專利名稱：銅診斷/測定試劑盒及銅濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種銅診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定銅濃 度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。
背景技術：
正常成人體內含銅量為80~150mg，血循環(huán)銅占總銅量的10%。血 槳中約95°/。銅32球蛋白牢固結合，稱為銅藍蛋白(Ceruloplasmin)，經(jīng) 酸處理后才能與銅試劑反應。其余5%為游離銅。許多酶都含有銅，如 細胞色素氧化酶、超氧化物岐化酶、尿酸氧化酶、賴氨酸氧化酶、酪 氨酸酶、多巴胺3-羥化酶等。與白蛋白疏松結合的銅是運輸、吸收、 排泄的重要形式和中間環(huán)節(jié)，也是合成各種細胞蛋白的原料。其它銅 蛋白還有血銅蛋白、肝蛋白和腦銅蛋白。銅參與造血過程，主要影響 鐵的吸收、運送和利用。
生物體液與組織中銅的測定方法包括分光光度法，火焰和無火焰原 子吸收分光光度法、發(fā)射光譜法、中子活化分析法和陽極溶出伏安法 等。銅的分光光度法都是利用銅形成有色絡合物。火焰原子吸收法利 用銅離子在火焰中被還原為CiA從銅空心陰極燈發(fā)出的光波C^吸收 的量與濃度成正比，用于血清、尿、組織中銅的測定。陽極溶出伏安 法是將銅離子作為汞齊被鍍于陽極上，電壓變得更正，使Cu從陽極"剝
下"或再次溶解，形成的電流與Cu的濃度成正比，廣泛應用于環(huán)境分 析。中子活化分析是利用中子將"Cu轉變成不穩(wěn)定6401同位素，后者 衰變時釋放Y射線可在1。 34MeV計數(shù)，應用于特定研究中心。
發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環(huán)擴增法 (Enzymatic Recycling Method)、 酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術，計量通過酶聯(lián)反應生成 吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)所導致 在400—700nm波長處吸光度的上升，得以測定銅濃度的方法，同時， 本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的銅診斷/測定試劑盒，采用該試劑不 僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行銅濃度測定， 而且測定速度快、靈敏度大、準確度高，因而可以得到切實的推廣應 用。
本發(fā)明銅濃度測定方法原理如下-賴氨酸+氧+水賴氨酸氧化酶/Cu24 6-氨基-2-氧代己酸
+氨+過氧化氫
氨+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶丙氨酸+水
+輔酶
丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨+丙酮酸+
過氧化氫
過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亞胺色原+水
這種方法應用需要銅激活的賴氨酸氧化酶(lysine oxidase; EC 1.4.3.13; EC 1.4.3.14)酶(偶)聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase; EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)及過氧化 物酶(peroxidase ; EC 1.1L1.7)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法。賴氨酸氧化酶 作為作用酶，功能為將賴氨酸酶解產(chǎn)生氨及過氧化氫。丙氨酸脫氫酶、 甘氨酸氧化酶作為循環(huán)酶丙氨酸脫氫酶的酶促作用使氨產(chǎn)生丙氨酸； 甘氨酸氧化酶再將丙氨酸再次變回氨并同時產(chǎn)生過氧化氫，使氨不斷 地被重復循環(huán)利用，因此連續(xù)不斷地產(chǎn)生過氧化氫。過氧化物酶作為 顯色酶，通過和過氧化氫的作用，使無色的還原型色原體組合氧化成 有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400—700nm (根據(jù)還 原型色原體組合的不同而定)波長處測定染料一吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneiminedye)—含量高低的光吸收大小速度， 得出銅濃度大小測定結果。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，如下成分關系的本發(fā)明銅診斷/測定試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
20 mmol/L 16 mmol/L 12000U/L 16000U/L
丙酮酸
賴氨酸氧化酶
甘氨酸氧化酶 16000 U/L
過氧化物酶 30000 U/L
還原型色原體組合 0.1——20 mmol/L
所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任何
一個配對組合.-
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基~ N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-雙氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
雙甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺
4- 氨基抗砒 石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基■~N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒 雙甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-翔基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
本發(fā)明的銅診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、賴氨酸、丙酮酸、賴氨酸氧化酶、丙 氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。試劑 盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、還原型輔酶、賴氨酸、 丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、賴氨酸氧 化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、賴氨酸、丙酮酸、 賴氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、還原型輔酶。
試劑2
緩沖液、還原型色原體組合、賴氨酸、丙酮酸。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、賴氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、 甘氨酸氧化酶。
過氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、賴氨酸、丙酮酸、 賴氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或試 劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的銅診斷/測定試劑為單試劑，包括: 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶
丙酮酸
賴氨酸氧化酶 丙氨酸脫氫酶 甘氨酸氧化酶 過氧化物酶
畫mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 16 mmol/L 12000U/L 16000U/L 16000U/L 30000 U/L
4-氨基抗砒 石碳酸
2 mmol/L
10 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間IO分鐘，測 試主波長505nm，測試副波長600nm，被測銅樣品與試劑的體積比例 為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時 間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的速度，從而測算出銅的濃 度大小。 實施例二
本實施例的銅診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑 還原型輔酶
丙酮酸
2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 16 mmol/L 0.2 mmol/L
試劑2
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 賴氨酸氧化f
甘氨酸氧化酶
過氧化物酶
4-氨基抗砒
50 mmol/L 15000U/L 12000U/L 16000U/L 扁00U/L 0.6 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37X:，反應時間10分鐘，測試
主波長546nm,測試副波長600nm，被測銅樣品與試劑的體積比例為
1/20，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間
大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化
分析儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的速度，從而測算出銅的濃
度大小。
實施例三
本實施例的銅診斷/測定試劑為三試劑，包括: 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
100 mmol/L 50 mmol/L
0,25 mmol/L 0.6 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
試劑3
丙酮酸 雙甲基苯胺
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
100 mmol/L 20 mmol/L 16 mmol/L 2 mmol/L
穩(wěn)定劑
賴氨酸氧化酶 丙氨酸脫氫酶
100 mmol/L
50 mmol/L
12000U/L 12000U/L
甘氨酸氧化酶 12000 U/L
過氧化物酶 20000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37i:，反應時間10分鐘，測試
主波長578nm，測試副波長660nm，被測銅樣品與試劑的體積比例為
1/30，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為速率法，延遲時間
大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化
分析儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的速度，從而測算出銅的濃
度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分 析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內外源 物質量污染。
權利要求
1.一種酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的銅濃度測定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100968860002C1.gif" wi="133" he="81" top= "48" left = "38" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度，得出銅濃度大小測定結果。
2. —種銅診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——5Ommol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L賴氨酸 1——5Ommol/L丙酮酸 1——50mmol/L過氧化物酶 500——80000 U/L賴氨酸氧化酶 1000——80000 U/L丙氨酸脫氫酶 1000——80000 U/L甘氨酸氧化酶 1000——80000 U/L還原型色原體組合 0.1——20 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。3. 根據(jù)權利要求2所述銅診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、賴氨酸、丙酮酸、賴氨酸氧化酶、 丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組 成單劑試劑。4. 根據(jù)權利要求2所述銅診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、賴氨酸、丙酮酸、賴氨酸氧化酶、 丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組 成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、賴氨酸、 丙酮酸、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、賴 氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型 色原體組合組成。過氧化物酶、還原型色原體組合、還原型輔酶、 賴氨酸、丙酮酸、賴氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在 試劑1或試劑2中的位置可以不限。5. 根據(jù)權利要求2所述銅診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、賴氨酸、丙酮酸、賴氨酸氧化酶、 丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組 成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、賴氨酸、丙酮酸、還原型色原 體組合組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、賴氨酸氧化酶、丙氨酸 脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶組成。過氧化物酶、還原型色 原體組合還原型輔酶、賴氨酸、丙酮酸、賴氨酸氧化酶、丙氨酸脫 氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。6. 根據(jù)權利要求2所述銅診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1—4000 mmol/L或0.1Q/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。7. 根據(jù)權利要求2所述銅診斷/測定試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個組合中的任一個配對組合 3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒2.4- 雙氯石碳酸4-氨基抗砒2,4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3.5- 雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的銅診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定銅濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、賴氨酸、丙酮酸、賴氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合及穩(wěn)定劑；通過一系列的酶促反應，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在40-700nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出銅濃度的大小。
文檔編號G01N33/84GK101169425SQ20061009688
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優(yōu)先權日2006年10月24日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司