮質(zhì)中積累，其中毒性作用的特征在于在暴露于毒性化合物的生物體中觀察到近端小管的明顯退化/再生。
文檔編號G01N33/68GK1873415SQ20061008853
公開日2006年12月6日 申請日期2006年6月1日 優(yōu)先權日2005年6月3日
發(fā)明者R·卡普廖利, A·迪克雷, H·邁斯特曼, S·呂佩 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司