專利名稱：無機磷診斷/測定試劑盒及無機磷濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明 還涉及測定無機磷濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動 態(tài)平衡，血中鈣、磷濃度之間有一定關(guān)系，正常人血鈣升高則血磷降 低，反之亦然。血漿中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每 100毫升血漿鈣磷濃度的乘積為35——40。當(dāng)二者乘積大于40時，鈣 和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，>70時，可發(fā)生轉(zhuǎn)移性鈣化。當(dāng)乘積 <35時，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用， 引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀 旁腺激素及降鈣素的調(diào)節(jié)。
由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機磷的檢測實際上是分 析磷酸鹽陰離子(H2P04"， HPO,)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非 還原法，染料結(jié)合法，酶法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度 法和流動注射分析法等。決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦 的中等實驗室測定無機磷的常規(guī)方法是比色法。
磷鉬酸還原法又有無蛋白學(xué)濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中
加入非離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類 很多，性能比較穩(wěn)定的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米
吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。 磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜 聚化合物，方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm 有光吸收，必須做標本空白，否則結(jié)果偏高。
酶法測定無機磷是發(fā)展趨勢，其優(yōu)點是無機磷酸鹽化合物在酶作用 下的中性范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動化分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測 還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得 以測定無機磷濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的 無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見 光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行無機磷濃度測定，而且測定 速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明無機磷濃度測定方法原理如下
磷酸根+蔗糖蔗糖磷酸化酶果糖+葡萄糖-1-磷酸 果糖+還原型輔酶甘露醇2-脫氫酶甘露醇+輔酶
這種方法應(yīng)用蔗糖磷酸化酶(Disaccharide phosphorylases ; EC 2.4.1.7)酶(偶)聯(lián)甘露醇2-脫氫酶(Mannitol dehydrogenase ; EC 1.1.1.13S ; EC1.1.1.67)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法/終點比色法。蔗糖磷酸化酶酶解蔗糖反應(yīng)產(chǎn)生果糖，再通過(偶)聯(lián)合甘露醇2-脫氫酶的作 用，最終將還原型輔酶(在340nrn處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm 處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的 程度/速度，通過測量340mn處吸光度下降的程度/速度，可以測算無 機磷的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明無機磷診斷/
測定試劑盒較為理想-
緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
蔗糖 30 mmol/L
蔗糖磷酸化酶 12000 U/L
甘露醇2-脫氫酶 16000 U/L
本發(fā)明的無機磷診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、甘露醇 2-脫氫酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、蔗糖。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶。
還原型輔酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶在試劑1或試 劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、蔗糖。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶。
還原型輔酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶在試劑l、試 劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定無機磷濃度的方法，其還 原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的 一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一
本實施例的無機磷診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 50 mmol/L 還原型輔酶 0.25 mmol/L
蔗糖 30 mmol/L 磷酸化酶 1200 mmol/L
甘露醇2-脫氫酶16000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機 磷樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延 遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出無機磷 的濃度大小。 實施例二
本實施例的無機磷診斷/測定試劑為雙試劑，包括:
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
蔗糖 20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
100 mmol/L
穩(wěn)定劑
蔗糖磷酸化酶 甘露醇2-脫氫酶
50 mmol/L 2000 U/L 24000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機 磷樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下 降反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出無機磷 的濃度大小。 實施例三
本實施例的無機磷診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 還原型輔酶 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
50 mmol/L 0.25 mmol/L
10Ommol/L
50 mmol/L
試劑3三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
蔗糖磷酸化酶 24000 U/L
甘露醇2-脫氫酶 36000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定無機磷濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C,反 應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波 長405nm，被測無機磷樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右， 檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出無機磷 的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無機磷(磷酸根)濃度測定方法，其方法原理如下磷酸根+蔗糖 蔗糖磷酸化酶 果糖+葡萄糖-1-磷酸果糖+還原型輔酶 甘露醇2-脫氫酶 甘露醇+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出無機磷的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種無機磷診斷/測定試劑盒，主要成分包括: 緩沖液穩(wěn)定劑 還原型輔酶20-500 mmol/L50 mmol/L0.1-0.35 mmol/L50 mmol/L蔗糖磷酸化酶 甘露醇2-脫氫酶1000-細00U/L1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、 蔗糖組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶組成。還原型輔酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶 在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、甘露醇 2-脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、 組成；試劑2，由緩沖液、蔗糖組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶組成。還原型輔酶、蔗糖、蔗糖磷 酸化酶、甘露醇2-脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以 不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷診斷/測定試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑1^4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定無機磷濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出無機磷的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果。
文檔編號G01N33/84GK101173942SQ200610097319
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司