專利名稱：一系列可阻斷il－6的創(chuàng)新多肽及其醫(yī)療應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及編碼可結(jié)合IL-6并阻斷其信號的創(chuàng)新多肽的DNA序列、其所編碼的多肽蛋白、該多肽在醫(yī)療藥物和診斷試劑上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，簡稱為IL-6)是一種多功能的調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，而且在很多人體疾病中起重要作用，包括各種感染、炎癥、自身免疫性疾病、和多種癌癥(Ishihara et al，Cytokine Growth Review，2002，13357-368)。人體內(nèi)IL-6的主要來源是單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)T細(xì)胞、B細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、和多種腫瘤細(xì)胞也都可以生成IL-6。IL-6的生理作用非常復(fù)雜，對B細(xì)胞、T細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、蝕骨細(xì)胞等多種細(xì)胞的生長、分化、和成熟起重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對炎癥反應(yīng)在不同的條件下可以有促進(jìn)、或抑制的作用。IL-6的促炎反應(yīng)和別的促炎因了(如TNFα和IL-1)類似，可以引起發(fā)燒和急性期蛋白質(zhì)(Acute phase protein)的生成，包括血清淀粉樣蛋白A(Serum amyloid A)、C反應(yīng)蛋白(C-reactiveprotein)、α1抗胰蛋白酶(α1 antitrypsin)、纖維酶原(Fibronogen)、觸珠蛋白(Haptoglobulin)等，而IL-6抑制炎癥反應(yīng)的作用則是通過抑制促炎因了TNFα和IL-1的生成來達(dá)到的。
多項(xiàng)研究表明，IL-6的濃度在多種癌癥、自身免疫性疾病、和其他疾病患者體內(nèi)出現(xiàn)異常升高，而且IL-6的作用和這些疾病的癥狀程度有直接關(guān)系，因此阻斷IL-6的作用是嘗試治療這些疾病的當(dāng)然選擇(Trikha et al，Clinical CancerResearch，2003，94653-4665)。IL-6的生物作用是通過和細(xì)胞膜表面的受體相結(jié)合，引發(fā)受體活化，從而把IL-6的信號由細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)。IL-6的受體是由二種蛋白IL-6R和GP130組成的二聚體，阻斷IL-6信號傳遞的最有效方法是抑制IL-6與其受體的結(jié)合。目前已經(jīng)有多種阻斷IL-6或IL-6受體的抑制劑正在歐美進(jìn)行癌癥和多種自身免疫性疾病的臨床試驗(yàn)，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus)、克隆病(Crohn’sDisease)、幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(Juvenile idiopathic arthritis)等，而且日本在2005年已經(jīng)批準(zhǔn)了一個針對IL-6受體的單克隆抗體新藥Actemra以用于治療Castleman病(一種罕見的淋巴增殖性疾病)，因此開發(fā)阻斷IL-6的抑制劑在醫(yī)療應(yīng)用上擁有重要意義。
研究表明，一個氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述的重組多肽M123可以在體外有效地結(jié)合IL-6(Silverman et al，Nature Biotechnology，2005，23(12)1556-1561)，但該多肽的生物活性和在人體內(nèi)的穩(wěn)定性均不足以滿足醫(yī)療應(yīng)用的需要，因此不能直接用于臨床。
本發(fā)明對此多肽進(jìn)行了改良，設(shè)計(jì)并建造了一系列的優(yōu)化多肽，從而大大增加了其在體內(nèi)外的穩(wěn)定性和生物活性，并且具有更長的血清半衰期，從而能夠在人體內(nèi)更有效地中和IL-6，達(dá)到更好的抑制炎癥反應(yīng)的治療效果。
本發(fā)明提供了三種不同的策略對M123進(jìn)行了優(yōu)化改良，分別得到了更加適合醫(yī)療應(yīng)用的優(yōu)化多肽。
第一，M123是個相對較小的多肽，只有共122個氨基酸，分子量為13.3kD，其在人體內(nèi)血液中的半衰期預(yù)計(jì)很短。一種已知的延長M123體內(nèi)半衰期的方法是將其連接一個多肽IG形成融合蛋白C326，IG的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述(Silverman et al，Nature Biotechnology，2005，23(12)1556-1561)，由于IG具有結(jié)合人體免疫球蛋白的功能，因此可以大大提高C326在血液中的半衰期。因?yàn)槿诤系鞍證326中的M123和IG是二個完全不同的功能區(qū)域，各自必須具備穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)才能保證該融合蛋白具有最佳的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物活性，而C326中連接M123和IG的肽鏈SAPASEPPGSL沒有經(jīng)過優(yōu)化選擇，不能夠保證M123和IG形成最佳的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而使得C326不具備最佳的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。為了提供一個包含IG和M123的最佳融合蛋白，本發(fā)明設(shè)計(jì)并建造了一個彈性結(jié)構(gòu)的優(yōu)化肽連接段G9連接于IG和M123之間，G9的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.3所述，由于G9高度的結(jié)構(gòu)彈性和可塑性，該融合蛋白具有優(yōu)異的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物活性，顯著增加了其對IL-6的親和力，大大提高了其醫(yī)療應(yīng)用性。
第二，對蛋白質(zhì)和多肽進(jìn)行聚乙二醇修飾(PEGylation)是一種延長藥物血清半衰期、及降低其免疫反應(yīng)的有效方法(Harris et al，Nature Reviews DrugDiscovery，2003，2(3)214-221)，其中常用的化學(xué)修飾方法是將聚乙二醇和多肽中唯一的一個自由的胱氨酸(Cystine)相結(jié)合，從而可以得到一個只在特定位置聯(lián)接一個聚乙二醇分子的單一多肽分子。M123本身不包含自由的胱氨酸，因此本發(fā)明將人免疫球蛋白IgG1中的鉸鏈(hinge region)N-端包含第一個胱氨酸的短肽鏈Hn，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述，連接到M123的C-端，得到了一個包含M123和一個自由胱氨酸的多肽，從而可以在聚乙二醇修飾后進(jìn)行醫(yī)療應(yīng)用。
第三，利用人免疫球蛋白Fc區(qū)域形成融合蛋白是一種已經(jīng)被證明行之有效的醫(yī)療應(yīng)用多肽的策略，不但可以通過Fc區(qū)域二聚化提高其生物活性，而且因?yàn)槊庖咔虻鞍籽褐型ǔ８哌_(dá)3星期的半衰期，大大延長該融合蛋白的血清半衰期(Chamow SM and Ashkenazi A，Antibody Fusion Proteins，1999，Wiley-Liss)。本發(fā)明將M123和人免疫球蛋白Fc形成了一個融合蛋白，并且在M123和Fc之間插入了一個彈性結(jié)構(gòu)的優(yōu)化肽連接段G9，該融合蛋白在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)后二聚化，大大提高了對IL-6的親和力，可達(dá)到更佳的治療效果。
由此，本發(fā)明描述了一系列創(chuàng)新的可抑制IL-6的優(yōu)化多肽蛋白，它們可以在體內(nèi)外高效結(jié)合IL-6，從而阻斷IL-6的生物作用，可用于治療多種癌癥和自身免疫性疾病，也可用于針對IL-6的診斷試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一系列全新的可結(jié)合IL-6的優(yōu)化多肽蛋白，其在體內(nèi)外都具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和生物活性，并能阻斷IL-6信號傳遞，從而抑制炎癥的發(fā)展。
本發(fā)明目的之二是提供編碼所述多肽的核苷酸序列。
本發(fā)明目的之三是提供含有編碼所述多肽的核苷酸序列，其表達(dá)載體和由該載體轉(zhuǎn)化的重組體，以及表達(dá)細(xì)胞。
本發(fā)明目的之四是提供該多肽作為抗炎藥物在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病中的應(yīng)用，還有包含上述多肽及可藥用載體的藥物組合物及其在治療相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
本發(fā)明目的之五是提供該多肽作為針對IL-6的診斷試劑。
本發(fā)明描述的優(yōu)化的融合蛋白質(zhì)是通過常規(guī)的基因重組技術(shù)所建造，具體實(shí)驗(yàn)步驟如《分子克隆》第三版(Joseph Sambrook，科學(xué)出版社)及類似的實(shí)驗(yàn)手冊所記載。
本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)，由可結(jié)合人免疫球蛋白的多肽IG和可結(jié)合IL-6的多肽M123構(gòu)成，IG和M123之間由一個優(yōu)化肽連接段相連，該肽連接段選自以下組a.Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly，表示為G9；b.任何一個長度為4到30的氨基酸序列，其具有彈性結(jié)構(gòu)并能增加融合蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物活性。
本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)，還可以是，由多肽M123和一個多肽短鏈構(gòu)成，該肽鏈選自以下組a.人免疫球蛋白IgG1中的鉸鏈N-端肽鏈Hn，氨基酸序列為Asp Lys ThrHis Thr Cys；b.任何一個包含自由胱氨酸、長度為4到30的氨基酸序列。
本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)，還可以是由多肽M123和人免疫球蛋白IgG1的Fc區(qū)域構(gòu)成。
其中1.結(jié)合IL-6的多肽M123，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2.結(jié)合人體免疫球蛋白的的多肽IG，氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.2所述。
3.連接M123和IG的彈性肽連接段G9，氨基酸序列如序列表中SEQID NO.3所述。
4.人免疫球蛋白IgG1中的鉸鏈(hinge region)N-端包含第一個胱氨酸的短肽鏈Hn，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述。
5.人免疫球蛋白IgG1中的Fc區(qū)域，表示為Fc，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所述。
如圖1所示，本發(fā)明提供的融合蛋白質(zhì)有三種形式，1.IL6BP-1IG-G9-M1232.IL6BP-2M123-Hn3.IL6BP-3M123-G9-Fc其中IL6BP-1和IL6BP-2可在細(xì)菌中表達(dá)，IL6BP-3可在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)其編碼DNA序列對應(yīng)于序列表中的SEQ ID NO.6、7、8。
上述融合蛋白質(zhì)及其編碼DNA可通過常規(guī)的基因重組技術(shù)獲得，然后分別克隆到載體中，所用載體可以是分子生物學(xué)所常用的質(zhì)粒、病毒或DNA片段。載體序列中包括用于驅(qū)動基因表達(dá)的啟動子、蛋白質(zhì)翻譯起始和終止信號。載體中有抗菌素抗性基因，以利于載體在宿主細(xì)胞，如細(xì)菌中繁殖。另外，載體中還可以包括真核細(xì)胞選擇性基因，用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞株的選擇。
由于M123和IG可以允許一定的氨基酸刪除和變異，仍然保持其分別對IL-6和人免疫球蛋白的親和力，所以本發(fā)明所涉及的優(yōu)化多肽的氨基酸序列也可以有一定的變化，它們都屬于本發(fā)明的范圍。
上述優(yōu)化多肽中的肽連接段G9的目的在于提供良好的彈性和可塑性，因此其氨基酸序列和長度都可以有一定的變化，也可以由一個完全隨機(jī)的肽鏈文庫中篩選而得，它們都屬于本發(fā)明的范圍。
上述優(yōu)化多肽中的Fc來自人免疫球蛋白IgG1，也可以是亞型IgG2、IgG3、IgG4、或者人免疫球蛋白IgM和IgA，該免疫球蛋白Fc片段可以為Fc全長或部分Fc序列，如選自CH2片斷、CH3片斷或絞合區(qū)域片段，它們都屬于本發(fā)明的范圍。
在完成含編碼上述優(yōu)化多肽的DNA序列的質(zhì)粒構(gòu)建以后，即可用該重組載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，表達(dá)相應(yīng)的優(yōu)化多肽。能夠用于表達(dá)這些優(yōu)化多肽的表達(dá)系統(tǒng)有多種，可以是原核細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞，它們包括(但不限于)細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等。含有編碼上述優(yōu)化多肽的重組質(zhì)粒可經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法有多種，其中包括但不限于電鉆孔法(electroporation)、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、鈣介導(dǎo)法等。
由于本發(fā)明中的優(yōu)化多肽IL6BP-3的氨基酸序列中包括可糖基化的氨基酸，因此，哺乳動物細(xì)胞是其最佳的表達(dá)系統(tǒng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)大規(guī)模表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞有多種，例如293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、SP20細(xì)胞、NS0細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞或PerC6細(xì)胞等，許多其他細(xì)胞也可用于這些蛋白質(zhì)的表達(dá)和生產(chǎn)，因此都包括在本發(fā)明所能使用的細(xì)胞之列。一種較佳的表達(dá)方法是在已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中對重組載體進(jìn)行基因擴(kuò)增，以提高相應(yīng)重組融合蛋白的表達(dá)量，例如用含有二氫葉酸還原酶(DHFR)的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染缺乏DHFR的宿主細(xì)胞后，可在細(xì)胞培養(yǎng)液中增加氨甲喋呤(MTX)的濃度以擴(kuò)增重組載體在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)量；又例如對表達(dá)谷氨酰胺合成酶(GS)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，利用增加培養(yǎng)液中甲硫氨酸亞砜(MSX)的濃度可擴(kuò)增重組載體的拷貝數(shù)量。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明優(yōu)化多肽和藥用載體的藥物組合物。該藥物組合物可以按照制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制成各種形式的藥物制劑，優(yōu)選的是注射劑，最優(yōu)選的是冷凍干燥注射劑。
本發(fā)明的藥物組合物，其中還包括任何一種或幾種其他的具有協(xié)同作用的抑制炎癥反應(yīng)的藥物，所述組合物可以和其他治療方法一起治療自身免疫性\炎癥性疾病。
本發(fā)明還包括，本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)在制備治療癌癥或自身免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用。其中所述治療癌癥或自身免疫性疾病的藥物是抑制炎癥反應(yīng)的藥物。
本發(fā)明還包括，本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)在制備診斷癌癥或自身免疫性疾病的試劑中的應(yīng)用。所述融合蛋白質(zhì)可以和其他診斷癌癥或自身免疫性疾病的方法一起使用。
表1列舉了ELISA實(shí)驗(yàn)中IL-6結(jié)合優(yōu)化多肽的EC50。

表2列舉了ELISA實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化多肽與IL-6競爭IL-6受體的EC50。


序列表說明1.SEQ ID NO.1多肽M1232.SEQ ID NO.2多肽IG3.SEQ ID NO.3肽連接段G94.EQ ID NO.4人免疫球蛋白IgG1中的鉸鏈N-端肽鏈Hn5.SEQ ID NO.5人免疫球蛋白Fc6.SEQ ID NO.6IL6BP-1的編碼DNA7.SEQ ID NO.7IL6BP-2的編碼DNA8.SEQ ID NO.8IL6BP-3的編碼DNA9.SEQ ID NO.9C326的編碼DNA


圖1優(yōu)化多肽示意圖，描述了本發(fā)明中優(yōu)化多肽IL6BP-1、IL6BP-2、和IL6BP-3的蛋白組成結(jié)構(gòu)，其中結(jié)合IL-6的多肽表示為M123，結(jié)合人免疫球蛋白的多肽表示為IG，人免疫球蛋白Fc區(qū)域表示為Fc，優(yōu)化肽連接段表示為G9，人免疫球蛋白IgG1中的鉸鏈N-端肽鏈表示為Hn。
圖2SDS-PAGE凝膠電泳中的多種優(yōu)化多肽，顯示了在本發(fā)明一較佳實(shí)施例中提純后的優(yōu)化多肽在SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺)凝膠電泳后、考馬斯亮藍(lán)染色的照片。其中第一條帶是標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)、第二條帶是提純前的IL6BP-1(17.7kD)、第三條帶是提純的IL6BP-1、第四條帶是提純的IL6BP-2(13.8kD)、第五條帶是提純的IL6BP-3(雙聚體，82.2kD)、第六條帶是提純的C326(18.2kD)。
圖3優(yōu)化多肽和IL-6的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，顯示了在本發(fā)明一較佳實(shí)施例中多種優(yōu)化多肽與IL-6在體外結(jié)合的試驗(yàn)結(jié)果。
圖4優(yōu)化多肽阻斷IL-6和其受體結(jié)合的實(shí)驗(yàn)，顯示了在本發(fā)明一較佳實(shí)施例中多種優(yōu)化多肽阻斷IL-6與其受體相結(jié)合的試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例對本發(fā)明所涉及的優(yōu)化多肽構(gòu)建、試驗(yàn)、和應(yīng)用作了詳細(xì)說明，但是本發(fā)明的內(nèi)容及用途并不限制于實(shí)例的范圍。
實(shí)施例1克隆編碼優(yōu)化多肽的DNA序列及構(gòu)建重組載體本發(fā)明中多種優(yōu)化多肽的編碼DNA是通過聚合酶酶鏈反應(yīng)(PCR)以不同的引物擴(kuò)增而得。本優(yōu)選實(shí)施例所構(gòu)建的三種優(yōu)化多肽的結(jié)構(gòu)見附圖1。
例1構(gòu)建M123基因編碼M123的DNA片段是由一系列60bp或更短的DNA寡鏈核苷酸和PCR引物擴(kuò)增合成而得。首先第一步由以下DNA寡鏈經(jīng)變性、退火、和DNA聚合酶延伸得到DNA片段1(100bp)DNA寡鏈15’-TGTCTGCCGGACCAGTTCCGCTGTGGCAATGGCCAGTGTATTCCGCTGGATTGGGTGTGT-3’DNA寡鏈25’-CCTCTTCATCCGAATCGTCCGGACAATCATTCACGCCATCACACACCCAATCCAGCGGAA-3’第二步用類似方法由以下DNA寡鏈合成DNA片段2(100bp)DNA寡鏈35’-GGACGATTCGGATGAAGAGGGCTGTCCACCGCGTACCTGTGCGCCGAGCCAGTTCCAGTG-3’DNA寡鏈45’-ATCGCACACCCAGCGCTGCGAAATGCAATAGCCGCTGCCACACTGGAACTGGCTCGGCGC-3’第三步以上述DNA片段1和2為模板，和以下引物進(jìn)行拼接PCR(BridgePCR)擴(kuò)增得到DNA片段3(200bp)引物15’-TGTCTGCCGGACCAGTTCCG-3’引物25’-TCCTCACAATCATTCTCGCCATCGCACACCCAGCGCTGCG-3’第四步用類似方法由以下DNA寡鏈合成DNA片段4(100bp)DNA寡鏈55’-GGCGAGAATGATTGTGAGGATGGCTCGGATGAGGCCAACTGTGCAGGCTCCGTACCGACC-3’DNA寡鏈65’-TGCAGCGGCCATTGCGGCACCGGAACTCATCCGACGGACAGGTCGGTACGGAGCCTGCAC-3’第五步用類似方法由以下DNA寡鏈合成DNA片段5(97bp)
DNA寡鏈75’-GTGCCGCAATGGCCGCTGCATTCCACGGGCATGGCGTTGCGATGGCGTGAATGATTGTGC-3’DNA寡鏈85’-CGTATGCTCTGTACAGTCTTCTTCATCCGAATTATCGGCACAATCATTCACGCCATC-3’第六步以上述DNA片段4和5為模板，和以下引物進(jìn)行拼接PCR擴(kuò)增得到DNA片段6(177bp)引物35’-GGCGAGAATGATTGTGAGGA-3’引物45’-CGTATGCTCTGTACAGTCTT-3’最后第七步以上述DNA片段3和6為模板，以引物1和4進(jìn)行拼接PCR擴(kuò)增得到編碼M123的基因(357bp)，其編碼的蛋白序列如SEQ ID NO.1所述。
例2構(gòu)建IG基因編碼IG的DNA片段是由以下二個DNA寡鏈核苷酸寡鏈經(jīng)變性、退火、和DNA聚合酶延伸合成而得DNA寡鏈95’-TGTCACCCTACCGGCCAATTTCGTTGTCGGAGCAGCGGCCGTTGCGTGTCACCGACCTGG-3’DNA寡鏈105’-ACAGTTTTCTTCATCCGAGTTGTCGCCACAGTCATTATCGCCATCGCACACCCAGGTCGGTGACACGCAAC-3’所得的編碼IG的基因(111bp)，其編碼的蛋白序列如SEQ ID NO.2所述。
例3構(gòu)建IL6BP-1基因及重組載體IL6BP-1由IG和M123融合而成，二者之間為肽連接段G9。
包含IG的PCR片段(168bp)是以上述IG基因?yàn)槟０搴腿缦乱飻U(kuò)增而得引物55’-GAGATATACATATGTGTCACCCTACCGGCCAATTTCG-3’引物65’-TCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCACAGTTTTCTTCATCCGAG-3’包含M123的PCR片段(394bp)是以上述M123基因?yàn)槟０搴腿缦乱飻U(kuò)增而得引物75’-GGCGGAGGTGGCGGAGGTGGATGTCTGCCGGACCAGTTC
CGG-3’引物85’-GGTGGTGCTCGAGCTACGTATGCTCTGTACAGTCTTC-3’然后IG-G9-M123的融合片段(541bp)是以上述IG和M123的PCR片段為模板，由引物5和8拼接PCR擴(kuò)增所得。編碼IL6BP-1的DNA克隆由該P(yáng)CR片段的NdeI和XhoI酶切產(chǎn)物(519bp)插入到載體質(zhì)粒pET24b(Novagen公司)的NdeI和XhoI酶切點(diǎn)所得。該重組質(zhì)粒利用T7啟動子來表達(dá)IL6BP-1，并包含醌那霉素(Kinamycin)抗性基因以利于在細(xì)菌中的繁殖。將編碼IL6BP-1的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染E.coli(DH5α)后加入LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，由Qiagen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切及測序鑒定，所獲得的編碼IL6BP-1的DNA序列如SEQ IDNO.6所述。
例4構(gòu)建IL6BP-2基因及重組載體編碼IL6BP-2的DNA是以上述M123基因?yàn)槟０搴腿缦乱飻U(kuò)增而得引物95’-GAGATATACATATGTGTCTGCCGGACCAGTTCCG-3’引物105’-GGTGGTGCTCGAGCTAGCATGTGTGAGTTTTGTCCGTATGCTCTGTACAGTCTTC-3’將所得PCR片段(405bp)的NdeI和XhoI酶切產(chǎn)物(383bp)插入到載體質(zhì)粒pET24b的NdeI和XhoI酶切點(diǎn)，轉(zhuǎn)染E.coli(DH5α)后即可獲得編碼IL6BP-2的重組質(zhì)粒，所獲得的編碼IL6BP-2的DNA序列如SEQ ID NO.7所述。
例5構(gòu)建IL6BP-3基因及重組載體IL6BP-3由M123和人免疫球蛋白IgG1 Fc區(qū)域融合而成，二者之間為肽連接段G9，其N端包含了人α-乳球蛋白(alpha-lactalbumin)的信號肽以保證其細(xì)胞外的分泌。IL6BP-3的建造是通過拼接PCR的方法構(gòu)造而得。
其中包含M123的PCR片段(462bp)是首先以上述M123基因?yàn)槟０?，和引?1和12擴(kuò)增得到424bp的DNA片段，然后以該DNA片段為模板，以引物13和12擴(kuò)增而到引物115’-TCTGCTCCTGGTTGGCATCCTATTCCATGCCACCCAGGCCTGTCTGCCGGACCAGTTCCG-3’引物125’-TCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCCGTATGCTC
TGTACAGTCTTC-3’引物135’-CCTCGAGAATTCGCAACCACCATGATGTCCTTTGTCTCTCTGCTCCTGGTTGGCATCC-3’其中包含F(xiàn)c的PCR片段(722bp)是從人淋巴結(jié)cDNA(BD Clontech公司)為模板和如下引物擴(kuò)增而得引物145’-GAGGTGGCGGAGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACC-3’引物155’-AAGGGAATCTAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3’編碼IL6BP-3的DNA是以上述462bp和722bp的PCR片段為模板，以引物13和15擴(kuò)增而得(1167bp)。將其EcoRI和NotI酶切產(chǎn)物(1141bp)插入到載體質(zhì)粒pCI-neo(Promega公司)的EcoRI和NotI酶切點(diǎn)后，轉(zhuǎn)染E.coli(DH5α)即可獲得編碼IL6BP-3的重組質(zhì)粒，所獲得的編碼IL6BP-3的DNA序列如SEQ IDNO.8所述。該重組質(zhì)粒利用CMV啟動子來表達(dá)IL6BP-3，并包含SV40的多聚腺苷酸(PolyA)序列以保證其最佳的表達(dá)量。該重組質(zhì)粒還包含氨芐青霉素(Ampicillin)抗性基因以利于在細(xì)菌中的繁殖，和新霉素(Neomycin)抗性基因以用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞的選擇。
例6構(gòu)建C326基因及重組載體編碼C326的cDNA是以包含IG和M123的PCR片段為模板拼接PCR擴(kuò)增所得。其中包含1G的PCR片段(151bp)是以上述IG基因?yàn)槟０濉⒁砸?和16擴(kuò)增而得引物165’-CCCGGCGGCTCCGATGCCGGTGCGCTACAGTTTTCTTCATCCGAG-3’包含M123的PCR片段(400bp)是以上述M123基因?yàn)槟０?、以引?和17擴(kuò)增而得引物175’-CCGGCATCGGAGCCGCCGGGCTCGCTGTGTCTGCCGGACCAGTTCCG-3’最后包含C326的PCR片段(531bp)是以上述包含IG和M123的PCR片段為模板，由引物5和8拼接PCR擴(kuò)增所得。編碼C326的DNA克隆由該P(yáng)CR片段的NdeI和XhoI酶切產(chǎn)物(509bp)插入到載體質(zhì)粒pET24b(Novagen公司)的NdeI和XhoI酶切點(diǎn)所得。轉(zhuǎn)染E.coli(DH5α)后即可獲得編碼C326的重組質(zhì)粒，其DNA序列如SEQ ID NO.9所述。
實(shí)施例2優(yōu)化多肽在細(xì)胞中的表達(dá)和提純優(yōu)化多肽IL6BP-1和IL6BP-2可在原核細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，提純后具有優(yōu)異的穩(wěn)定性和生物活性，而IL6BP-3是和人免疫球蛋白Fc區(qū)域的融合蛋白，其肽鏈需要得到糖基化修飾，因此，哺乳動物細(xì)胞是其最佳的表達(dá)系統(tǒng)。
IL6BP-1、IL6BP-2、和C326的表達(dá)和提純分別將編碼IL6BP-1、IL6BP-2、和C326的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21(DE3)GOLD(Stratagene公司)后，在培養(yǎng)基2xYT中、37℃條件下、搖晃培養(yǎng)至OD600為0.6，加入IPTG至500μM后繼續(xù)培養(yǎng)三個小時(shí)以表達(dá)該優(yōu)化多肽。細(xì)胞離心沉淀分離后，均勻打散于5倍的TBS-Ca(10mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，1mM CaCl2)緩沖液中后，在80℃的水浴中裂解細(xì)胞15分鐘，離心沉淀后，上清液中優(yōu)化多肽的比例可高達(dá)60％，然后通過二步離子交換層析柱的方法可提純至99％以上。第一步是DEAE-Sepharose層析柱(Amersham公司)，第二步是Q-Sepharose層析柱(Amersham公司)，二步層析均是利用100mM-1M的NaCl梯度洗脫，洗脫液中還包含10mM Tris，pH 7.5，和1mM CaCl2。純化后的蛋白可用A280吸收法確定濃度，并可置-20℃長期儲存，其SDS-PAGE凝膠電泳顯示于圖3。
IL6BP-3的表達(dá)和提純將編碼IL6BP-3的重組高純度質(zhì)粒利用Lipofectamine 2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染藥盒(Invitrogen公司)導(dǎo)入CHOS細(xì)胞(Invitrogen公司)中，在無血清培養(yǎng)液CHOSSFMII(Invitrogen公司)中培養(yǎng)二天后加入新酶素，用有限密度稀釋法進(jìn)行克隆培養(yǎng)，大約14天后挑取新酶素抗性克隆進(jìn)行細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)并在液氮中冷凍收藏。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的CHOS細(xì)胞可在轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)生產(chǎn)IL6BP-3，其濃度可用ELISA法定量確定。
包含IL6BP-3的細(xì)胞培養(yǎng)液可采取葡萄球菌A蛋白親和層析的方法進(jìn)行純化。將蛋白A-Sepharose層析柱以PBS緩沖液洗以平衡后，以2毫升/分鐘的速度將超濾器濃縮過的培養(yǎng)液上樣，用PBS緩沖液洗直至未結(jié)合的蛋白全被洗脫(以A280進(jìn)行監(jiān)測)，然后用100mM的檸檬酸(PH 3)洗脫結(jié)合蛋白，立刻以足夠多的2M Tris進(jìn)行中和。純化后的融合蛋白可用ELISA法或A280吸收法確定濃度，并可置-20℃長期儲存，其SDS-PAGE凝膠電泳顯示于圖3。
實(shí)施例3優(yōu)化多肽與IL-6的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)本發(fā)明利用生物素(Biotin)標(biāo)記的IL-6(R&D Systems公司)來檢測優(yōu)化多肽和IL-6的直接結(jié)合，以及其阻斷IL-6和IL-6受體的結(jié)合，從而達(dá)到抑制IL-6的生物活性的目的。所有的實(shí)驗(yàn)中均以C326為參照，以比較優(yōu)化多肽和C326的生物活性。
IL6BP-1、IL6BP-2、和IL6BP-3與IL-6的ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)在本實(shí)驗(yàn)中，以每孔100μl的30nM的優(yōu)化多肽IL6BP-1、IL6BP-2、IL6BP-3、或C326為底物直接加樣至ELISA板孔底部，然后加入不同濃度的Biotin-IL-6溫育后，再加酶結(jié)合物Streptavidin-HRP以檢測結(jié)合的IL-6，最后加TMB顯色，比色儀測量的結(jié)果原始實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖3中顯示，其中優(yōu)化多肽與IL-6的結(jié)合度和信號強(qiáng)度成正比，經(jīng)Prism4軟件(GraphPad公司)Sigmoidal非線性擬合后所得到的EC50及其標(biāo)準(zhǔn)偏差在表1中顯示。C326可以有效地和IL-6直接結(jié)合，其EC50在本實(shí)驗(yàn)中為13.3nM，而IL6BP-1和IL6BP-2的EC50分別為6.4nM和6.9nM，表示這二種優(yōu)化多肽對IL-6的親和力比C326提高了一倍。同時(shí)IL6BP-3是二聚體，其EC50為3.9nM，更加顯著地增高了對IL-6的親和力。
IL6BP-1、IL6BP-2、和IL6BP-3阻斷IL-6和IL-6受體的結(jié)合實(shí)驗(yàn)IL-6的受體是由IL-6R和GP130組成的，為了檢驗(yàn)本發(fā)明的優(yōu)化多肽是否能有效地阻斷IL-6和其受體的結(jié)合，從而抑制IL-6的信號傳遞，本實(shí)驗(yàn)首先以每孔100μl的30nM IL-6R(R&D Systems公司)為底物加樣至ELISA板孔底部，然后加入2nM的GP130(R&D Systems公司)、1nM的Biotin-IL-6、和不同濃度的優(yōu)化多肽共同溫育，最后加酶結(jié)合物Streptavidin-HRP以檢測結(jié)合的IL-6，TMB顯色后的原始實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于圖4，經(jīng)Prism4軟件Sigmoidal非線性擬合后所得到的EC50及其標(biāo)準(zhǔn)偏差在表2中顯示。由于本實(shí)驗(yàn)測量的是優(yōu)化多肽和IL-6受體對IL-6的相互競爭，因此優(yōu)化多肽與IL-6的結(jié)合度和信號強(qiáng)度成反比。C326阻斷IL-6與其受體相結(jié)合的EC50為106.8pM，而IL6BP-1、IL6BP-2、和IL6BP-3的EC50分別為51.2pM、44.0pM、和22.2pM。此結(jié)果和上述優(yōu)化多肽和IL-6直接結(jié)合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致，IL6BP-1和IL6BP-2這二種優(yōu)化多肽對IL-6的親和力比C326提高了大約一倍，IL6BP-3則比C326提高了大約5倍。
綜上所述，本發(fā)明所提供的優(yōu)化多肽IL6BP-1、IL6BP-2、和IL6BP-3具有優(yōu)良的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物活性、顯著地提高了對IL-6的親和性、并能有效地阻斷IL-6和其受體的結(jié)合，大大提高了它們在醫(yī)療應(yīng)用和診斷試劑的可用性。
實(shí)施例4IL6BP-1注射劑按制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)將IL6BP-1和藥物可接受的載體混合，冷凍干燥。
實(shí)施例5IL6BP-2注射劑按制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)將IL6BP-1和藥物可接受的載體混合，冷凍干燥。
實(shí)施例6IL6BP-3注射劑按制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)將IL6BP-1和藥物可接受的載體混合，冷凍干燥。
序列表<110>余波<120>一系列可阻斷IL-6的創(chuàng)新多肽及其醫(yī)療應(yīng)用<160>9<210>1<211>119<212>PRT<213>人工序列<400>1Cys Leu Pro Asp Gln Phe Arg Cys Gly Asn Gly Gln Cys Ile Pro Leu1 5 10 15
Asp Trp Val Cys Asp Gly Val Asn Asp Cys Pro Asp Asp Ser Asp Glu20 25 30Glu Gly Cys Pro Pro Arg Thr Cys Ala Pro Ser Gln Phe Gln Cys Gly35 40 45Ser Gly Tyr Cys Ile Ser Gln Arg Trp Val Cys Asp Gly Glu Asn Asp50 55 60Cys Glu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Asn Cys Ala Gly Ser Val Pro Thr65 70 75 80Cys Pro Ser Asp Glu Phe Arg Cys Arg Asn Gly Arg Cys Ile Pro Arg85 90 95Ala Trp Arg Cys Asp Gly Val Asn Asp Cys Ala Asp Asn Ser Asp Glu100 105 110Glu Asp Cys Thr Glu His Thr115 119<210>2<211>37<212>PRT<213>人工序列<400>2Cys His Pro Thr Gly Gln Phe Arg Cys Arg Ser Ser Gly Arg Cys Val Ser Pro1 5 10 15Thr Trp Val Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Glu Asn20 25 30 35Cys37<210>3<211>9<212>PRT
<213>人工序列<400>3Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly1 5 9<210>4<211>6<212>PRT<213>人工序列<400>4Asp Lys Thr His Thr Cys1 5 6<210>5<211>226<212>PRT<213>人工序列<400>5Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro1 5 10 15Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr20 25 30 35Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys40 45 50Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg55 60 65 70Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His75 80 85Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu90 95 100 105
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro110 115 120 125Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser130 135 140Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu145 150 155 160Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser165 170 175Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln180 185 190 195Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr200 205 210 215Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro G1y Lys220 225 226<210>6<211>501<212>DNA<213>人工序列<400>61 atgtgtcacc ctaccggcca atttagatgc cgcagtagcg gcagatgcgt ttcaccgacc61 tgggtttgcg acggcgataa tgattgtggg gacaactcgg atgaagaaaa ctgtggtgga121 ggcggaggtg gcggaggtgg atgtctgccg gaccagttcc ggtgcggcaa cggccaatgc181 attccactgg actgggtttg cgacggcgtt aatgattgtc cggacgactc ggatgaagaa241 ggctgtccac cgcgtacgtg tgcgccgagc cagttccagt gcggcagcgg ctactgcatt301 tcacagcgct gggtttgcga cggcgaaaat gattgtgagg acggctcgga tgaagcaaac361 tgtgcaggct ccgtacctac gtgtccgtcg gacgagttcc ggtgcagaaa cggccgctgc421 attccacggg cctggcgttg cgacggcgta aatgattgtg cggacaactc ggatgaagaa481 gactgtacag agcatacgta g
<210>7<211>381<212>DNA<213>人工序列<400>71 atgtgtctgc cggaccagtt ccggtgcggc aacggccaat gcattccact ggactgggtt61 tgcgacggcg ttaatgattg tccggacgac tcggatgaag aaggctgtcc accgcgtacg121 tgtgcgccga gccagttcca gtgcggcagc ggctactgca tttcacagcg ctgggtttgc181 gacggcgaaa atgattgtga ggacggctcg gatgaagcaa actgtgcagg ctccgtacct241 acgtgtccgt cggacgagtt ccggtgcaga aacggccgct gcattccacg ggcctggcgt301 tgcgacggcg taaatgattg tgcggacaac tcggatgaag aagactgtac agagcatacg361 gacaaaactc acacatgcta g<210>8<211>1125<212>PRT<213>人工序列<400>81 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcctgt61 ctgccggacc agttccggtg cggcaacggc caatgcattc cactggactg ggtttgcgac121 ggcgttaatg attgtccgga cgactcggat gaagaaggct gtccaccgcg tacgtgtgcg181 ccgagccagt tccagtgcgg cagcggctac tgcatttcac agcgctgggt ttgcgacggc241 gaaaatgatt gtgaggacgg ctcggatgaa gcaaactgtg caggctccgt acctacgtgt301 ccgtcggacg agttccggtg cagaaacggc cgctgcattc cacgggcctg gcgttgcgac361 ggcgtaaatg attgtgcgga caactcggat gaagaagact gtacagagca tacgggtgga421 ggcggaggtg gcggaggtgg agacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa481 ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc541 tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc601 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag
661 gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg721 ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag781 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca841 tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat901 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc961 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac1021 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac1081 aaccactata cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga<210>9<211>507<212>DNA<213>人工序列<400>91 atgtgtcacc ctaccggcca atttcgttgt cggagcagcg gccgttgcgt gtcaccgacc61 tgggtgtgcg atggcgataa tgactgtggc gacaactcgg atgaagaaaa ctgtagcgca121 ccggcatcgg agccgccggg ctcgctgtgt ctgccggacc agttccgctg tggcaatggc181 cagtgtattc cgctggattg ggtgtgtgat ggcgtgaatg attgtccgga cgattcggat241 gaagagggct gtccaccgcg tacctgtgcg ccgagccagt tccagtgtgg cagcggctat301 tgcatttcgc agcgctgggt gtgcgatggc gagaatgatt gtgaggatgg ctcggatgag361 gccaactgtg caggctccgt accgacctgt ccgtcggatg agttccggtg ccgcaatggc421 cgctgcattc cacgggcatg gcgttgcgat ggcgtgaatg attgtgccga taattcggat481 gaagaagact gtacagagca tacgtag
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白質(zhì)，由可結(jié)合人免疫球蛋白的多肽IG和可結(jié)合IL-6的多肽M123構(gòu)成，IG和M123之間由一個優(yōu)化肽連接段相連，該肽連接段選自以下組a.Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly，表示為G9；b.任何一個長度為4到30的氨基酸序列，其具有彈性結(jié)構(gòu)并能增加融合蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物活性。
2.一種融合蛋白質(zhì)，由多肽M123和一個多肽短鏈構(gòu)成，該肽鏈選自以下組a.人免疫球蛋白IgG1中的鉸鏈N-端肽鏈Hn，氨基酸序列為Asp Lys ThrHis Thr Cys；b.任何一個包含自由胱氨酸、長度為4到30的氨基酸序列。
3.一種融合蛋白質(zhì)，由多肽M123和人免疫球蛋白IgG1的Fc區(qū)域構(gòu)成。
4.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白質(zhì)，為IL6BP-1IG-G9-M123。
5.如權(quán)利要求2所述的融合蛋白質(zhì)，為IL6BP-2M123-Hn。
6.如權(quán)利要求3所述的融合蛋白質(zhì)，為IL6BP-3M123-G9-Fc。
7.編碼權(quán)利要求4、5、6的融合蛋白質(zhì)的重組DNA，其DNA序列見序列表中的SEQ ID NO.6、7、8。
8.包含權(quán)利要求7所述重組DNA的重組載體，該載體選自質(zhì)粒、病毒或DNA片段。
9.包含權(quán)利要求8所述重組載體的重組體，其中宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括應(yīng)用了DHFR/MTX或GS/MSX基因擴(kuò)增系統(tǒng)的宿主細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述融合蛋白質(zhì)在制備治療癌癥或自身免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述治療癌癥或自身免疫性疾病的藥物是抑制炎癥反應(yīng)的藥物。
12.一種藥物組合物，包括如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述融合蛋白質(zhì)及藥學(xué)上可接受的載體。
13.權(quán)利要求12所述的組合物，是注射劑、粉針劑、冷凍干燥劑或鼻腔噴霧劑。
14.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，還包括任何一種或幾種其他的具有協(xié)同作用的治療癌癥或抑制炎癥反應(yīng)的藥物，所述組合物可以和其他治療方法一起使用，所述其他治療方法選自化學(xué)療法、反射療法、基因療法。
15.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述融合蛋白質(zhì)在制備診斷癌癥或自身免疫性疾病的試劑中的應(yīng)用。
16.如權(quán)利要求14的應(yīng)用，所述融合蛋白質(zhì)可以和其他診斷癌癥或自身免疫性疾病的方法一起使用。
全文摘要
本發(fā)明描述了一系列創(chuàng)新的可抑制IL－6的優(yōu)化多肽蛋白，它們具有高度的生物活性、優(yōu)異的穩(wěn)定性、和良好的體內(nèi)半衰期，可以在體內(nèi)外高效結(jié)合IL－6，從而阻斷IL－6的生物作用，可用于治療多種癌癥和自身免疫性疾病，也可用于針對IL－6的診斷試劑；本發(fā)明包括這些能抑制IL－6的優(yōu)化多肽蛋白、及其編碼重組DNA序列和表達(dá)載體、該重組蛋白的藥物用途、含有該重組蛋白的藥物及其制劑。
文檔編號G01N33/574GK1876684SQ20061009078
公開日2006年12月13日 申請日期2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日
發(fā)明者余波, 鄭佳 申請人:余波