專利名稱：可自我尋址自我組裝的用于分子生物學分析和診斷的微電子系統(tǒng)及裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明有關一種能有效地進行和控制顯微形式的多步和多路反應的可自我尋址，自我組裝微電子系統(tǒng)的設計、制造和使用。特別地，這些反應包括分子生物學反應，例如核酸雜交、抗體/抗原反應、臨床診斷，和生物高分子合成。
背景技術：
分子生物學包括核酸和蛋白質分析的各種各樣技術，這些大部分技術形成了臨床診斷分析的基礎。這些技術包括核酸雜交分析，限制性酶分析，基因序列分析，以及核酸和蛋白質的分離和純化(參見，如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室印刷，冷泉港，紐約Molecular CloningA Laboratory Manual 2Ed.，Cold Spring Harbor laboratory Press，Cold Spring Harbor New York，1989)。
大多數(shù)分子生物學技術牽連到對大量樣品進行無數(shù)的操作(例如，移液)。這些通常是復雜而耗時的，常需要高度的精確性。許多種技術因缺少靈敏度，特異性或重復性而限制其的應用。例如，因靈敏度和特異性的問題已極大地限制了核酸雜交的應用。
核酸雜交分析通常包括在大量非-目標核酸分子中用探針識別極微量的特異性目標核酸(DNA或RNA)。為了保證高特異性，雜交常在由溫度、鹽、洗滌劑、溶劑、離液劑和變性劑組合而獲得的嚴格條件下進行。
復合的樣品核酸雜交分析已在各種濾膜和固體支持物上進行(參見G.A.Beltz et al，酶學方法，Vol 100，Part B，R.Wu，L.Grossman，K.Moldave，Eds.，Academic Press，New York，19章，pp.266-308，1985)。一種形式，即所謂“斑點”雜交，包括非-共價連接目標DNA到一濾膜上，隨后濾膜與放射性同位素標記的探針雜交?！鞍唿c”雜交獲得了廣泛的使用，并發(fā)展了多個改進形式(參見M.L.M.Anderson和B.D.Young，核酸雜交-實用方法，B.D.Hames和S.J.Higgins，Eds.，IRL Press，WashingtonDC，第4章，pp.73-111，1985)。這種技術已經發(fā)展成能進行基因組突變的復合分析(D.Nanibhushan和D.Rabin，在EPA 0228075，July 8，1987)和檢測重疊克隆以及構建基因組圖譜(G.A.Evans，在USP#5.219.726.June 15，1993)。
另一種形式，即所謂“夾心”雜交，包括共價連接寡聚核苷酸探針到一固體支持物上并用它們捕獲和識別多核酸目標(M.Ranki etal.，Gene，21，pp.77-85，1983；A.M.Palva，T.M.Ranki，和H.E.Soderlund，在UKP Application GB 2156074A，Oct.2，1985，T.M.Ranki和H.E.Soderlund在USP#4,563,419，January 7，1986；A.D.B.Malcolm和J.A.Langdale，in PCTWO 86/03782，July 3，1986；Y.Stabinsky，in USP#4,751,177，January 14，1988；T.H.Adams et al.，in PCT WO 90/01564，F(xiàn)eb.22，1990 R.B.Wallace et al.，6 NucleicAcid Res 11，p.3543，1979；和B.J.Connor et al.，80Proc Natl Acad Sci USA pp.278-282，1983)。
應用通用的核酸雜交形式和嚴格性控制方法，對檢測低拷貝數(shù)(例如1-100,000)核酸目標仍是困難的即使使用最靈敏的報告基團(酶，熒光團，放射性同位素)等和與其配套的檢測系統(tǒng)(熒光計，發(fā)光計，光子計數(shù)器，閃爍計數(shù)器，等等)。
這個困難是由各種與直接探針雜交相關聯(lián)的本身問題引起的。首先和最嚴重的困難涉及雜交反應的嚴格性控制。雜交反應通常在最嚴格的條件下進行以便獲得最高程度的特異性。嚴格性控制的方法包括初始的在雜交過程以及隨后的漂洗過程中應用最適溫度、離子強度和變性劑。不幸的是應用這些嚴格性條件引起用于檢測的雜交了的探針/目標復合物的數(shù)量顯著下降。
第二種困難涉及在大多數(shù)樣品中DNA的高度復雜性，特別在人類基因組DNA樣品中。當一個樣品由大量與特異目標序列非常相似的序列所組成時，既使最特異性的探針序列與非-目標序列也會有大量部分雜交。
第三種困難涉及在探針和它的特異目標間的不適合的雜交動力學因素。既使在最佳條件下，大部分雜交反應是在相當?shù)蜐舛鹊奶结樅湍繕朔肿娱g進行的。此外，探針常不得不與互補鏈競爭目標核酸。
對于大部分現(xiàn)今的雜交形式的第四種困難是高水平的非-特異性背景信號。這是由DNA探針與幾乎任何材料的親和性引起的。
這些問題，或單個或幾個組合，在上述雜交形式中導致喪失核酸雜交的靈敏度和/或特異性。這是不幸的因為對大多數(shù)基于核酸的臨床診斷分析而言檢測低拷貝數(shù)核酸目標是必須的。
由于識別低拷貝數(shù)核酸目標的困難，研究者們極大地依賴于聚合酶鏈式反應(PCR)來擴增目標核酸序列(參見M.A.Innis et al.，PCR程序方法和應用的導論，Academic Press，1990)，由PCR反應產生的大量目標核酸序列改進了隨后的直接核酸探針技術，雖然其代價是加長了步驟和增加了繁瑣性。
在用直接探針識別低拷貝數(shù)目標核酸方面與通常出現(xiàn)的困難相反的一個明顯例外是原位雜交技術。這個技術使得低拷貝數(shù)的獨特核酸序列在單個細胞中被識別。在原位雜交形式中，目標核酸被自然地限制在一個細胞(～20-50μm2)或一個細胞核(～10μm2)區(qū)域內具有相對高的局部濃度。而且，探針/目標雜交信號被限制在形態(tài)上可區(qū)分的區(qū)域；這使得該形式雜交比在一個固體支持物上雜交更易區(qū)別陽性信號與虛假的或非-特異性的信號。
模仿原位雜交，為在顯微-形式的多路或矩陣裝置(如，DNA芯片)上進行復合樣品核酸雜交分析一些新技術發(fā)展了起來(參見M.Barinage，253 Science，pp.1489，1991；W.Bains，10 Bio/Technology，pp，757-758，1992)。這些方法通常結合特異的DNA序列到固體支持物非常小的特殊區(qū)域上，例如DNA芯片的微井。這些雜交形式是傳統(tǒng)的“斑點”和“夾心”雜交體系在顯微范圍內的改進。
顯微-形式的雜交能用于進行“雜交測序”(SBH)(參見M.Barinaga，253 Science，pp.1489，1991；W.Bains，10 Bio/Technology，pp，757-758，1992)。SBH應用所有可能的n-核苷酸寡聚體(n-mers)來鑒別在一未知DNA樣品中的n-mers，隨后通過規(guī)則系統(tǒng)分析線性排列產生DNA序列(R.Drmanac和R.Crkvenjakov，Yugoslav Patent Kpplication#570/87，1987R.Drmanac et al.，4 Genomics，114，1989；Strezoska etal.，88 Proc.Natl.Acad.Sci，UAS 10089 1991；和R.DrmanacR.B.Crkvenjakov，USP#5,202,231，April 13，1993)。
有兩種形式可進行SBH。第一種形式包括在一個支持物上形成一個所有可能n-mers的列陣，然后用其與目標序列雜交。第二種形式包括結合目標序列到一個支持物上，隨后用所有可能的n-mers來標記。兩種形式都具有直接探針雜交的基本困難和涉及多路雜交的額外困難。
在UKP Application GB 8810400，1988；和B.Genomics1008，1992年中，Southern提出應用第一種形式來分析或測定DNA序列。Southern應用PCR擴增的基因組DNA鑒定了一個已知單點突變。Southern也描述了一種為進行SBH而在一個固體支持物上合成寡聚核苷酸列陣的方法。然而，Southern沒有講述如何獲得列陣中每一個寡聚核苷酸的最適的嚴格性條件。
在364 Nature，pp.555-556，1993中，F(xiàn)odor等人應用1,0248-mer的寡聚核苷酸列陣在一個固體支持物上測定了DNA序列。在這例中，目標DNA是僅含有核苷酸A和C并熒光標記的單鏈12-mer寡聚核苷酸。1pmol(～6×1011分子)的12-mer目標序列對與列陣上8-mer寡聚體雜交是必須的。該結果顯示了多個錯配合。象Southern一樣，F(xiàn)odor et al.，沒有講述直接探針雜交的基本困難，例如多路雜交的嚴格性控制。這些困難，與需要大量簡單12-mer目標一起，表明這一SBH形式的嚴重局限性。
同時，在260 Science 1649-1652，1993中，Drmanac等人應用第二種形式為數(shù)種短(116bp)的DNA序列測序。目標DNA被結合到膜支持物上(“斑點”形式)。每一個濾膜順序地與272個標記過的10-mer和11-mer寡聚核苷酸雜交。大范圍的嚴格性條件被用來獲得每一個n-mer探針的特異性雜交；漂洗時間從5分鐘到過夜不等，溫度從0℃到16℃不等。大多數(shù)探針需要在16℃漂洗3小時。濾膜必須曝光2到18小時以便識別雜交信號。盡管是簡單目標序列，降低了寡聚體探針量，和使用現(xiàn)有的最嚴格條件，總的假陽性雜交率是5％。
在251 Science 767-773，1991中，F(xiàn)odor等人應用照相平版印刷技術在一個基質上合成寡聚核苷酸。在USP#5,143,854 Sept.1，1992中，Pirrung等人講述了在硅基質上以列陣方式大范圍照相平版印刷固相合成多肽。
另一種矩陣雜交方法，Beattie et al.，在1992年圣地亞哥會議基因識別Nov.1992中，應用一種微機器人體系在一種玻璃基質上存放含有特異性DNA序列的微滴于單個微加工的樣品井中。每個樣品中雜交反應是由詢問微型電極測定固定裝置來識別，而該固定裝置排在每個微井四周并帶有交流(AC)電場。
不管那種形式，現(xiàn)今顯微范圍DNA雜交和SBH方法都沒能克服與直接探針雜交反應聯(lián)系著的本身物理困難。它們需要非常高水平的相對短的單鏈目標序列或PCR擴增的DNA，并產生高水平的虛假陽性雜交信號，既使是在最嚴格條件下。在應用短寡聚核苷酸序列的多路形式例子中，不可能用任何傳統(tǒng)的方法獲得對于每個序列最適的嚴格條件，因為用于這些形式的列陣或裝置不能在單個場所相對于另一場所改變或調整溫度、離子強度，或變性劑。因此，一個共同的嚴格條件必須用于所有裝置上的序列。這導致了大量非-特異性和部分雜交并嚴重地限制了該裝置的應用。這一困難隨著列陣中不同序列數(shù)目的增多和序列長度的下降而更加復雜。這對于SBH是特別的困難，它需要大量短寡聚核苷酸探針。
不同大小，電荷或構象的核酸常規(guī)是通過電泳技術分離，電泳技術能通過電場中它們的不同遷移率來區(qū)別雜交核酸。脈沖場電泳使用在介質(如，凝膠)四周安排復合電極來分離那些由傳統(tǒng)凝膠電泳系統(tǒng)不能解決的非常大的DNA片段(參見R.Anand和E.M.Southern核酸凝膠電泳-實用方法2nd.D.Rickwood和B.D.Hames Eds.IRL Press，New York，pp.101-122，1990)。
在USP#4,908,112，March 13，1990中，Pace講述了使用微加工技術制造硅基質上的毛細管凝膠電泳系統(tǒng)。復合電極被用于該系統(tǒng)中用來在裝置中移動分子通過分離介質。
在USP 5,126,022 June 30，1992中，Soane和Soane講述了大量電極能被用來控制混合物中帶電分子通過細管中凝膠分離介質的線性移動。電極必須被安裝在細管中以便控制分子在分離介質中的移動和定位。
在26 IEEE在工業(yè)應用中的反作用6，pp，1165-1172，1990中，Washizu，M.和Kurosawa O.，應用高頻交流(AC)電場來使DNA分子定向在微加工電極間產生的電場線上，然而，使用直流(DC)電場限制了他們的工作。在靜電雜志25卷109-123頁，1990中，Washizu描述了應用介電電泳來操作細胞和生物分子。細胞能融合以及生物分子能沿著由微電極結構間AC電壓產生的電場線定向。然而，介電電泳過程需要非常高頻(1MHz)AC電壓和一種低電導率介質。雖然這些技術能沿著AC電場線使不同大小的DNA分子定向，但它們不能區(qū)別相同大小的雜交復合物。
從上述討論中已很明顯，花費了極大的努力來提供有效的技術以實施多步，多路分子生物學反應。然而，正如上述的種種原因，這些技術已被證明是欠缺的。盡管對有效技術有長期熟知的需求，但滿意的方案還沒有被提出來。
本發(fā)明的摘要本發(fā)明涉及設計、制造，和使用一種可自我尋址自我組裝的微電子系統(tǒng)和裝置，它能有效地進行顯微形式的被控制的多步和多路反應。這些反應包括，但不局限于，大多數(shù)分子生物學過程，例如核酸雜交，抗體/抗原反應，和有關的臨床診斷學。此外，權利要求的裝置能進行多步組合的生物高分子合成，包括，但不局限于，在特定微場所合成不同的寡聚核苷酸或多肽。
權利要求的裝置是應用微平版印刷和微機械技術制造的。裝置在其表面具有一個可尋址的微場所的矩陣；每單個微場所能夠電子地控制和引導特異性結合實體(例如，核酸，抗體)的轉移和結合于其自身。所有微場所能被它們特異的結合實體尋址。應用這一裝置，在最小外界干預下這系統(tǒng)能被自我組裝。
這裝置能控制和有效地進行各種測定和反應。分析物或反應物通過自由場電泳被轉移到任何特定的微場所上，在這兒分析物或反應物有效地濃縮并在所說的微場所與特異的結合實體反應。檢測特異分析物或反應物的靈敏度因濃縮效應而提高了。任何未結合的分析物或反應物能通過反向微場所的極性而被移走。這樣，裝置也提高了測定和反應的特異性。
裝置為特定微場所上的雜交反應提供獨立的嚴格性控制。這樣矩陣上所有的微場所在同一時間里能有不同的嚴格性條件，允許復合雜交在最適條件下進行。
通過使用輔助的光學(熒光或紫外分光光度計)成像識別系統(tǒng)或集成的傳感元件，裝置也促進在每個微場所上檢測雜交復合物。
此外，裝置積極的特性允許復雜的多步反應在最少外部物理操作下進行。如需要的話，被特異結合實體尋址的主裝置能被電子地復制或拷貝成另一個基礎裝置。
這樣，權利要求的裝置能用完全的和精確的電子控制，最好使用微處理機，進行多步和多路反應。多步和多路反應的速率，特異性和靈敏度在權利要求的裝置的特定微場所上極大地提高。
本發(fā)明克服了在本說明書背景中描述的多樣品雜交的列陣和裝置具有的限制性。以前的方法和裝置相對于實際的雜交過程功能上是被動的。雖然復雜的照相平版印刷技術被用于制造列陣，或微電子傳感元件被組裝進用于檢測，但以前的裝置不控制或影響實際雜交過程。它們不被設計成能主動地克服任何與雜交反應聯(lián)系著的固有物理困難。
本發(fā)明可應用符合于本發(fā)明目標的任何大小或形狀的微場所。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，亞-毫米級的微場所被選用。
“特異的結合實體”一詞通常表示一種能通過共價鍵或非-共價鍵與其它分子特異性親和結合的生物或合成的分子。優(yōu)選地，一種特異結合實體含有(或自然地或通過化學修飾)一種功能的化學基團(伯胺、巰基、醛基，等等)，一種共同序列(核酸)，一種抗原表位(抗體)，半抗原或一種配體，這些成份允許結合實體共價反應或非-共價結合到微場所表面的共同功能基團上。特異結合實體包括，但不局限于脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)，合成的寡聚核苷酸、抗體、蛋白質、肽、凝集素、修飾的多糖，合成的復合大分子，具功能的納米結構，合成高分子，修飾/封閉的核苷酸/核苷，修飾/封閉的氨基酸、熒光團、生色團、配體、螯合物和半抗原。
“嚴格性控制”一詞表示區(qū)別特異和非-特異結合相互作用的能力。
因此，首先，本發(fā)明特征地描述一種帶有可電子地自我尋址微場所列陣的裝置。每個微場所包含由基質支撐著的基礎直流(DC)微電極。每個微場所表面有一種用于小的相反離子自由經過的滲透層，和一種用于共價結合特異結合實體的粘附層。
“列陣”或“矩陣”是表示裝置上場所的一種排列。場所能排列成二維列陣、三維列陣、或其它矩陣形式。場所的數(shù)量可從幾個到至少數(shù)十萬個。
在第二方面，本發(fā)明特征地描述一種用于轉移結合實體到裝置的任何微場所上的方法。當被活化時，一個微場所能影響任何帶電具功能的特異結合實體自由場電泳轉移直接到它本身上。一旦結合到特定微場所上，這具功能的特異結合實體立即變成共價地結合到那個特定微場所表面的粘附層上。其它微場所能通過保持它們在與帶電分子相反電勢上而同時被保護。這一過程能迅速地重復直至所有微場所被它們特異結合實體尋址。
“帶電具功能的特異結合實體”一詞表示一種被化學地活化(即，能夠共價地結合到場所上)和帶有一個凈電荷(或正電或負電)的特異結合實體。
在第三方面，本發(fā)明特征地描述一種在裝置的任何特定微場所上濃縮和反應分析物或反應物的方法。在特異結合實體結合到粘附層以后，每個微場所的基礎微電極繼續(xù)以直流(DC)方式起作用。這種獨特的特性允許那些自由存在溶液中的相對稀的帶電分析物或反應分子以連續(xù)的或平行的方式在任何保持與分析或反應分子相反電荷的特定微場所上被快速地轉移、濃縮、和反應。特定的微場所能被保護或掩蓋起來，通過保持它們在與分析或反應分子相同電荷情況下。這種在選擇的微場所上濃縮稀的分析或反應分子的能力在這些微場所上極大地加速反應速率。
當所需的反應完成后，微電極的電勢能被反轉以便從這些微場所上移去非-特異性分析物或未反應的分子。
特異的分析物或反應產物可以從任何微場所上釋放出并轉移到其它場所上進一步分析；或貯存在其它可尋址的場所上；或從本系統(tǒng)中完全移走。
在這特異微場所上分析物隨后的分析也通過這種從這些場所上排斥非-特異性實體的能力極大地被改進。
在第四方面，本發(fā)明特征地描述了一種增進核酸雜交反應的嚴格性控制的方法，包括下列步驟-在進行雜交的特定微場所上快速地濃縮稀的目標DNA和/或探針DNA序列；-從已發(fā)生雜交的特定微場所上快速地移走非-特異地結合的目標DNA序列；-從已發(fā)生雜交的特定微場所上快速地移走競爭的互補目標DNA序列；-提高電勢以便移走部分雜交的DNA序列(多于一個堿基錯配)；-調節(jié)電勢以便增進單個錯配雜交的分辨能力(例如，識別點突變)；-應用獨立的電勢控制到在同一批溶液中發(fā)生的單個雜交反應上；和-使用電勢控制以便增進未-擴增目標DNA序列雜交到捕獲寡聚核苷酸探針的列陣上。
在第五方面，本發(fā)明特征地描述一種在微場所上合成生物高分子的方法。
在第六方面，本發(fā)明特征地描述一種復制主裝置的方法。
在第七方面，本發(fā)明特征地描述數(shù)種方法用于應用自我尋址的帶配套的光學，光電子或電子檢測系統(tǒng)的微電子學裝置或自我尋址的帶一體化的光學、光電子或電子檢測系統(tǒng)的微電子學裝置檢測和分析已在已尋址的微場所上發(fā)生的反應。
圖的簡要描述

圖1是應用微平版印刷技術制造的三個可自我尋址的微場所的橫截面。
圖2是一個微平版印刷地制造的微場所的橫截面。
圖3是一個可自我尋址的64微場所芯片的圖解代表，該芯片是實際被制造，由寡聚核苷酸尋址的，和經測試的。
圖4表明特定結合化學過程，該過程允許快速共價結合特異性寡聚核苷酸到一個微場所的粘附表層。
圖5是一幅微機械加工的96微場所裝置的放大圖解圖。
圖6是微機械加工的裝置的橫截面。
圖7是表明裝置用來在特定微場所電子地濃縮分析物或反應分子的原理。
圖8表明用三個特異寡聚核苷酸結合實體(SS0-A，SS0-B，和SS0-C)來自我引導組裝一個裝置。
圖9表明一種用在含有特異DNA捕獲序列微場所上濃縮的樣品/目標DNA進行的電子控制的雜交過程。
圖10表明一種電子引導的系列雜交過程。
圖11表明為確定單點突變的電子嚴格性控制(ESC)的雜交過程。
圖12表明一種不使用標記的DNA探針而檢測雜交的DNA的方案，即，電子控制的染料識別過程。
圖13表明一種電子控制復制裝置的方案。
圖14表明一種電子引導組合性合成寡聚核苷酸的方案。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明的裝置和有關的方法允許一些重要的分子生物學和診斷反應能在完全電子控制下進行。本發(fā)明的基本思想是一種帶有特殊設計的可尋址的微場所的微電子裝置。每個微場所具有能共價結合特異結合實體的衍生表面層(即，粘附層)，一種滲透層，和一種基礎的直流(DC)微電極。在基本的微電子結構初期制造后，裝置能夠自我引導用特異結合實體來尋址每個特定的微場所。自我尋址的裝置隨后能在它的任何微場所上主動地進行多步，組合的和多路反應。裝置能夠電子地引導和控制快速移動和濃縮分析物和反應物到或離開任何它的微場所。裝置電子地控制各種反應動力學方面的能力提供了多個新的和重要的優(yōu)越性和改進。
本發(fā)明的思想和實施方案分三部分描述。第一部分，“基本裝置的設計和制造”描述基本基礎的微電子學裝置的設計和應用微平版印刷和微加工技術制造該裝置。第二部分，“該裝置自我引導的尋址”描述裝置的自我尋址和自我裝配，特別是快速轉移和結合特異結合實體到每個微場所上。第三部分“裝置的應用”描述裝置如何提供各種多步，組合的，和多路反應的電子控制。這部分也描述裝置的各種使用和應用。
(1)基本裝置的設計和制造為了使裝置能進行多步和多路反應，它的主要電子元件在水溶液中必須能保持活性操作狀態(tài)。為滿足這一需求，每個微場所必須具有一個基礎的功能DC方式微電極。其它為設計和制造裝置的考慮包括，但不局限于，材料的相容性，特異結合實體的特性和隨后反應物和分析物的特性，和微場所的數(shù)量。
“一種功能的DC方式微電極”是表示一種微電極偏壓或是正電或是負電，并以直流電方式(或是連續(xù)的或是脈沖的)運行，它能影響或引起帶電的特異結合實體反應物或分析物自由場電泳式移動到或離開裝置上任何場所，或在樣品溶液中。
在本發(fā)明范圍內，分子的自由場電泳式移動不取決于由絕緣材料為界或限制的所產生的電場。
一個裝置可被設計成僅含有二個可尋址微場所或含有數(shù)十萬個微場所。一般來說，一種帶有大量微場所的復雜裝置是應用微平版印刷技術制造的。制造是在硅或其它合適基質材料例如玻璃、二氧化硅、塑料或陶瓷材料上進行的。這些微電子“芯片”的設計能被認為是大范圍列陣或多路分析裝置。一種帶有少量微場所的裝置能應用微加工技術而制造。
可尋址微場所可為任何形狀，優(yōu)選地園形、方形、或長方形。一個可尋址微場所的大小可為任何大小，優(yōu)選地從亞-微米(～0.5μm)到幾厘米(cm)的范圍，5μm到100μm是使用微平版印刷技術制造的裝置的最優(yōu)選的大小范圍，而100μm到5毫米是使用微加工技術制造的裝置最優(yōu)選的大小范圍。制造小于微平版印刷方法分辨力的微場所將需要諸如電子束平版印刷、離子束平版印刷，或分子束外延技術。顯微場所是分析和診斷類型應用所必須的，同時，較大的可尋址場所(例如，大于2mm)是制備范圍生物高分子合成所必須的。
在通過使用微平版印刷和/或微加工技術微場所制造后，化學技術被用來構建特殊的粘附和滲透層，它們能允許在微場所下面的DC方式微電極(1)影響或引起特異(帶電)的結合實體從任何場所的自由場電泳式移動；(2)濃縮和共價結合特異結合實體到特定的微場所的經特別修飾過的表面上；和(3)在結合特異結合實體以后繼續(xù)以DC方式主動地發(fā)揮功能以便其它反應物和分析物能被轉移到或離開微場所。
設計參數(shù)(微平版印刷)圖1表明使用微平版印刷技術制造的一種自我尋址的微場所的基本設計。三個微場所(10)(ML-1，ML-2，ML-3)在沉積在絕緣層/基礎材料的金屬位點形成(12)的表層上。該金屬位點(12)作為基礎微電極結構(10)。一種絕緣材料把金屬位點(12)之間相互隔離開。絕緣材料包括，但不局限于，二氧化硅、玻璃、防染劑、橡膠、塑料、或陶瓷材料。
圖2表明形成在微平版印刷制造的金屬位點(12)之上一個獨立的微場所(10)的基本特征。該可尋址的微場所是在金屬位點(12)之上形成，并包含一個氧化層(20)，一個滲透層(22)，一個粘附層(24)，和一個結合實體層(26)。金屬氧化層提供共價結合滲透層的基礎。滲透層提供了位于金屬表面和粘附/結合實體層之間的空間并允許溶劑分子，小相反離子，和氣體自由地進入或離開金屬表面。微平版印刷技術制造的裝置滲透層的厚度可從大約1納米(nm)到10微米(μm)范圍，從2nm到1μm是最優(yōu)選的。粘附層提供了共價結合結合實體的基礎。微平版印刷技術制造的裝置粘附層的厚度能從0.5nm到1μm的范圍，1nm到200nm是最優(yōu)選的。在一些情況下，滲透層和粘附層能從相同材料形成。特異結合實體共價結合到粘附層上，形成特異結合實體層。特異結合實體層通常是單層的特異結合分子。然而，在一些情況下結合實體層能有幾層或甚至多層結合分子。
滲透和粘附層的一定設計和功能方面是通過特異結合實體分子的物理(例如，大小和形狀)和化學特性支配的，它們也在一定程度上被隨后轉移和結合到微場所上的反應和分析分子的物理和化學特性所支配。例如，寡聚核苷酸結合實體能被結合到一種類型的微場所表面上而不引起DC方式功能的喪失，即，基礎的微電極仍能引起其它分析分子的快速自由場電泳式轉移到或離開寡聚核苷酸結合實體結合著的表面。然而，如果大球形蛋白質結合實體(如，抗體)結合到相同類型的表面，它們可有效地絕緣這表面而引起DC方式功能的降低或完全喪失。粘附層合適的修飾將不得不進行以便或降低大結合實體(例如，大球形蛋白)的數(shù)目或在表面結合實體間提供空間。
微場所間空間的決定是由制造的難易，微場所間檢測分辨力的要求，和裝置上需要的微場所數(shù)量。然而，微場所間特點空間，或微場所的特別安排或地形對于裝置的功能不是必須的，其中微場所(即，基礎微電極)的任何組合能在裝置所有區(qū)域內操作。這既不必包裝裝置也不必用絕緣邊界限制微場所。這是因為復雜的電場形式或絕緣邊界對在任何電極間的空間或介質內選擇地移動、分離、停留或定向特異的分子是不需要的。裝置通過結合特異結合分子和隨后的分析物和反應物到可尋址微場所的表面來完成這些。自由場電泳式推進力提供了在裝置上任何和所有場所間快速和直接轉移任何帶電分子。
隨著微場所的數(shù)目增加超過數(shù)百，微場所間的基礎電路的復雜性增加了。在這種情況下微場所的分組形式不得不改變并有比例地增加空間距離，或多層電路能被制造入基本裝置中。
除了已被特異結合實體尋址的微場所以外，一個裝置將包含一些未-被尋址的，或簡易的微場所它們起其它的功能。這些微場所能被用于貯存試劑，暫時地保留反應物或分析物和為多余反應物、分析物或樣品中其它干擾成份，作為處理單元。其它未被尋址的微場所能用于與已尋址的微場所一起去影響或干擾在這些特定微場所上發(fā)生的反應。這些微場所增加了裝置內活性和控制。這也是可能的即微場所在兩個分離的裝置間相互作用和轉移分子。這提供一種機理即把從一個貯存裝置上的結合實體或反應物加樣到一個工作裝置上，和拷貝或復制一個裝置。
圖3顯示一個含有64可尋址微場所(30)的矩陣型裝置。64微場所的裝置是一種方便的設計，它適合標準微電子芯片包裝元件。這種裝置是在約1.5cm×1.5cm的硅芯片基質上制造，帶有大約750μm×750μm含有64個微場所的中心區(qū)域。每個微場所(32)大約50μm見方并與相鄰微場所間相距50μm。連接每個單獨基礎微電極的電路沿著金屬接觸墊(300μm見方)的外周(10mm×10mm)走線(34)。在帶有微場所的區(qū)域和接觸墊之間形成抬高的內周，產生一個能裝下大約2到10微升(μl)樣品溶液的腔。該“芯片”能被放置在一個標準鉛塊包裝中，并且芯片的接觸墊(34)與鉛塊包裝的管腳用線相連。包裝了的芯片能隨后插入到一個微處理機上控制DC電源輸出和插入到能控制和操縱裝置的萬用表儀器上。制造過程(微平版印刷)微平版印刷制造步驟通常微平版印刷或照相平版印刷技術可用于制造具有大量小微場所的復雜“芯片”類型的裝置。雖然裝置的制造不需要復雜的照相平版印刷，但材料的選擇和電子裝置能在水溶液中主動地起作用的條件必須需要特別的考慮。
圖3所示的64微場所裝置能使用相對簡單的蒙片設計和標準的微平版印刷技術來制造。一般地，基底的基質材料可以是1到2厘米見方的硅晶片或大約0.5毫米厚的芯片。硅芯片第1步復蓋一層1到2微米厚二氧化硅(SiO2)絕緣層，它可用等離子體增強的化學蒸氣沉積(PECVD)而形成。
在下步，通過真空蒸發(fā)而沉積一層0.2到0.5微米金屬層(例如，鋁)。除鋁以外，用于電路的合適金屬包括金、銀、錫、銅、鉑、鈀、碳和各種合金。為了保證極好地粘附到絕緣材料(SiO2)上一些特殊的技術被用于各種不同的金屬。
下步該芯片復蓋一層正電的光致抗蝕劑(Shipley，MicropositA2 1350 J)，用線路模型蒙片(光場)，曝光和沖洗。光溶的抗蝕劑被沖走，并且暴露的鋁被蝕刻?？刮g劑的小島現(xiàn)在被移走，留下鋁線路模型在芯片上。這包括一個外周的金屬接觸墊，相連的線路(電線)和作為可尋址微場所基礎的中心列陣的微電極。
使用PECVD，芯片被先復蓋1層0.2到0.4微米SiO層，然后是0.1到0.2微米氮化硅(Si3N4)層。芯片隨后復蓋正電的光致抗蝕劑，為接觸墊和微電極場所蒙片，曝光，并沖洗。光溶的抗蝕劑被移走，SiO2和Si3N4層被蝕刻以便暴露鋁接觸墊和微電極。周圍的島式抗蝕劑然后被移走，在接觸墊和微電極間的連接線由SiO2和Si3N4層保持相互絕緣。
SiO2和Si3N4層為裝置的功能提供了重要的特性。首先，第二個SiO2層具有更好地接觸并增進了鋁線路的密封性。也可能應用抗蝕劑材料絕緣和密封。這個防止當微電極工作時由電解影響導致的線路逐漸損害。最終的Si3N4表層復蓋的應用是因為該層與隨后的用于修飾供粘附特異結合實體的微電極表面的試劑具有極低的反應性。
滲透和粘附層形成步驟在這時裝置上的微電極場所已準備好用特殊的滲透和粘附層來修飾。這代表了本發(fā)明的最重要部分，并且是本裝置主動功能化的核心。目標是在微電極上構建一個帶有選擇擴散特性的中間滲透層和一個帶有最佳結合特性的粘附表層。粘附層必須具有從每平方微米(μm2)105到107功能化的場所用于最佳結合特異結合實體。然而，結合特異的結合實體不應復蓋表面或使表面絕緣而阻止下面的微電極起作用。一個具功能的裝置需要實際金屬微電極表面的部分區(qū)域(～5％到25％)保持與溶劑(H2O)分子接觸，并允許相反離子(例如，Na+和Cl-)和電解氣體(例如，O2和H2)的擴散發(fā)生。
中間的滲透層也必須允許擴散的發(fā)生。此外，滲透層必須具有一種孔限特性它限制或阻止較大結合實體，反應物，和分析物與微電極表面的物理接觸。這滲透層保持活性的微電極表面物理地與微場所的結合實體層一定距離。
就原始裝置功能而言，本設計允許電泳式轉移所需的電解反應在微電極表面發(fā)生，但避免了對結合實體，反應物，和分析物的不利電化學影響。
衍生金屬微電極表面的一種優(yōu)選的步驟是應用氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)。APS容易與金屬和硅表面的氧化物和/或羥基團起反應。APS提供一種組合的滲透層和粘附層，并帶有伯胺基團用于隨后共價結合結合實體。就表面結合位點而言，APS在略氧化的鋁表面產生一個相對高水平的功能化激活(即，大量伯胺基團)在SiO2表面產生一個中等水平的功能化激活，和產生非常有限的功能化激活的Si3N4表面。
APS反應的進行是通過用溶于甲苯的10％APS溶液在50℃處理整個裝置(即，芯片)表面30分鐘。芯片然后在甲苯，乙醇中沖洗，然后在50℃干燥1小時。微電極金屬表面即被大量伯胺基團(105到106每平方微米)所功能活化?，F(xiàn)在結合實體能被共價地結合到衍生的微電極表面。
APS步驟對結合寡聚核苷酸結合實體工作很好。圖4表明結合3′-末端醛基衍生的寡聚核苷酸(40)到一個APS功能化激活的表面(42)的機制。雖然這代表了優(yōu)選的方法的一個方面，多個類型結合實體共價的和非-共價的結合各種各樣的其它結合反應是可能的。
設計和制造(微加工)這部分描述如何使用微加工技術(例如，鉆孔，銑削，等)或非-平版印刷技術來制造裝置。通常，這些裝置比那些由微平版印刷技術生產的裝置具有相對較大的微場所(＞100微米)。這些裝置能用于分析應用，以及制備類型的應用，例如生物高分子合成。大的可尋址場所能以三維方式制造(例如，管狀或園筒狀)以便攜帶大量結合實體。這種裝置可應用各種材料制造，包括，但不局限于，塑料、橡膠、硅、玻璃(例如，微槽的，毛細管，等等)，或陶瓷。在微加工裝置的情況下，連續(xù)的線路和較大的電極結構能應用對那些本領域的技術人員熟知的標準線路板印刷技術被印刷在材料上。
可尋址的微場所裝置應用微加工技術能相對簡單地被制造。圖5一個代表性96微場所裝置的圖解。這種微場所裝置是從一個適合的材料坯(2cm×4cm×1cm)通過穿過材料鈷96個等比例相隔的孔(直徑1mm)而制造的。一個電極線路板(52)是在塑料材料坯的薄片上形成的，它準確地安置在微場所元件的上部(54)。在線路板的下部含有單根電線(印刷線路)到每個微場所上(55)。短的鉑電極結構(～3-4mm)(62)被設計成延伸進入單個微場所腔(57)。印刷的線路電線用合適的防水絕緣材料覆蓋。印刷線路電線會聚到一個孔中，它允許連接到多路開關控制器(56)和DC電源(58)上。裝置是部分浸沒并在一個共同的緩沖液貯槽(59)中工作。
雖然由微加工和微平版印刷技術制造的裝置的微場所的初始功能是相同的，但它們的設計是不同的。由微平版印刷制造的裝置，其滲透和粘附層是直接在基礎金屬微電極上形成的。由微加工技術制造的裝置，其滲透和粘附層由在單個腔或槽(57)中的緩沖液從它們單個金屬電極結構(62)上物理地分離開(見圖6)。在微加工的裝置中滲透和粘附層能應用功能化的親水凝膠，膜，或其它合適的多孔材料而形成。
一般地說，組合的滲透和粘附層的厚度從10μm到10mm。例如，一種26％到35％聚丙烯酰胺(帶有0.1％聚賴氨酸)的修飾的親水凝膠，能被用來部分填充裝置上每個獨立的微場所腔。這種濃度的凝膠形成一種理想的滲透層并帶有從2nm到3nm的孔徑限度。結合到凝膠中的聚賴氨酸為隨后粘附特異結合實體提供伯胺功能基團。這種類型的凝膠滲透層允許電極以DC方式主動地起功能。當電極被激活時，這凝膠滲透層允許小的相反離子通過，但較大的特異結合實體分子在外部表面被濃縮。在這兒它們共價地結合到外層伯胺基團上，有效地成為粘附層。
為形成滲透和粘附層的另一種技術是將一種多孔膜材料結合入每個微場所腔的基部。膜的外表面隨后用化學功能基團衍生以形成粘附層。進行這種方法的合適技術和材料對于本領域的技術人員是熟知的。
上述關于裝置設計和制造的描述不應被認為是對基本裝置其它變型或形式的限制。多個帶有較大量或較小量可尋址微場所裝置的變型是為了不同的分析和制備應用被預想的。帶有較大量可尋址場所的裝置變型是為了制備生物高分子合成的應用預想的。一些變型也被期望作為電子地可尋址的和可控制的試劑分配器為與其它裝置一起使用，包括那些由微平版印刷技術生產的裝置。
(2)裝置的自我引導的尋址權利要求的裝置能夠用一個特異結合實體電子地自我尋址每個微場所。裝置本身直接影響或引起轉移和粘附特異結合實體到特定微場所上。裝置自我裝配自己以無需外界過程，機械加工，或在一個特定微場所放置一個特異結合實體。這種自我尋址過程既快速又特異，并能以系列或平行的方式進行。
裝置能通過保持選擇的微場所以DC方式并與特異結合實體相反的電荷(電勢)被特異的結合實體系列地尋址。所有其它的微場所與特異結合實體保持相同的電荷。在結合實體不是多于某個微場所的粘附位點時，需要活化僅一個其它微場所以便影響電泳式轉移到這特定的微場所上。特異結合實體被迅速地轉移(幾秒鐘，或最好地短于1秒)通過溶液，并直接地濃縮在特定的微場所上在這兒并立即共價結合到特定的表面。在特定微場所上電子地濃縮反應物或分析物(70)的能力被表示在圖7。所有其它微場所保持不受那個特異結合實體的影響。任何未反應的結合實體通過反向那個特定微場所的極性被移走，并被電泳到一個處理場所上。這種循環(huán)重復直至所有希望的微場所被它們特異結合實體所尋址。圖8表示用特異性寡聚核苷酸結合實體(82、84、86)尋址特定微場所(81、83、85)的系列過程。
為尋址微場所的偶聯(lián)過程簡單地包括同時活化大量(特別的基團或線路)的微電極以便相同的特異結合實體被轉移，濃縮，并與多于一個特定微場所起反應。
(3)裝置的應用一旦裝置被特異結合實體自我尋址后，各種分子生物學類型的多步和多路反應和分析就能在裝置上進行。本發(fā)明的裝置能夠電子地提供對多個重要反應參數(shù)的主動的或動態(tài)的控制。這種電子控制導致在反應速率，特異性，和靈敏性方面顯著提高。在這些反應參數(shù)上的提高是由于裝置電子地控制和影響下述事件的能力(1)快速轉移反應物或分析物到含有結合著特異結合實體的特定微場所上(2)由于濃縮了與那個特定微場所上特異結合實體起反應的反應物或分析物而促進反應速率；和(3)從那個微場所上快速和選擇地移走那些未反應的和非特異性結合的成份。這些優(yōu)點被應用在一個新的被稱為“電子嚴格性控制”的過程中。
本發(fā)明的自我可尋址裝置能夠快速地進行各種顯微形式的多步和/或多路反應和過程；它包括，但不局限于-DNA和RNA雜交過程和分析以傳統(tǒng)的方式，和新的改進的矩陣形式；-分子生物學反應過程，例如，限制性酶反應和分析，連接反應，激酶反應，和擴增過程；-抗體/抗原反應過程包括大或小的抗原和半抗原；-診斷測定，例如，雜交分析，基因分析，指紋分析，和免疫診斷；-生物分子偶聯(lián)過程(即，共價和非共價標記核酸、酶、蛋白、或抗體用報告基團)；-生物高分子合成過程，例如，寡聚核苷酸或肽的組合性合成；-水溶性合成高分子的合成，例如，碳水化合物或線狀聚丙烯酸酯；和-大分子和納米結構(納米大小顆粒和結構)的合成和制造。
核酸雜交核酸雜交被用作本發(fā)明的實例是因為它們帶有最困難的多步和多路反應的特征。
權利要求的裝置和方法允許核酸雜交以各種傳統(tǒng)的和新的方式進行。裝置電子地控制反應參數(shù)的能力極大地改進了核酸雜交分析，特別是裝置提供電子嚴格性控制(ESC)的能力。
“核酸雜交”是表示發(fā)生在所有天然的合成形式的和衍生的核酸間的雜交，包括脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，聚核苷酸和寡聚核苷酸。
傳統(tǒng)的雜交形式，如“斑點”雜交和“夾心”雜交，能用權利要求的裝置以及大范圍列陣或矩陣形式進行。
舉例來說，一種用于DNA雜交分析的裝置以如下的方式被設計、制造、和應用。微場所的列陣首先用微平版印刷技術制造。列陣上可尋址微場所的數(shù)量取決于最終的用途。裝置以系列方式被一組特異的寡聚核苷酸快速地自我尋址。在這種情況下，特異的寡聚核苷酸是3′-末端醛基功能化的寡聚核苷酸在(6-mer到100-mer的范圍)。醛基功能基團允許共價粘附到特定微場所粘附表面(見圖4)。這特異的寡聚核苷酸類群能在傳統(tǒng)的DNA合成儀上應用傳統(tǒng)技術方便地合成。
合成每個特異寡聚核苷酸是從核糖核酸控制的多孔玻璃(CPG)載體上開始的。因此，3′-末端點含有一個核糖核苷酸，它在合成和純化后通過過碘酸氧化容易地轉變成一個末端二醛衍生物。含有醛基的寡聚核苷酸(40)將容易地與微場所表面的伯胺功能基團通過西佛堿反應過程反應。
裝置用特異寡聚核苷酸的電子尋址在圖8顯示。第1個特定微場所(ML-1)(81)用它的特異序列寡聚核苷酸(SS0-1(82)尋址是通過保持該特定微電極(ML-1)在一個正DC電勢，而所有其它微電極被保持在一個負電勢(圖8(A))而完成的。在水緩沖液中醛基功能化的特異序列(SS0-1)被自由場電泳到ML-1處，在這兒它濃縮(＞106倍)和立即共價地結合到ML-1的表面(81)。所有其它微電極保持負的，并保留被保護或隔離，不與SS0-1序列(82)起反應。ML-1的電勢然后反轉成負(-)，以電泳任何未反應SS0-1到一個處理系統(tǒng)。該循環(huán)重復，SS0-2(84)→ML-2(83)，SS0-3(86)→ML-3(85)，SS0-n→ML-n直到所有期望的微場所用它們特異DNA序列所尋址(圖8(D))。
另一種尋址裝置的方法是從一個電子試劑提供裝置上轉移特異性結合實體例如特異性寡聚核苷酸。這種提供裝置能裝載大量結合實體或試劑并能被用作加樣分析裝置。結合實體將在兩種裝置間被電子地轉移。這種步驟取消了在用結合實體尋址該裝置過程中對物理操作，例如移液，的需求在裝置與結合實體尋址過程中。
然而另一種尋址裝置的方法是在特定的微場所進行組合的合成特異性寡聚核苷酸。組合的合成在下面部分中描述。
在裝置被特異性DNA序列尋址后，列陣裝置上的微場所保持作為獨立的工作直流(DC)電極。這是可能的因為粘附到電極表面是以基礎的微電極不被化學地或物理地絕緣的方式進行的。每個微電極仍然產生為了自由場電泳式轉移其它帶電DNA分子到和離開微場所表面需要的強直流電。DNA列陣裝置對DNA雜交和任何其它隨后反應的所有方面提供的完全電子控制。
電子地控制的雜交過程的一個實例表示在圖9。在這種情況，每個可尋址的微場所具有一個特異性捕獲序列(90)。含有目標DNA(92)的樣品溶液被加到裝置上。所有的微場所被活化并且樣品DNA在微場所被濃縮(圖9(B))。從稀溶液中來的目標DNA分子或在微場所高度濃縮，允許非常迅速地雜交到表面上特異性互補DNA序列上。反轉微電極電勢從微場所上排斥所有未雜交的DNA，而目標DNA保持已雜交狀態(tài)(圖9(C))。以同樣的模式，報告探針在隨后步驟中被雜交以便檢測雜交復合物。
電子控制雜交過程通過提高整個雜交效率和通過從微場所區(qū)域移走非-特異DNA顯著提高了目標DNA分子的隨后檢測。這是期望即10,000到100,000拷貝的目標序列在未擴增的基因組DNA中將是可識別的。這種類型的雜交反應能在數(shù)分鐘內，最少的外界操作下進行。極度地漂洗不是必須的。
另一種DNA雜交測定的常見方式包括把目標DNA固定在表面，然后雜交特定探針到這些目標DNA上。這種方式能包括或相同的目標DNA在多個場所上，或不同的目標DNA在特定的場所上。圖10表示這系列雜交方式的一種改進方式。在這種情況下微場所(101-107)被不同的捕獲DNA分子所尋址。它們以系列方式被不同序列的特異性寡聚核苷酸(108，109)雜交。這微場所隨后被偏壓成正以便轉移分子到它本身上而隨后偏壓成負以便轉移分子到下一個微場所上。特異地雜交的DNA將保持在微場所上而不管電極的電勢。序列特異性寡聚核苷酸能用一個合適的報告基團例如熒光團來標記。
權利要求的裝置能夠提供電子嚴格性控制。嚴格性控制對于雜交特異性是必須的，并且對于分辨點突變中一個堿基錯配是特別重要的。圖11顯示電子嚴格控制如果被用于為一個堿基錯配分析提高雜交特異性。電子嚴格控制也能被應用到多個堿基錯配分析中。
準確配合的DNA雜交子(110)比錯配DNA(112)雜交子穩(wěn)定。通過偏壓微場所成負(圖11(B))和在一定時間內釋放一固定量的電能，有可能變性或移走錯配的DNA雜交子而保留準確配合的DNA雜交子(圖11(C))。在進一步的改進中，權利要求的裝置對每個發(fā)生在裝置上的特定雜交反應提供獨立的嚴格控制。用傳統(tǒng)的或被動的列陣方式，不可能對發(fā)生在相同雜交溶液中的所有雜交過程獲得最適嚴格性。然而，本發(fā)明的主動列陣裝置能夠對在不同微場所上的雜交反應提供不同的電子嚴格性，甚至這些雜交反應是發(fā)生在同批雜交溶液中。這一特性克服了傳統(tǒng)矩陣雜交形式，雜交測序(SBH)形式，和其它多路分析的主要限制。
這種對雜交提供電子嚴格性控制的能力也提供了檢測DNA雜交而不用報告基團標記的DNA探針的機制。它提供了一種方法來進行雜交過程本身更加直接的檢測。一種熒光染料檢測過程在圖12顯示并在實例4和6中描述。直接檢測DNA雜交子通過應用DNA結合染料例如溴化乙錠能獲得。染料結合到雙鏈和單鏈DNA上但對前者有更大的親和力。在圖12(B)中，帶正電荷的染料(122)被轉移到負電地偏壓的微場所上。染料與雜交的(120)和未雜交的(121)DNA序列兩者結合(圖12C)。通過偏壓微場所成正和在固定時間內釋放一定量的電能，結合到未雜交微場所上的染料分子被選擇性地移走。應用的電能量對DNA雜交子無不利影響作用。
帶有結合的染料分子的雜交DNA隨后應用配套的或一體化的光學系統(tǒng)被熒光地檢測。
下面重復由本發(fā)明的裝置為核酸雜交反應和分析提供的重要的優(yōu)越性(1)快速轉移稀的目標DNA和/或探針DNA序列到雜交要發(fā)生的特定微場所上。這步在不多于幾秒鐘時間內發(fā)生。
(2)在雜交要發(fā)生的特定微場所上濃縮稀的目標DNA和/或探針DNA序列。這濃縮效應能超過一百萬倍(＞106)。
(3)從已發(fā)生雜交的特定微場所上快速移走非-特異地結合的目標DNA序列。這步需時10到20秒。
(4)從已發(fā)生雜交的特定微場所上快速移走競爭的互補目標DNA序列。這步需時10到20秒。
(6)在數(shù)分鐘內進行一次完全雜交過程的能力。
(7)進行一次帶有最少外界操作或漂洗步驟的雜交過程的能力。
(8)應用電子嚴格性控制(ESC)移走部分雜交的DNA序列。
(9)進行在1000到100,000拷貝數(shù)范圍內的未-擴增基因組目標DNA序列的雜交分析的能力。
(10)應用ESC提高單個堿基錯配雜交(點突變)的分辨力。
(11)應用ESC在矩陣雜交中提供單個嚴格性控制。
(12)通過移走非-特異性背景成份提高雜交反應的檢測。
(13)發(fā)展一種排除了應用共價標記的報告探針或目標DNA識別雜交反應需要的新程序。
裝置的復制除了用特異性結合實體分別地尋址單個裝置以外，也可能生產一種主裝置，它能拷貝特異的結合實體到其它裝置上。這代表了生產裝置的另一種方法。復制裝置的過程顯示在圖13。一個帶有已用特異性結合序列尋址的微場所的主裝置與各個互補DNA序列(130)雜交。這些互補序列被活化并因此能夠共價結合到微場所粘附層上。
一個未尋址的含有粘附層的姐妹裝置(132)與已雜交的主裝置配合(圖13(B))。主裝置的微場所被偏壓成負而姐妹裝置的微場所被偏壓成正。DNA雜交子被變性并轉移到姐妹裝置上，在這兒活化了的DNA序列共價地結合到微場所上(圖13(C))。這過程能以并聯(lián)地或串聯(lián)地實施，取決于裝置的幾何形狀以便微場所間的交叉干擾達最低。這些雜交子能通過應用足夠的負電勢或使用一種帶正電的離液劑或變性劑被變性。
識別系統(tǒng)在熒光結合反應的情況下，能夠使用一種落射熒光類型的顯微鏡檢測系統(tǒng)來分析結合反應。系統(tǒng)的靈敏度取決于配套的圖像識別元件(CCD，ICCD，微通道片)或光子計數(shù)PMT系統(tǒng)。另一種方法是直接地與裝置以夾心方式配套一種靈敏的CCD識別器或離子雪崩光電二極管(APD)識別器。再另一種方法是在裝置中組合進光電子或微電子檢測系統(tǒng)。
組合的生物高分子合成本發(fā)明的裝置也能夠進行生物高分子例如寡聚核苷酸和肽的組合的合成。這種過程允許自我引導的合成發(fā)生而無需任何外界引導或影響。這種組合的合成允許非常大量的序列在一個裝置上合成。組合的合成的基本概念包括應用裝置在可尋址的微場所上運輸，濃縮和反應各種單體，結合試劑，或封閉試劑。這概念利用裝置保護一些場所不受附近試劑的影響的能力。對這概念也重要的是在這些化學合成過程中選擇性步驟的識別，其中一種或多種反應物具有一個凈正電或負電，或為這些過程構建合適的試劑。
組合的寡聚核苷酸合成的一種方法顯示在圖14。這種方法從一套選擇性的可尋址微場所(140)開始，該微場所表面已用封閉的伯胺(X-NH-)基團(142)衍生過。這過程的起始步驟包括應用一種帶電的去封閉試劑(144)使電極選擇性地去封閉。在這種情況下，這試劑能攜帶一個正(+)電荷。這過程是通過應用對那些正被去封閉的電極加上一個負電勢，而對那些保持被保護狀態(tài)的電極加上一個正電勢(圖14(B))而進行的。應用正和負電勢到選擇的電極上引起帶電試劑在那些正被去封閉的微場所上濃縮，并從其它電極表面排除試劑。
在第二步，化學結合上第1個堿基，在這兒是胞嘧啶，到去封閉的微場所上是通過簡單地暴露該系統(tǒng)于磷酰胺試劑(X-C)而進行的。這(C)核苷酸結合到去封閉的微場所表面，而不結合到任何封閉的電極表面(圖14(C)和(D))。在這點上正常的磷酰胺化學進行著直到下步去封閉步驟。
在第二個去封閉步驟(圖14(D))，那些將結合下個堿基的電極點被賦于負電，而那些仍保持被保護狀態(tài)的被賦于正電。現(xiàn)在該系統(tǒng)暴露將結合的下個堿基中，在這兒是(X-A)(148)，并獲得選擇的結合到去封閉的微場所上(圖14(E)和(F))。這結合和去封閉過程反復進行，直到所有不同的DNA序列在每個可尋址的微場所表面被合成。
上述的實例代表一種合成核酸的可能方法。另一種方法包括完全水溶DNA合成。在這種情況下，帶電的水溶結合試劑，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDCA)，被用于與水溶性核苷酸衍生物一起進行寡聚核苷酸合成。這種方法將比現(xiàn)有的基于有機溶劑的方法具有重要的優(yōu)越性，現(xiàn)有的方法需要極度地封閉堿基的組成部分。水溶性合成將是花費少的并消除了使用那些在現(xiàn)今基于有機溶劑過程中使用的多個有毒物質。第三種方法包括應用帶電的單體。
在DNA合成外，相似的過程能發(fā)展用于肽合成，和其它復雜高分子的合成。在本說明書中仔細考慮的實例代表這技術的起始點，并是基于DNA或肽合成的有機溶劑合成過程。
在如下實例中的緩沖液、溶液，和培養(yǎng)液的配方描述在J.Sambrook，E.F.Fritsch and F.Maniatis，分子克隆實驗手冊，2nd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，1989。
實施例1寡聚體試劑合成的DNA探針應用傳統(tǒng)的磷酰胺化學在Applied Biosystems自動DNA合成儀上合成。寡聚體被設計成含有5′氨基或3′核糖核苷末端。5′端功能活化的實現(xiàn)通過應用ABI氨基連接臂2試劑而3′端功能活化則通過啟動從一個RNA CPG載體上的合成開始。3′核糖核苷酸末端能通過能與伯胺基團反應生成席佛堿的過碘酸氧化方法轉化成一個二醛基末端。反應條件如下水中溶解20-30O.D.的寡聚體使終濃度達1O.D./μl。加入1體積的0.1M醋酸鈉，pH 5.2和1體積0.45M過碘酸鈉(用新鮮水配制)。在周圍溫度下在黑暗中保持攪拌并反應至少2小時。加樣反應混合物到0.1M磷酸鈉pH 7.4緩沖液平衡的Sephadex G-10柱上(巴氏德移液管，0.6×5.5cm)。收集200μl級分，點樣2μl水溶液在薄層層析(TLC)上并收集紫外(UV)吸收級分。
如下的寡聚體含有3′核糖核苷酸末端(U)ET12R5′-GCT AGC CCC TGC TCA TGA GTC TCUCP-1 5′-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAUAT-A15′-CTA CGT GGA CCT GGA GAG GAA GGAGAC TGC CTG UAT-A25′-GAG TTC AGC AAA TTT GGA GUAT-A35′-CGT AGA ACT CCT CAT CTC CUAT-A45′-GTC TCC TTC CTC TCC AGUAT-A55′-GAT GAG CAG TTC TAC GTG GUAT-A65′-CTG GAG AAG AAG GAG ACUAT-A75′-TTC CAC AGA CTT AGA TTT GAC UAT-A85′-TTC CGC AGA TTT AGA AGA TUAT-A95′-TGT TTG CCT GTT CTC AGA CUAT-A10 5′-CAT CGC TGT GAC AAA ACA TU含有5′氨基的寡聚體通常地與熒光團，例如德克薩斯紅(TR.ex，590nm，em.610nm)起反應?；酋Ｂ葘Σ坊欠浅；顫姷囊孕纬梢粋€穩(wěn)定的氨磺酰鍵。德克薩斯紅-DNA結合物的形成如下德克薩斯紅磺酰氯(分子探針)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中到終濃度為50mg/ml(80mM)。寡聚體溶解在0.4M碳酸氫鈉pH 9.0-9.1中，達終濃度1O.D./μl(對21-mer是5.4mM)。在一個微試管中，10μl寡聚體和20μl德克薩斯紅混合。在黑暗中讓反應進行1小時。用氨水或羥胺終止反應，凍干樣品并用PAGE純化(Sambrooket al.，1989，Supra)。
如下的寡聚體含有5′氨基末端ET21A 5′-Aminolink2-TGC GAG CTG CAG TCA GAC ATET10AL5′-Aminolink2-GAG AGA CTC ATG AGC AGGET11AL5′-Aminolink2-CCT GCT CAT GAG TCT CTCT25′-Aminolink2-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTRC-A1 5′-Aminolink2-CAG GCA GTC TCC TTC CTC TCCAGG TCC ACG TAGRC-A2 5′-Aminolink2-CTC CAA ATT TGC TGA ACT CRC-A3 5′-Aminolink2-GGA GAT GAG GAG TTC TAC GRC-A4 5′-Aminolink2-CTG GAG AGG AAG GAG ACRC-A5 5′-Aminolink2-CCA CGT AGA ACT GCT CAT CRC-A6 5′-Aminolink2-GTC TCC TTC TTC TCC AGRC-A7 5′-Aminolink2-GTC AAA TCT AAG TCT GTG GAARC-AB 5′-Aminolink2-ATC TTC TAA ATC TGC GGA ARC-A9 5′-Aminolink2-GTC TGA GAA CAG GCA AAC ARC-A105′-Aminolink2-ATG TTT TGT CAC AGC GAT G實施例2在一種微加工的裝置上的電子地可尋址微場所——聚賴氨酸方法微電極從毛細管(0.2mm×5mm)制成。毛細管被充滿含有0.1～1.0％聚賴氨酸的18-26％聚丙烯酰胺并讓其聚合。多余的毛細管被做記號和移走以防止捕獲在管子中的氣泡并標準化管子長度。毛細管以這樣一種方式安放以使它們共享一個共同的上緩沖液貯槽并有單獨的低緩沖液貯槽。每個低緩沖液貯槽包含有一個鉑線電極。
上槽中毛細管的頂表面被認為是可尋址的微場所，上和下槽充滿0.1M磷酸鈉pH 7.4緩沖液并用BioRad 500/1000電源在0.05mA恒流預電泳10分鐘將2μl(0.1O.D.)過碘酸氧化的ET12R移液入上貯槽同時電源接上在恒流下電泳2-5分鐘。反轉極性從而使測試毛細管被偏壓面成負并電泳另一個2-5分鐘。未結合的DNA被排斥而共價結合的DNA保留下來。
吸掉上槽緩沖液并用緩沖液沖洗。拆除裝置并安裝一個新鮮的參考毛細管。重新充滿貯槽并加入熒光標記的補體DNA，即，ET10AL-TR。在正電地偏壓的測試微場所電泳地濃縮寡聚體，在0.05mA恒電流下達2-5分鐘。反轉極性并移走未結合的補體。移走測試毛細管并檢查熒光。對非-特異性結合的負控制是按上述實施的只要用一個非互補性DNA序列ET21A-TR代替ET10AL-TR。
毛細管微場所的橫截面用配有Hamamatsu ICCD照相圖像系統(tǒng)的落射熒光顯微鏡觀察。熒光結果表明補體ET10AL-TR雜交到結合實體/捕獲序列上，并且即使當電勢被改變成負時仍保持雜交狀態(tài)。
ET21A-TR非互補體當電勢反轉時不保留在測試毛細管上。
實施例3在一個微加工制造的裝置上的電子地可尋址微場所——琥珀酰亞胺丙烯酸酯方法本實施例描述共價地結合寡聚體的5′末端的另一種粘附化學。毛細管的制造同上述除了1％琥珀酰亞胺丙烯酸酯(分子探針)用于代替聚賴氨酸。毛細管新鮮制備因為琥珀酰亞胺酯與伯胺基起反應并是不穩(wěn)定的，特別在高于pH 8.0時。毛細管按上述安放，并且貯槽充滿0.1M磷酸鈉pH 7.4緩沖液。在0.05mA預電泳毛細管10分鐘。移液2μl含有5′氨基末端的ET10AL(0.1O.D.)，進入上貯槽中然后電源接上電泳2-5分鐘。反轉極性以便測試毛細管被偏壓成負并再電泳2-5分鐘。未結合的DNA被排斥而共價結合的DNA保留下。
吸掉上槽緩沖液并用緩沖液沖洗。拆除參考毛細管并安裝一個新鮮的參考毛細管。重新充滿貯槽并加入熒光標記的補體寡聚體，ET11AL-TR和同上述一樣電泳。對非特異結合的陰性對照同上述一樣實施只要用一個非補體DNA序列ET21A-TR代替ET11AL-TR。
熒光結果表明補體ET11A1-TR雜交到捕獲序列上并即使電勢被改變成負時仍保持雜交狀態(tài)。ET21A-TR非-補體當電勢反轉時不保留在工作毛細管上。
實施例4電子控制的熒光染料檢測過程-PAGEDNA染料例如溴化乙錠(EB)當結合入DNA時成為熒光的。當DNA是雙鏈時比單鏈時熒光和結合親和力更大。如同實施例1一樣制備毛細管并同上述一樣雜交。EB被加到溶液中(～0.05mM EB終濃度)測試毛細管被偏壓成負因為EB是帶正電的。毛細管在550nm激發(fā)和600nm發(fā)射時觀察落射熒光。雜交的和未雜交的微場所表示紅色熒光(從EB上)。
毛細管被重新安裝并偏壓成正以排斥EB。保持恒流在0.05mA達0.03伏特-小時。
捕獲目標正常的信號ET10AL ET11AL(正) ＞200ET10AL ET21A(負) 1在未雜交的微場所上的熒光減小而雜交的毛細管保持熒光。熒光信號用一臺ICCD照相圖像系統(tǒng)和特征峰熒光密度來測量。如果整個熒光信號區(qū)域被積分的話信噪比是＞＞1000倍。這表明了一種提高信噪比并從而提高測定的動力學范圍的方法。
實施例5金屬基質上的電子地可尋址場所鋁(Al)和金(Au)電線(0.25mm Aldrich)與溶于甲苯中的10％3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)起反應。APS試劑容易地與金屬表面氧化物和/或羥基基團起反應形成在氧化物和/或羥基基團與伯胺基團間的共價鍵。任何鋁的預處理是不需要的。金線在5×SSC溶液中電解以便形成氧化層。另外地金屬線能用高氯酸浴氧化。
APS反應的實施如下金屬線切成3英寸放入玻璃皿中。加入甲苯完全覆蓋金屬線并在加熱板上加溫到50～60℃。加入APS到終濃度10％?；旌先芤翰⒗^續(xù)反應30分鐘。用數(shù)倍體積甲苯沖洗3次，然后用數(shù)倍體積乙醇沖洗3次在50℃烘箱中干燥。經APS處理的金屬線能與醛基反應形成席佛堿。結合實體ET12R同其它地方描述的一樣用高碘酸氧化。電極被放入裝有去空氣水的槽中。電源加上0.05mA恒流保持30秒?；罨^的ET12R立即放入。接上電源，液體被吸出并加入新鮮水然后再次吸出。測試(偏壓成正)和參考電極放入含有熒光標記的補體DNA，ET10-TR的雜交緩沖液(HB，5×SSC，0.1％SDS)中。2分鐘以后用漂洗緩沖液(1×SSC，0.1％SDS)沖洗電極3次，每次1分鐘并觀察熒光(ex.590nm em.610nm)。
結果表明ET12R被特異地結合到處理過的金屬表面上。測試電極是熒光的而參考電極無熒光。非-特異性DNA吸附到金屬上是由在雜交緩沖液中的SDS所防止。因電解而粘附到金基質上和隨后的APS處理是有效的。獲得的信號是顯著強于由未-氧化的金獲得的信號。更加重要地，這實例表明金屬表面能用一個結合實體化學地功能化和衍生并不與溶液成為絕緣狀態(tài)。APS方法代表了形成DNA-金屬結合物的多個現(xiàn)存化學方法中的一種。
實施例6電子地控制的熒光染料識別過程——金屬線DNA-鋁電極基質如同實例5中描述的一樣制備和雜交。雜交的和未雜交的DNA-Al電極用一個未衍生的Al線作為參考而制備。EB被加入到溶液中測試DNA電極被偏壓成負來吸引染料。溶液被吸走并加入新鮮緩沖液。金屬表面在顯微鏡下檢查。
重新安裝裝置并加上正電電勢達一定伏特小時。緩沖液被吸走，電極通過落射熒光被觀察。這被反復直到在雜交的和未雜交的金屬表面有一個顯著的熒光區(qū)別。
捕獲目標 正常的信號ET12R ET10AL(正) ＞140ET12R 無(負) 1未雜交金屬表面的熒光堿小而雜交的金屬表面保持熒光。熒光信號用一臺ICCD照相圖像系統(tǒng)和特征峰熒光密度來測量。如果整個熒光信號區(qū)域被積分則信噪比將是＞＞1000倍。本實施例表明一種增加信噪比和因此提高測量動力學范圍的方法。相似的結果應用毛細管凝膠構型獲得，指明電化學影響不極大地影響測量的實施。
實施例7主動地編程的電子矩陣(APEX)——微機械加工制造一個6個可尋址250μm毛細管場所的放射狀列陣被微機械加工。該裝置有一個共同的上槽和分離的下槽以便每個微場所的電勢是單個可尋址的。一個唯一的寡聚體結合實體用在其它地方描述的方法定位于和結合到某個特異的毛細管微場所上。測試微場所有一個正電勢而其它微場所有負電勢以防止非-特異性相互作用。
列陣被漂洗然后與一個互補熒光標記的DNA探針雜交。列陣被漂洗以移走多余的探針然后在落射熒光顯微鏡下觀察。只有特異地尋址的微場所將是熒光的。過程將用其它結合實體在其它場所重復并用一個標記了其它熒光成分的探針雜交來證明。
DNA序列被特異地置于事先確定的位置與其它場所只有可忽略的交叉干擾。這使得用幾個到數(shù)百個唯一序列在事先確定的場所制造微矩陣成為可能。
實施例8主動的編程的電子矩陣(APEX)——微平板印刷制造一個8×8矩陣的50μm見方的鋁電極墊在硅晶片(見圖3)上被設計，制造和包裝出來，帶有一個開關盒(見裝置制造部分詳述)。進行數(shù)種材料和過程的改進同下述，以便提高芯片的選擇性和有效性。
8a)選擇頂部復蓋層APS過程包含在整個芯片中。功能活化過程的選擇性取決于芯片表面的反應性。為了減小功能活化和微場所周圍區(qū)域隨后DNA粘附，一種比SiO2或金屬氧化物對APS低反應性的材料是需要的。光致抗蝕劑和氮化硅被試驗。不同的頂部復蓋層被加到二氧化硅芯片上。芯片用落射熒光檢查并隨后用APS處理接著共價粘附高碘酸氧化的多聚ARNA序列(Sigma，MW 100,000)。芯片用200nM用德克薩斯紅標記的20-mer(T2-TR)溶液在雜交緩沖液中雜交，在37℃5分鐘。芯片用WB漂洗3次并用1×SSC漂洗1次。芯片用熒光在590nm激發(fā)610nm處發(fā)射檢查。
氮化硅被選中因為相對于二氧化硅它具有對APS更少的反應性并不象所試的光致抗蝕劑那樣本身具有熒光。其它方法例如UV燃燒背景區(qū)域也是可能的。
8b)APEX物理的特性完成的矩陣芯片應用一個配有B&L顯微鏡和CCD照相機的探針測試平臺(微操作型號6000)視覺檢查。芯片測試在測試墊和外圍接觸墊間的連續(xù)性。這測試借助用連接在萬用表上的操作探針頭接觸這些墊進行。連續(xù)性保證了墊已被蝕刻低到金屬表面。這些墊隨后檢查在電解環(huán)境中的穩(wěn)定性。金屬線被調整以在正常干燥條件下操縱達1mA電流。然而，對潮濕環(huán)境的反應不知道。一滴(1～5μl)緩沖溶液(1×SSC)被移液到8×8矩陣上。表面張力保持液體在一處使得外圍接觸墊區(qū)域干燥。一個探針頭接觸接觸墊而另一個探針頭接觸液體。電流增加到50nA以最高電壓50V，使用HP6625A電源和HP3458A數(shù)字萬用表。
開始的制造包括硅基質，一個二氧化硅絕緣層，鋁沉積和模型，和一個氨化硅頂端層。這些芯片在潮濕環(huán)境中不非常穩(wěn)定因為金屬/氮接觸面是天然物理的電解將破壞氮化層。這將導致墊電子地變短。進一步地，氮化硅和鋁具有不同的膨脹系數(shù)以致于當電流加上時氮化層將斷裂。這將導致溶液直接地接觸金屬，再次導致電解而進一步破壞氮化層。
第二制造步驟包括在鋁金屬和氮化硅層間的二氧化硅絕緣層。二氧化硅和鋁具有更加兼容的物理特性并可形成一個較好的化學界面以提供更穩(wěn)定和結實的芯片。
8c)DNA粘附矩陣芯片用APS試劑按實例5中描述的方法功能化活化。芯片然后用高碘酸氧化的多聚A RNA處理(Sigma，平均分子量100,000)。芯片在WB中漂洗去除多余和未結合的RNA。這一過程用捕獲序列復蓋整個芯片并在暴露的金屬表面比氮化物覆蓋的區(qū)域有更高的密度。芯片與200nM T2-TR溶液在HB中雜交5分鐘37℃。然后在周圍溫度下WB中洗3次和1×SSC中洗1次每次1分鐘。芯片檢查在590nm激發(fā)610nm發(fā)射的熒光。
開放的金屬區(qū)域略有熒光并有墊的形狀。低熒光密度和/或不規(guī)則邊界表明這些墊沒有完全地開放。額外的等離子體蝕刻時間是需要的。
8d)電子控制的雜交主動地雜交的實施借助應用實例8c中的芯片并偏壓一個微場所成正。這是通過使用也能自動地偏壓剩余的微場所成負的開關箱或通過使用一個外部溶液電極實現(xiàn)的。僅3微升水被放置在矩陣墊上。電流，～1-5nA，加上達數(shù)秒鐘并加上0.1pmole T2-TR到溶液中。液體被移走芯片干燥并在德克薩斯紅波長處檢查熒光(ex.590nm，em.610nm)。
僅僅正電地偏壓的微場所是熒光的。這能重復數(shù)次以便選擇性地雜交其它微場所。此外，在某微場所熒光的DNA借助偏壓原始場所成負而目的場所成正能被轉移置于另一個微場所上。
8e)電子控制的尋址和裝置制造矩陣被功能化活化用APS如同上述。結合實體CP-1用高碘酸氧化方法活化。矩陣中4個微場所偏壓成正而剩余的微場所被偏壓成負。2μl水被置于矩陣上并加上電流。加上結合實體，CP-1，并允許在指定的場所濃縮。移走液體，芯片用水簡單沖洗并將2μl水置于芯片上。再次，加上電流達數(shù)秒鐘并加入0.1皮摩爾T2-TR。在短時間后液體被移走整個芯片在WB中漂洗3次。干燥芯片檢查熒光。
結果指明正電地偏壓的微場所是熒光的。本實施例示范了用特異結合實體選擇性尋址微場所，定位和共價結合序列到微場所上，以及互補目標序列特異性雜交到衍生的微場所上。
8f)基因的模式APEX芯片帶有3′核糖核苷末端的DNA結合實體被合成它對HLA基因dQa的多態(tài)性是特異的。這結合實體用上述的高碘酸氧化法來活化。反向補體也合成帶有5′氨基末端并與熒光團結合，例如德克薩斯紅，若丹明或Bodipy染料，如同在其它處描述的。微場所用伯胺基通過APS處理被功能性活化，如同其它處描述的。數(shù)μl溶液置于矩陣上而留下接觸墊干燥。通過偏壓該微場所成正某特異微場所被尋址，加入高碘酸氧化過的DNA寡聚體，約0.1皮摩爾，并轉移定位共價地結合到那個場所上。極性被反轉未結合的結合實體分子被移走。對另一個結合實體在另一個尋址的微場所重復該過程直到所有特殊的結合實體被結合到芯片上。芯片然后雜交到單個熒光標記的補體序列上以便確定結合反應的特異性以及立刻整個地顯現(xiàn)所有被尋址的微場所。在相同的已被變性移走互補寡聚體(10分鐘90℃在0.05％SDS中)的芯片上，尋址的微場所與未標記的反向補體或基因組DNA雜交。通過別處描述的熒光染料檢測測定法而識別。
結果將表明微場所是特異地被獨特的結合實體尋址。對負電偏壓的微場所的非特異的結合可忽略不計。裝置和配合的結合實體化學在變性條件下是穩(wěn)定的，因此使得尋址的和制造的裝置能重復使用。變性雜交子的其它方法是增加電流和/或增加加上電流的時間。
實施例9電子的嚴格性控制裝置影響電子嚴格性控制的能力是用Ras癌基因模式系統(tǒng)來示范的。一個單堿基對錯配反向地影響解鏈溫度(Tm)，雙螺旋穩(wěn)定性的一種指標。傳統(tǒng)的區(qū)別錯配和完全配合的方法(即嚴格性控制)取決于溫度和鹽的條件。嚴格性也受到電泳的電勢的影響。下面列出的寡聚體能被配對而形成具0～2個錯配的雜交子。寡聚體結合實體被結合到微場所上并雜交，如同其它處描述的一樣。微場所的極性然后反轉，雜交子接受恒電流達一定時間，或確定的功率水平以便變性錯配對而不影響完全配合。
Ras-G5′-GGT GGT GGG CGC CGGCGG TGT GGG CAA GAU-3′Ras-1 3′-CC GCG GCCGCC ACA C-Aminolink2-5′Ras-2 3′-CC GCG GCAGCC ACA C-Aminolink2-5′Ras-3 3′-CC GTG GCAGCC ACA C-Aminolink2-5′Ras-T5′-GGT GGT GGG CGC CGTCGG TGT GGG CAA GAU-3′微電極是從毛細管制造的如同其它處描述。結合實體Ras-G經高碘酸氧化并共價地結合到已尋址的微場所上。Ras-G微場所隨后與完全配合的Ras-1-TR雜變，與一個堿基對錯配(G-A)的Ras-2-TR或二個堿基對錯配(G-A或G-T)的Ras-3-TR雜交。微場所熒光檢查以便證實互補序列是雜交的和雜交到何種程度。毛細管被重新安裝并加上恒電流達到控制的時間直到錯配雜交子被移走而不顯著影響完全地配合的雜交子。
結果將指明嚴格性能受到電泳的電勢的影響。該實施例示范了每個微場所能具有單個的嚴格性控制，因此克服了對于被限制于單個共同的嚴格性水平的大范圍的并聯(lián)過程技術的一個主要障礙。
權利要求
1.一種用于電子控制含有對某個結合場所特異結合實體和非特異結合實體的溶液中帶電結合實體的相互作用的方法，它包括下列步驟放置該溶液接觸含有第1基礎電極的和一個覆蓋的滲透層的第1結合場所，和含有第2基礎電極的和一個覆蓋的滲透層的第2結合場所；放置所述第1結合場所在相對于所述第2結合場所的一個吸引勢，在所述第1場所濃縮結合實體。
2.一種用于電子控制含有對第1和第2結合場所特異結合和非特異結合DNA序列的溶液中DNA雜交的方法，它包括下列步驟放置該溶液接觸第1、第2和第3場所；放置所述第1和第2結合場所在一個正電勢而所述第3場所在一個負電勢，在所述第1和第2場所濃縮DNA；放置所述第1和第2特異性結合場所在一個負電勢而所述第3場所在一個正電勢；和放置所述第1和第2結合場所在相對于所述第3場所的負電勢，其中所述負電勢或電流足以從所述第1和第2場所上移走非特異地結合的DNA，而不足以移走特異地結合的DNA序列。
3.一種用于電子控制含有對第1結合場所和隨后第2特異結合場所特異和非特異DNA序列的溶液中DNA雜交的方法，它包括下列步驟放置該溶液接觸所述第1、第2和第3場所；放置所述第1結合場所在一個正電勢而所述第2結合場所在一個負電勢，在所述第1場所上濃縮DNA；放置所述第1結合場所在一個負電勢而所述第2結合場所在一個正電勢，在所述第2場所濃縮DNA；和放置所述第1和第2結合場所在相對于所述第3結合場所的負電勢，其中所述負電勢或電流足以從所述第1和第2場所上移走非特異地結合的DNA而不足以移走特異地結合的DNA。
4.權利要求3的雜交方法，其中所述負電勢或電流是逐漸地增加或減少的。
5.權利要求2或3的方法，其中復合的特異和非特異DNA序列被應用于一個結合場所的列陣上。
6.權利要求1的用于電子控制相互作用的方法，它包括下列步驟放置所述第1結合場所于一個相對于第2結合場所的排斥勢，其中所述排斥勢足以從所述第1結合場所上移走非特異地結合的結合實體，而不足以移走特異地結合的結合實體。
7.權利要求1的方法，進一步包括將特異性結合實體附著在第一結合場所的滲透層上。
8.權利要求1的方法，進一步包括將在第一結合場所上濃縮的結合實體與結合到滲透層的互補的特異性結合實體相互作用。
9.權利要求8的方法，進一步包括反轉第一結合場所的電勢，其數(shù)量足以從所述第1結合場所上移走非特異地結合的結合實體，而不足以移走特異地結合的結合實體。
10.權利要求1的方法，其中的特異性結合實體包括一種能通過共價鍵與其它分子特異性親和結合的生物分子。
11.權利要求1的方法，其中的特異性結合實體包括一種能通過非共價鍵與其它分子特異性親和結合的生物分子。
12.權利要求1的方法，其中的特異性結合實體包括一種能通過共價鍵與其它分子特異性親和結合的合成分子。
13.權利要求1的方法，其中的特異性結合實體包括一種能通過非共價鍵與其它分子特異性親和結合的合成分子。
14.權利要求1的方法，其中的特異的結合實體選自脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)，合成的寡聚核苷酸、抗體、蛋白質、肽、凝集素、修飾的多糖，合成的復合大分子，具功能的納米結構，合成高分子，修飾/封閉的核苷酸/核苷，修飾/封閉的氨基酸、熒光團、生色團、配體、螯合物和半抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于電子控制含有對某個結合場所特異結合實體和非特異結合實體的溶液中帶電結合實體的相互作用的方法。本發(fā)明還涉及一種用于電子控制含有對第1和第2結合場所特異結合和非特異結合DNA序列的溶液中DNA雜交的方法。本發(fā)明涉及一種用于電子控制含有對第1結合場所和隨后第2特異結合場所特異和非特異DNA序列的溶液中DNA雜交的方法。其中，借助于對于上述場所的電勢的調控，濃縮結合實體，例如DNA序列，并且保證在上述場所的結合實體，例如DNA序列，的特異性結合。
文檔編號G01N33/53GK1920055SQ200610100328
公開日2007年2月28日 申請日期1994年10月26日 優(yōu)先權日1993年11月1日
發(fā)明者M·J·赫勒, E·杜 申請人:內諾金有限公司