專利名稱：同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑的制備方法，尤其涉及一種同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備方法，還涉及這種試劑的使用方法。
背景技術(shù)：
獸藥、農(nóng)藥、食品添加劑、霉菌毒素等殘留嚴(yán)重威脅到人民的健康和生命安全，氯霉素、鹽酸克倫特羅、己烯雌酚、硝基呋喃類和孔雀石綠等是重點(diǎn)監(jiān)控對(duì)象。此外，違禁藥物、濫用藥物如嗎啡等的危害極其嚴(yán)重。對(duì)上述這些危害物進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)，是保護(hù)人類健康及生命安全、維護(hù)社會(huì)安定的關(guān)鍵之一。
上述危害物均屬小分子化合物，常規(guī)的檢測(cè)方法主要分為理化分析方法和免疫分析方法兩類。理化分析方法有氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)(CZE)、質(zhì)譜(MS)、串聯(lián)質(zhì)譜(MS-MS)以及各方法之間的聯(lián)用技術(shù)等，其中以色譜法及其聯(lián)用技術(shù)為常用。免疫分析方法包括放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、熒光免疫法(FIA)等，以酶聯(lián)免疫法(ELISA)常見(jiàn)。理化分析方法，尤其是聯(lián)用技術(shù)可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定性及定量分析，但操作步驟復(fù)雜，檢測(cè)周期冗長(zhǎng)，儀器價(jià)格昂貴，難于普及推廣，更不能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)，不利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和監(jiān)控管理。而免疫分析方法，尤其酶聯(lián)免疫法(ELISA)，是近幾年發(fā)展起來(lái)并應(yīng)用廣泛的快速篩查分析方法，具有快速、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度不夠高、信息量低、只能進(jìn)行單目標(biāo)檢測(cè)。
隨著對(duì)殘留指標(biāo)限量值的逐步降低，高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)更凸顯重要。在要求高靈敏度的同時(shí)，多靶標(biāo)同步分析技術(shù)也越來(lái)越顯得重要。
熒光染色的聚合物微球可以進(jìn)行光學(xué)編碼并作為診斷試劑而應(yīng)用于雙抗體夾心模式的免疫分析，最初使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，這種方法也屬于流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)的一種。將不同顏色(或亮度)的微球作為載體，通過(guò)物理吸附或共價(jià)結(jié)合方式使之與抗體(捕獲抗體)結(jié)合，用來(lái)特異性識(shí)別待測(cè)抗原，用熒光素標(biāo)記的針對(duì)同一待測(cè)抗原的抗體(檢測(cè)抗體)作為探針以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。用不同的微球?qū)Σ煌N捕獲抗體進(jìn)行光學(xué)編碼，將微球混合在同一體系中則可同時(shí)進(jìn)行多標(biāo)靶分析，特異性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)快速診斷。J.Dasso等人做了ELISA方法和編碼微球流式分析方法的比較，結(jié)果都表明編碼微球分析方法重復(fù)性更好、有更廣泛的動(dòng)力學(xué)測(cè)定范圍、敏感性更高，所需時(shí)間和樣品量更少([1]RAYMOND E.BIAGINI，DEBORAH L.SAMMONS，JEROME P.SMITH，et al.[J].Clinical and diagnosticlaboratory immunology，Jan.2004，P50-55；[2]JOSEPH DASSO，JULIET LEE，HANH BACH，etal.[J].Journal of Immunological Methods，2002，26323-33)。X.Yan等人使用兩種不同的類似的熒光編碼微球方法，實(shí)現(xiàn)了A型和B型流感病毒的同時(shí)檢測(cè)，重復(fù)性好、敏感性高、試劑耗量小、實(shí)驗(yàn)成本低([3]XIAOMEI YAN，ERIKA G.SCHIEKE，KAREN M.GRACE，et al.[J].Journal of Immunological Methods，2003，28427-38)。Richard T.Carson等人在100μL體系中定量檢測(cè)15種細(xì)胞因子，獲得了滿意效果，而100μL體系僅夠ELISA方法檢測(cè)一種細(xì)胞因子([4]RICHARD T.CAISON，DARIO A.A.VIGNALI.[J].Journal of ImmunologicalMethods，1999，22741-52)。20世紀(jì)90年代中期美國(guó)Luminex公司開(kāi)發(fā)出基于流式編碼微球檢測(cè)的小型專用儀器、控制軟件及配套試劑，形成了懸浮芯片技術(shù)(Suspension chip)或液相芯片(LiquiChip)技術(shù)，大大延伸了流式的檢測(cè)平臺(tái)。
然而，只具有抗原性但沒(méi)有免疫原性的小分子化合物，如農(nóng)藥、獸藥、食品添加劑、霉菌毒素、違禁藥物等，只具有一個(gè)可與抗體結(jié)合的位點(diǎn)，不能發(fā)生雙抗體夾心式的免疫反應(yīng)。因此上述編碼微球的流式細(xì)胞術(shù)、懸浮芯片技術(shù)或液相芯片技術(shù)，不能用于只具有抗原性但沒(méi)有免疫原性的小分子化合物的檢測(cè)。目前對(duì)屬小分子化合物，如農(nóng)藥、獸藥、食品添加劑、霉菌毒素、違禁藥物等危害物檢測(cè)時(shí)所采用的常見(jiàn)方法如，GC、HPLC、TLC、CZE、MS、MS-MS等，存在著儀器價(jià)格昂貴，操作步驟復(fù)雜，檢測(cè)周期冗長(zhǎng)，難于普及推廣，更不能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)，不利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和監(jiān)控管理的問(wèn)題。對(duì)小分子化合物的檢測(cè)如何實(shí)現(xiàn)重復(fù)性好、敏感性高、試劑耗量小、實(shí)驗(yàn)成本低、多靶標(biāo)同步分析、能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)、易于普及推，從而達(dá)到對(duì)危害物質(zhì)能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和監(jiān)控管理，是目前急需解決的技術(shù)問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備方法及其使用方法。采用本發(fā)明同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備方法制備的試劑，對(duì)小分子化合物的檢測(cè)重復(fù)性好、敏感性高、試劑耗量小、實(shí)驗(yàn)成本低、可多靶標(biāo)同步分析；能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)、易于普及推廣；從而達(dá)到對(duì)屬小分子化合物危害物質(zhì)能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和監(jiān)控管理，克服了目前對(duì)小分子化合物檢測(cè)存在的問(wèn)題。
同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑包括編碼微球試劑和小分子化合物抗體探針，其中小分子化合物抗體探針為熒光量子點(diǎn)(量子點(diǎn)是一種熒光納米顆粒，隨粒徑大小的不同可具備不同的熒光顏色)抗體探針、熒光量子點(diǎn)二抗探針、熒光染料抗體探針或熒光染料二抗探針之一。
同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備方法，其步驟如下1.制備編碼微球試劑1)小分子化合物全抗原的制備使小分子化合物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)載體進(jìn)行蛋白偶聯(lián)，得到小分子化合物全抗原；小分子化合物為孔雀石綠、結(jié)晶紫、鹽酸克倫特羅、氯霉素、萊克多巴胺、沙丁胺醇、硝基呋喃類獸藥代謝物(AOZ、AMOZ、AHD和SEM)、磺胺、鏈霉素、甲胺磷、對(duì)硫磷、甲萘威、甲霜靈或嗎啡之一；用分光光度計(jì)測(cè)定制備好的小分子化合物全抗原的濃度，用摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution-PBS，下文中的PBS都為此種磷酸鹽緩沖溶液)稀釋到質(zhì)量濃度為1mg/ml；2)磷酸鹽-氫氧化鈉緩沖溶液的配制用當(dāng)量濃度為5N的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)摩爾濃度為0.1M的NaH2PO3水溶液的酸度，使pH＝6.0-6.5；3)微球活化取1-5μL顆粒直徑為3-10μm、熒光顏色為紅、橙、黃或綠之一及熒光強(qiáng)度為1至8級(jí)之一的聚苯乙烯熒光微球，先放入超聲波清洗器中超聲30s，然后放入渦旋振蕩器中振蕩10s，上述再加入到一個(gè)離心管中，再加入200-500μL上述200-500μL上述磷酸鹽-氫氧化鈉緩沖溶液，混合均勻；經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后倒掉廢液，然后每次用200μL磷酸鹽-氫氧化鈉緩沖溶液洗滌，洗滌2-3次，(洗滌即為混合均勻后經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄倒掉廢液)；再加入80-300μL上述磷酸鹽-氫氧化鈉緩沖溶液、5-20μL質(zhì)量濃度為50mg/ml的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-Hydroxysul fosuccinimide sodium salt，NHS)和5-20μL質(zhì)量濃度為50mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC]，避光搖振20min(即用錫箔包裹離心管在渦旋振蕩器中低速振蕩，以下避光搖振過(guò)程皆按此操作)；經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后倒掉廢液，然后每次用200μL摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的PBS洗滌，洗滌2-3次，再溶于50-300μL摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的PBS溶液中，得到活化微球液；4)小分子化合物全抗原在微球上的固定化取上述活化微球液80-100μL，加入到離心管中，再加入10-20μL質(zhì)量濃度為1mg/mL上述制備的小分子化合物全抗原，避光搖振0.5-2小時(shí)，經(jīng)3,000rpm離心20分鐘，倒掉廢液；得到已固定化小分子化合物全抗原的微球；5)配制封閉液用摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的PBS溶解牛血清蛋白(BSA)使其重量百分比濃度為2-10％；再加入疊氮化鈉(NaN3)使重量百分比濃度為0.02-0.03％，混合均勻，得到封閉液；溶解后牛血清蛋白(BSA)的優(yōu)選重量百分比濃度為5％-10％；6)已固定化小分子化合物全抗原的微球的封閉向上述已固定化小分子化合物全抗原的微球中加入200μL上述封閉液，然后放入渦旋振蕩器中振蕩10s，避光搖振1-2小時(shí)，于4℃放置10-15小時(shí)使微球封閉；再每次用100-200μL封閉液洗滌，洗滌2次，用摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的PBS定容至100-200μL，即制得編碼微球試劑；每次用封閉液洗滌時(shí)，優(yōu)選用量為150-200μL。
2.制備小分子化合物抗體探針1)制備熒光量子點(diǎn)抗體探針a基于上述小分子化合物全抗原，對(duì)小鼠或大鼠利用雜交瘤技術(shù)通過(guò)細(xì)胞融合，克隆篩選小分子化合物單克隆抗體；或者用制得的小分子化合物全抗原分別免疫兔、羊或雞，制備篩選特異性好的小分子化合物多克隆抗體；b用硫酸銨分級(jí)沉淀法和柱層析分離提純技術(shù)分別對(duì)上述小分子化合物單克隆抗體或小分子化合物多克隆抗體進(jìn)行純化，用分光光度計(jì)測(cè)定純化后小分子化合物單克隆抗體或小分子化合物多克隆抗體的質(zhì)量濃度；c制備熒光量子點(diǎn)抗體探針用摩爾濃度為0.1M、pH＝7.4的Na3PO4溶液溶解上述純化后的小分子化合物單克隆抗體或小分子化合物多克隆抗體，使其質(zhì)量濃度為10mg/mL，得到小分子化合物抗體溶液；取2mL小分子化合物抗體溶液，加入在水相合成的摩爾濃度為0.00125mol/L CdTe(碲化鎘)量子點(diǎn)溶液0.5-2mL，混合均勻后，再加入質(zhì)量濃度為0.6mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)1mL，將反應(yīng)體系用摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的Na3PO4溶液補(bǔ)足至5mL，室溫下避光搖振反應(yīng)2h；在4℃條件下，用400mL摩爾濃度為0.01M的Na3PO4、摩爾濃度為0.15M的NaCl、pH 7.4的透析液對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行透析，透析袋截流量為10000-30000，每6h換一次透析液，共計(jì)30h；得到熒光量子點(diǎn)抗體探針；加入在水相合成的摩爾濃度為0.00125mol/L CdTe(碲化鎘)量子點(diǎn)溶液的優(yōu)選體積為1mL-2mL；2)制備熒光量子點(diǎn)二抗探針用抗小鼠、大鼠、兔、羊或雞之一的IgG抗體替換上述小分子化合物的單克隆抗體或小分子化合物的特異性好的多克隆抗體，其余步驟按制備熒光量子點(diǎn)抗體探針的步驟操作，即可制得熒光量子點(diǎn)二抗探針；3)制備熒光染料抗體探針用藻紅蛋白(PE)、異硫氰酸熒光素(FITC)熒光染料對(duì)上述小分子化合物的單克隆抗體或小分子化合物的特異性好的多克隆抗體，進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記步驟如下(1)抗體、藻紅蛋白(PE)或異硫氰酸熒光素(FITC)的預(yù)處理①將上述5mg小分子化合物的單克隆抗體或小分子化合物的特異性好的多克隆抗體每次用400ml含質(zhì)量百分比濃度為0.05％的NaN3，pH7.2、摩爾濃度為10mM的PBS緩沖液進(jìn)行透析，透析3-4次，其間更換緩沖液，每次透析時(shí)間為3-4小時(shí)，最后一次透析過(guò)夜；②將5mg PE或FITC每次用400ml含摩爾濃度為50mM的NaH2PO4、摩爾濃度為2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)、pH 7.0緩沖液進(jìn)行透析，透析3-4次，其間更換緩沖液，每次透析時(shí)間為3-4小時(shí)，最后一次透析過(guò)夜；③上述透析后的抗體、PE或FITC分別經(jīng)10,000rpm，4℃離心10分鐘去除沉淀；用分光光度計(jì)分別測(cè)定抗體、PE或FITC的質(zhì)量濃度；(2)PE或FITC的衍生化①取Sephadex G-25層析柱，用5倍柱床體積含摩爾濃度為50mM的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、摩爾濃度為2mM的EDTA、pH 6.0的交換緩沖液平衡；②按照每mg上述經(jīng)透析PE或FITC中加入10-13μL的摩爾濃度為10mg/mL的琥珀酰亞胺-4-(N-甲基馬來(lái)酰亞胺)環(huán)己烷-1-碳酸酯(SMCC)的無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)溶液的比例加入SMCC，室溫避光搖振反應(yīng)60min；加入平衡后的Sephadex G-25層析柱中去除游離的SMCC，收集PE或FITC，得到衍生化的PE或FITC；用分光光度計(jì)測(cè)定衍生化的PE或FITC質(zhì)量濃度；(3)抗體的還原①Sephadex G-25層析柱用5倍柱床體積含摩爾濃度為50mM的MES、摩爾濃度為2mM的EDTA、pH 6.0的交換緩沖液平衡；②按照每mL上述經(jīng)透析的抗體溶液中加入20μL的摩爾濃度為1M的二硫蘇糖醇(DTT)的比例加入DTT，室溫避光搖振反應(yīng)30min；加入平衡后的Sephadex G-25層析柱中去除游離的DTT，收集抗體部分，得到還原后的抗體；用分光光度計(jì)測(cè)定抗體質(zhì)量濃度；(4)PE或FITC和抗體的共價(jià)交聯(lián)①將上述還原后的抗體按照1個(gè)IgG分子結(jié)合1-3個(gè)PE或FITC分子的比例逐滴加入到上述衍生化的PE或FITC中，邊加邊攪動(dòng)；室溫避光振蕩反應(yīng)2小時(shí)；得到PE-抗體或FITC-抗體；用分光光度計(jì)測(cè)定PE-抗體或FITC-抗體質(zhì)量濃度；1個(gè)IgG分子結(jié)合PE或FITC分子的優(yōu)選比例為1-2個(gè)；
②向每mg上述PE-抗體或FITC-抗體中加入0.34μL摩爾濃度為10mg/mL的N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)的DMSO溶液的比例加入NEM進(jìn)行封閉，室溫避光搖振反應(yīng)20min；然后置蛋白截流量為30,000的濃縮器中濃縮；濃縮比為3-4∶1；濃縮的優(yōu)選比為3.5-4∶1；(5)凝膠分離純化①Sephacryl S-300層析柱用5倍柱床體積含摩爾濃度為10mM的PBS、摩爾濃度為1M的Urea尿素、質(zhì)量百分比濃度為0.05％的NaN3、pH7.2緩沖液平衡，其中柱體包裹錫箔紙進(jìn)行避光；②利用經(jīng)緩沖液平衡的Sephacryl S-300層析柱對(duì)上述濃縮后的PE-抗體或FITC-抗體進(jìn)行純化，根據(jù)洗脫曲線收集合格的標(biāo)記產(chǎn)品，得到純化后的PE-抗體或FITC-抗體；③將上述純化后的PE-抗體或FITC-抗體分別每次用400ml含質(zhì)量百分比濃度為0.05％的NaN3、pH7.4、摩爾濃度為100mM的PBS緩沖液進(jìn)行透析，透析3-4次，其間更換緩沖液，每次透析時(shí)間為3-4小時(shí)，最后一次透析過(guò)夜；然后置蛋白截流量為30,000的濃縮器中濃縮；濃縮比為3-4∶1，得到純化后的PE-抗體或FITC-抗體的濃縮液；濃縮的優(yōu)選比為3.5-4∶1；④將上述純化后的PE-抗體或FITC-抗體的濃縮液分別經(jīng)10,000rpm，4℃離心10分鐘去除沉淀，制得PE-抗體探針或FITC-抗體探針；4)制備熒光染料二抗探針用抗小鼠、大鼠、兔、羊、雞IgG抗體替小分子化合物的單克隆抗體或特異性好的多克隆抗體，其余步驟按制備熒光染料抗體探針中步驟進(jìn)行操作，即可制得熒光染料二抗探針。
同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的使用方法即采用同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑檢測(cè)小分子化合物的方法為抗體探針直接法、抗體探針間接法；檢測(cè)步驟如下1.抗體探針直接法1)分別取含有孔雀石綠、結(jié)晶紫、鹽酸克倫特羅、氯霉素、萊克多巴胺、沙丁胺醇、硝基呋喃類獸藥代謝物(AOZ、AMOZ、AHD和SEM)、磺胺、鏈霉素、甲胺磷、對(duì)硫磷、甲萘威、甲霜靈或嗎啡之一的待測(cè)小分子化合物的樣本提取液各100μL，加入離心管中，分別加入與待測(cè)小分子化合物對(duì)應(yīng)的上述編碼微球試劑30-100μL，再分別加入與待測(cè)小分子化合物對(duì)應(yīng)的上述熒光量子點(diǎn)抗體探針或PE、FITC熒光染料抗體探針3-10μL，避光搖振0.5-2小時(shí)，使其發(fā)生免疫反應(yīng)，生成編碼微球-熒光量子點(diǎn)抗體探針復(fù)合物或編碼微球-熒光染料抗體探針復(fù)合物；
2)將上述編碼微球-熒光量子點(diǎn)抗體探針復(fù)合物或編碼微球-熒光染料抗體探針復(fù)合物分別經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，分別每次用200μL PBS洗2次，送入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)；采用流式技術(shù)使復(fù)合物呈單列順序逐個(gè)地通過(guò)檢測(cè)區(qū)，當(dāng)編碼微球及熒光量子點(diǎn)抗體探針或熒光染料抗體探針的兩種信號(hào)同時(shí)被檢測(cè)時(shí)為有效測(cè)試信號(hào)，該信號(hào)通過(guò)軟件的門(mén)技術(shù)記錄下來(lái)，當(dāng)存在待測(cè)小分子化合物時(shí)，待測(cè)小分子化合物和編碼微球包被的蛋白偶聯(lián)抗原與探針發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，致使復(fù)合物上探針的熒光量子點(diǎn)或熒光染料熒光信號(hào)降低，降低的程度與待測(cè)小分子化合物的量呈有規(guī)律的相關(guān)性，用待測(cè)小分子化合物抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液分別建立待測(cè)小分子化合物定量檢測(cè)直接法的模型，依據(jù)分別建立的模型對(duì)待測(cè)小分子化合物進(jìn)行單一的或同時(shí)對(duì)多種小分子化合物定量檢測(cè)。小分子化合物抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液的配制用PBS緩沖溶液對(duì)質(zhì)量濃度為1mg/ml的小分子化合物抗原進(jìn)行倍比稀釋，得到一系列如質(zhì)量濃度為0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml及8.1ng/ml的小分子化合物抗原標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液。
2.抗體探針間接法1)分別取含有孔雀石綠、結(jié)晶紫、鹽酸克倫特羅、氯霉素、萊克多巴胺、沙丁胺醇、硝基呋喃類獸藥代謝物(AOZ、AMOZ、AHD和SEM)、磺胺、鏈霉素、甲胺磷、對(duì)硫磷、甲萘威、甲霜靈或嗎啡之一的待測(cè)小分子化合物的樣本提取液各100μL，加入離心管中，分別加入與待測(cè)小分子化合物對(duì)應(yīng)的上述編碼微球試劑30-100μL，再分別加入待測(cè)小分子化合物的上述單克隆抗體或待測(cè)小分子化合物的特異性好的多克隆抗體3-10μL，避光搖振0.5-2小時(shí)，使其發(fā)生免疫反應(yīng)，生成編碼微球-抗體復(fù)合物；2)將上述編碼微球-抗體復(fù)合物分別經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次分別用200μL PBS洗滌，洗滌2次，除去未與編碼微球試劑結(jié)合的抗體；再分別加入30-100μL與待測(cè)小分子化合物抗體對(duì)應(yīng)的熒光量子點(diǎn)二抗探針或熒光染料二抗探針，避光搖振0.5-1小時(shí)使免疫反應(yīng)完全，生成編碼微球-抗體-熒光量子點(diǎn)二抗探針或編碼微球-抗體-熒光染料二抗探針復(fù)合物，送入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
抗體探針間接法采用與直接法相同的檢測(cè)方式建立小分子化合物定量檢測(cè)抗體探針間接法的模型，依據(jù)分別建立的模型對(duì)待測(cè)小分子化合物進(jìn)行單一的或同時(shí)對(duì)多種小分子化合物定量檢測(cè)。
以上所述直接法及間接法均通過(guò)微球的顏色、亮度或粒徑大小的區(qū)別進(jìn)行光學(xué)編碼，而其顏色、亮度或粒徑的不同將在流式細(xì)胞儀上一一顯現(xiàn)出來(lái)，例如，不同顏色的微球在儀器上將有不同的PMT(光電倍增管)檢測(cè)器收集到光電信號(hào)、不同亮度的微球在儀器上的熒光光譜上將出現(xiàn)不同的峰、不同粒徑的微球則在儀器上將顯現(xiàn)在不同的區(qū)域位置，而這種種不同都可以同時(shí)通過(guò)儀器將其區(qū)分開(kāi)進(jìn)行識(shí)別；通過(guò)儀器光學(xué)測(cè)量實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)小分子化合物的識(shí)別，相當(dāng)于給每種小分子化合物貼上了標(biāo)簽，可進(jìn)行定性檢測(cè)，也可進(jìn)行定量檢測(cè)；本發(fā)明是基于流式技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)小分子化合物抗原的方法。以熒光聚合物微球?yàn)檩d體通過(guò)與蛋白偶聯(lián)小分子化合物結(jié)合制得相應(yīng)編碼微球試劑。用熒光量子點(diǎn)或PE、FITC熒光染料標(biāo)記經(jīng)純化的小分子化合物單克隆抗體及多克隆抗體或者與小分子化合物抗體對(duì)應(yīng)的IgG抗體(二抗)而制得相應(yīng)的特異性熒光探針。利用直接法或間接法建立檢測(cè)模型，采用流式技術(shù)控制微球復(fù)合物呈單列逐個(gè)順序通過(guò)檢測(cè)區(qū)；利用微球顏色、亮度或粒徑大小的區(qū)別對(duì)微球進(jìn)行光學(xué)編碼，與熒光量子點(diǎn)探針或PE、FITC的熒光染料探針組合，當(dāng)某種編碼微球和與其組合的某種顏色的熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針信號(hào)同時(shí)被檢測(cè)到時(shí)即可特定地識(shí)別一種小分子化合物，多種小分子化合物的編碼微球試劑及其熒光量子點(diǎn)或熒光染料探針組合起來(lái)可組合成多種識(shí)別靶標(biāo)，因此可進(jìn)行多種小分子化合物同步定性及定量檢測(cè)。
本發(fā)明公開(kāi)的用于多種小分子化合物同步檢測(cè)的試劑盒(滿足100次實(shí)驗(yàn)量)包括一種或多種不同小分子化合物編碼微球試劑、一種或多種不同小分子化合物抗體熒光探針或一種或多種不同小分子化合物抗體及其對(duì)應(yīng)的熒光二抗探針、一種或多種不同小分子抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液、PBS緩沖洗液；標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；器材由容量為1.5ml的離心管、量程分別為1-10μL、10-100μL、20-200μL移液槍及其所需配套槍頭、錫箔、渦旋振蕩器、離心機(jī)、流式細(xì)胞儀上樣用試管及檢測(cè)專用儀器流式細(xì)胞儀組成。
本發(fā)明提供的試劑盒可用于食品、農(nóng)產(chǎn)品、活體動(dòng)物及人體中獸藥、農(nóng)藥、違禁藥物、濫用藥物中的小分子化合物的檢測(cè)，靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速、成本低廉。
本發(fā)明所使用的檢測(cè)儀器包括流式細(xì)胞儀、懸浮式(液相)芯片檢測(cè)系統(tǒng)及微流控芯片流式細(xì)胞儀。其中懸浮式(液相)芯片檢測(cè)儀是基于流式編碼微球檢測(cè)的小型專用儀器，能夠滿足多種小分子化合物的同步檢測(cè)，但其功能上目前只能對(duì)紅色熒光微球進(jìn)行分析，微流控芯片流式細(xì)胞儀是結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)及微流控芯片技術(shù)研發(fā)的小型化流式細(xì)胞儀，具有小型化、低成本特點(diǎn)，因此便于攜帶，在基層現(xiàn)場(chǎng)實(shí)施檢測(cè)。
本發(fā)明所需的試劑、儀器、設(shè)備均可在市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1用于多種小分子化合物同步檢測(cè)的試劑盒所需試劑的配制1.按上述方法制備編碼微球試劑，其中第3步，取顆粒直徑為3μm、熒光強(qiáng)度為2級(jí)、熒光顏色為紅、橙、黃或綠色的聚苯乙烯熒光微球各1μL；或取顆粒直徑為10μm、熒光顏色為綠色、熒光強(qiáng)度為1、2、4、5、6或8級(jí)的聚苯乙烯熒光微球各5μL；或取熒光顏色為紅色、熒光強(qiáng)度為3級(jí)、顆粒直徑為4、5、6、8、9μm的聚苯乙烯熒光微球各3μL；其中第5步，使BSA的重量百分比濃度為2％、5％或10％；其中第6步，每次用100μL、150μL或200μL封閉液洗2次。
2.按上述方法制備熒光量子點(diǎn)抗體探針，其中第3步，加入在水相合成的摩爾濃度為0.00125mol/L CdTe量子點(diǎn)溶液0.5mL、1mL或2mL；透析袋蛋白截流量為10000、20000或30000。
3.按上述方法制備熒光量子點(diǎn)二抗探針，其中第3步、加入在水相合成的摩爾濃度為0.00125mol/L CdTe量子點(diǎn)溶液0.5mL、1mL或2mL；透析袋蛋白截流量為10000、20000或30000。
4.按上述方法制備熒光染料抗體探針，其中第4步，按照1個(gè)IgG分子結(jié)合1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)PE或FITC分子的比例；濃縮比例為3∶1、3.5∶1或4∶1；其中第5步，濃縮比例為3∶1、3.5∶1或4∶1。
5.按上述方法制備熒光染料二抗探針，其中第4步，還原后的抗體按照1個(gè)IgG分子結(jié)合1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)PE或FITC分子的比例逐滴加入；濃縮比例為3∶1、3.5∶1或4∶1；其中第5步，濃縮比例為3∶1、3.5∶1或4∶1。
實(shí)施例2同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑盒的裝配(可測(cè)試100次)1.一種或多種不同小分子化合物編碼微球試劑用于某一種小分子化合物檢測(cè)的試劑盒，配這種小分子化合物編碼微球試劑100次實(shí)驗(yàn)所需量10mL，如孔雀石綠檢測(cè)試劑盒配有孔雀石綠編碼微球試劑10mL，以上試劑皆4℃保存。
用于多種小分化合物子檢測(cè)試的劑盒，分別配每種小分子化合物編碼微球試劑100次實(shí)驗(yàn)所需量10mL，試劑盒里面的編碼微球之間至少粒徑、熒光顏色或熒光強(qiáng)度之一有區(qū)別，如對(duì)鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、氯霉素同時(shí)檢測(cè)，配鹽酸克倫特羅的粒徑為3μm、紅色熒光、熒光強(qiáng)度為1級(jí)的編碼微球試劑10mL、萊克多巴胺的粒徑為3μm、紅色熒光、熒光強(qiáng)度為8級(jí)的編碼微球試劑10mL，氯霉素的粒徑為3μm、橙色熒光、熒光強(qiáng)度為8級(jí)的編碼微球試劑10mL；或鹽酸克倫特羅的粒徑為3μm、紅色熒光、熒光強(qiáng)度為5級(jí)的編碼微球試劑10mL、萊克多巴胺的粒徑為10μm、紅色熒光、熒光強(qiáng)度為5級(jí)的編碼微球試劑10mL，氯霉素的粒徑為7μm、綠色熒光、熒光強(qiáng)度為8級(jí)的編碼微球試劑10mL；或鹽酸克倫特羅的粒徑為5μm、紅色熒光、熒光強(qiáng)度為6級(jí)的編碼微球試劑10mL、萊克多巴胺的粒徑為5μm、綠色熒光、熒光強(qiáng)度為3級(jí)的編碼微球試劑10mL，氯霉素的粒徑為5μm、綠色熒光、熒光強(qiáng)度為8級(jí)的編碼微球試劑10mL，以上試劑皆4℃保存；2.一種或多種不同小分子化合物抗體熒光探針或一種或多種不同小分子化合物抗體及其對(duì)應(yīng)的熒光二抗探針用于某一種小分子化合物直接法檢測(cè)的試劑盒，配這種小分子化合物抗體熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針100次實(shí)驗(yàn)所需量1mL，如孔雀石綠直接法檢測(cè)的試劑盒，配有孔雀石綠單克隆抗體或特異性好的多克隆抗體的熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針1mL，以上試劑皆4℃保存。
用于某一種小分子化合物間接法檢測(cè)的試劑盒，配這種小分子化合物單克隆抗體或特異性好的多克隆抗體100次實(shí)驗(yàn)所需量1mL、其對(duì)應(yīng)的熒光量子點(diǎn)二抗探針或熒光染料二抗探針100次實(shí)驗(yàn)所需量1mL，如孔雀石綠間接法檢測(cè)試劑盒配有由小鼠制得的孔雀石綠單克隆抗體1mL、羊抗小鼠二抗熒光量子點(diǎn)探針或羊抗小鼠二抗熒光染料探針1mL，以上試劑皆4℃保存。
用于多種小分子化合物直接法檢測(cè)試的劑盒，分別配每種小分子化合物抗體熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針100次實(shí)驗(yàn)所需量1mL，如鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和氯霉素直接法同時(shí)檢測(cè)試劑盒里面配備鹽酸克倫特羅單克隆抗體或特異性好的多克隆抗體熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針1mL、萊克多巴胺單克隆抗體或特異性好的多克隆抗體熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針1mL和氯霉素單克隆抗體或特異性好的多克隆抗體熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針1mL，以上試劑皆4℃保存。
用于多種小分子化合物間接法檢測(cè)的試劑盒，分別配每種小分子化合物的單克隆抗體或特異性好的多克隆抗體100次實(shí)驗(yàn)所需量1mL、其對(duì)應(yīng)的二抗熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針100次實(shí)驗(yàn)所需量1mL，如鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和氯霉素間接法同時(shí)檢測(cè)的試劑盒里面配備由小鼠制得的鹽酸克倫特羅單克隆抗體1mL、由兔制得的萊克多巴胺多克隆抗體1mL、由小鼠制得的氯霉素單克隆抗體1ml，對(duì)應(yīng)由小鼠制得的鹽酸克倫特羅單克隆抗體的羊抗小鼠二抗熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針1mL、對(duì)應(yīng)由兔制得的萊克多巴胺多克隆抗體的羊抗兔二抗熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針1mL和對(duì)應(yīng)由小鼠制得的氯霉素單克隆抗體的羊抗小鼠二抗熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針1mL；以上試劑皆4℃保存；3.一種或多種不同小分子化合物抗原系列標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液?jiǎn)蝹€(gè)小分子化合物檢測(cè)試劑盒，配所需檢測(cè)的小分子化合物抗原標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度試劑10次實(shí)驗(yàn)所需量1mL；如檢測(cè)孔雀石綠試劑盒配有系列質(zhì)量濃度為0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml及8.1ng/ml的孔雀石綠抗原標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度試劑每種1ml；以上試劑皆4℃保存；多種小分子化合物檢測(cè)試劑盒，配所需檢測(cè)的小分子化合物抗原標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度試劑；如同時(shí)檢測(cè)克倫特羅、萊克多巴胺和氯霉素試劑盒里面配有系列質(zhì)量濃度為0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml及8.1ng/ml的克倫特羅抗原標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度試劑每種1ml、系列質(zhì)量濃度為0ng/ml、0.06ng/ml、0.2ng/ml、0.6ng/ml、1.8ng/ml及5.4ng/ml的萊克多巴胺抗原標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度試劑每種1ml和系列質(zhì)量濃度為0ng/ml、0.05ng/ml、0.2ng/ml、0.8ng/ml、3.2ng/ml及12.8ng/ml的氯霉素抗原標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度試劑每種1ml；以上試劑皆4℃保存；4.PBS緩沖洗液100次實(shí)驗(yàn)所需量200mL，4℃保存。
5.其他標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1份；容量為1.5ml的離心管100個(gè)；量程分別為1-10μL、10-100μL、20-200μL移液槍各一把及配套槍頭各1000個(gè)；錫箔1卷、渦旋振蕩器1臺(tái)；離心機(jī)1臺(tái)、流式細(xì)胞儀1臺(tái)及流式細(xì)胞儀上樣用試管100個(gè)；實(shí)施例3同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑盒的使用方法-抗體探針直接法檢測(cè)單個(gè)小分子化合物，例如要檢測(cè)樣品中鹽酸克倫特羅的含量a.試劑盒中配的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1)分別取100μL質(zhì)量濃度為0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml及8.1ng/ml鹽酸克倫特羅抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液于離心管中，分別加入粒徑為4μm、紅色熒光，熒光強(qiáng)度為3級(jí)的活化微球液固定化鹽酸克倫特羅全抗原制得的編碼微球試劑100μL，再分別加入10μL鹽酸克倫特羅單克隆抗體綠色熒光量子點(diǎn)探針，避光搖振0.5小時(shí)使其發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，生成編碼微球-熒光量子點(diǎn)抗體探針復(fù)合物；
2)經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次用200μL PBS洗2次，轉(zhuǎn)入到流式細(xì)胞儀檢測(cè)試管中待測(cè)；3)上儀器進(jìn)行檢測(cè)，利用流式細(xì)胞儀中能對(duì)多種顏色同時(shí)分析，再利用儀器信號(hào)收集分析軟件，對(duì)紅色熒光與綠色熒光所收集到的信號(hào)做雙參圖，由圖所得到的雙陽(yáng)性即判定為結(jié)合上了抗體，得到的數(shù)據(jù)同鹽酸克倫特羅抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
b.檢測(cè)樣品1)取100μL待測(cè)樣本提取液于離心管中，加粒徑為4μm、紅色熒光，熒光強(qiáng)度為3級(jí)的活化微球液固定化鹽酸克倫特羅全抗原制得的編碼微球試劑100μL于容量為1.5ml的離心管中，再加入鹽酸克倫特羅單克隆抗體綠色量子點(diǎn)熒光探針10μL，避光搖振1小時(shí)，使其發(fā)生免疫反應(yīng)，生成編碼微球-熒光量子點(diǎn)抗體探針復(fù)合物；2)將上述編碼微球-熒光量子點(diǎn)探針復(fù)合物經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次用200μL PBS洗2次，轉(zhuǎn)入到流式細(xì)胞儀檢測(cè)試管中待測(cè)；3)上儀器進(jìn)行檢測(cè)，得到的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，以確定待測(cè)樣本提取液中鹽酸克倫特羅抗原的質(zhì)量濃度，從而得到樣品的檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)施例4同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑盒的使用方法-抗體探針直接法同時(shí)檢測(cè)多種小分子化合物，例如要同時(shí)檢測(cè)樣品中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺與氯霉素的含量a.試劑盒中配的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1)分別取100μL質(zhì)量濃度為0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml及8.1ng/ml的鹽酸克倫特羅抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液于離心管中，分別加入粒徑為4μm、紅色熒光，熒光強(qiáng)度為3級(jí)的活化微球液固定化鹽酸克倫特羅全抗原制得的編碼微球試劑100μL，再分別加入鹽酸克倫特羅單克隆抗體FITC染料綠色熒光探針10μL，避光搖振2小時(shí)使其發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)；生成編碼微球-熒光染料抗體探針復(fù)合物；2)將上述編碼微球-熒光染料抗體探針復(fù)合物分別經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次用200μL PBS洗2次，再分別轉(zhuǎn)入到流式細(xì)胞儀檢測(cè)試管中待測(cè)；3)上儀器進(jìn)行檢測(cè)，利用流式細(xì)胞儀中能對(duì)多種顏色同時(shí)分析，再利用儀器信號(hào)收集分析軟件，對(duì)紅色熒光與綠色熒光所收集到的信號(hào)做雙參圖，由圖所得到的雙陽(yáng)性即判定為結(jié)合上了抗體，得到的數(shù)據(jù)同鹽酸克倫特羅抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液作圖，繪制出鹽酸克倫特羅抗原質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
同理用萊克多巴胺抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液、粒徑為5μm、橙色熒光、熒光強(qiáng)度為6級(jí)的活化微球液固定化萊克多巴胺全抗原得的編碼微球試劑及其單克隆抗體FITC染料綠色熒光探針發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，經(jīng)儀器進(jìn)行檢測(cè)，繪制出萊克多巴胺抗原質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
同理用氯霉素抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液、粒徑為4μm、紅色熒光、熒光強(qiáng)度為6級(jí)的活化微球液固定化氯霉素全抗原制得的編碼微球試劑及其特異性好的多克隆抗體PE染料橙色熒光探針發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，經(jīng)儀器進(jìn)行檢測(cè)繪制出氯霉素抗原質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
b.樣品的檢測(cè)1)取100μL待測(cè)樣本提取液于離心管中，加入粒徑為4μm、紅色熒光、熒光強(qiáng)度為3級(jí)的活化微球液固定化鹽酸克倫特羅全抗原制得的編碼微球試劑30μL于離心管中；再加入粒徑為5μm、橙色熒光、熒光強(qiáng)度為6級(jí)的活化微球液固定化萊克多巴胺全抗原得的編碼微球試劑30μL及粒徑為4μm、紅色熒光、熒光強(qiáng)度為6級(jí)的活化微球液固定化氯霉素全抗原制得的編碼微球試劑30μL；然后再加入鹽酸克倫特羅單克隆抗體FITC染料綠色熒光探針、萊克多巴胺單克隆抗體FITC染料綠色熒光探針及氯霉素特異性好的多克隆抗體PE染料橙色熒光探針各3μL，避光搖振1小時(shí)使其發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，生成編碼微球-熒光染料抗體探針復(fù)合物；2)將上述編碼微球-熒光染料抗體探針復(fù)合物分別經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次用200μL PBS洗2次，再分別轉(zhuǎn)入到流式細(xì)胞儀檢測(cè)試管中待測(cè)。
3)上儀器進(jìn)行檢測(cè)，利用流式細(xì)胞儀中能對(duì)多種顏色同時(shí)分析，再利用儀器信號(hào)收集分析軟件，且由于鹽酸克倫特羅編碼微球的紅色熒光強(qiáng)度為3級(jí)與氯霉素編碼微球的6級(jí)紅色熒光強(qiáng)度不同，其在紅色熒光通道所收集的信號(hào)將是由2個(gè)不同的峰組成，對(duì)不同的峰作門(mén)即可得到1張代表鹽酸克倫特羅由紅色熒光與綠色熒光所收集到的信號(hào)作出的雙參圖及1張代表氯霉素由紅色熒光與橙色熒光所收集到的信號(hào)作出的雙參圖，由圖所得到的雙陽(yáng)性即判定是否結(jié)合上了鹽酸克倫特羅抗體或者氯霉素抗體，得到的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，以確定待測(cè)樣本提取液中鹽酸克倫特羅抗原及氯霉素抗原的質(zhì)量濃度；同時(shí)由于萊克多巴胺編碼微球的粒徑5μm與鹽酸克倫特羅編碼微球及氯霉素編碼微球粒徑為4μm不同，且萊克多巴胺編碼微球的橙色熒光與鹽酸克倫特羅編碼微球及氯霉素編碼微球的紅色熒光不同所以可得到1張代表萊克多巴胺的由橙色熒光與綠色熒光所收集到的信號(hào)做出的雙參圖，由圖所得到的雙陽(yáng)性即判定是否結(jié)合上了萊克多巴胺，得到的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，以確定待測(cè)樣本提取液中萊克多巴胺抗原的質(zhì)量濃度；從而得到樣品的檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)施例5同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑盒的使用方法-抗體探針間接法檢測(cè)單個(gè)小分子化合物，例如要檢測(cè)樣品中鹽酸克倫特羅的含量a.試劑盒中配的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1)分別取100μL質(zhì)量濃度為0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml及8.1ng/ml鹽酸克倫特羅抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液于離心管中，分別加入粒徑為4μm、綠色熒光，熒光強(qiáng)度為3級(jí)的活化微球液固定化鹽酸克倫特羅全抗原制得的編碼微球試劑100μL，再分別加入10μL鹽酸克倫特羅單克隆抗體，避光搖振0.5小時(shí)使其發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，生成編碼微球-抗體復(fù)合物；2)將上述編碼微球-抗體復(fù)合物經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次用200μL PBS洗2次；3)再加入100μL橙色PE染料標(biāo)記的對(duì)應(yīng)鹽酸克倫特羅單克隆抗體的二抗探針，避光搖振0.5小時(shí)使其發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)；生成編碼微球-抗體-熒光染料二抗探針復(fù)合物；4)將上述編碼微球-抗體-熒光染料二抗探針復(fù)合物經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次用200μL PBS洗2次，轉(zhuǎn)入到流式細(xì)胞儀檢測(cè)試管中待測(cè)；5)上儀器進(jìn)行檢測(cè)，利用流式細(xì)胞儀中能對(duì)多種顏色同時(shí)分析，再利用儀器信號(hào)收集分析軟件，對(duì)綠色熒光與橙色熒光所收集到的信號(hào)做雙參圖，由圖所得到的雙陽(yáng)性即判定為結(jié)合上了抗體，得到的數(shù)據(jù)同鹽酸克倫特羅抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
b.檢測(cè)樣品1)取100μL待測(cè)樣本提取液于離心管中，加入粒徑4μm的綠色熒光，熒光強(qiáng)度為3級(jí)的活化微球液固定化鹽酸克倫特羅全抗原制得的編碼微球試劑100μL，再加入鹽酸克倫特羅單克隆抗體10μL，避光搖振2小時(shí)，使其發(fā)生免疫反應(yīng)；生成編碼微球-抗體復(fù)合物；2)將上述編碼微球-抗體復(fù)合物經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次用200μL PBS洗2次；3)再加入100μL橙色PE染料標(biāo)記的對(duì)應(yīng)鹽酸克倫特羅單克隆抗體的二抗探針，避光搖振1小時(shí)使其發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，生成編碼微球-抗體-熒光染料二抗探針復(fù)合物；4)將上述編碼微球-抗體-熒光染料二抗探針復(fù)合物經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次用200μL PBS洗2次，轉(zhuǎn)入到流式細(xì)胞儀檢測(cè)試管中待測(cè)；5)上儀器進(jìn)行檢測(cè)，得到的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，以確定待測(cè)樣本提取液中鹽酸克倫特羅抗原的質(zhì)量濃度，從而得到樣品的檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)施例6同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑盒的使用方法-抗體探針間接法檢測(cè)多個(gè)小分子化合物，例如要同時(shí)檢測(cè)樣品中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺與氯霉素的含量時(shí)；a.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1)分別取100μL質(zhì)量濃度為0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、0.9ng/ml、2.7ng/ml及8.1ng/ml鹽酸克倫特羅抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液于離心管中，分別加入粒徑為3μm、紅色熒光、熒光強(qiáng)度為1級(jí)的活化微球液固定化鹽酸克倫特羅全抗原制得的編碼微球試劑100μL，再分別加入10μL鹽酸克倫特羅單克隆抗體，避光搖振1小時(shí)使其發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，生成編碼微球-抗體復(fù)合物；2)將上述編碼微球-抗體復(fù)合物經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次用200μL PBS洗2次；3)再加入100μL綠色熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的對(duì)應(yīng)鹽酸克倫特羅單克隆抗體的二抗探針，避光搖振0.5小時(shí)使其發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)生成編碼微球-抗體-熒光量子點(diǎn)二抗探針復(fù)合物；4)將上述編碼微球-抗體-熒光量子點(diǎn)二抗探針復(fù)合物經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次用200μL PBS洗2次，轉(zhuǎn)入到流式細(xì)胞儀檢測(cè)試管中待測(cè)；5)上儀器進(jìn)行檢測(cè)，利用流式細(xì)胞儀中能對(duì)多種顏色同時(shí)分析，再利用儀器信號(hào)收集分析軟件，對(duì)紅色熒光與綠色熒光所收集到的信號(hào)做雙參圖，由圖所得到的雙陽(yáng)性即判定為結(jié)合上了抗體，得到的數(shù)據(jù)同鹽酸克倫特羅抗原系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線；同理繪制出用粒徑為10μm、橙色熒光、熒光強(qiáng)度為8級(jí)的活化微球液固定化萊克多巴胺全抗原得的編碼微球試劑、萊克多巴胺特異性好的多克隆抗體和紅色熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的對(duì)應(yīng)萊克多巴胺多克隆抗體的二抗探針發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，經(jīng)儀器進(jìn)行檢測(cè)繪制出萊克多巴胺抗原質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；同理繪制出用粒徑為3μm、紅色熒光、熒光強(qiáng)度為8級(jí)的活化微球液固定化氯霉素全抗原得的編碼微球試劑、氯霉素單克隆抗體和綠色熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的對(duì)應(yīng)氯霉素單克隆抗體的二抗探針發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，經(jīng)儀器進(jìn)行檢測(cè)繪制出氯霉素抗原質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
b.檢測(cè)樣品1)取100μL待測(cè)樣本提取液于離心管中，加入粒徑為3μm、紅色熒光、熒光強(qiáng)度為1級(jí)的活化微球液固定化鹽酸克倫特羅全抗原制得的編碼微球試劑30μL、粒徑為10μm、橙色熒光、熒光強(qiáng)度為8級(jí)的活化微球液固定化萊克多巴胺全抗原得的編碼微球試劑30μL及粒徑為3μm的紅色熒光，熒光強(qiáng)度為8級(jí)的活化微球液固定化氯霉素全抗原制得的編碼微球試劑30μL，再加入鹽酸克倫特羅單克隆抗體、萊克多巴胺特異性好的多克隆抗體及氯霉素單克隆抗體各3μL，避光搖振2小時(shí)使其發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，生成編碼微球-抗體復(fù)合物；2)將上述編碼微球-抗體復(fù)合物經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次用200μL PBS洗2次；3)再加入30μL綠色熒光量子點(diǎn)標(biāo)記對(duì)應(yīng)鹽酸克倫特羅單克隆抗體的二抗探針、30μL紅色熒光量子點(diǎn)標(biāo)記對(duì)應(yīng)萊克多巴胺多克隆抗體的二抗探針及30μL綠色熒光量子點(diǎn)標(biāo)記對(duì)應(yīng)氯霉素單克隆抗體的二抗探針，避光搖振1小時(shí)使其發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)生成編碼微球-抗體-熒光量子點(diǎn)二抗探針復(fù)合物；4)將上述編碼微球-抗體-熒光量子點(diǎn)二抗探針復(fù)合物經(jīng)3,000rpm離心20分鐘后棄廢液，每次用200μL PBS洗2次，轉(zhuǎn)入到流式細(xì)胞儀檢測(cè)試管中待測(cè)；5)上儀器進(jìn)行檢測(cè)，利用流式細(xì)胞儀中能對(duì)多種顏色同時(shí)分析，再利用儀器信號(hào)收集分析軟件，且由于鹽酸克倫特羅編碼微球的紅色熒光強(qiáng)度為1級(jí)與氯霉素編碼微球的8級(jí)紅色熒光強(qiáng)度不同，其在紅色熒光通道所收集的信號(hào)將是由2個(gè)不同的峰組成，對(duì)不同的峰作門(mén)即可得到2張不同的分別代表鹽酸克倫特羅及氯霉素由紅色熒光與綠色熒光所收集到的信號(hào)作出的雙參圖，由圖所得到的雙陽(yáng)性即判定是否結(jié)合上了鹽酸克倫特羅抗體或者氯霉素抗體，得到的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，以確定待測(cè)樣本提取液中鹽酸克倫特羅抗原及氯霉素抗原的質(zhì)量濃度，同時(shí)由于萊克多巴胺編碼微球的粒徑8μm與鹽酸克倫特羅編碼微球及氯霉素編碼微球粒徑3μm不同，且萊克多巴胺編碼微球的橙色熒光與鹽酸克倫特羅編碼微球及氯霉素編碼微球的紅色熒光不同所以可得到1張代表萊克多巴胺的由橙色熒光與紅色熒光所收集到的信號(hào)做出的雙參圖，由圖所得到的雙陽(yáng)性即判定是否結(jié)合上了萊克多巴胺，得到的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，以確定待測(cè)樣本提取液中萊克多巴胺抗原的質(zhì)量濃度；從而得到樣品的檢測(cè)結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備方法，其步驟如下1)制備編碼微球試劑(1)制備小分子化合物全抗原使小分子化合物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與牛血清蛋白或卵清蛋白載體進(jìn)行蛋白偶聯(lián)，得到小分子化合物全抗原；小分子化合物為孔雀石綠、結(jié)晶紫、鹽酸克倫特羅、氯霉素、萊克多巴胺、沙丁胺醇、硝基呋喃類獸藥代謝物、磺胺、鏈霉素、甲胺磷、對(duì)硫磷、甲萘威、甲霜靈或嗎啡之一；用分光光度計(jì)測(cè)定制備好的小分子化合物全抗原的濃度，用摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液稀釋到質(zhì)量濃度為1mg/ml；(2)配制磷酸鹽-氫氧化鈉緩沖溶液用當(dāng)量濃度為5N的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)摩爾濃度為0.1M的NaH2PO3水溶液的酸度，使pH＝6.0-6.5；(3)微球活化取1-5μL顆粒直徑為3-10μm、熒光顏色為紅、橙、黃或綠之一及熒光強(qiáng)度為1至8級(jí)之一的聚苯乙烯熒光微球，先放入超聲波清洗器中超聲30s，然后放入渦旋振蕩器中振蕩10s，再加入離心管中，再加入200-500μL上述磷酸鹽-氫氧化鈉緩沖溶液，混合均勻；經(jīng)3,000rpm離心20分鐘，倒掉廢液；然后每次用200μL磷酸鹽-氫氧化鈉緩沖溶液洗滌，洗滌2-3次，；再加入80-300μL上述磷酸鹽-氫氧化鈉緩沖溶液、5-20μL質(zhì)量濃度為50mg/ml的NHS和5-20μL質(zhì)量濃度為50mg/ml的EDC，避光搖振20min；經(jīng)3,000rpm離心20分鐘，倒掉廢液；然后每次用200μL摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的PBS洗滌，洗滌2-3次，再溶于50-300μL摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的PBS溶液中，得到活化微球液；(4)小分子化合物全抗原在微球上的固定化取上述活化微球液80-100μL，加入到離心管中，再加入10-20μL上述制備的質(zhì)量濃度為1mg/mL的小分子化合物全抗原，避光搖振0.5-2小時(shí)，經(jīng)3,000rpm離心20分鐘，倒掉廢液；得到已固定化小分子化合物全抗原的微球；(5)配制封閉液用摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的PBS溶解BSA使其重量百分比濃度為2-10％；再加入NaN3使重量百分比濃度為0.02-0.03％，混合均勻，得到封閉液；(6)已固定化小分子化合物全抗原的微球的封閉向上述已固定化小分子化合物全抗原的微球中加入200μL上述封閉液，然后放入渦旋振蕩器中振蕩10s，避光搖振1-2小時(shí)，于4℃放置10-15小時(shí)，使微球封閉；再每次用100-200μL封閉液洗，洗滌2次，用摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的PBS定容至100-200μL，即制得編碼微球試劑；2)制備小分子化合物抗體探針(1)制備熒光量子點(diǎn)抗體探針①基于上述小分子化合物全抗原，對(duì)小鼠或大鼠利用雜交瘤技術(shù)通過(guò)細(xì)胞融合，克隆篩選小分子化合物單克隆抗體；或者用制得的小分子化合物全抗原分別免疫兔、羊或雞，制備篩選特異性好的小分子化合物多克隆抗體；②用硫酸銨分級(jí)沉淀法和柱層析分離提純技術(shù)分別對(duì)上述小分子化合物單克隆抗體或小分子化合物多克隆抗體進(jìn)行純化，用分光光度計(jì)測(cè)定純化后小分子化合物單克隆抗體或小分子化合物多克隆抗體的質(zhì)量濃度；③制備熒光量子點(diǎn)抗體探針用摩爾濃度為0.1M、pH＝7.4的Na3PO4溶液溶解上述純化后的小分子化合物單克隆抗體或小分子化合物多克隆抗體，使其質(zhì)量濃度為10mg/mL，得到小分子化合物抗體溶液；取2mL小分子化合物抗體溶液，加入在水相合成的摩爾濃度為0.00125mol/L CdTe量子點(diǎn)溶液0.5-2mL，混合均勻后，再加入質(zhì)量濃度為0.6mg/ml的EDC1mL，將反應(yīng)體系用摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的Na3PO4溶液補(bǔ)足至5mL，室溫下避光反應(yīng)2h；在4℃條件下，用400mL摩爾濃度為0.01M的Na3PO4、摩爾濃度為0.15M的NaCl、pH 7.4的透析液對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行透析，透析袋截流量為10000-30000，每6h換一次透析液，共計(jì)30h；得到熒光量子點(diǎn)抗體探針；(2)制備熒光量子點(diǎn)二抗探針用抗小鼠、大鼠、兔、羊或雞之一IgG抗體替換上述小分子化合物的單克隆抗體或小分子化合物的特異性好的多克隆抗體，其余步驟按制備熒光量子點(diǎn)抗體探針的步驟操作，即可制得熒光量子點(diǎn)二抗探針；(3)制備熒光染料抗體探針PE或FITC熒光染料對(duì)上述小分子化合物的單克隆抗體或小分子化合物的特異性好的多克隆抗體，進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記步驟如下①抗體、PE或FITC的預(yù)處理a.將上述5mg小分子化合物的單克隆抗體或小分子化合物的特異性好的多克隆抗體每次用400ml含質(zhì)量百分比濃度為0.05％的NaN3，pH7.2、摩爾濃度為10mM的PBS緩沖液進(jìn)行透析，透析3-4次，其間更換緩沖液，每次透析時(shí)間為3-4小時(shí)，最后一次透析過(guò)夜；b.將5mg PE或FITC每次用400ml含摩爾濃度為50mM的NaH2PO4、摩爾濃度為2mM的EDTA、pH 7.0緩沖液進(jìn)行透析，透析3-4次，其間更換緩沖液，每次透析時(shí)間為3-4小時(shí)，最后一次透析過(guò)夜；c.上述透析后的抗體、PE或FITC分別經(jīng)10,000rpm，4℃離心10分鐘去除沉淀；用分光光度計(jì)分別測(cè)定抗體、PE或FITC的質(zhì)量濃度；②PE或FITC的衍生化a.取Sephadex G-25層析柱，用5倍柱床體積含摩爾濃度為50mM的MES、摩爾濃度為2mM的EDTA、pH 6.0的交換緩沖液平衡；b.按照每mg上述經(jīng)透析PE或FITC中加入10-13μL的摩爾濃度為10mg/mL的SMCC的DMSO溶液的比例加入SMCC，室溫避光搖振反應(yīng)60min；加入平衡后的Sephadex G-25層析柱中去除游離的SMCC，收集PE或FITC，得到衍生化的PE或FITC；用分光光度計(jì)測(cè)定衍生化的PE或FITC質(zhì)量濃度；③抗體的還原a.ephadex G-25層析柱用5倍柱床體積含摩爾濃度為50mM的MES、摩爾濃度為2mM的EDTA、pH 6.0的交換緩沖液平衡；b.按照每mL上述經(jīng)透析的抗體溶液中加入20μL的摩爾濃度為1M的DTT的比例加入DTT，室溫避光搖振反應(yīng)30min；加入平衡后的Sephadex G-25層析柱中去除游離的DTT，收集抗體部分，得到還原后的抗體；用分光光度計(jì)測(cè)定抗體質(zhì)量濃度；④PE或FITC和抗體的共價(jià)交聯(lián)a.將上述還原后的抗體按照1個(gè)IgG分子結(jié)合1-3個(gè)PE或FITC分子的比例逐滴加入到上述衍生化的PE或FITC中，邊加邊攪動(dòng)；室溫避光振蕩反應(yīng)2小時(shí)；得到PE-抗體或FITC-抗體；用分光光度計(jì)測(cè)定PE-抗體或FITC-抗體質(zhì)量濃度；b.向每mg上述PE-抗體或FITC-抗體中加入0.34μL摩爾濃度為10mg/mL的NEM的DMSO溶液的比例加入NEM進(jìn)行封閉，室溫避光搖振反應(yīng)20min；然后置蛋白截流量為30,000的濃縮器中濃縮；濃縮比為3-4∶1；⑤凝膠分離純化a.Sephacryl S-300層析柱用5倍柱床體積含摩爾濃度為10mM的PBS、摩爾濃度為1M的Urea尿素、質(zhì)量百分比濃度為0.05％的NaN3、pH7.2緩沖液平衡，其中柱體包裹錫箔紙進(jìn)行避光；b.利用經(jīng)緩沖液平衡的Sephacryl S-300層析柱對(duì)上述濃縮后的PE-抗體或FITC-抗體進(jìn)行純化，根據(jù)洗脫曲線收集合格的標(biāo)記產(chǎn)品，得到純化后的PE-抗體或FITC-抗體；c.將上述純化后的PE-抗體或FITC-抗體分別每次用400ml含質(zhì)量百分比濃度為0.05％的NaN3、pH7.4、摩爾濃度為100mM的PBS緩沖液進(jìn)行透析，透析3-4次，其間更換緩沖液，每次透析時(shí)間為3-4小時(shí)，最后一次透析過(guò)夜；然后置蛋白截流量為30,000的濃縮器中濃縮；濃縮比為3-4∶1，得到純化后的PE-抗體或FITC-抗體的濃縮液；d.將上述純化后的PE-抗體或FITC-抗體的濃縮液分別經(jīng)10,000rpm，4℃離心10分鐘去除沉淀，制得PE-抗體探針和FITC-抗體探針；(4)制備熒光染料二抗探針用抗小鼠、大鼠、兔、羊或雞之一IgG抗體替小分子化合物的單克隆抗體或特異性好的多克隆抗體，其余步驟按制備熒光染料抗體探針中步驟進(jìn)行操作，即可制得熒光染料二抗探針。
2.如權(quán)利要求1所述同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備方法，其特征在于，制備編碼微球試劑步驟中，其中第5步，使BSA的重量百分比濃度為5％-10％；其中第6步，每次用150μL-200μL封閉液洗2次。
3.如權(quán)利要求2所述同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備方法，其特征在于，制備熒光量子點(diǎn)抗體探針、熒光量子點(diǎn)二抗探針步驟中，加入在水相合成的摩爾濃度為0.00125mol/L CdTe量子點(diǎn)溶液1mL-2mL；透析袋蛋白截流量為20000-30000。
4.如權(quán)利要求3所述同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備方法，其特征在于，制備熒光染料抗體探針、熒光染料二抗探針步驟中，還原后的抗體按照1個(gè)IgG分子結(jié)合1-2個(gè)PE或FITC分子的比例逐滴加入；濃縮比例為3.5-4∶1。
5.如權(quán)利要求1-4之一所述同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備方法制備的同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑。
6.如權(quán)利要求1-4之一所述同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備方法制備的試劑，用于同步監(jiān)測(cè)多種小分子化合物的試劑盒組成如下1)檢測(cè)小分子化合物的試劑盒配如下試劑(1)需檢測(cè)的每種小分子化合物編碼微球試劑10mL，其中編碼微球之間至少粒徑、熒光顏色或熒光強(qiáng)度之一有區(qū)別；(2)需檢測(cè)的每種小分子化合物抗體熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針1mL；或需檢測(cè)的每種小分子化合物單克隆抗體或特異性好的多克隆抗體1mL、其對(duì)應(yīng)的二抗熒光量子點(diǎn)探針或熒光染料探針1mL；(3)需檢測(cè)的小分子化合物抗原標(biāo)準(zhǔn)濃度試劑各1ml；(4)PBS緩沖洗液200mL；2)其他標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1份；容量為1.5ml的離心管100個(gè)；量程分別為1-10μL、10-100μL、20-200μL移液槍各一把及配套槍頭各1000個(gè)；錫箔1卷、渦旋振蕩器1臺(tái)；離心機(jī)1臺(tái)、流式細(xì)胞儀1臺(tái)及流式細(xì)胞儀上樣用試管100個(gè)；
7.如權(quán)利要求1-4之一所述同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備方法制備的試劑的使用方法—同步檢測(cè)多種小分子化合物的方法，其步驟如下1)抗體探針直接法(1)分別取含有孔雀石綠、結(jié)晶紫、鹽酸克倫特羅、氯霉素、萊克多巴胺、沙丁胺醇、硝基呋喃類獸藥代謝物、磺胺、鏈霉素、甲胺磷、對(duì)硫磷、甲萘威、甲霜靈或嗎啡之一的待測(cè)小分子化合物的樣本提取液各100μL，加入離心管中，再分別加入與待測(cè)小分子化合物對(duì)應(yīng)的編碼微球試劑30-100μL，再分別加入待測(cè)小分子化合物的熒光量子點(diǎn)抗體探針或PE、FITC熒光抗體探針3-10μL，避光搖振0.5-2小時(shí)，使其發(fā)生免疫反應(yīng)，生成編碼微球-熒光量子點(diǎn)探針復(fù)合物或編碼微球-熒光染料抗體探針復(fù)合物；2)將上述編碼微球-熒光量子點(diǎn)探針復(fù)合物或編碼微球-熒光染料抗體探針復(fù)合物分別經(jīng)3,000rpm離心20分鐘，棄廢液，再分別每次用200μL PBS洗2次，送入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)；2)抗體探針間接法(1)分別取含有孔雀石綠、結(jié)晶紫、鹽酸克倫特羅、氯霉素、萊克多巴胺、沙丁胺醇、硝基呋喃類獸藥代謝物、磺胺、鏈霉素、甲胺磷、對(duì)硫磷、甲萘威、甲霜靈或嗎啡之一的待測(cè)小分子化合物的樣本提取液各100μL，加入離心管中，再分別加入與待測(cè)小分子化合物對(duì)應(yīng)的編碼微球試劑30-100μL，再分別加入待測(cè)小分子化合物的單克隆抗體或小分子化合物的特異性好的多克隆抗體3-10μL，避光搖振0.5-2小時(shí)，使其發(fā)生免疫反應(yīng)，生成編碼微球-抗體復(fù)合物；(2)將上述編碼微球-抗體復(fù)合物分別經(jīng)3,000rpm離心20分鐘，棄廢液，每次分別用200μL PBS洗2次，除去未與編碼微球試劑結(jié)合的抗體；再分別加入30-100μL待測(cè)小分子化合物的上述熒光量子點(diǎn)二抗探針或熒光染料二抗探針，避光搖振0.5-1小時(shí)使免疫反應(yīng)完全，生成編碼微球-抗體-熒光量子點(diǎn)二抗探針或編碼微球-抗體-熒光染料二抗探針復(fù)合物，送入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種同步檢測(cè)多種小分子化合物的試劑的制備方法及其使用方法。制備步驟如下制備編碼微球試劑；制備小分子化合物抗體探針－熒光量子點(diǎn)抗體探針、熒光量子點(diǎn)二抗探針、熒光染料抗體探針或熒光染料二抗探針之一。本發(fā)明的使用方法——檢測(cè)小分子化合物的方法抗體探針直接法、抗體探針間接法。采用本發(fā)明制備的試劑或本發(fā)明提供的試劑盒可用于食品、農(nóng)產(chǎn)品、活體動(dòng)物及人體中獸藥、農(nóng)藥、違禁藥物、濫用藥物等中的小分子化合物的檢測(cè)，重復(fù)性好、靈敏度高；簡(jiǎn)便、快速、能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)；試劑耗量小，測(cè)試成本低廉；可多靶標(biāo)同步分析；易于普及推廣；從而達(dá)到對(duì)危害物質(zhì)能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和監(jiān)控管理。
文檔編號(hào)G01N33/544GK1945331SQ20061011390
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2006年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月20日
發(fā)明者鄒明強(qiáng), 李錦豐, 高海霞 申請(qǐng)人:鄒明強(qiáng)