專利名稱：銅診斷/測(cè)定試劑盒及銅濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種銅診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定銅濃 度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景正常成人體內(nèi)含銅量為80-150mg，血循環(huán)銅占總銅量的10%。血 漿中約95。/。銅a2球蛋白牢固結(jié)合，稱為銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin)，經(jīng) 酸處理后才能與銅試劑反應(yīng)。其余5%為游離銅。許多酶都含有銅，如 細(xì)胞色素氧化酶、超氧化物岐化酶、尿酸氧化酶、賴氨酸氧化酶、酪 氨酸酶、多巴胺P-羥化酶等。與白蛋白疏松結(jié)合的銅是運(yùn)輸、吸收、 排泄的重要形式和中間環(huán)節(jié)，也是合成各種細(xì)胞蛋白的原料。其它銅 蛋白還有血銅蛋白、肝蛋白和腦銅蛋白。銅參與造血過(guò)程，主要影響 鐵的吸收、運(yùn)送和利用。生物體液與組織中銅的測(cè)定方法包括分光光度法，火焰和無(wú)火焰原 子吸收分光光度法、發(fā)射光譜法、中子活化分析法和陽(yáng)極溶出伏安法 等。銅的分光光度法都是利用銅形成有色絡(luò)合物。火焰原子吸收法利 用銅離子在火焰中被還原為CiA從銅空心陰極燈發(fā)出的光波C^吸收 的量與濃度成正比，用于血清、尿、組織中銅的測(cè)定。陽(yáng)極溶出伏安 法是將銅離子作為汞齊被鍍于陽(yáng)極上，電壓變得更正，使Cu從陽(yáng)極"剝 下"或再次溶解，形成的電流與Cu的濃度成正比，廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析。中子活化分析是利用中子將"Cu轉(zhuǎn)變成不穩(wěn)定6401同位素，后者 衰變時(shí)釋放Y射線可在1。 34MeV計(jì)數(shù)，應(yīng)用于特定研究中心。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的 變化，得以測(cè)定銅濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方 法的銅診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或 半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行銅濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度 高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明銅濃度測(cè)定方法原理如下-賴氨酸+氧+水賴氨酸氧化酶/012+ 6-氨基-2-氧代己酸+氨+過(guò)氧化氫 氨+肌苷單磷酸+輔酶鳥苷單磷酸還原酶鳥苷單磷酸+還原'性輔酶這種方法應(yīng)用需要銅激活的賴氨酸氧化酶(lysine oxidase; EC 1.4.3.13; EC 1.4.3.14)酶(偶)聯(lián)鳥苷單磷酸還原酶(Guanosine 5'-phosphate reductase ; EC 1.7.1.7)酶促反應(yīng)速率比色法。賴氨酸氧 化酶酶解賴氨酸反應(yīng)產(chǎn)生氨，再通過(guò)(偶)聯(lián)合鳥苷單磷酸還原酶的 作用，最終將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在 340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上 升的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上升的速度，可以測(cè)算銅的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明銅診斷/測(cè)定試劑盒較為理想緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 50 mmol/L輔酶 3 mmol/L賴氨酸 20 mmol/L肌苷單磷酸 16mmol/L賴氨酸氧化酶 12000 U/L鳥苷單磷酸還原酶 16000 U/L本發(fā)明的銅診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、賴氨酸、肌苷單磷酸、賴氨酸氧化酶、 鳥苷單磷酸還原酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、賴氨酸、肌苷單磷酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、賴氨酸氧化酶、鳥苷單磷酸還原酶。 輔酶、賴氨酸、肌苷單磷酸、賴氨酸氧化酶、鳥苷單磷酸還原酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2緩沖液、賴氨酸、肌苷單磷酸。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、賴氨酸氧化酶、鳥苷單磷酸還原酶。 輔酶、賴氨酸、肌苷單磷酸、賴氨酸氧化酶、鳥苷單磷酸還原酶在 試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定銅濃度的方法，其輔酶可 以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的銅診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑 50 mmol/L輔酶 3 mmol/L賴氨酸 20 mmol/L肌苷單磷酸賴氨酸氧化酶鳥苷單磷酸還原酶16 mmol/L 12000U/L 16000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)銅樣品 與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間 大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出銅的濃 度大小。 實(shí)施例二本實(shí)施例的銅診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L3 mmol/L 12 mmol/L 16 mmol/LL苷單磷酸試劑2(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑50 mmol/L賴氨酸氧化酶 16000 U/L鳥苷單磷酸還原酶 16000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)銅樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出銅的濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的銅診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑輔酶 試劑210Ommol/L 50 mmol/L 3 mmol/L三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液肌苷單磷酸10Ommol/L 20 mmol/L 20 mmol/L試劑3垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L賴氨酸氧化酶 10000 U/L鳥苷單磷酸還原酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定銅濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時(shí) 間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm， 被測(cè)銅樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約.分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘 左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出銅的濃度大小。申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí) 施例類同，不另一一例舉。總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分 析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1. 一種酶比色法及酶聯(lián)法的銅的濃度測(cè)定方法，其方法原理如下賴氨酸+氧+水賴氨酸氧化酶/Cu2+6-氨基-2-氧代己酸 +氨+過(guò)氧化氫氨+肌苷單磷酸+輔酶鳥苷單磷酸還原酶鳥苷單磷酸 +還原性輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出銅的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種銅診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括: 緩沖液 穩(wěn)定劑20-500 mmol/L50 mmol/L6 mmol/L50 mmol/L肌苷單磷酸賴氨酸氧化酶鳥苷單磷酸還原酶50 mmol/L1000——80000 U/L1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用: 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述銅診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、賴氨酸、肌苷單磷酸、賴氨酸氧化酶、 鳥苷單磷酸還原酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述銅診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、賴氨酸、肌苷單磷酸、賴氨酸氧化酶、鳥苷單磷酸還原酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔 酶、賴氨酸、肌苷單磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、賴氨 酸氧化酶、鳥苷單磷酸還原酶組成。輔酶、賴氨酸、肌苷單磷酸、 賴氨酸氧化酶、鳥苷單磷酸還原酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述銅診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、賴氨酸、肌苷單磷酸、賴氨酸氧化酶、 鳥苷單磷酸還原酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔 酶組成；試劑2，由緩沖液、賴氨酸、肌苷單磷酸組成；試劑3， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、賴氨酸氧化酶、鳥苷單磷酸還原酶組成。輔酶、 賴氨酸、肌苷單磷酸、賴氨酸氧化酶、鳥苷單磷酸還原酶在試劑1、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述銅診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的銅診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定銅濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、賴氨酸、肌苷單磷酸、賴氨酸氧化酶、鳥苷單磷酸還原酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出銅的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過(guò)紫外/可見(jiàn)光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N33/84GK101221187SQ20061009688
公開(kāi)日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司