專利名稱：利用核特異熒光染色和子房整體透明技術觀察水稻胚囊的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種觀察水稻胚囊的方法，尤其是涉及一種利用核特異熒光染色和子房整體透明技術觀察水稻胚囊的方法。
背景技術：
胚囊是被子植物特有的雌配子體結構，參與其有性生殖的許多過程。胚囊的結構與功能是植物生殖生物學研究的一個主要方面。然而被子植物的胚囊處于胚珠組織層層包裹之中，有的植物胚珠外又有較厚的子房壁，這給胚囊的研究工作帶來很大困難。到目前為止，先后提出過許多觀察胚囊的方法與技術，如石蠟切片法；顯微解剖法；酶解分離法；整體透明法；整體染色透明法等。
觀察胚囊的傳統方法是石蠟切片法，適于觀察胚囊內部細微結構。但其制片過程復雜，工作量大，且根據連續(xù)切片來建立胚囊的整體結構概念也較困難。因此，顯微解剖方法、酶解分離法、整體透明法、整體染色透明法等技術被相繼提出。
顯微解剖法是在解剖鏡或顯微鏡下用解剖針、昆蟲針或玻璃微針直接將胚囊從胚珠中剝離出來進行觀察。此技術可用于固定及新鮮植物材料胚囊及其組成細胞的分離。與傳統切片技術相比，利用顯微解剖技術可觀察到切片法難以觀察到的某些特殊形狀胚囊的整體結構。但該方法技術要求高，操作難度大，費時費力，并且操作過程中容易改變細胞組織原來的位置和形狀。因此需要熟練精巧的手工操作。
酶解分離法是利用酶液軟化或裂解胚珠組織的細胞壁，然后借助于振蕩、壓片或顯微解剖等外力作用使胚珠組織細胞離散，從而分離出胚囊。酶解分離法是整體胚囊分離技術中比較理想的方法。因為酶解分離出來的胚囊比較接近原來的生活狀態(tài)，同時，酶解法分離的胚囊立體感強，保持完好的整體性。在同一視野下，通過調節(jié)焦距能看到胚囊各組成部分的空間結構關系，特別適合于生活大孢子和胚囊發(fā)育時期的研究。不足之處是操作難度大，成功率有限。同時酶液可能對生活胚囊造成有害影響。
整體透明法是20世紀70年代發(fā)展起來的一項技術，它利用透明劑處理整體胚珠或子房，組織經透明后即可觀察到其中包藏的胚囊。Herr首先提出胚珠整體透明技術，他用一種復合透明劑“4”混合透明劑(乳酸∶水合三氯乙醛∶酚∶丁香油∶二甲苯＝2∶2∶2∶2∶1)浸泡胚珠，在相差或干涉顯微鏡下觀察大孢子母細胞、大孢子和胚囊。Herr和其它研究者先后用這種方法研究了多種植物材料均獲得成功。Crane提出用另一種透明劑水楊酸甲酯(即冬青油)，其透明效果好于“4”混合透明劑，不僅可以用于胚珠，而且可以用于子房的透明。此方法優(yōu)點是制片過程簡單快速，可省去切片的繁多程序，并且可以獲得富有立體感的胚囊結構圖像。然而，單純的透明法也有一定的局限性。主要是子房或胚珠經透明后在光學顯微鏡下觀察反差太小，只能看到細胞壁的結構。為了觀察胚囊內細胞核及核仁的結構，必須借助相差或干涉差裝置。
為了克服單純透明法反差小的局限性，Stelly等提出了在冬青油透明前，先用梅氏蘇木精明礬染色，這樣增大了反差，用一般視野觀察即可看見Solanum sp.胚珠中的大孢子發(fā)生與胚囊結構。楊弘遠在此基礎上建立了“愛氏蘇木精—冬青油”新的染色透明程序，分別對向日葵、煙草和水稻的子房進行了染色透明，使觀察效果相對提高，但由于觀察方法落后，使得觀察效果也不太理想。任宏等利用發(fā)育中的水稻胚囊具有自發(fā)熒光的特點，對其透明處理后不經染色直接利用激光掃描共聚焦掃描顯微鏡進行觀察。水稻胚囊經488nm波長的激光激發(fā)后，能產生自發(fā)熒光，但這種自發(fā)熒光相對較弱，所以觀察到胚囊內的細胞輪廓比較模糊。張華華等和郭海濱等利用2％硫酸鋁鉀媒染——4％蔗糖曙紅溶液對水稻子房進行整體染色——2％硫酸鋁鉀分色，透明后利用激光掃描共聚焦掃描顯微鏡進行觀察，在543nm波長的激光的激發(fā)下，能夠較好的反映胚囊內各細胞的結構。但這種方法步驟繁瑣且只適合對開花前較小的胚囊進行觀察，而對開花后較大的胚囊則不適用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就在針對水稻子房，尤其是開花后較大的子房材料染料不易透過，因此胚囊內各細胞不易染色的特點，從而提供一種觀察效果更好的利用核特異熒光染色和子房整體透明技術觀察水稻胚囊的方法。
本發(fā)明的目的可通過以下措施來實現
本發(fā)明方法是用核熒光染色和子房整體透明技術對水稻各個發(fā)育時期的胚囊和受精后各個時期的胚胎發(fā)育過程進行觀察；具體方法是，取水稻的穎花用固定液固定，觀察前將固定好的穎花用50％-75％的酒精沖洗一下，然后在解剖鏡下分離出子房，保存于70％-75％酒精中備用；染色前，各個時期的水稻子房經各級濃度梯度下降的乙醇溶液直至蒸餾水處理，每次20min-30min；然后用NaOH溶液或HCl溶液處理1-2h，蒸餾水沖洗后，再用0.5-1μg/ml的DAPI溶液或Hoechst溶液染色10-24h；接著用乙醇溶液梯度脫水，每級20min-30min；隨后將子房放入無水乙醇中脫水至少兩次，每次的脫水時間至少1h，接著，再轉入無水乙醇中脫水12h以上；然后將已經脫水的子房材料在體積比為1∶1的無水乙醇和水楊酸甲酯組成的混合液中過渡至少1h，再用水楊酸甲酯透明處理至少3次；在前兩次透明時，每次至少2h，最后一次透明的時間為15h以上；上述子房材料經過水楊酸甲酯透明處理后可以在水楊酸甲酯中保存?zhèn)溆?；觀察前，將處理好的子房夾出，置于凹玻片上封片或小培養(yǎng)皿上；將制備好的凹玻片置于熒光顯微鏡直接觀察；或者，將制備好的凹玻片或小培養(yǎng)皿置于激光共聚焦掃描顯微鏡上，用激光激發(fā)，掃描獲得成熟胚囊和胚胎發(fā)育過程的各個時期的清晰圖片。
本發(fā)明的方法中，具體是，取水稻的穎花用甲醛-醋酸-酒精(FAA)固定液固定，并保存于甲醛-醋酸-酒精(FAA)固定液中；觀察前將固定的穎花用70％的酒精沖洗一下，然后在解剖鏡下分離出子房，保存于70％酒精中備用；染色前，各個時期的水稻子房經50％、30％、15％乙醇至蒸餾水處理，處理時間為每次20min，然后用1M的NaOH溶液軟化處理1-2h，接著用蒸餾水沖洗，然后用1μg/ml的DAPI溶液染色12h；隨后用15％、30％、50％、70％、85％、95％的乙醇梯度脫水，每級20min，隨后將子房放入無水乙醇中脫水兩次，每次的脫水時間為2h，接著，再轉入無水乙醇中脫水12h；然后將已經脫水的子房材料在無水乙醇和水楊酸甲酯(1∶1)組成的混合液中過渡1h，然后再用水楊酸甲酯透明處理3次；在前兩次透明時，每次2h，最后一次透明的時間為15h；上述子房材料經過水楊酸甲酯透明處理后可以在水楊酸甲酯中保存?zhèn)溆茫^察前，用鑷子輕輕將處理好的子房夾出，置于凹玻片或小培養(yǎng)皿上，用丁香油封片；將制備好的載玻片置于激光共聚焦掃描顯微鏡上，用波長488nm激光激發(fā)，掃描獲得成熟胚囊和胚胎發(fā)育過程的各個時期的清晰圖片。
本發(fā)明由于采用上述方法，即在染色前，先用一定濃度的氫氧化鈉溶液對水稻子房進行軟化處理(使染料更易進入胚囊內各細胞)，然后利用細胞核熒光染料DAPI與細胞核的特異結合來觀察胚囊內各細胞及細胞核的結構，在激光掃描共聚焦顯微鏡下胚囊內各細胞的細胞核以及核仁發(fā)出明亮熒光，細胞輪廓比較清晰，層次感強，能清晰觀察到細胞的內部構造。不論是對開花前較小的胚囊材料還是開花后較大的胚囊材料都取得了較好的觀察效果。對于開花前不同發(fā)育時期的胚囊，經處理后能清晰的觀察到胚囊內各細胞或細胞核的內部結構和發(fā)育動態(tài)；對開開花后的胚囊材料，經處理后能清晰的觀察到胚囊內卵細胞和極核雙受精過程、胚胎發(fā)育過程以及胚乳發(fā)育過程中各個細胞的結構特點和發(fā)育特點。該發(fā)明對水稻以及其它被子植物的胚囊發(fā)育過程以及胚胎發(fā)育過程的觀察提供了一種快速實用的方法。這對被子植物胚胎學研究具有一定的推動作用。
具體實施例方式
本發(fā)明以下結合實施例作以詳細的描述實施例1本發(fā)明本發(fā)明方法是用核熒光染色和子房整體透明技術對水稻各個發(fā)育時期的胚囊和受精后各個時期的胚胎發(fā)育過程進行觀察；具體方法是，取水稻的穎花用固定液固定，觀察前將固定好的穎花用50％的酒精沖洗一下，然后在解剖鏡下分離出子房，保存于70％酒精中備用；染色前，各個時期的水稻子房經各級濃度梯度下降的乙醇溶液直至蒸餾水處理，每次20min；然后用NaOH溶液或HCl溶液處理1h，蒸餾水沖洗后，再用0.5μg/ml的DAPI溶液或Hoechst溶液染色10h；接著用乙醇溶液梯度脫水，每級20min；隨后將子房放入無水乙醇中脫水至少兩次，每次的脫水時間至少1h，接著，再轉入無水乙醇中脫水12h以上；然后將已經脫水的子房材料在體積比為1∶1的無水乙醇和水楊酸甲酯組成的混合液中過渡至少1h，再用水楊酸甲酯透明處理3次；在前兩次透明時，每次2h，最后一次透明的時間為15h；上述子房材料經過水楊酸甲酯透明處理后可以在水楊酸甲酯中保存?zhèn)溆?；觀察前，將處理好的子房夾出，置于凹玻片上封片或小培養(yǎng)皿上；將制備好的凹玻片置于熒光顯微鏡直接觀察；或者，將制備好的凹玻片或小培養(yǎng)皿置于激光共聚焦掃描顯微鏡上，用激光激發(fā)，掃描獲得成熟胚囊和胚胎發(fā)育過程的各個時期的清晰圖片。
實施例2本發(fā)明本發(fā)明方法是用核熒光染色和子房整體透明技術對水稻各個發(fā)育時期的胚囊和受精后各個時期的胚胎發(fā)育過程進行觀察；具體方法是，取水稻的穎花用固定液固定，觀察前將固定好的穎花用60％的酒精沖洗一下，然后在解剖鏡下分離出子房，保存于72％酒精中備用；染色前，各個時期的水稻子房經各級濃度梯度下降的乙醇溶液直至蒸餾水處理，每次23min；然后用NaOH溶液或HCl溶液處理1.2h，蒸餾水沖洗后，再用0.6μg/ml的DAPI溶液或Hoechst溶液染色15h；接著用乙醇溶液梯度脫水，每級23min；隨后將子房放入無水乙醇中脫水兩次，每次的脫水時間2h，接著，再轉入無水乙醇中脫水13h以上；然后將已經脫水的子房材料在體積比為1∶1的無水乙醇和水楊酸甲酯組成的混合液中過渡2h，再用水楊酸甲酯透明處理3次；在前兩次透明時，每次3h，最后一次透明的時間為16h以上；上述子房材料經過水楊酸甲酯透明處理后可以在水楊酸甲酯中保存?zhèn)溆?；觀察前，將處理好的子房夾出，置于凹玻片上封片或小培養(yǎng)皿上；將制備好的凹玻片置于熒光顯微鏡直接觀察；或者，將制備好的凹玻片或小培養(yǎng)皿置于激光共聚焦掃描顯微鏡上，用激光激發(fā)，掃描獲得成熟胚囊和胚胎發(fā)育過程的各個時期的清晰圖片。
實施例3本發(fā)明本發(fā)明方法是用核熒光染色和子房整體透明技術對水稻各個發(fā)育時期的胚囊和受精后各個時期的胚胎發(fā)育過程進行觀察；具體方法是，取水稻的穎花用固定液固定，觀察前將固定好的穎花用65％的酒精沖洗一下，然后在解剖鏡下分離出子房，保存于73％酒精中備用；染色前，各個時期的水稻子房經各級濃度梯度下降的乙醇溶液直至蒸餾水處理，每次25min；然后用NaOH溶液或HCl溶液處理1.5h，蒸餾水沖洗后，再用0.7μg/ml的DAPI溶液或Hoechst溶液染色20h；接著用乙醇溶液梯度脫水，每級25min；隨后將子房放入無水乙醇中脫水兩次，每次的脫水時間3h，接著，再轉入無水乙醇中脫水14h以上；然后將已經脫水的子房材料在體積比為1∶1的無水乙醇和水楊酸甲酯組成的混合液中過渡3h，再用水楊酸甲酯透明處理3次；在前兩次透明時，每次4h，最后一次透明的時間為17h以上；上述子房材料經過水楊酸甲酯透明處理后可以在水楊酸甲酯中保存?zhèn)溆茫挥^察前，將處理好的子房夾出，置于凹玻片上封片或小培養(yǎng)皿上；將制備好的凹玻片置于熒光顯微鏡直接觀察；或者，將制備好的凹玻片或小培養(yǎng)皿置于激光共聚焦掃描顯微鏡上，用激光激發(fā)，掃描獲得成熟胚囊和胚胎發(fā)育過程的各個時期的清晰圖片。
實施例4本發(fā)明本發(fā)明方法是用核熒光染色和子房整體透明技術對水稻各個發(fā)育時期的胚囊和受精后各個時期的胚胎發(fā)育過程進行觀察；具體方法是，取水稻的穎花用固定液固定，觀察前將固定好的穎花用74％的酒精沖洗一下，然后在解剖鏡下分離出子房，保存于74％酒精中備用；染色前，各個時期的水稻子房經各級濃度梯度下降的乙醇溶液直至蒸餾水處理，每次28min；然后用NaOH溶液或HCl溶液處理1.9h，蒸餾水沖洗后，再用0.9μg/ml的DAPI溶液或Hoechst溶液染色22h；接著用乙醇溶液梯度脫水，每級29min；隨后將子房放入無水乙醇中脫水至少兩次，每次的脫水時間至少5h，接著，再轉入無水乙醇中脫水15h以上；然后將已經脫水的子房材料在體積比為1∶1的無水乙醇和水楊酸甲酯組成的混合液中過渡5h，再用水楊酸甲酯透明處理至少3次；在前兩次透明時，每次至少5h，最后一次透明的時間為20h以上；上述子房材料經過水楊酸甲酯透明處理后可以在水楊酸甲酯中保存?zhèn)溆茫挥^察前，將處理好的子房夾出，置于凹玻片上封片或小培養(yǎng)皿上；將制備好的凹玻片置于熒光顯微鏡直接觀察；或者，將制備好的凹玻片或小培養(yǎng)皿置于激光共聚焦掃描顯微鏡上，用激光激發(fā)，掃描獲得成熟胚囊和胚胎發(fā)育過程的各個時期的清晰圖片。
實施例5本發(fā)明本發(fā)明方法是用核熒光染色和子房整體透明技術對水稻各個發(fā)育時期的胚囊和受精后各個時期的胚胎發(fā)育過程進行觀察；具體方法是，取水稻的穎花用固定液固定，觀察前將固定好的穎花用75％的酒精沖洗一下，然后在解剖鏡下分離出子房，保存于75％酒精中備用；染色前，各個時期的水稻子房經各級濃度梯度下降的乙醇溶液直至蒸餾水處理，每次30min；然后用NaOH溶液或HCl溶液處理2h，蒸餾水沖洗后，再用1μg/ml的DAPI溶液或Hoechst溶液染色24h；接著用乙醇溶液梯度脫水，每級30min；隨后將子房放入無水乙醇中脫水至少兩次，每次的脫水時間6h，接著，再轉入無水乙醇中脫水18h以上；然后將已經脫水的子房材料在體積比為1∶1的無水乙醇和水楊酸甲酯組成的混合液中過渡至少6h，再用水楊酸甲酯透明處理至少3次；在前兩次透明時，每次至少6h，最后一次透明的時間為20h以上；上述子房材料經過水楊酸甲酯透明處理后可以在水楊酸甲酯中保存?zhèn)溆?；觀察前，將處理好的子房夾出，置于凹玻片上封片或小培養(yǎng)皿上；將制備好的凹玻片置于熒光顯微鏡直接觀察；或者，將制備好的凹玻片或小培養(yǎng)皿置于激光共聚焦掃描顯微鏡上，用激光激發(fā)，掃描獲得成熟胚囊和胚胎發(fā)育過程的各個時期的清晰圖片。
實施例6本發(fā)明的方法中，具體是，取水稻的穎花用甲醛-醋酸-酒精(FAA)固定液固定，并保存于甲醛-醋酸-酒精(FAA)固定液中；觀察前將固定的穎花用70％的酒精沖洗一下，然后在解剖鏡下分離出子房，保存于70％酒精中備用；染色前，各個時期的水稻子房經50％、30％、15％乙醇至蒸餾水處理，處理時間為每次20min，然后用1M的NaOH溶液軟化處理1-2h，接著用蒸餾水沖洗，然后用1μg/ml的DAPI溶液染色12h；隨后用15％、30％、50％、70％、85％、95％的乙醇梯度脫水，每級20min，隨后將子房放入無水乙醇中脫水兩次，每次的脫水時間為2h，接著，再轉入無水乙醇中脫水12h；然后將已經脫水的子房材料在無水乙醇和水楊酸甲酯(1∶1)組成的混合液中過渡1h，然后再用水楊酸甲酯透明處理3次；在前兩次透明時，每次2h，最后一次透明的時間為15h；上述子房材料經過水楊酸甲酯透明處理后可以在水楊酸甲酯中保存?zhèn)溆?，觀察前，用鑷子輕輕將處理好的子房夾出，置于凹玻片或小培養(yǎng)皿上，用丁香油封片；將制備好的載玻片置于激光共聚焦掃描顯微鏡上，用波長488nm激光激發(fā)，掃描獲得成熟胚囊和胚胎發(fā)育過程的各個時期的清晰圖片。
另外，上述幾個實施例僅舉出了本方法中各參數范圍值中的幾個具體點值。根據需要，還可以在本發(fā)明方法中各個參數范圍值內取任意其他點值。
權利要求
1.一種利用核特異熒光染色和子房整體透明技術觀察水稻胚囊的方法，其特征在于其方法是用核熒光染色和子房整體透明技術對水稻各個發(fā)育時期的胚囊和受精后各個時期的胚胎發(fā)育過程進行觀察；方法如下，取水稻的穎花用固定液固定，觀察前將固定好的穎花用50％-75％的酒精沖洗一下，然后在解剖鏡下分離出子房，保存于70％-75％酒精中備用；染色前，各個時期的水稻子房經各級濃度梯度下降的乙醇溶液直至蒸餾水處理，每次20min-30min；然后用NaOH溶液或HCl溶液處理1-2h，蒸餾水沖洗后，再用0.5-1μg/ml的DAPI溶液或Hoechst溶液染色10-24h；接著用乙醇溶液梯度脫水，每級20min-30min；隨后將子房放入無水乙醇中脫水至少兩次，每次的脫水時間至少1h，接著，再轉入無水乙醇中脫水12h以上；然后將已經脫水的子房材料在體積比為1∶1的無水乙醇和水楊酸甲酯組成的混合液中過渡至少1h，再用水楊酸甲酯透明處理至少3次；在前兩次透明時，每次至少2h，最后一次透明的時間為15h以上；上述子房材料經過水楊酸甲酯透明處理后可以在水楊酸甲酯中保存?zhèn)溆?；觀察前，將處理好的子房夾出，置于凹玻片上封片或小培養(yǎng)皿上；將制備好的凹玻片置于熒光顯微鏡直接觀察；或者，將制備好的凹玻片或小培養(yǎng)皿置于激光共聚焦掃描顯微鏡上，用激光激發(fā)，掃描獲得成熟胚囊和胚胎發(fā)育過程的各個時期的清晰圖片。
2.根據權利要求1所述的利用核特異熒光染色和子房整體透明技術觀察水稻胚囊的方法，其特征在于所述方法具體是，取水稻的穎花用甲醛-醋酸-酒精(FAA)固定液固定，并保存于甲醛-醋酸-酒精(FAA)固定液中；觀察前將固定的穎花用70％的酒精沖洗一下，然后在解剖鏡下分離出子房，保存于70％酒精中備用；染色前，各個時期的水稻子房經50％、30％、15％乙醇至蒸餾水處理，處理時間為每次20min，然后用1M的NaOH溶液軟化處理1-2h，接著用蒸餾水沖洗，然后用1μg/ml的DAPI溶液染色12h；隨后用15％、30％、50％、70％、85％、95％的乙醇梯度脫水，每級20min，隨后將子房放入無水乙醇中脫水兩次，每次的脫水時間為2h，接著，再轉入無水乙醇中脫水12h；然后將已經脫水的子房材料在無水乙醇和水楊酸甲酯(1∶1)組成的混合液中過渡1h，然后再用水楊酸甲酯透明處理3次；在前兩次透明時，每次2h，最后一次透明的時間為15h；上述子房材料經過水楊酸甲酯透明處理后可以在水楊酸甲酯中保存?zhèn)溆?，觀察前，用鑷子輕輕將處理好的子房夾出，置于凹玻片或小培養(yǎng)皿上，用丁香油封片；將制備好的載玻片置于激光共聚焦掃描顯微鏡上，用波長488nm激光激發(fā)，掃描獲得成熟胚囊和胚胎發(fā)育過程的各個時期的清晰圖片。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用核特異熒光染色和子房整體透明技術觀察水稻胚囊的方法，其方法是用核熒光染色和子房整體透明技術對水稻各個發(fā)育時期的胚囊和受精后各個時期的胚胎發(fā)育過程進行觀察；本發(fā)明是在染色前，先用一定濃度的氫氧化鈉溶液對水稻子房進行軟化處理，然后利用細胞核熒光染料DAPI與細胞核的特異結合來觀察胚囊內各細胞及細胞核的結構，在激光掃描共聚焦顯微鏡下胚囊內各細胞的細胞核以及核仁發(fā)出明亮熒光，細胞輪廓比較清晰，層次感強，能清晰觀察到細胞的內部構造。不論是對開花前較小的胚囊材料還是開花后較大的胚囊材料都取得了較好的觀察效果。
文檔編號G01N1/30GK1916609SQ20061010704
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月13日 優(yōu)先權日2006年9月13日
發(fā)明者代西梅, 黃群策, 秦廣雍, 李國平 申請人:代西梅