專利名稱：氨診斷/測定試劑盒及氨的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定氨濃 度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。 目前應(yīng)用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析 法。
擴散法是標(biāo)本堿化后，釋放出NH3，用酸滴定釋放出的氨，或用 Nessler反應(yīng)形成棕黃色碘化雙滎胺進(jìn)行比色。這些方法需要堿化，內(nèi) 源性的氨形成造成影響，使其準(zhǔn)確性和精密度受到影響，目前已很少 應(yīng)用；離子交換法比擴散法更準(zhǔn)確，CV為8X 13X;離子選擇電極 法是利用NH3擴散到電極表面，引起電極的PH發(fā)生變化進(jìn)行測定， 該方法的CV為3.5X 4.8X，回收率高。結(jié)合具體實際，應(yīng)以酶法測 定為實用。
檢索中國專利，僅査出87105593.7專利申請公開了一種血氨測定 速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù) 監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化， 得以測定氨濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的氨
診斷/測定試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、 全自動生化分析儀上進(jìn)行氨濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高， 因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明氨濃度測定方法原理如下
氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺
+腺苷二磷酸+磷酸根
磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶
甘油酸-l,3-雙磷酸+還原型輔酶
這種方法應(yīng)用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase ; EC6.3丄2) 偶聯(lián)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ; EC 1.2丄59)酶促反應(yīng)終點法。谷氨酰胺合成酶酶解氨反應(yīng)產(chǎn)生磷酸 根，再通過偶聯(lián)甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm 處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而 得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm 處吸光度上升的程度，可以測算氨的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨診斷/測定
試劑盒較為理想
緩沖液 100riimol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 4000 U/L 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 6000 U/L
谷氨酸 16mmol/L 腺苷三磷酸 6 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 4mmol/L 本發(fā)明的氨診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、 谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。 輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、谷氨酰胺合成酶、甘 油醛-3-磷酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以 是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直 接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。 輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、谷氨酰胺合成酶、甘
油醛-3-磷酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試
劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體
試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨濃度的方法，其輔酶可
以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實施例一
本實施例的氨診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 4000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 6000 U/L
谷氨酸 16mmol/L
腺苷三磷酸 6 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 4 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨樣品 與試劑的體積比例為1/25,反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間 大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨的濃 度大小。 實施例二
本實施例的氨診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶
谷氨酸
腺苷三磷酸
甘油醛-3-磷酸
3 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L 6 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
谷氨酰胺合成酶
6000U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始
吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨樣品
與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，
延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化
分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨的濃
度大小。
實施例三
本實施例的氨診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶
10Ommol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 .穩(wěn)定劑 腺苷三磷酸 甘油醛-3-磷酸
100mmol/L 50 mmol/L 4 mmol/L 8 mmol/L
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 8000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 4000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定氨濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時 間10分鐘，起始吸光度《0.1,測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測氨樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘 左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨的濃 度大小。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法的氨的濃度測定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972270002C1.gif" wi="133" he="37" top= "38" left = "36" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出氨的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種氨診斷/測定試劑盒，主要成分包括: 緩沖液 穩(wěn)定劑20-500 mmol/L50 mmol/L輔酶谷氨酰胺合成酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶谷氨酸腺苷三磷酸甘油醛-3-磷酸 其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 也可以配制成液體試劑，直接使用。6 mmol/L1000-80000 U/L1000-80000 U/L20 mmol/L1-12 mmol/L8 mmol/L在使用前加水溶解后使用;
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述氨診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、谷氨酰胺合成酶、甘油酸-3-磷酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫 酶組成。輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、谷氨酰胺合 成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油醛-3-磷酸組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成。輔酶、谷氨酸、腺苷 三磷酸、甘油醛-3-磷酸、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1-4000 mmol/L或0.1。/n-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定氨濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出氨的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果。
文檔編號G01N33/53GK101169411SQ20061009722
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司