專利名稱：無機(jī)磷診斷/測定試劑盒及無機(jī)磷濃度的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明 還涉及測定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測 定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動 態(tài)平衡，血中鈣、磷濃度之間有一定關(guān)系，正常人血鈣升高則血磷降 低，反之亦然。血漿中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每 100毫升血漿鈣磷濃度的乘積為35——40。當(dāng)二者乘積大于40時(shí)，鈣 和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，〉70時(shí)，可發(fā)生轉(zhuǎn)移性轉(zhuǎn)化。當(dāng)乘積 <35時(shí)，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用， 引起佝僂病或軟骨病。血槳[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀 旁腺激素及降鈣素的調(diào)節(jié)。
由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機(jī)磷的檢測實(shí)際上是分 析磷酸鹽陰離子(H2P04"， HP042—)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非 還原法，染料結(jié)合法，酶法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度 法和流動注射分析法等。決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦 的中等實(shí)驗(yàn)室測定無機(jī)磷的常規(guī)方法是比色法。
磷鉬酸還原法又有無蛋白學(xué)濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中 加入非離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類 很多，性能比較穩(wěn)定的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米
吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。 磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜 聚化合物，方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm 有光吸收，必須做標(biāo)本空白，否則結(jié)果偏高。
酶法測定無機(jī)磷是發(fā)展趨勢，其優(yōu)點(diǎn)是無機(jī)磷酸鹽化合物在酶作用 下的中性范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動化分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimeiric Method)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在 340nm波長處吸光度的變化，得以測定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法， 同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定 試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生 化分析儀上進(jìn)行無機(jī)磷(磷酸根)濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確 度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明無機(jī)磷(磷酸根)濃度測定方法原理如下
磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶
甘油酸-l，3-雙磷酸+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydro驟nase ; EC 1.2丄59)酶促反應(yīng)終點(diǎn)法。甘油醛-3-磷酸脫氫酶
酶解無f幾磷(磷酸根)反應(yīng)，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰) 還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型 輔酶在340rnn處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上升的 程度，可以測算無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明無機(jī)磷(磷 酸根)診斷/測定試劑盒較為理想
緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L
甘油醛-3-磷酸 4mmol/L
本發(fā)明的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘油醛-3-磷酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。 輔酶、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶在試劑1或試劑2中
的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油醛-3-磷酸。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
輔酶、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試 劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的 方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L
甘油醛-3-磷酸
4 mmol/L
試劑全部溶lf配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍千燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機(jī)磷 (磷酸根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升 反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機(jī)磷 (磷酸根)的濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
輔酶
甘油醛-3-磷！
10Ommol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
甘油醛-3-磷酸脫氫酶
100 mmol/L 50 mmol/L 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機(jī)磷 (磷酸根)樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎?反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機(jī)磷 (磷酸根)的濃度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑
輔酶
50 mmol/L
3 mmol/L
試劑2
E三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑
甘油醛-3-磷f
50 mmol/L
2 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
甘油醛-3-磷酸脫氫
50 mmol/L
16000U/L
試劑全部洛解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用
測定無機(jī)磷(磷酸根)濃度時(shí)，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度
37°C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測 試副波長405nm，被測無機(jī)磷(磷酸根)樣品與試劑1、試劑2、試劑 3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間 大約O分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機(jī)磷 (磷酸根)的濃度大小。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法的無機(jī)磷(磷酸根)的濃度測定方法，其方法原理如下磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 甘油酸-1，3-雙磷酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——50mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L甘油醛-3-磷酸脫氫酶 3000——80000 U/L甘油醛-3-磷酸 1——40mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)杈利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征 在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組 成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘油醛-3-磷酸 組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成。輔 酶、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征 在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油醛-3-磷酸組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成。輔酶、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征 在于還包括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述 穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少 一種中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法技術(shù)的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、甘油醛-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果。
文檔編號G01N33/84GK101173940SQ20061009731
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司