專利名稱：巖藻糖苷酶診斷試劑盒及巖藻糖苷酶活性測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種巖藻糖苷酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定 巖藻糖苷酶活性的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1980年法國(guó)學(xué)者Deugnier等研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者血清巖藻 糖苷酶升高，并被眾多的研究所證實(shí)。故有人提出巖藻糖苷酶可作為 原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)志物，與甲胎蛋白聯(lián)合或參照應(yīng)用大大提高了診 療價(jià)值。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，巖藻糖苷酶對(duì)某些疾病的發(fā)生、發(fā)展均具 有重要意義。
血清巖藻糖苷酶測(cè)定主要有熒光法和比色法。比色法以4-硝基苯a 丄-巖藻吡喃糖苷或4-硝基苯(1丄-巖藻糖苷為底物顯色，本法簡(jiǎn)便，設(shè) 備要求不高，國(guó)內(nèi)外廣泛采用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)色原在410或366nrn波長(zhǎng)處吸 光度的變化，得以測(cè)定巖藻糖苷酶活性的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給 出用以實(shí)現(xiàn)該方法的巖藻糖苷酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以 在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行巖藻糖苷酶活性 測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明巖藻糖苷酶活性測(cè)定方法原理如下-
合成色原巖藻糖苷底物巖藻糖苷酶色原+相應(yīng)巖藻糖苷 這種方法應(yīng)用巖藻糖苷酶酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法，巖藻糖苷酶酶解合
成色原巖藻糖苷底物釋放出色原(在410或366nrn處有吸收峰)， 從而得以測(cè)定410或366nrn處吸光度上升的速度，可以測(cè)算巖藻 糖苷酶的活性大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合 考慮，無(wú)論是單劑或雙劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明巖藻糖苷酶診斷試
劑盒較為理想
緩沖液 500 mmol/L
穩(wěn)定劑 10 mmol/L
合成色原巖藻糖苷底物 3 mmol/L
本發(fā)明的巖藻糖苷酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、合成色原巖藻糖苷底物。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑-試劑1
緩沖液 。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、合成色原巖藻糖苷底物。 合成色原巖藻糖苷底物在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。
無(wú)論是單劑或雙劑，本發(fā)明測(cè)定巖藻糖苷酶活性的方法，其合成色 原巖藻糖苷底物可以是對(duì)硝基苯基-2-o- (oc-L-吡喃巖藻糖苷)-卩-D-吡 喃半乳糖、對(duì)硝基苯基-巖藻糖苷、對(duì)硝基苯基-ot-L-吡喃巖藻糖苷或 4-甲基傘形酮-a-L-巖藻糖苷中的 一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的巖藻糖苷酶診斷試劑為單試劑，包括
檸檬酸鈉緩沖液 pH6.0 500 mmol/L
穩(wěn)定劑 10mmol/L 對(duì)硝基苯基-2-o- (a-L-吡喃巖藻糖苷)-p-D-吡喃半乳糖
3 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成千粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起 始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)410nm，測(cè)試副波長(zhǎng)505nm，被測(cè)巖藻糖 苷酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))， 延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生 化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)410nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出巖藻
糖苷酶的活性大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的巖藻糖苷酶診斷試劑為雙試劑，包括:
試劑l
檸檬酸鈉緩沖液 pH6.0
500 mmol/L
試劑2
檸檬酸鈉緩沖液 pH6.0 穩(wěn)定劑
4-甲基傘形酮-a-L-巖藻糖苷
500 mmol/L 10 mmol/L 3 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)366nm，測(cè)試副波長(zhǎng)505nm,被測(cè)巖藻糖苷 酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上 升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)366nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出巖 藻糖苷酶的活性大小。 總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析 儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好、不受內(nèi)外源物 質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種巖藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)活性測(cè)定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972140002C1.gif" wi="130" he="6" top= "38" left = "40" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應(yīng)物置于可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)410或366nm吸光度上升的速度，測(cè)算出巖藻糖苷酶的活性大小測(cè)定結(jié)果。合成色原-巖藻糖苷底物可以是下列底物中之任何一種對(duì)硝基苯基-2-o-(α-L-吡喃巖藻糖苷)-β-D-吡喃半乳糖(p-Nitrophenyl-2-o-(α-L-fucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside)對(duì)硝基苯基-巖藻糖苷(p-Nitrophenyl-α-L-fucoside)對(duì)硝基苯基-α-L-吡喃巖藻糖苷(p-Nitrophenyl-a-L-fucopyranoside)以上三種底物其吸收波長(zhǎng)皆為410nm4-甲基傘形酮-α-L-巖藻糖苷(4-Methylumbelliferyl-α-L-fucoside)吸收波長(zhǎng)366nm。
2. —種巖藻糖苷酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——50 mmol/L合成色原-巖藻糖苷底物 0.3——12 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述巖藻糖苷酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、合成色原-巖藻糖苷底物組成單劑試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述巖藻糖苷酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、合成色原-巖藻糖苷底物組成雙劑試劑；試劑1， 由緩沖液組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、合成色原-巖藻糖苷底 物組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種巖藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定巖藻糖苷酶活性的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、合成色原-巖藻糖苷底物及穩(wěn)定劑，這些成分可以配成單劑試劑盒及雙劑試劑盒；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)410nm或366nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出巖藻糖苷酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過(guò)可見(jiàn)光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N21/25GK101169366SQ20061009721
公開(kāi)日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司