專(zhuān)利名稱(chēng)：瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種用于檢測(cè)由燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N病菌引起的瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病，即BFB的特異試劑及其制備方法，尤其是一種瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠及制備方法。
背景技術(shù)：
燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N(Acidovorax avenae subsp.citrulli)，簡(jiǎn)稱(chēng)Aac，可以引起瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病(Bacterial fruit blotch of cucurbits)，簡(jiǎn)稱(chēng)BFB，這種細(xì)菌屬于世界性檢疫有害生物，而尤其引起的上述病害是我國(guó)公布的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫危險(xiǎn)性病、蟲(chóng)、雜草名錄》中規(guī)定的三類(lèi)危險(xiǎn)性病害。
瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病目前發(fā)病地區(qū)有日益擴(kuò)大的趨勢(shì)。該病苗期癥狀常表現(xiàn)為大的黑色病斑而無(wú)任何水浸狀，這使田間診斷變的很困難，病原細(xì)菌的分離培養(yǎng)診斷需要10～14d，程序繁瑣。瓜類(lèi)種子細(xì)菌性果實(shí)腐斑病帶菌率大于0.1％時(shí)，就可能給生產(chǎn)帶來(lái)較大損失。但如此低的帶菌率，給檢測(cè)增加了很大的難度，如用99％的準(zhǔn)確度確保種子批號(hào)的帶菌率在0.1％以下，每個(gè)批號(hào)需抽取50000粒種子檢測(cè)，這就是檢測(cè)費(fèi)用高的原因之一。研制出適合我國(guó)實(shí)際的種子帶菌檢測(cè)技術(shù)，是防止該病在我國(guó)蔓延的有效措施之一。
目前檢測(cè)瓜類(lèi)種子細(xì)菌性果實(shí)腐斑病的方法有
(1)幼苗檢測(cè)。即在溫室條件下，創(chuàng)造適合瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病的發(fā)病條件，即溫度在27～30℃之間，濕度在85％以上，一般需要4～5周后才可檢測(cè)出種子細(xì)菌性果實(shí)腐斑病的帶菌率。這種方法是傳統(tǒng)的病菌檢測(cè)方法，是國(guó)際種子協(xié)會(huì)認(rèn)可的檢測(cè)方法，能反映在實(shí)際情況下可能的發(fā)病情況，但條件較難控制，費(fèi)時(shí)，占地大，費(fèi)用高。根據(jù)我國(guó)制種批次小，分散的具體實(shí)情，這種檢測(cè)方法很難推廣應(yīng)用。
(2)保濕生長(zhǎng)盒檢測(cè)法。即在透光的塑料盒中裝入蛭石和珍珠巖，然后將種子散播其上，密封后放入25℃，日光燈人工生長(zhǎng)室中，大約兩周后即可檢測(cè)出病苗。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是條件控制準(zhǔn)確，占地小，易于規(guī)范化操作，準(zhǔn)確性較高；缺點(diǎn)是有時(shí)會(huì)受苗期其它病害如瘁倒病的干擾。
(3)利用半選擇性培養(yǎng)基。將種子發(fā)芽后保濕保溫，然后將幼苗勻漿液在半選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)，找出細(xì)菌性果實(shí)腐斑病菌菌落，將其純化后再根據(jù)病菌的生理生化和病理特征確認(rèn)。也可從種子中分離獲得，可先將種皮和種胚分離后分別置于pH7.1的磷酸緩沖液中培養(yǎng)過(guò)夜，然后劃線(xiàn)分離，以確定種子是內(nèi)部帶菌還是外部帶菌。對(duì)病葉、病果，取新鮮病健交界處病斑，用KB培養(yǎng)基就能夠分離得到。瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病菌在該培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)2d可見(jiàn)菌落，3d后，菌落圓形，直徑1～2mm，3～4d后，菌落繼續(xù)擴(kuò)大，形成一個(gè)橄欖綠中心的環(huán)形，而多數(shù)其它種傳細(xì)菌菌落藍(lán)色菌落更小。
(4)血清學(xué)檢測(cè)方法。近年趨向于利用熒光抗體法和酶聯(lián)吸附法。熒光抗體法(fluorescent antibody technique)是將熒光染料與抗體以化學(xué)方法結(jié)合起來(lái)形成標(biāo)記抗體。抗體與熒光染料結(jié)合不影響抗體的特性，標(biāo)記的熒光抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合后，受熒光顯微鏡高壓汞燈光源的紫外光照射，便激發(fā)出熒光，熒光的存在就表示抗原的存在。酶聯(lián)免疫吸附法，enzyme linked immunosorbent assay簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA，是繼免疫熒光技術(shù)和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。有直接法、間接法、雙抗夾心法及競(jìng)爭(zhēng)法。ELISA具有選擇性好、靈敏度高、結(jié)果判斷客觀準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。ELISA技術(shù)對(duì)大量樣品的檢測(cè)尤其適合。血清學(xué)技術(shù)最主要的缺點(diǎn)是受抗血清質(zhì)量和專(zhuān)化性的限制。多克隆抗體制備簡(jiǎn)單，但通常和近緣細(xì)菌有交叉反應(yīng)，飽和吸附雖然可以消除部分交叉反應(yīng)，但常以降低效價(jià)為代價(jià)；單克隆抗體雖然專(zhuān)化性好，但一般只能檢測(cè)一個(gè)或幾個(gè)血清型的細(xì)菌，制備過(guò)程復(fù)雜，技術(shù)和設(shè)備要求較高。
(5)分子檢測(cè)。近些年來(lái)，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)被越來(lái)越多的應(yīng)用于植物病原細(xì)菌的檢測(cè)。由于這一技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，故而在各個(gè)領(lǐng)域包括植物病源菌方面得到廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。如中國(guó)專(zhuān)利CN02125686.1，公開(kāi)一種改進(jìn)了PCR反應(yīng)參數(shù)和目標(biāo)產(chǎn)物電泳條帶檢測(cè)程序的定量聚合酶鏈反應(yīng)方法。其特點(diǎn)是聚合酶鏈反應(yīng)的正、反引物的最終濃度為1-100uM。反應(yīng)中正、反引物的解鏈溫度為85-92℃，PCR反應(yīng)的引物長(zhǎng)度可為25-50鹼基。PCR反應(yīng)包括高溫模板變性、引物與模板退火延伸兩步。退火延伸溫度為72-82℃。并可以將染色劑SYBR金與PCR樣品混合后一起進(jìn)行電泳，然后定量測(cè)定電泳凝膠上PCR產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度，SYBR金在加樣緩沖液中的重量百分比濃度為萬(wàn)分之一至百分之一。PCR反應(yīng)更為穩(wěn)定，使PCR平坡出現(xiàn)推遲，目標(biāo)產(chǎn)物直線(xiàn)累積期增長(zhǎng)。從而使經(jīng)典PCR能在完全保持其簡(jiǎn)單、快速和專(zhuān)一的優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了定量功能的突破。將SYBR金與樣品混合一起進(jìn)行電泳的作法，則不僅提高了定量染色靈敏度，擴(kuò)展了定量測(cè)定的線(xiàn)性范圍，而且省略了染色步驟，減少了染色劑用量。
目前美國(guó)農(nóng)業(yè)部、Georgia大學(xué)和一些種子企業(yè)的科學(xué)家均已研究出瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病菌基因組專(zhuān)一的引物，這些引物主要為瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病基因組的hrp基因，16SrRNA基因和16S-23SrRNA間隔區(qū)。此法雖然其檢測(cè)的靈敏度高、速度快，但需要較多的一次性投入。
吸附介質(zhì)廣泛用于生物化學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域分離純化核酸、蛋白質(zhì)等生物分子，但未見(jiàn)用于植物病原菌鑒定的報(bào)道。免疫磁珠及是一種較先進(jìn)的吸附介質(zhì)，它是利用免疫學(xué)原理將抗體與惰性有機(jī)大分子相偶聯(lián)而形成的一種特異吸附抗原的物質(zhì)，它能像磁鐵吸附鐵一樣，特異撲捉和濃縮相對(duì)應(yīng)的抗原，如蛋白質(zhì)、酶、細(xì)菌、真菌、病毒等，將該磁珠與其它技術(shù)相結(jié)合，如ELISA、PCR等，可用于病原菌的快速診斷，極大提高診斷的特異性和靈敏度。如中國(guó)專(zhuān)利CN99252058.4，公開(kāi)一種空腸彎曲菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，應(yīng)用抗血清和磁性微珠制備空腸彎曲菌免疫磁珠，利用免疫磁珠直接捕獲檢樣中的空腸彎曲菌，煮沸法提取空腸彎曲菌的DNA，設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增空腸彎曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的引物與探針和/或空腸彎曲菌的馬尿酸酶(hipO)基因的引物與探針，通過(guò)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)得到擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)；又如中國(guó)專(zhuān)利法，包括傳感器、信號(hào)放大電路、信號(hào)處理電路、檢測(cè)顯示器和偏置磁場(chǎng)，傳感器包括各AMR薄膜構(gòu)成的惠斯登電橋；電橋的輸入端與恒流電源相連接，輸出端與信號(hào)放大電路的輸入端相連接，電橋固定地或可位移地置于偏置磁場(chǎng)中；偏置磁場(chǎng)為電磁線(xiàn)圈產(chǎn)生的單向交變磁場(chǎng)，包括產(chǎn)生交變磁場(chǎng)的變磁線(xiàn)圈；信號(hào)放大電路包括鎖相放大電路、電流放大器；鎖相放大電路還與一信號(hào)發(fā)生器的輸出端相連接，信號(hào)發(fā)生器的輸出端一方面向鎖相放大電路提供參考電壓信號(hào)，另一方面與電流放大器相連接，而電流放大器與變磁線(xiàn)圈相連接。本發(fā)明的檢測(cè)裝置生產(chǎn)成本低、靈敏度高、能探測(cè)免疫磁微球產(chǎn)生的磁場(chǎng)微弱信號(hào)。
綜上所述，利用免疫磁珠技術(shù)，建立BFB的快速檢測(cè)是控制該病傳播的有效措施。該項(xiàng)技術(shù)研究的主要目標(biāo)是建立BFB的免疫吸附分離-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即研制IAS-PCR快速檢測(cè)技術(shù)及試劑盒，其核心技術(shù)是BFB免疫磁珠的設(shè)計(jì)與研制。
二
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，設(shè)計(jì)與研制，并提出一種BFB免疫磁珠，即一種瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐癍病免疫磁珠及制備方法。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的措施在于1、制備BFB免疫抗體；將標(biāo)準(zhǔn)的BFB病原擴(kuò)大培養(yǎng)及收集菌體，超聲波峰提取菌體蛋白，制成佐劑BFB抗原，免疫家兔，待效價(jià)達(dá)到1∶64，放血獲得抗BFB血清，用硫酸銨鹽析，F(xiàn)pLc蛋白酶A柱純化得到BFB抗體IgG。
2、制作BFB免疫磁珠；
2、制作BFB免疫磁珠；將上述BFB抗體IgG，與固相載體相偶聯(lián)后即為BFB免疫磁珠，制作路線(xiàn)如下(1)、選擇不溶于水的惰性物作為固相載體；(2)、固相載體與離子交換基團(tuán)交鏈，形成離子交換固相載體；(3)、通過(guò)離子交換活化固相載體，使其帶有大量可交換的負(fù)離子；(4)、活化離子交換固相載體與BFB免疫抗體交鏈而得到BFB免疫磁珠。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于將廣泛用于生物化學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域分離純化細(xì)菌、病毒核酸、蛋白質(zhì)等生物分子的吸附介質(zhì)技術(shù)，用于植物病原菌鑒定。它是利用免疫學(xué)原理將抗體與惰性有機(jī)大分子相偶聯(lián)而形成的一種特異吸附抗原的物質(zhì)。利用免疫磁珠技術(shù)，建立BFB的快速檢測(cè)是控制該病傳播的有效措施，實(shí)現(xiàn)多種相關(guān)檢測(cè)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的整合，由于這一技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，極大提高診斷的特異性和靈敏度。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11、制備BFB免疫抗體；將標(biāo)準(zhǔn)的BFB病原擴(kuò)大培養(yǎng)及收集菌體，超聲波峰提取菌體蛋白，制成佐劑BFB抗原，免疫家兔，待效價(jià)達(dá)到1∶64，放血獲得抗BFB血清，用硫酸銨鹽析，F(xiàn)pLc蛋白酶A柱純化得到BFB抗體IgG。
2、制作BFB免疫磁珠將上述BFB抗體IgG，與固相載體相偶聯(lián)后即為BFB免疫磁珠，制作路線(xiàn)如下(1)、固相載體的選擇。這種載體為多糖聚合物，選擇SephadexCellulose或Sephadex-agrose等均可。
(2)、固相載體與離子交換基團(tuán)二乙基氨基乙基交鏈，形成離子交換固相載體。反應(yīng)如下 (3)、離子交換固相載體的活化。
(4)、活化離子交換固相載體與BFB抗體交鏈得到BFB免疫磁珠。
實(shí)施例2本發(fā)明的瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠制備方法為1、將標(biāo)準(zhǔn)的BFB病原擴(kuò)大培養(yǎng)及收集菌體，超聲波破碎提取菌體蛋白，制成佐劑BFB抗原，免疫家兔，待效價(jià)達(dá)到1∶64，放血獲得抗BFB血清，用硫酸銨鹽析，F(xiàn)pLc蛋白酶A柱純化得到BFB抗體IgG。
2、取帶有陰離子交換基因固體載體Sephadex或Cellulose等5克，加入無(wú)菌水250ml，過(guò)夜，充分溶脹。
3、將上述膠1ml裝入小層析柱中，用pH6.8，0.01mol/L的TB含0.4mol/L NaCl洗脫10ml，之后改用pH6.8，0.01mol/L TB液平衡洗脫20ml。
4、取純化的含蛋白量5mg的BFB抗體0.5ml，加入上述小層析柱中，待BFB免體進(jìn)入柱床后，此時(shí)BFB病原菌特異地被載體上的BFB抗體吸附，而后改用pH6.8，0.01mol/L TB洗脫約10ml，至洗脫液中無(wú)蛋白質(zhì)為止。層析柱中的膠即為含BFB抗體IgG的BFB免疫磁珠。取出后懸浮5ml pH6.8，0.01mol/L TB中，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 經(jīng)上述制作過(guò)程最后得到了BFB免疫磁珠，這種磁珠能有效地捕捉，濃縮種子提取液中的BFB病原。
BFB免疫磁珠應(yīng)用實(shí)例1、取待檢測(cè)疑帶菌種子2000粒三角開(kāi)口，加pH6.8 PB0.01mol/L200ml，37℃真空抽提4小時(shí)，此時(shí)種子中的BFB進(jìn)入200ml抽提液中并能擴(kuò)增BFB。
2、加入BFB免疫磁珠0.1ml懸浮液，輕輕攪拌10分鐘，此時(shí)200ml抽提液中如存在BFB病原，則全部吸附在磁珠表面。500rpm離心5分鐘，棄去上清，沉淀為可能吸附BFB病原的BFB免疫磁珠，加100μl裂解液，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3、取上述可能吸附BFB病原的BFB免疫磁珠50μl加置100℃裂解15min。
4、向上述可能吸附BFB病原的BFB免疫磁珠中，加入PCR擴(kuò)增所需的試劑和擴(kuò)增的條件擴(kuò)增。
5、擴(kuò)增后，電泳出現(xiàn)360bp特異帶，為待測(cè)樣品帶有BFB病原菌。
上述內(nèi)容中的離子交換固相載體，可以應(yīng)用于任何細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)及酶的特異性免疫磁珠。
權(quán)利要求
1.一種瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，1)、制備BFB免疫抗體；將標(biāo)準(zhǔn)的BFB病原擴(kuò)大培養(yǎng)及收集菌體，超聲波破碎提取菌體蛋白，制成佐劑BFB抗原，免疫家兔，待效價(jià)達(dá)到1∶64，放血獲得抗BFB血清，用硫酸銨鹽析，F(xiàn)pLc蛋白酶A柱純化得到BFB抗體IgG；2)、制作BFB免疫磁珠；將上述BFB抗體IgG，與固相載體相偶聯(lián)后即為BFB免疫磁珠，制作路線(xiàn)如下(1)、選擇不溶于水的惰性物作為固相載體；(2)、固相載體與離子交換基團(tuán)交鏈，形成離子交換固相載體。；(3)、通過(guò)離子交換活化固相載體，使其帶有大量可交換的負(fù)離子；(4)、活化離子交換固相載體與BFB免疫抗體交鏈。
2.如權(quán)利要求1所述的瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，固相載體的選擇，這種載體為多糖聚合物。
3.如權(quán)利要求2所述的瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，固相載體選擇Sephadex。
4.如權(quán)利要求2所述的瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，固相載體選擇Cellulose。
5.如權(quán)利要求2所述的瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，固相載體選擇Sephadex-agrose。
6.如權(quán)利要求1所述的瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，固相載體與離子交換基團(tuán)二乙基氨基乙基交鏈，形成離子交換固相載體，反應(yīng)如下
7.如權(quán)利要求1所述的瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，離子交換固相載體的活化，
8.如權(quán)利要求1所述的瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，活化離子交換固相載體與BFB抗體交鏈得到BFB免疫磁珠，
9.如權(quán)利要求1所述的瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，1)、將標(biāo)準(zhǔn)的BFB病原擴(kuò)大培養(yǎng)及收集菌體，超聲波峰提取菌體蛋白，制成佐劑BFB抗原，免疫家兔，待效價(jià)達(dá)到1∶64，放血獲得抗BFB血清，用硫酸銨鹽析，F(xiàn)pLc蛋白酶A柱純化得到BFB抗體IgG；2)、取帶有陰離子交換基因固體載體Sephadex或Cellulose等5克，加入無(wú)菌水250ml，過(guò)夜，充分溶脹；3)、將上述膠1ml裝入小層析柱中，用pH6.8，0.01mol/L的TB含0.4mol/L NaCl洗脫10ml，之后改用pH6.8，0.01mol/L TB液平衡洗脫20ml；4)、取純化的含蛋白量5mg的BFB抗體0.5ml，加入上述小層析柱中，待BFB免體進(jìn)入柱床后，此時(shí)BFB病原菌特異地被載體上的BFB抗體吸附，而后改用pH6.8，0.01mol/L TB洗脫約10ml，至洗脫液中無(wú)蛋白質(zhì)為止；層析柱中的膠即為含BFB抗體IgG的BFB免疫磁珠；取出后懸浮5ml pH6.8，0.01mol/L TB中，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
一種瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病免疫磁珠及制備方法，屬于一種用于檢測(cè)引起的瓜類(lèi)細(xì)菌性果實(shí)腐斑病BFB的燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N病菌的試劑及其制備方法，1)制備BFB免疫抗體；2)制作BFB免疫磁珠a.選擇不溶于水的惰性物作為固相載體；b.固相載體與離子交換基團(tuán)交鏈，形成離子交換固相載體；c.通過(guò)離子交換活化固相載體，帶有大量可交換的負(fù)離子；d.活化離子交換固相載體與BFB免疫抗體交鏈而得到BFB免疫磁珠。本發(fā)明利用免疫學(xué)原理將抗體與惰性有機(jī)大分子相偶聯(lián)而形成的一種特異吸附抗原的物質(zhì)，利用免疫磁珠技術(shù)，建立BFB的快速檢測(cè)，是控制該病傳播的有效措施，這一技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，提高BFB檢測(cè)的特異性和靈敏度。
文檔編號(hào)G01N33/546GK101086498SQ20061009143
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2006年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者喻梅輝, 張紅, 馬光玉, 王葉筠, 周志成, 丁建軍, 穆全昌, 姜明, 張興平 申請(qǐng)人:新疆西域?qū)崢I(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司