專利名稱：用作特異性識別腫瘤細胞的功能化量子點的制備方法
所屬技術(shù)領(lǐng)域一種用作特異性識別腫瘤細胞的功能化量子點的制備方法，屬于本發(fā)明為納米材料和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤是危害全人類的頭號疾病。腫瘤的早期診斷、早期治療和靶向治療是人們一直關(guān)注和研究的內(nèi)容。用于細胞生物學(xué)研究的傳統(tǒng)熒光染料存在很多無法客服的局限性，如激發(fā)波長要求嚴格，熒光效率低，發(fā)射波長和激發(fā)波長容易交疊，光穩(wěn)定性差，等等，給生物學(xué)研究帶來了很多不便。
隨著技術(shù)的發(fā)展，納米技術(shù)的研發(fā)重心已經(jīng)逐漸從單一的納米材料的合成向功能、應(yīng)用、器件化轉(zhuǎn)移。其中，在納米技術(shù)和生物技術(shù)的接口領(lǐng)域，量子點已經(jīng)得到了良好的應(yīng)用。文獻中報道的量子點的制備方法多為反相微膠束法，人們多用含有Cd2+離子和S2-離子的溶液來制備CdS量子點，例如，Heesun Yang，paul HHolloway，app.phy.lett.2003，82，1965.等等。雖然是可行的，但是在反應(yīng)時間以及產(chǎn)物的均勻度上欠佳，存在著效率和所得量子點的單分散性以及反應(yīng)條件苛刻，反應(yīng)物毒性等問題。由于量子點多在油相中制備，而生物環(huán)境是水相的，所以在功能化之前要對所得的量子點進行表面改性。水溶性的量子點在文獻中已有報道，如Daniel R.Larson et al.Science，2003，300，1434-1436.等等。用作生物學(xué)研究的量子點要對不同種類的細胞有特異性識別功能，現(xiàn)有的量子點在表面功能化修飾方面不能滿足這一要求，在染色過程中存在非特異性染色問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用作特異性識別腫瘤細胞的功能化量子點的制備方法，以提高量子點的特異性靶向功能，盡可能地降低非特異性染色的強度，適應(yīng)了細胞生物學(xué)研究的需要。
一種用作特異性識別腫瘤細胞的功能化量子點的制備方法，應(yīng)用于制備檢測細胞膜上表達有高水平葉酸受體的腫瘤細胞，其特征在于由以下步驟組成(1)、CdS量子點的制備；(2)、選擇帶有巰基的小分子化合物對量子點進行表面改性；(3)、量子點表面功能化修飾經(jīng)過(2)對量子點的表面進行改性之后，用丙酮洗滌3-5遍，洗滌，離心，烘干交替進行；然后，將5mg量子點粉末分散在5-10mLPBS中，分別加入20-30μL 0.05M的NHS和EDC的DMSO溶液，攪拌30-60分鐘，加入20-30μL 0.05M的葉酸的DMSO溶液，攪拌，反應(yīng)12-24個小時；最后用去離子水將反應(yīng)物透析5-8個小時，將未反應(yīng)的小分子去除；加入20-30μL 0.05M的NHS和EDC的DMSO溶液的目的在于使體系中形成一種活性比較高的中間體，可以和隨后加入的葉酸上的氨基反應(yīng)。
上述CdS量子點的制備，可以采用水熱法等常規(guī)方法，可以采用S的鹽溶液作為S源。但如果采用H2S做為S源，即在室溫下將H2S氣體通入微乳液體系中，以制備量子點，可改善制備過程，使制備條件變的簡單，提高產(chǎn)物均勻性和可控性。
如果在通入H2S氣體之前，先向體系中通5-10分鐘的氮氣，可以排掉體系中的氧氣，防止H2S氣體被氧化。
如果在CdS量子點的制備過程中，控制微膠束體系中Cd鹽和表面活性劑的濃度可以控制量子點的粒徑。
上述方法制備的功能化量子點應(yīng)用于檢測細胞膜上表達有高水平葉酸受體的腫瘤細胞。
與現(xiàn)有的量子點相比，使用H2S做為S源，通入氮氣排掉反應(yīng)體系中的氧氣，制備方便，快捷，反應(yīng)裝置和反應(yīng)條件要求不苛刻。要想使得量子點對目標(biāo)細胞進行特異性染色，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，制備的整個過程不需要苛刻的設(shè)備條件，操作安全簡便，原料安全，成本低。在量子點的表面功能化修飾時，選擇葉酸作為量子點表面靶向功能分子。葉酸是腫瘤細胞中代謝旺盛的主要原料之一，它與腫瘤細胞膜表面的葉酸受體特異性地結(jié)合而進入細胞參與細胞代謝，腫瘤細胞的細胞膜表面的葉酸受體水平遠遠高于正常細胞。故葉酸受體已作為許多治療腫瘤的藥物的靶向功能受體分子。本發(fā)明把葉酸成功地修飾到了所制備的CdS量子點的表面，使得量子點其具有特異性識別葉酸受體的功能。


圖1細胞識別中所用的CdS量子點的透射電子顯微鏡的照片，粒徑約5nm。
圖2量子點的紫外可見光吸收光譜。
圖3量子點在380nm的紫外激發(fā)下的熒光光譜，其519nm附近的熒光發(fā)射峰明顯，正是我們探測腫瘤細胞的熒光基礎(chǔ)。
圖4未經(jīng)巰基乙酸修飾的CdS量子點的紅外圖譜。
圖5經(jīng)過巰基乙酸修飾后的CdS量子點的紅外吸收圖譜(從圖4和圖5的吸收峰可以確定巰基乙酸成功地修飾到了量子點上)。
圖6用未經(jīng)過葉酸修飾的量子點和HepG2共培養(yǎng)1個小時后的熒光照片。
圖7用未經(jīng)過葉酸修飾的量子點和HepG2共培養(yǎng)3個小時后的熒光照片。
圖8用未經(jīng)過葉酸修飾的量子點和HepG2共培養(yǎng)6個小時后的熒光照片。
圖9用經(jīng)過葉酸修飾的量子點和HepG2共培養(yǎng)1個小時后的熒光照片。
圖10用經(jīng)過葉酸修飾的量子點和HepG2共培養(yǎng)3個小時后的熒光照片。
圖11用經(jīng)過葉酸修飾的量子點和HepG2共培養(yǎng)6個小時后的熒光照片。
具體實施例方式
實施例1一、量子點的制備(1)配制AOT和正庚烷的溶液配制0.1M的AOT的正庚烷溶液30mL。
(2)反膠束體系的配置向上述溶液中加入CdCl2的水溶液，使得水相在體系中的濃度為0.1M。加入CdCl2的水溶液之后，用超聲波分散30分鐘，直到體系澄清透明，這樣便得到了反相微膠束體系。
(3)反應(yīng)生成CdS量子點室溫下，向上述反相微膠束體系通入5分鐘氮氣，排除體系內(nèi)的氧氣，然后在磁力攪拌的情況下，向上述微膠束體系中統(tǒng)入充足的H2S氣體。當(dāng)體系顏色不再變化就說明反應(yīng)完成，量子點已經(jīng)成功制備。
2.巰基乙酸表面改性將上述反應(yīng)物加入丙酮進行破乳，把量子點表面的表面活性劑洗掉。用丙酮清洗、離心，反復(fù)5次。然后烘干得到量子點粉末。
向5mg半導(dǎo)體量子點中加入5mL的巰基乙酸，室溫下磁力攪拌12小時。
3.量子點表面功能化修飾即量子點和葉酸連接。
在上述過程中攪拌12小時后，用丙酮洗滌3遍(洗滌，離心，烘干交替進行)，然后將其分散在5mLPBS中，分別加入25μL 0.05M的NHS和EDC的DMSO溶液，攪拌半個小時后，加入25μL 0.05M的葉酸的DMSO溶液，攪拌，反應(yīng)12個小時。最后用去離子水將反應(yīng)物透析5個小時，將未反應(yīng)的小分子去除。
如圖1-圖5為本實施例制備的功能化量子點的粒徑和表面修飾效果圖，表明該方法成功地制備了高質(zhì)量的量子點。
二、細胞染色實施過程及其觀測利用常規(guī)的細胞培養(yǎng)方法，選擇HeLa、HepG2、KB細胞等表達有高水平葉酸受體(FR)的腫瘤細胞和正常的上皮細胞與上述量子點共同培養(yǎng)，然后用激光共聚焦顯微鏡觀測，經(jīng)過比較不同細胞種類、不同培養(yǎng)時間下細胞的熒光強度，確證了腫瘤細胞對量子點的特異性吸附和內(nèi)化呈時間依賴性(6小時達到飽和狀態(tài))。
如圖6-11為HepG2的試驗結(jié)果，證實了該技術(shù)的有效性和可靠性。
實施例2本發(fā)明的方法最大的創(chuàng)造性在于，量子點表面功能化修飾(即量子點和葉酸連接)這一步驟。這一步驟為經(jīng)過含有巰基的小分子化合物對制備的量子點進行表面之后，用丙酮洗滌3-5遍，洗滌，離心，烘干交替進行；然后，將5mg量子點粉末分散在5-10mLPBS中，分別加入20-30μL 0.05M的NHS的DMSO溶液以及同樣體積的0.05M的EDC的DMSO溶液，攪拌30-60分鐘，加入20-30μL 0.05M的葉酸的DMSO溶液，攪拌，反應(yīng)12-24個小時。最后用去離子水將反應(yīng)物透析5-8個小時，將未反應(yīng)的小分子去除。
權(quán)利要求
1.一種用作特異性識別腫瘤細胞的功能化量子點的制備方法，其特征在于由以下步驟組成(1)、CdS量子點的制備；(2)、選擇帶有巰基的小分子化合物對量子點進行表面改性；(3)、量子點表面功能化修飾經(jīng)過上一步對量子點的表面進行改性之后，用丙酮洗滌3-5遍，洗滌、離心、烘干交替進行；然后，將5mg量子點粉末分散在5-10mLPBS中，向PBS中加入20-30μL 0.05M的NHS的DMSO溶液以及同樣體積的0.05M的EDC的DMSO溶液，攪拌30-60分鐘；之后再向上述體系中加入20-30μL 0.05M的葉酸的DMSO溶液，攪拌，反應(yīng)12-24個小時；最后用去離子水將反應(yīng)物透析5-8個小時，將未反應(yīng)的小分子去除。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識別腫瘤細胞的功能化量子點的制備方法，其特征在于所述的第一步CdS量子點的制備方法是室溫下采用反相微膠束體法，并以H2S做為S源。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的特異性識別腫瘤細胞的功能化量子點的制備方法，其特征在于在通入H2S氣體之前，先向體系中通5-10分鐘的氮氣，排掉體系中的氧氣。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的特異性識別腫瘤細胞的功能化量子點的制備方法，其特征在于所述的CdS量子點的制備過程中，通過微膠束體系中鎘鹽和表面活性劑的濃度控制量子點的粒徑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用作特異性識別腫瘤細胞的量子點的制備及其表面功能化方法，其特征在于該方法制備及經(jīng)表面功能化修飾的量子點應(yīng)用于檢測細胞膜上表達有高水平葉酸受體的腫瘤細胞。
全文摘要
一種用作特異性識別腫瘤細胞的功能化量子點的制備方法，屬于納米材料和生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括以下步驟組成(1)CdS量子點的制備；(2)選擇帶有巰基的小分子化合物對量子點進行表面改性；(3)量子點表面功能化修飾經(jīng)過上步對量子點的表面進行改性之后，加入NHS及EDC的DMSO溶液使體系中形成一種活性比較高的中間體，可以和隨后加入的葉酸上的氨基反應(yīng)。由于用含有巰基的小分子修飾量子點的表面，改善了水溶性。再通過一種有效的方法將葉酸和量子點連接起來，使得這些熒光量子點可以特異性地識別表達有高水平葉酸受體的癌細胞，從而可以用作熒光探針用于細胞生物學(xué)研究。
文檔編號G01N33/53GK1975420SQ200610098270
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日
發(fā)明者張培根, 余德才, 賀志鵬, 張海黔 申請人:南京航空航天大學(xué)