專利名稱：使用溶膠-凝膠基體的農(nóng)藥殘留物快速活體鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包埋乙醯膽堿胸(Ache)的方法，步驟包括在水中從一 氧化硅溶液中形成硅溶膠，調(diào)節(jié)所述乙醯膽堿胸(Ache)的酸堿度至低于7 度以穩(wěn)定所述硅溶膠，從而形成一種含有乙醯膽堿鷹(Ache)的硅溶膠基體。 本發(fā)明提供一種生物吸收介體的技術(shù)，其中的酵若儲存在一個溫度4aC、 用完即棄、以異丁烯酸制成的比色杯內(nèi)，可長期保持穩(wěn)定性及活性。該技 術(shù)提供一種在異丁烯酸的用完即棄比色杯中制備一用完即棄形的酵鑒定。 所述包埋的酵證實可以與常用于蔬菜類對抗害蟲的農(nóng)藥如有機磷酸鹽、氨 基甲酸鹽類等作出反應。此溶膠一凝膠中的相互作用的作用方式為抑制活 動；底物(ACTI)及硝基苯甲斷DTNB)與所述酵的顯色反應結(jié)果呈黃色，該 顏色證明為在溶膠基體中形成，即在溶膠腔內(nèi)形成，若輕微搖動含溶膠一 凝膠的比色杯，所述顏色便釋放到顏色肉眼可見的自由溶液，但若要準確 量度抑制活動，則需要用量熱分光測光儀量度形成顏色的吸光度，測試的 計算基礎為與一對照溶液，即一不含農(nóng)藥的溶液，作顏色轉(zhuǎn)變百分差的比 較。抑制百分率的限界值被設至最低，以決定樣本中農(nóng)藥成分的可接受程 度。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種用于包埋乙醯膽堿嗨(Ache)的溶膠一凝膠方法，用于 生物鑒定研究。改善生物鑒定效能的新物質(zhì)近年不斷發(fā)展，在這方面最具 挑戰(zhàn)性的發(fā)展之一是生物載體基體固定和集合生物分子于主基體內(nèi)，以及 保留所述生物分子的功能性。近年來，各種技術(shù)不斷發(fā)展，如聚合物和無 機基體的吸附、共價連接、封鎖及包埋，以取得可再生及發(fā)達的固定技術(shù) 來保存活體分子的活動。由溶膠一凝膠法制成的硅主基體已出現(xiàn)并成為一個可靠的平臺，來包 埋生物分子如酵、抗體及細胞。硅主基體的包埋為酵提供一個較穩(wěn)定的環(huán) 境，因為聚合物架構(gòu)在生物分子附近生長，形成一個隔離罩，從而防止酵 的聚集和伸展。這些溶膠一凝膠基體屬化學惰性、熱穩(wěn)定的、吸水及透明 的，容許分光監(jiān)察封鎖的樣本。溶膠一凝膠基體細孔里的微包埋不會降低
生物分子的仿射性及活動，因為酵并不是真的附在基體上。本發(fā)明的目的 是發(fā)展一種包埋溶膠一凝膠的家蠅乙醯膽堿胸，作為一種生物感應物質(zhì)， 可用于探測蔬菜里的農(nóng)藥殘留物的活體鑒定。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的在于提供一種制造有細孔、透明、含有一包埋生物 物質(zhì)的溶膠一凝膠基體的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用作定量或定性探測一種測試物質(zhì)的 方法，所述測試物質(zhì)與一活性生物物質(zhì)反應，或其反應由一活性生物物質(zhì) 催化，其特征在于所述生物物質(zhì)包埋于一溶膠一凝膠基體內(nèi)，并所述溶 膠 一 凝膠基體由非酒精方法制備。本發(fā)明的再一目的在于提供一種儲存一生物物質(zhì)于一個有細孔的透明 溶膠一凝膠基體內(nèi)的方法，其特征在于即使暴露于不利環(huán)境，所述物質(zhì) 的生物活性保持于約80%至少6個月。為達致本發(fā)明的上述及其它目的，本發(fā)明提供-一種制造有細孔、透明、含有一包埋生物物質(zhì)的溶膠一凝膠基體的方 法，包括以下步驟(i) 在一含有水和一酸性催化劑的非酒精介體中混合一金屬垸氧化合 物，并攪拌混合物直至取得清液，以形成一單相溶膠；(ii) 加入一緩沖劑來提升步驟(i)所取得的混合物的酸堿度至5至7度；(iii) 加入一生物物質(zhì)至步驟(ii)所得的緩沖溶膠中；(iv) 形成一溶膠一凝膠，并容許所述溶膠一凝膠時效成形；(v) 容許所述溶膠一凝膠中一部分水蒸發(fā)，令步驟(iv)的形成物的體積減少，并所述生物物質(zhì)包埋在所述體積減少的溶膠一凝膠單塊內(nèi)。 一種用作定量或定性探測一種測試物質(zhì)的方法，所述測試物質(zhì)與一活性生物物質(zhì)反應，或其反應由一活性生物物質(zhì)催化，其特征在于所述生 物物質(zhì)包埋于一溶膠一凝膠基體內(nèi)，并所述溶膠一凝膠基體由非酒精方法 制備。所述定量或定性探測方法包括以下步驟(i) 制備所述溶膠一凝膠基體，其包括包埋于一有細孔、透明并由非 酒精溶膠一凝膠方法制備的基體的所述活性生物物質(zhì)；(ii) 令含溶膠一凝膠基體的所述生物物質(zhì)與含有所測試物質(zhì)的一氣體 或水溶液接觸；
(iii)定量或定性探測、觀察或量度包埋于所述溶膠一凝膠基體的所述 生物物質(zhì)的一個或多于一個特征的轉(zhuǎn)變。一種儲存一生物物質(zhì)于一個有細孔的透明溶膠一凝膠基體內(nèi)的方法， 其特征在于即使暴露于不利環(huán)境，所述物質(zhì)的生物活性保持于約80%至少6個月，包括以下步驟(i) 在一含有水和一酸性催化劑的非酒精介體中混合一金屬烷氧化合物，并攪拌混合物直至取得清液，以形成一單相溶膠；(ii) 加入一緩沖劑來提升步驟(i)所取得的混合物的酸堿度至5至7度；(iii) 加入一生物物質(zhì)至步驟(ii)所得的緩沖溶膠中；(iV)形成一溶膠一凝膠，并容許所述溶膠一凝膠時效成形；(v) 容許所述溶膠一凝膠中一部分水蒸發(fā)，令步驟(iv)的形成物的體積減少，并所述生物物質(zhì)包埋在所述體積減少的溶膠一凝膠單塊內(nèi)；(vi) 儲存步驟(v)形成的凝膠及包埋于內(nèi)的所述生物物質(zhì)。
具體實施方式
本發(fā)明以上述的情況為前題。本發(fā)明的目的是提供一種快速生物鑒定 方法，以測試樣本如蔬菜水果里的農(nóng)藥殘留物。為達致上述目的，發(fā)明人 進行了深入的研究，并取得基于酵和農(nóng)藥處于不同緩沖濃度及酸堿度時的 相互作用的結(jié)果。實驗中深入研究了溶膠一凝膠和緩沖劑的混合比例，并 取得最佳的混合物，發(fā)展了一種以利用酵的溶膠一凝膠包埋法為基礎、用 以快速測試農(nóng)藥殘留物的新型生物感應物質(zhì)。本發(fā)明采用三種毒性不同的 有機磷酸鹽，即敵敵畏(第一類一高毒性及危險復合物)、殺蟲劑毒死蜱及 殺螟松(第二類一輕微毒性復合物)，以研究所述溶膠一凝膠固定過程的效用。酵抑制活動顯示所述生物感應物質(zhì)對這些有機磷酸鹽農(nóng)藥的反應為高度可再生。觀察所得，摻入酵的溶膠一凝膠單塊儲存于溫度4。C能保持穩(wěn) 定達3個月。此外，所述凝膠能大量生產(chǎn)，從而令其成本低達至可用完即棄的程度。不同分光測光儀測試所得的比較數(shù)據(jù)得出與摻有農(nóng)藥樣本的數(shù)據(jù)的趨勢相近。本發(fā)明物質(zhì)，即包埋乙醯膽堿腺(Ache)的溶膠一凝膠，可 用作一種快速測試有機磷酸鹽農(nóng)藥的生物試劑。本發(fā)明生物鑒定能使用這生物感應物質(zhì)為一生物辯認元素。所述包埋 過程在室溫下進行，并利用磷酸緩沖劑以減低酵的變性作用。本發(fā)明采用 三種毒性不同的有機磷酸鹽，即敵敵畏(第一類一高毒性及危險復合物)、 殺蟲劑毒死蜱及殺螟松(第二類—輕微毒性復合物)，得出動態(tài)量程分別界乎百萬分之0.1及1.0、百萬分之20及100，以及百萬分之100及1000的敵敵畏、殺蟲劑毒死蜱及殺螟松連的校準標繪。觀察所得，當半數(shù)所述有機磷酸鹽農(nóng)藥的最大抑制作用(15。)與不同濃度的底物碘化乙酰硫代膽堿(ATCI)反應時，便出現(xiàn)競爭性抑制。酵抑制活動顯示所述生物感應物質(zhì)對 這些有機磷酸鹽的反應為高度可再生。較低的酵淋溶率(20。/。)顯示微包埋 過程可把酵保持于所述溶膠一凝膠基體內(nèi)。摻入酵的溶膠一凝膠單塊儲存 于溫度4。C能保持穩(wěn)定達3個月。此外，所述凝膠能大量生產(chǎn)，從而令其 成本低以達至可用完即棄。再生數(shù)據(jù)由莧菜紅或中國莧菜(皺果莧)及空心 菜(蕹菜)中的敵敵畏采集所得，平均相對標準偏差為2.44%的摻有農(nóng)藥樣 本得出的再生的百分率為約80%，顯示本發(fā)明的生物感應物質(zhì)能被采用為 一種用作生物感應裝置的生物試劑。 溶膠—凝膠的制備溶膠一凝膠的制備根據(jù)Ellerby et al.[3]所描述的方法進行，為一包括 兩個步驟的方法。以Kumar[4]的方法為基礎，但改變初始物，在一個管形 玻璃瓶內(nèi)混合4.5毫升的硅酸甲酯(TMOS)、 1.4毫升的水和0.1毫升，以制備經(jīng)酸催化的硅膠，然后攪拌混合物至取得清液，再密封所述管形瓶并 發(fā)酵24小時，以取得一種合適的硅發(fā)酵凝膠。 化學品及試劑來自家蠅(HFAChE)的乙醯膽堿胸(Ache) (1.25Umg—"由臺灣農(nóng)業(yè)研究 中心(Taiwan Agricultural Research lnstitute)購得。碘化乙酰硫代膽堿 (ATCI)和5，5'二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5' -dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) 畫DTNB)由Sigma Chemical Co.購得。有機磷酸鹽農(nóng)藥，即敵敵畏(99%) 和殺蟲劑毒死蜱(99。/。)由德國的Riedel de Haen (Seelze)購得。標準濃度 為100kigml"的物質(zhì)在甲醇里制備，并儲存于4。C。硅酸甲酯(TMOS)自 東京Kasei， TCI (等級99%)購入。甲醇、鹽酸及其它化學品自Merck購 入。另需制備一種酸堿度為8和0.1M的磷酸緩沖劑。所述用完即棄的異 丁烯酸比色杯由Dispolab-Kartell購入，需1.5毫升。在溶膠一凝膠基體中保存酵把一個含有70|jl的緩沖劑、20|jl家蠅(HFAChE)(0.5 U m。和30pl溶膠的混合物放入一個用完即棄的比色杯內(nèi)，溶膠一 凝膠數(shù)秒內(nèi)便固化。
所述酵完全包埋于所述滋長中的網(wǎng)絡內(nèi)。所述比色杯用交叉膠片密封，以防止時效成形期間凝膠快速蒸發(fā)引致破裂。整個膠化作用需時約15分鐘， 然后把所述溶膠存于4°C等待時效成形。 淋溶測試兩個不同的比色杯被分別用作加入20 pl家蠅(HFAChE)及20 ijI溶肢。 第三個比色杯用作加入30 |J|溶膠、70 yl緩沖劑及20 pl乙醯膽堿騰 (Ache)，量度在一分鐘后進行，以讓所述物質(zhì)進行固定。每個比色杯加入 1毫升緩沖劑，然后用分光測光儀于280nm波長量度蛋白質(zhì)的光密度。再生測試蔬菜(莧菜)樣本切成細塊， 一個子樣本(50克)量重后放入混合瓶，其 與50 |jl的百萬分之一的敵敵畏均勻混合1小時，培育后，加入分量為50 毫升的甲醇，混合物再混合5分鐘，然后利用濾紙過濾抽取物以取得過濾 液。至于對照實驗，除均勻混合敵敵畏的步驟外，步驟如上所述。分析酵 抑制活動的步驟與Salmahetal. [5]的研究中所述相似。 一分量為50 pl的 過濾液在一個含有己摻入乙醯膽堿腌(Ache)溶膠一凝膠的比色杯內(nèi)培育 10分鐘。加入底物5分鐘后，即以分光方法量度吸光度。摻入酵的溶膠—凝膠單塊的特征由硅酸甲酯(TMOS)衍生的溶膠一凝膠單塊為光透明及有細孔，因而適 合乙醯膽堿嗨(Ache)的包埋。本發(fā)明使用先前的結(jié)果顯示的最佳作業(yè)環(huán)境， 例如緩沖劑及酵與溶膠的比例為3:1、酵的分量為0.5U，以及作業(yè)底物濃 度為5.0x10'SM，來達至所述生物感應物質(zhì)的特征[6。淋溶測試于所述 特征研究之先已成功施行，其所述摻入酵的溶膠—凝膠單塊的淋溶率見表 1.0。蛋白的光密度(280nm)顯示80。/。的所述包埋乙醯膽堿鷹(Ache)在1 分鐘的膠化作用時間里保留在所述溶膠一凝膠基體中。根據(jù)Bhatia and Brinker [1]，摻入酵的硅基體的細孔應為細小得可以防止包埋的大分子淋 溶，但大得足以讓緩沖離子、底物分子及分析物無限制的運行。樣本 平均光密度(280nm) 淋溶率％自由酵乙醯膽堿胸(Ache) 0.515 0%
溶膠溶液 0.015 0%摻入乙醯膽堿嗨(Ache)溶膠 10.102 19.8一凝膠單塊表1.0參考資料1) Bhatia， R.B.， Brinker， C丄，Gupta A.K. & Singh， A.K. (2000). Aqueous sol-gel process for protein encapsulation. Chem-Mater. 12(8): 2434-24".2) Diaz， A.N. & Peinado， M.C.R. (1997). Sol-gel cholinesterase biosensor for organophosphorus pesticide fluorimetric analysis-Sensors and Actuators B. 38-39: 426-431.3) Ellerby, LM., Nishida, C.R.' Yamanaka, SA， Dunn， B.， Valentine, 丄S. & Zink，丄l. (1992). Encapsultion of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255:11134-1118.4) Kumar, A.， Malhotra, R.， Malhotra, B.D. & Grover, S.K. (2000). Co-immobilization of cholesterol oxidase and horseradish peroxidase in a sol-gel film. Anal. Chim Acta. 414: 43-50.5) Salmah A.A,， Musa A., Othman., Abu Bakar S. and Zamri I. (2002). Kestabilan Bio-Molekul Terpegun Di dalam Sol-Gel Bagi Menghasilkan Penderia optik Kolinesteres Untuk Penyaringan Awal Racun Makhluk Perosak 5th. Proc. Joint Chemistry Seminar UKM-ITB.6) Salmah AA， Musa A., Othman O.， Abu Bakar S. and Zamri I. (2002). Spectrophotometric Determination of Organophosphorus pesticides using Sol-Gel Encapsulated Housefly Acetylcholinestesrase. Paper submitted to丄Non-Cryst. Solids. 7) Ellman G丄,，Courtney D.K., Anders V. and Featherstone R. M.， (1961). A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 8: 88.8) Ware G. W. (1978) Pesticides: theory and application. San Francisco: Freeman & Company.上述實施例為本發(fā)明的優(yōu)選方式，為闡明本發(fā)明特別披露了本發(fā)明的 一些例子，但本發(fā)明的實施方式并不為上述實施例所限定，其它的任何未 背離本發(fā)明的精神下所作的實質(zhì)或原理上的改變、修飾、替代、組合、簡 化，均應為等效的置換或替換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制造一有細孔、透明、含有一包埋生物物質(zhì)的溶膠-凝膠基體的方法，包括以下步驟(i)在一含有水和一酸性催化劑的非酒精介體中混合一金屬烷氧化合物，并攪拌混合物直至取得清液，以形成一單相溶膠；(ii)加入一緩沖劑來提升步驟(i)所取得的混合物的酸堿度至5至7度；(iii)加入一生物物質(zhì)至步驟(ii)所得的緩沖溶膠中；(iv)形成一溶膠-凝膠，并容許所述溶膠-凝膠時效成形；(v)容許所述溶膠-凝膠中一部分水蒸發(fā)，令步驟(iv)的形成物的體積減少，并所述生物物質(zhì)包埋在所述體積減少的溶膠-凝膠單塊內(nèi)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述金屬烷氧化合物為硅酸甲酯(TMOS)、正硅酸乙酯(TEOS)，或任何其它合適材料。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述酸性催化劑為鹽 酸(HCI)或任何其它合適催化劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述緩沖劑及酵與所述溶膠一凝膠的比例最佳為3:1 。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述溶膠粒子的大小以所述溶膠一凝膠被弄干時可產(chǎn)生的細孔的大小為基礎，即等同所述包埋 生物物質(zhì)的生物物質(zhì)的粒子的大小。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述生物物質(zhì)是在包含核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、活性蛋白、脫氧核糖核酸(DNA)、 核糖核酸(RNA)或蛋白的活性碎片，以及細胞或組織的組別中挑選的。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述生物物質(zhì)為任何 活性蛋白或其活性碎片。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述蛋白或其活性碎 片為一種從乙醯膽堿嗨或任何酵或活性復合物組別中挑選的酵或活性復 合物。
9. 一種用作定量或定性探測一種測試物質(zhì)的方法，所述測試物質(zhì)與一活性生物物質(zhì)反應，或其反應由一活性生物物質(zhì)催化，其特征在于所述生物物質(zhì)包埋于一溶膠一凝膠基體內(nèi)，并所述溶膠一凝膠基體由非酒精 方法制備，所述定量或定性探測方法包括以下步驟-(i) 制備所述溶膠一凝膠基體，其包括包埋于一有細孔、透明并由非酒精溶膠一凝膠方法制備的基體的所述活性生物物質(zhì)；(ii) 令含溶膠一凝膠基體的所述生物物質(zhì)與含有所測試物質(zhì)的一氣體 或水溶液接觸；(iii) 定量或定性探測、觀察或量度包埋于所述溶膠一凝膠基體的所述 生物物質(zhì)的一個或多于一個特征的轉(zhuǎn)變。
10. 根據(jù)上述任一權(quán)利要求中所述一種定量或定性探測農(nóng)藥的方法。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述農(nóng)藥為一種從一 個包括敵敵畏、殺蟲劑毒死蜱及殺螟松組別中挑選的有機磷酸鹽或其它有 機磷酸鹽。
12. —種儲存一生物物質(zhì)于一個有細孔的透明溶膠一凝膠基體內(nèi)的方法，其特征在于即使暴露于不利環(huán)境，所述物質(zhì)的生物活性保持于約80% 至少6個月，包括以下步驟(i) 在一含有水和一酸性催化劑的非酒精介體中混合一金屬垸氧化合物，并攪拌混合物直至取得清液，以形成一單相溶膠；(ii) 加入一緩沖劑來提升步驟(i)所取得的混合物的酸堿度至5至7度；(iii) 加入一生物物質(zhì)至步驟(ii)所得的緩沖溶膠中；(iv) 形成一溶膠一凝膠，并容許所述溶膠一凝膠時效成形；(v) 容許所述溶膠一凝膠中一部分水蒸發(fā)，令步驟(iv)的形成物的體積 減少，并所述生物物質(zhì)包埋在所述體積減少的溶膠一凝膠單塊內(nèi)；(vi) 儲存步驟(v)形成的凝膠及包埋于內(nèi)的所述生物物質(zhì)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的儲存一生物物質(zhì)于一個有細孔的透明溶膠一凝膠基體內(nèi)的方法，其特征在于所述生物物質(zhì)為一活性蛋白或活性蛋白碎片，并所述金屬烷氧化合物包括硅酸甲酯(TMOS)、正硅酸乙酯 (TEOS)，或任何其它合適材料，并即使暴露于不利環(huán)境，所述蛋白或蛋白 碎片的生物活性保持于約80%至少6個月。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述儲存了至少6個月的活性生物物質(zhì)， 然而其特征在于所述物質(zhì)的生物活性保持約80%。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其特征在于所述生物物質(zhì)、 活性蛋白或活性蛋白碎片為乙醯膽堿嗨或任何其他酵或活性復合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速活體鑒定，用來測試一樣本中的農(nóng)藥殘留物，特別是一種以利用酵的溶膠—凝膠包埋法為基礎、用以測試農(nóng)藥殘留物的新型生物感應物質(zhì)；酵抑制活動顯示生物感應物質(zhì)對農(nóng)藥殘留物的反應為可再生的，并摻入酵的溶膠—凝膠單塊儲存于溫度4℃能保持穩(wěn)定，以及具經(jīng)濟效益。
文檔編號G01N21/77GK101131388SQ200610111319
公開日2008年2月27日 申請日期2006年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月21日
發(fā)明者幕沙·阿馬得, 曽里·依沙可, 舍麥·阿布敦·阿塞, 阿布·巴卡爾·沙雷 申請人:馬來西亞農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所;馬來西亞博特拉大學;馬來西亞國民大學