專利名稱：阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
阿侖膦酸鈉(Alendronate Sodium)屬于第三代二膦酸鹽類骨吸收抑制劑，具有良好的防治骨質(zhì)疏松作用，不良反應(yīng)少，作用持久，易于推廣應(yīng)用等突出優(yōu)點(diǎn)。
鑒于阿侖膦酸鈉具有上述諸多突出優(yōu)點(diǎn)，所以臨床開發(fā)成為熱門，評(píng)價(jià)阿侖膦酸鈉不同制劑的生物等效性對(duì)于阿侖膦酸鈉的新藥開發(fā)和新藥評(píng)價(jià)非常重要。目前，在生物等效性研究領(lǐng)域中，普遍采用體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)方法評(píng)價(jià)，測(cè)定血藥濃度再進(jìn)行雙處理、兩周期隨機(jī)交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，即以藥時(shí)曲線下面積(auc)、峰濃度(cmax)和達(dá)峰時(shí)間(tmax)為參數(shù)，通過多因素方差分析、雙單側(cè)t-檢驗(yàn)和計(jì)算90％可信區(qū)間來評(píng)價(jià)藥物的生物等效性。但由于口服阿侖膦酸鈉后血漿濃度極低，不適合進(jìn)行體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)，上述方法在評(píng)價(jià)阿侖膦酸鈉不同制劑的生物等效性時(shí)無法應(yīng)用。目前阿侖膦酸鈉的各種劑型的開發(fā)和療效評(píng)價(jià)處于一種無規(guī)則狀態(tài)，或者完全按新藥做全面的臨床，無謂增加了研發(fā)時(shí)間和成本的投入；或者就干脆全免，不對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，這樣給患者用藥帶來了隱患，上述情況成為目前阿侖膦酸鈉各種新劑型、規(guī)格在開發(fā)和評(píng)價(jià)中存在的制約因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷提供一種評(píng)價(jià)阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案本發(fā)明的阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法主要包括以下步驟(1)采集尿樣；(2)尿樣預(yù)處理；(3)尿樣衍生化；(4)尿樣測(cè)定。
上述采集尿樣的步驟是對(duì)服用定量受試制劑與或參比制劑的受試者，按如下時(shí)間間隔進(jìn)行取樣的服藥前的1.5-1小時(shí)、服藥后的0-0.25、0.25-1、1-2、2-3、3-4、4-6、6-8、8-12、12-24、24-36小時(shí)；其中每次取尿樣量為1-10ml。
上述采集尿樣的步驟是按如下方法進(jìn)行取樣的在服藥前的1.5-1小時(shí)，取尿樣10ml為空白；在服藥后的0.25小時(shí)，取尿樣10ml；在服藥后的1小時(shí)，補(bǔ)水150ml，取尿樣10ml；在服藥后的2小時(shí)，補(bǔ)水150ml，取尿樣10ml；在服藥后的3小時(shí)，補(bǔ)水150ml，取尿樣10ml；在服藥后的4小時(shí)，補(bǔ)水150mL，低脂、低鈣標(biāo)準(zhǔn)餐，取尿樣10ml；在服藥后的6小時(shí)，取尿樣10ml；在服藥后的8小時(shí)，取尿樣10ml；在服藥后的12小時(shí)，取尿樣10ml；在服藥后的24小時(shí)，取尿樣10ml；在服藥后的36小時(shí)，取尿樣10ml。
上述采集尿樣的步驟中，受試者禁食過夜，服用定量受試制劑或參比制劑，300mL溫水送服，保持站立30分鐘，且服藥后15分鐘禁尿上述尿樣預(yù)處理的步驟按下述步驟操作①向尿樣中加入緩沖液強(qiáng)力振搖；②再加入CaCl2溶液強(qiáng)力振搖；③再加入NaOH試液強(qiáng)力振搖，置于離心機(jī)上離心分離，得到沉淀物；④向步驟③得到的沉淀物中加入醋酸試液，振蕩；⑤再加入水，振搖；⑥再加入NaOH溶液，振搖，置于離心機(jī)上離心分離，得到沉淀物；⑦向步驟⑥得到的沉淀物中加入醋酸試液，振蕩；⑧再加入鈣離子鰲合劑，振蕩；⑨再加入檸檬酸鹽，振蕩，得到尿樣預(yù)處理的終溶液；上述步驟①中的緩沖液為KH2PO4緩沖液或NaH2PO4緩沖液；上述步驟⑧中的鈣離子鰲合劑為EGTA檸檬酸鈉或EDTA檸檬酸鈉。
上述的尿樣預(yù)處理步驟的步驟①中所加入的緩沖液為KH2PO4，所加入緩沖液的濃度為0.1M、體積為200μL；尿樣預(yù)處理步驟的步驟②中所加入的CaCl2溶液的濃度為0.1M、體積為200μL；尿樣預(yù)處理步驟的步驟③中所加入的NaOH試液的濃度為1M、體積為400μL，置于離心機(jī)上分離時(shí)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)，離心時(shí)間為10分鐘，有乳白色沉淀產(chǎn)生，分離時(shí)將離心管輕輕傾斜，以防止因振蕩而使離心沉淀物的損失、擦去離心管口余液；尿樣預(yù)處理步驟的步驟④中所加入的醋酸試液的濃度為2M、體積為400μL，加液時(shí)用力將沉淀沖起使之易于溶解，然后在渦旋振蕩器上振蕩一分鐘；尿樣預(yù)處理步驟的步驟⑤中所加入的水為10mL；尿樣預(yù)處理步驟的步驟⑥中所加入的NaOH溶液的濃度為1M、體積為2mL，離心時(shí)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)，離心時(shí)間為10分鐘，有乳白色沉淀產(chǎn)生，分離時(shí)將離心管輕輕傾斜，以防止因振蕩而使離心沉淀物的損失、擦去離心管口余液；尿樣預(yù)處理步驟的步驟⑦中所加入的醋酸試液的濃度為2M、體積為400μL，振蕩器為渦旋振蕩器，振蕩時(shí)間為一分鐘；尿樣預(yù)處理步驟的步驟⑧中所加入的EDTA檸檬酸鈉的濃度為0.2M、體積為600μL，振蕩方式為渦旋振蕩；尿樣預(yù)處理步驟的步驟⑨中所加入的檸檬酸鈉的濃度為2M、體積為100μL，振蕩方式為渦旋振蕩。
上述尿樣衍生化步驟要隨時(shí)測(cè)定隨時(shí)衍生化，尿樣衍生化步驟是按如下步驟操作①向尿樣預(yù)處理的終溶液中加入碳酸鈉溶液，調(diào)節(jié)PH值9-10，振蕩；②再加衍生化試劑，渦旋振蕩后于黑暗處放置10-60分鐘；③再加入檸檬酸試劑，渦旋振蕩，在酸環(huán)境下終止反應(yīng)；④再加入二氯甲烷，振搖，置于離心機(jī)上離心，去除衍生化試劑，分層而得到上清液；上述步驟②中所加入的衍生化試劑為FMOC-Cl或FMOC-NH2。
上述尿樣衍生化步驟中的步驟①中所取的尿樣預(yù)處理終溶液為500ul，所加入的碳酸鈉溶液的濃度為2M，振蕩方式為渦旋振蕩，振蕩時(shí)間為兩分鐘；尿樣衍生化步驟中的步驟②中所加入的衍生化試劑的濃度為100mg/mL、體積為20μL，渦旋振蕩后的放置時(shí)間為30分鐘；尿樣衍生化步驟中的步驟⑧中所加入的檸檬酸試劑的濃度為2M、體積為50μL，渦旋振蕩的時(shí)間為1分鐘，酸環(huán)境由調(diào)節(jié)pH值得到；尿樣衍生化步驟中的步驟④中所加入的二氯甲烷為5mL，離心時(shí)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為每分鐘2000轉(zhuǎn)，離心時(shí)間為5分鐘(5)取上清液100μL進(jìn)樣，進(jìn)行檢測(cè)。
上述尿樣測(cè)定步驟的測(cè)定條件是色譜條件Waters公司515泵，Shimazu型熒光檢測(cè)器；色譜柱Kromasil C18 4.6×150cm 5μM反向柱；流動(dòng)相(緩沖液25mM檸檬酸+25mM焦磷酸鈉)∶乙腈∶甲醇＝16∶5∶3；柱溫40℃；流速1.0mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)260nm；發(fā)射波長(zhǎng)310nm。
由于口服阿侖膦酸鈉制劑后血藥濃度極低，不適合進(jìn)行體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)。本發(fā)明提供一種阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，該方法以服藥36小時(shí)內(nèi)阿侖膦酸鈉經(jīng)尿排泄量作為合理的研究參數(shù)，可以彌補(bǔ)阿侖膦酸鈉血藥濃度低不適于做生物等效性評(píng)價(jià)的缺陷。分別給受試者服用受試制劑和參比制劑后，以本發(fā)明提供的一種阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法測(cè)得尿樣的Ae0-36和Rmax作為基礎(chǔ)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，計(jì)算Ae0-36和Rmax的個(gè)體內(nèi)比率(受試制劑/參比制劑)90％的置信區(qū)間，再將此區(qū)間與相應(yīng)的生物等效性研究可接受范圍(80％-125％)相比，判斷是否具有生物等效性。
對(duì)本發(fā)明所述的一種阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法進(jìn)行了如下評(píng)價(jià)(1)對(duì)照溶液線性(溶液+Alendronate對(duì)照品溶液)

1、加入30000ng/mL(30μg/mL)alendronate stock體積μL2、加入0.2M檸檬酸鈉體積μL3、衍生化之前濃度ng/mL4、衍生階段稀釋倍數(shù)5、alendronatse終濃度ng/mL(2)尿樣線性(尿樣+Alendronate對(duì)照品溶液)

1、加入Alendronate stock solution in 0.2M檸檬酸鈉體積μL2、Alendronate尿藥濃度ng/mL3、加入0.2M檸檬酸鈉體積μL4、最終用2M HAc溶解體積μL5、加入0.2M EDTA-檸檬酸鈉體積μL6、加入2M檸檬酸鈉體積μL7、大約的終體積μL乙酸溶后體積約為650μL8、衍生化階段加入溶液總體積μL；9、終濃度ng/mL(大約)；500mL到760mL；(2025mL，上樣溶液較尿液濃縮倍數(shù)4.9876)加入Na2CO3后，測(cè)pH值，9到10之間。
將上述對(duì)照溶液、尿樣進(jìn)行濃度測(cè)定，進(jìn)而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1為對(duì)照溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系為y＝9.609644x-84.507904，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999699；圖2為尿樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系為y＝48.405341x+169.114480，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999408。
通過對(duì)比可以得出以下結(jié)論本發(fā)明所述一種阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法其中阿侖膦酸鈉尿樣濃度的測(cè)定方法線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好而且靈敏、專一、可靠，能夠進(jìn)一步進(jìn)行阿侖膦酸鈉不同制劑生物等效性的評(píng)價(jià)。


圖1為對(duì)照溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2為尿樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施方式
選取受試者1對(duì)分成A、B兩組，禁食過夜，受試者A組服用“固邦”(受試制劑，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)生產(chǎn)，規(guī)格10mg/片)10mg×4片；受試者B組服用“福善美”(參比制劑，默沙東公司生產(chǎn)，規(guī)格10mg/片)10mg×4片；分別以300mL溫水送服，保持站立30分鐘，直至服藥后15分鐘禁尿，服藥36小時(shí)內(nèi)按以下步驟操作取尿樣

各時(shí)間段所取尿樣做如下處理
(1)尿樣預(yù)處理

(2)隨測(cè)隨衍生化

在色譜條件Waters公司515泵，Shimazu型熒光檢測(cè)器；色譜柱Kromasil C184.6×150cm 5μM反向柱；流動(dòng)相緩沖液(25mM檸檬酸+25mM焦磷酸鈉)∶乙腈∶甲醇＝16∶5∶3；柱溫40℃；流速1.0mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)260nm；發(fā)射波長(zhǎng)310nm條件下進(jìn)行檢測(cè)，并選取A、B組具有代表性數(shù)據(jù)各一組如下一、A組受試制劑結(jié)果

二、B組參比制劑結(jié)果

通過對(duì)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，受試制劑和參比制劑平均Ae0-36分別為96.23±60.81μg和102.88±57.52μg；平均Rmax分別為35.36±22.88μg/h和36.15±21.07μg/h；而Tmax分別為0.583±0.858h和0.529±0.856h。兩種藥物制劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)未發(fā)現(xiàn)顯著差異?；A(chǔ)參數(shù)Ae0-36和Rmax的個(gè)體內(nèi)比率的90％置信區(qū)間分別為0.96-1.11和1.01-1.17，在生物等效性試驗(yàn)可接受范圍內(nèi)。因此可以得出結(jié)論受試制劑與參比制劑具有生物等效性。
權(quán)利要求
1.一種阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，其特征在于主要包括以下步驟(1)采集尿樣；(2)尿樣預(yù)處理；(3)尿樣衍生化；(4)尿樣測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，其特征在于采集尿樣的步驟是對(duì)服用定量受試制劑或參比制劑的受試者，按如下時(shí)間間隔進(jìn)行取樣的服藥前的1.5-1小時(shí)、服藥后的0-0.25、0.25-1、1-2、2-3、3-4、4-6、6-8、8-12、12-24、24-36小時(shí)；其中每次取尿樣量為1-10ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，其特征在于采集尿樣的步驟是按如下方法進(jìn)行取樣的在服藥前的1.5-1小時(shí)，取尿樣10ml為空白；在服藥后的0.25小時(shí)，取尿樣10ml；在服藥后的1小時(shí)，補(bǔ)水150ml，取尿樣10ml；在服藥后的2小時(shí)，補(bǔ)水150ml，取尿樣10ml；在服藥后的3小時(shí)，補(bǔ)水150ml，取尿樣10ml；在服藥后的4小時(shí)，補(bǔ)水150mL，低脂、低鈣標(biāo)準(zhǔn)餐，取尿樣10ml；在服藥后的6小時(shí)，取尿樣10ml；在服藥后的8小時(shí)，取尿樣10ml；在服藥后的12小時(shí)，取尿樣10ml；在服藥后的24小時(shí)，取尿樣10ml；在服藥后的36小時(shí)，取尿樣10ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，其特征在于采集尿樣的步驟中，受試者禁食過夜，服用定量受試制劑或參比制劑，300mL溫水送服，保持站立30分鐘，且服藥后15分鐘禁尿。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，其特征在于尿樣預(yù)處理的步驟按下述步驟操作①向尿樣中加入緩沖液強(qiáng)力振搖；②再加入CaCl2溶液強(qiáng)力振搖；③再加入NaOH試液強(qiáng)力振搖，置于離心機(jī)上離心分離，得到沉淀物；④向步驟③得到的沉淀物中加入醋酸試液，振蕩；⑤再加入水，振搖；⑥再加入NaOH溶液，振搖，置于離心機(jī)上離心分離，得到沉淀物；⑦向步驟⑥得到的沉淀物中加入醋酸試液，振蕩；⑧再加入鈣離子鰲合劑，振蕩；⑨再加入檸檬酸鹽，振蕩，得到尿樣預(yù)處理的終溶液；上述步驟①中的緩沖液為KH2PO4緩沖液或NaH2PO4緩沖液；上述步驟⑧中的鈣離子鰲合劑為EGTA檸檬酸鈉或EDTA檸檬酸鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，其特征在于所述的尿樣預(yù)處理步驟的步驟①中所加入的緩沖液為KH2PO4，所加入緩沖液的濃度為0.1M、體積為200μL；尿樣預(yù)處理步驟的步驟②中所加入的CaCl2溶液的濃度為0.1M、體積為200μL；尿樣預(yù)處理步驟的步驟③中所加入的NaOH試液的濃度為1M、體積為400μL，置于離心機(jī)上分離時(shí)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)，離心時(shí)間為10分鐘，有乳白色沉淀產(chǎn)生，分離時(shí)將離心管輕輕傾斜，以防止因振蕩而使離心沉淀物的損失、擦去離心管口余液；尿樣預(yù)處理步驟的步驟④中所加入的醋酸試液的濃度為2M、體積為400μL，加液時(shí)用力將沉淀沖起使之易于溶解，然后在渦旋振蕩器上振蕩一分鐘；尿樣預(yù)處理步驟的步驟⑤中所加入的水為10mL；尿樣預(yù)處理步驟的步驟⑥中所加入的NaOH溶液的濃度為1M、體積為2mL，離心時(shí)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)，離心時(shí)間為10分鐘，有乳白色沉淀產(chǎn)生，分離時(shí)將離心管輕輕傾斜，以防止因振蕩而使離心沉淀物的損失、擦去離心管口余液；尿樣預(yù)處理步驟的步驟⑦中所加入的醋酸試液的濃度為2M、體積為400μL，振蕩器為渦旋振蕩器，振蕩時(shí)間為一分鐘；尿樣預(yù)處理步驟的步驟⑧中所加入的EDTA檸檬酸鈉的濃度為0.2M、體積為600μL，振蕩方式為渦旋振蕩；尿樣預(yù)處理步驟的步驟⑨中所加入的檸檬酸鈉的濃度為2M、體積為100μL，振蕩方式為渦旋振蕩。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，其特征在于尿樣衍生化步驟要隨時(shí)測(cè)定隨時(shí)衍生化，尿樣衍生化步驟是按如下步驟操作①向尿樣預(yù)處理的終溶液中加入碳酸鈉溶液，調(diào)節(jié)PH值9-10，振蕩；②再加衍生化試劑，渦旋振蕩后于黑暗處放置10-60分鐘；③再加入檸檬酸試劑，渦旋振蕩，在酸環(huán)境下終止反應(yīng)；④再加入二氯甲烷，振搖，置于離心機(jī)上離心，去除衍生化試劑，分層而得到上清液；上述步驟②中所加入的衍生化試劑為FMOC-Cl或FMOC-NH2。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，其特征在于所述的尿樣衍生化步驟中的步驟①中所取的尿樣預(yù)處理終溶液為500ul，所加入的碳酸鈉溶液的濃度為2M，振蕩方式為渦旋振蕩，振蕩時(shí)間為兩分鐘；尿樣衍生化步驟中的步驟②中所加入的衍生化試劑的濃度為100mg/mL、體積為20μL，渦旋振蕩后的放置時(shí)間為30分鐘；尿樣衍生化步驟中的步驟③中所加入的檸檬酸試劑的濃度為2M、體積為50μL，渦旋振蕩的時(shí)間為1分鐘，酸環(huán)境由調(diào)節(jié)pH值得到；尿樣衍生化步驟中的步驟④中所加入的二氯甲烷為5mL，離心時(shí)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為每分鐘2000轉(zhuǎn)，離心時(shí)間為5分鐘(5)取上清液100μL進(jìn)樣，進(jìn)行檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，其特征在于尿樣測(cè)定步驟的測(cè)定條件是色譜條件Waters公司515泵，Shimazu型熒光檢測(cè)器；色譜柱Kromasil C18 4.6×150cm 5μM反向柱；流動(dòng)相(緩沖液25mM檸檬酸+25mM焦磷酸鈉)∶乙腈∶甲醇＝16∶5∶3；柱溫40℃；流速1.0mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)260nm；發(fā)射波長(zhǎng)310nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，其特征在于尿樣測(cè)定步驟的測(cè)定條件是色譜條件Waters公司515泵，Shimazu型熒光檢測(cè)器；色譜柱Kromasil C18 4.6×150cm 5μM反向柱；流動(dòng)相(緩沖液25mM檸檬酸+25mM焦磷酸鈉)∶乙腈∶甲醇＝16∶5∶3；柱 溫40℃；流速1.0mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)260nm；發(fā)射波長(zhǎng)310nm。
全文摘要
本發(fā)明提供一種評(píng)價(jià)阿侖膦酸鈉生物等效性的檢測(cè)方法，是以服用受試制劑與參比制劑后的尿樣為檢測(cè)對(duì)象，該方法主要包括以下步驟(1)采集定量尿樣；(2)尿樣預(yù)處理；(3)尿樣衍生化；(4)尿樣測(cè)定。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好而且靈敏、專一、可靠，能夠進(jìn)一步進(jìn)行阿侖膦酸鈉不同制劑生物等效性的評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1908659SQ20061010968
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2006年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月17日
發(fā)明者郭衛(wèi)芹, 張 育, 李國(guó)聰, 周杰, 高志峰 申請(qǐng)人:石家莊歐意藥業(yè)有限公司