專利名稱：銅診斷/測定試劑盒及銅濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種銅診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定銅濃 度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
正常成人體內(nèi)含銅量為80~150mg，血循環(huán)銅占總銅量的10%。血 漿中約95。/。銅a2球蛋白牢固結(jié)合，稱為銅藍蛋白(Ceruloplasmin),經(jīng) 酸處理后才能與銅試劑反應(yīng)。其余5%為游離銅。許多酶都含有銅，如 細胞色素氧化酶、超氧化物岐化酶、尿酸氧化酶、賴氨酸氧化酶、酪 氨酸酶、多巴胺P-羥化酶等。與白蛋白疏松結(jié)合的銅是運輸、吸收、 排泄的重要形式和中間環(huán)節(jié)，也是合成各種細胞蛋白的原料。其它銅 蛋白還有血銅蛋白、肝蛋白和腦銅蛋白。銅參與造血過程，主要影響 鐵的吸收、運送和利用。
生物體液與組織中銅的測定方法包括分光光度法，火焰和無火焰原
子吸收分光光度法、發(fā)射光譜法、中子活化分析法和陽極溶出伏安法 等。銅的分光光度法都是利用銅形成有色絡(luò)合物?；鹧嬖游辗ɡ?用銅離子在火焰中被還原為CuQ，從銅空心陰極燈發(fā)出的光波CuG吸收 的量與濃度成正比，用于血清、尿、組織中銅的測定。陽極溶出伏安 法是將銅離子作為汞齊被鍍于陽極上，電壓變得更正，使Cu從陽極"剝 下"或再次溶解，形成的電流與Cu的濃度成正比，廣泛應(yīng)用于環(huán)境分
析。中子活化分析是利用中子將"Cu轉(zhuǎn)變成不穩(wěn)定6401同位素，后者 衰變時釋放Y射線可在1。 34MeV計數(shù)，應(yīng)用于特定研究中心。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶倍增法(Enzymatic doubling Method)、酶比色t去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶) 聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定銅濃度的方法，同時，本發(fā) 明還將給出用以實現(xiàn)該方法的銅診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可 以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行銅濃度測定， 而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明銅濃度測定方法原理如下
賴氨酸+氧+水賴氨酸氧化酶/Cu^ 6-氨基-2-氧代己酸
+氨+過氧化氫
氨+酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+
水+輔酶
過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+ 2水 這種方法應(yīng)用需要銅激活的賴氨酸氧化酶(lysine oxidase; EC 1.4.3.13; EC 1.4.3.14)酶(偶)聯(lián)谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase; EC 1.4.1.2; EC 1.4.1.3)、 NADH過氧化物酶(NADH peroxidase ; EC
l.ll丄l; EC1.11丄2)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測/速率比色法。賴氨酸氧化酶
酶解賴氨酸反應(yīng)產(chǎn)生氨及過氧化氫，再通過(偶)聯(lián)合谷氨酸脫氫酶、
NADH過氧化物酶分別作用于氨及過氧化氫，最終都將還原型輔酶(在
340nrn處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nrn處沒有吸收峰)，從而 得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm 處吸光度下降的速度，可以測算銅的濃度大小。谷氨酸脫氫酶及NADH 過氧化物酶可以只加一個，二個都加就起倍增作用，可以提高靈敏度'倍。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明銅診斷/測定 試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
賴氨酸 20 mmol/L
酮戊二酸酯 16 mmol/L
賴氨酸氧化酶 12000 U/L
谷氨酸脫氫酶 16000 U/L
本發(fā)明的銅診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括-
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、賴氨酸、酮戊二酸酯、賴氨酸 氧化酶、谷氨酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、賴氨酸、酮戊二酸酯。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、賴氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、賴氨酸、酮戊二酸酯、賴氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶 在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2
緩沖液、賴氨酸、酮戊二酸酯。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、賴氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、賴氨酸、酮戊二酸酯、賴氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶 在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀 態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定銅濃度的方法，其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的銅診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
酮戊一
指
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 16 mmol/L 12000U/L 16000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm,測試副波長405nm，被測銅樣 品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時 間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出銅的濃 度大小。 實施例二
本實施例的銅診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
畫mmol/L
50 mmol/L
還原型輔f
0.25 mmol/L12 mmol/L
酮戊二酸酯
20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
賴氨酸氧化酶
100mmol/L
50 mmol/L
16000U/L 20000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測銅樣 品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反 應(yīng))，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出銅的濃 度大小。 實施例三
本實施例的銅診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑 還原型輔酶 試劑2
100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
酮戊二酸酯
100mmol/L 10 mmol/L 26 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑
賴氨酸氧化酶
50 mmol/L 24000 U/L 36000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定銅濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時 間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7,測試主波長340nm，測試副波長 405nm，被測銅樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5， 反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間 2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出銅的濃
度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)
用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的銅濃度測定方法，其方法原理如下賴氨酸+氧+水 賴氨酸氧化酶/Cu2+ 6-氨基-2-氧代己酸 +氨+過氧化氫氨+酮戊二酸酯+還原型輔酶 谷氨酸脫氫酶 谷氨酸+ 水+輔酶過氧化氫+還原型輔酶 NADH過氧化物酶 輔酶+2水將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出銅的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種銅診斷/測定試劑盒，主要成分包括: 緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 1-20 mmol/L還原型輔酶 0.1-0.35 mmol/L賴氨酸 1-50 mmol/L酮戊二酸酯 1-50 mmol/L賴氨酸氧化酶1000"——80000 U/L谷氨酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液體試劑，直接使用。根據(jù)權(quán)利要求2所述銅診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、賴氨酸、酮戊二酸酯、賴氨酸氧 化酶、谷氨酸脫氫酶組成單劑試劑。
3.
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述銅診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、賴氨酸、酮戊二酸酯、賴氨酸氧 化酶、谷氨酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 還原型輔酶、賴氨酸、酮戊二酸酯組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定 齊U、賴氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、賴氨酸、酮 戊二酸酯、賴氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述銅診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、賴氨酸、酮戊二酸酯、賴氨酸氧 化酶、谷氨酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 還原型輔酶組成；試劑2,由緩沖液、賴氨酸、酮戊二酸酯組成； 試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、賴氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶組成。 還原型輔酶、賴氨酸、酮戊二酸酯、賴氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶 在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述銅診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1—4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的銅診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定銅濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、賴氨酸、酮戊二酸酯、賴氨酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出銅的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果。
文檔編號G01N33/84GK101173933SQ200610097309
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司