專利名稱：肌酐診斷試劑盒及肌酐濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肌酐診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定肌酐濃 度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
測定肌酐主要有化學(xué)測定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和 毛細(xì)管電泳法等。
化學(xué)測定法成本低廉，操作簡便，是目前國內(nèi)測定肌酐最常用的方 法之一。標(biāo)本中的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復(fù)合 物。此法的缺點(diǎn)是特異性不高，維生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多 巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質(zhì)和一些抗生素如青霉素G、頭孢西丁、 頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應(yīng)生成紅色。
高效液相層析法(HPLC),肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷，通過陽 離子交換層析柱可與其他成分很好分離，在234nm測定其光吸收。此 法分析的精密度高、特異性好，但本法不適于大批量臨床標(biāo)本分析， 通常作為肌酐測定的參考方法，用于評價(jià)市售肌酐測定的試劑盒和某 些科研目的。檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?0106198.0、申請日為1990. 12. 18 的中國專利申請公開了用高效液相色譜直接測定人尿中假尿嘧啶核苷 (簡稱假尿苷)，再通過分光光度法同時(shí)測出肌酐，分別用假尿苷和假 尿苷/肌酐作為鼻咽癌和肺癌的標(biāo)志物c 毛細(xì)管電泳法，血清標(biāo)本用高速離心作預(yù)處理，尿液標(biāo)本可用低速
離心，除去有形成分，上清液用膠束動電毛細(xì)管電泳分離后測定235nm
處吸光度。本法測定線性范圍寬，操作較為簡便，但需用特殊設(shè)備和
進(jìn)行血清標(biāo)本的預(yù)處理，臨床常規(guī)使用困難。
酶學(xué)測定法主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase )和肌
酐酶(Creatininase)兩大類。
檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?2139298.6、申請日為2002. 11. 15的專利
申請公開了應(yīng)用酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測定試劑。該發(fā) 明所指的酶法測定試劑并不加入測定反應(yīng)所需的還原型煙酰胺輔酶或 其類似物，而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類似物及其相應(yīng) 的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶-底物 -NAD或酶-底物-NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物 緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰胺輔酶或其類似物，當(dāng)被還原的還原型煙 酰胺輔酶或其類似物達(dá)到一定的濃度時(shí)，該發(fā)明所指的酶法試劑就可 達(dá)到測定樣本中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、 氨、肌酑和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的特點(diǎn)在于為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移 酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試 劑和二氧化碳試劑等的測試提供一個內(nèi)源合成丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試
劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和 二氧化碳試劑等反應(yīng)所需要的底物一還原型煙酰胺輔酶。其缺點(diǎn)之一 為，這個系統(tǒng)在生成反應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時(shí)，也抵消 了部分丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐 和二氧化碳等的活性，造成試劑測試的準(zhǔn)確性大大降低。其缺點(diǎn)之二
是，該試劑在正式測試前必須事先反應(yīng)一段時(shí)間，以便能夠產(chǎn)生足夠 的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來就造成了緩不濟(jì)急的結(jié)果，給測試帶
來很大的不便。
據(jù)申請?zhí)枮?2139298.6、申請日為2002.11.15的專利介紹，該 系統(tǒng)由于不斷生成測定所需的NADH或NADPH，從而大大提高了試劑的 穩(wěn)定性，并大大降低試劑的生產(chǎn)成本。其實(shí)在試劑中加入NADH或NADPH 的穩(wěn)定劑已經(jīng)不是困難或增加成本的問題，反而比在試劑中增加一個 反應(yīng)系統(tǒng)要經(jīng)濟(jì)得多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法
(Enzymatic Recycling Method)、 酶比色》去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還原型 煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定 肌酐濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的肌酐診斷 試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生 化分析儀上進(jìn)行肌酐濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可 以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明肌酐濃度測定方法原理如下
肌酐+水肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子 氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸
+水+輔酶
丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+
過氧化氫
肌酐脫亞胺酶(creatinine deaminase ; EC 3.5.4.21)作為作用酶， 功能為將肌酐酶解產(chǎn)生氨離子。甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC1.4.3.19)作為循環(huán)酶甘氨酸氧化酶的酶促作用使丙氨酸再次變回氨
離子和丙酮酸，使氨離子不斷地被重復(fù)循環(huán)利用。丙氨酸脫氫酶
(alanine dehydrogenase ; EC 1.4丄1)作為顯色酶，在不斷地被重復(fù) 循環(huán)利用的氨離子和丙酮酸的一起作用下，使還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)不斷地被氧化成為氧化型輔酶(在340nrn處沒有吸收峰)， 從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量 340nm處吸光度下降的速度，可以測算肌酐的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明肌酐診斷試
劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸 16mmol/L
肌酐脫亞胺酶 6000 U/L
丙氨酸脫氫酶 10000 U/L
甘氨酸氧化酶 8000 U/L
本發(fā)明的肌酐診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨 酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。 也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧 化酶。
還原型輔酶、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶，丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化
酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在 使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧 化酶。
還原型輔酶、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化 酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉 狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定肌酐濃度的方法，其還原 型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明( 實(shí)施例一
本實(shí)施例的肌酐診斷試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 丙酮酸
肌酐脫亞胺酶
謹(jǐn)mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 16 mmol/L
6000 U/L 10000 U/L
甘氨酸氧化酶 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；
使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始
吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐
樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲
時(shí)間大約1分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化
分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出肌酐的
濃度大小。
實(shí)施例二
本實(shí)施例的肌酐診斷試劑為雙試劑，包括:
試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
丙酮酸
100mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
肌酐脫亞胺酶 丙氨酸脫氫酶 甘氨酸氧化酶
50 mmol/L 細(xì)0 U/L 16000U/L 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐 樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降 反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出肌酐的 濃度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的肌酐診斷試劑為三試劑，包括-試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 還原型輔f
50 mmol/L 0.25 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
丙酮酸
100 mmol/L 50 mmol/L 12 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
肌酐脫亞胺酶
甘氨酸氧化酶
100 mmol/L 50 mmol/L 6000 U/L 12000U/L 12000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定肌酐濃度時(shí)，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng) 時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長 405nm，被測肌酐樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5， 反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測時(shí)間 2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出肌酐的 濃度大小。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)
用o
權(quán)利要求
1.一種酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的肌酐濃度測定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100968820002C1.gif" wi="133" he="48" top= "48" left = "38" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出肌酐的濃度大小測定結(jié)果。
2, 一種肌酐診斷試劑盒，主要成分包括:緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 1--500 mmol/L還原型輔酶 0.1--0.35 mmol/L丙酮酸 2---30 mmol/L肌酐脫亞胺酶2000---12000 U/L丙氨酸脫氫酶 4000--20000U/L甘氨酸氧化酶 2000-12000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用: 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸 脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸 脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 還原型輔酶、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞 胺酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成。還原型輔酶、丙酮酸、 肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸 脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 還原型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸組成；試劑 3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧 化酶組成。還原型輔酵、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、 甘氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的肌酐診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定肌酐濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出肌酐的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果。
文檔編號G01N33/70GK101169419SQ20061009688
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司