專利名稱：：表面等離子體共振的生物傳感器的生物芯片、制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片、制備方法及應(yīng)用，所提供的芯片主要用于研究類胰島素等酪氨酸激酶受體與細(xì)胞內(nèi)上游信號(hào)蛋白相互作用動(dòng)力學(xué)，以及激酶抑制劑對(duì)相互作用影響。屬于蛋白質(zhì)生物芯片領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞表面受體與其下游信號(hào)蛋白的相互作用傳統(tǒng)的研究方法有免疫沉淀、蛋白印跡及酵母雙雜交。免疫沉淀及免疫印跡依靠與信號(hào)蛋白或受體結(jié)合的抗體特異性，其靈敏度度低，不足以進(jìn)行蛋白間微弱相互作用的檢測(cè)。酵母雙雜交已用于研究胰島素/類胰島素受體(IR/IGF-1R)與其信號(hào)蛋白間的相互作用，此法比免疫印跡靈敏，蛋白間微弱的相互作用即可激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，但不能給出定量信息，如膜受體與胞外配體或胞內(nèi)受體結(jié)合蛋白及底物因缺乏相應(yīng)的方法而不能獲得其相互作用的動(dòng)力學(xué)及熱力學(xué)特征常數(shù)。而且，由于信號(hào)的產(chǎn)生依賴于酵母的轉(zhuǎn)錄與翻譯系統(tǒng)，不能排除酵母系統(tǒng)本身對(duì)蛋白相互作用的影響。目前表面等離子體共振生物傳感器已廣泛應(yīng)用于生物及醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，包括抗原決定組定位(epitopemapping),蛋白-DNA相互作用，藥物篩選等。并應(yīng)用于類胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中上游信號(hào)蛋白的相互作用，例如類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-1)與IGF-1結(jié)合蛋白相互作用?；诒砻娴入x子體的胰島素底物(IRS-1)多肽片斷與PI3K相互作用用于胰島素受體拮抗劑篩選，抗體修飾的表面用于從細(xì)胞裂解液中直接捕獲表面生長(zhǎng)因子受體，直接用來(lái)研究PDGF受體與其胞外配體的相互作用。
發(fā)明內(nèi)容為克服傳統(tǒng)方法研究類胰島素受體與胞內(nèi)蛋白相互作用非實(shí)時(shí)性及復(fù)雜性，本發(fā)明基于表面等離子體生物傳感器的CM5芯片，采用抗體捕獲的方法制備了類胰島素受體(IGF-1R)的蛋白質(zhì)芯片并用此芯片研究IGF-1R和與其直接相互作用信號(hào)蛋白間相互作用。本發(fā)明的目的是提供一種研究細(xì)胞表面受體與其信號(hào)蛋白分子和抑制劑相互作用的實(shí)時(shí)檢測(cè)的蛋白芯片、制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的細(xì)胞表面受體蛋白芯片的構(gòu)成有是在玻璃基底上有金表面鍍膜，金表面膜上固定有葡聚糖凝膠層，在葡聚糖凝膠層上固定單克隆抗體，通過(guò)抗體捕獲并固定表面受體。固定的受體分子可以用SPR直接觀察受體與信號(hào)分子相互作用，以及抑制劑對(duì)該相互作用的影響。SPR能檢測(cè)傳感片表面的折射率變化，當(dāng)P偏振光從金屬表面一側(cè)的光密介質(zhì)射向光疏介質(zhì)時(shí)，某一角度的反射光呈明顯的暗帶，此角度(SPR共振角)主要依賴于傳感片表面的物質(zhì)的質(zhì)量；當(dāng)生物分子結(jié)合到傳感片表面或傳感片表面物質(zhì)量發(fā)生變化時(shí)，其共振角將發(fā)生變化(見(jiàn)圖l.從I到II的變化)，共振角的變化可通過(guò)觀察共振信號(hào)隨時(shí)間變化的函數(shù)(與質(zhì)量變化呈正比)可進(jìn)行無(wú)侵入性實(shí)時(shí)性觀測(cè)?？诡愐葝u素受體beta亞基的單克隆抗體固定于CM5芯片表面，制成類胰島素受體(IGF-1R)的蛋白質(zhì)芯片，來(lái)捕獲過(guò)表達(dá)人細(xì)胞裂解液中類胰島素受體，然后利用此芯片研究并比較IGF-1R與胞內(nèi)各信號(hào)蛋白質(zhì)相互作用動(dòng)力學(xué)常數(shù)。所述的抗類胰島素受體Beta亞基的單克隆抗體是NeoMarkers公司的MS-641-PIABX或MS-641-PABX，其緩沖液中不含一級(jí)胺，如Tri-HCl和穩(wěn)定劑牛血清白蛋白，且其固定量在1000-2000RU，并根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，固定量作以調(diào)整，或用Calbiochem公司的抗類胰島素受體Beta亞基的單克隆抗體Ab-l，目錄號(hào)GR11L，因含有1:1BSA，固定量相應(yīng)加大至3000-5000RU，并根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康墓潭孔饕哉{(diào)整；所述的來(lái)捕獲IGF-1R表達(dá)細(xì)胞裂解液中類胰島素受體的特征是直徑10mm平皿鋪滿80%的過(guò)表達(dá)重組人源IGF-1R的細(xì)胞需500pL裂解液，順序12，000轉(zhuǎn)高速離心15分鐘和70，000轉(zhuǎn)超速離心30分鐘，制備含有過(guò)表達(dá)的類胰島素受體的細(xì)胞裂解液上清液，此上清液70jxL直接通過(guò)固定有抗體的CM5表面7分鐘，IGF-1R固定量一般為600-800RU;用此表面研究并比較胞內(nèi)與IGF-1R直接相互作用的各信號(hào)蛋白與IGF-1R相互作用動(dòng)力學(xué)常數(shù)，其特征是文獻(xiàn)査詢得到IGF-1R與IRS-1，SHC，PI3K，GRB2具有直接相互作用，用含重組IRS-1,SHC,PI3-K或GRB2的HBS-EP流動(dòng)液通過(guò)捕獲有IGF-1R的蛋白質(zhì)芯片表面，研究并比較IRS-1，SHC,PI3-K，GRB2與IGF-1R的Ka,Kd,KD，KA的相互作用動(dòng)力學(xué)常數(shù)，此芯片用含0.5。/。SDS的lOmMNaOH溶液再生去掉IGF-lR，用來(lái)重新捕獲過(guò)表達(dá)IGF-1R細(xì)胞裂解液中的IGF-1R。本發(fā)明所述的基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片，制作具體步驟是1、抗類胰島素受體beta亞基的單克隆抗體固定于CM5芯片按照標(biāo)準(zhǔn)的EDC/NHS化學(xué)處理過(guò)程固定抗體于CM5芯片上(BIAcore公司產(chǎn)品)2、細(xì)胞培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)。對(duì)照組細(xì)胞的培養(yǎng)基中不加G418，實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)組一致。3、細(xì)胞裂解及含IGF-1R細(xì)胞膜裂解片收獲當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到鋪滿平皿時(shí)，500ul/平皿收獲，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，超速離心，上清液即細(xì)胞裂解液低溫保存。4、基于表面等離子體生物傳感器的IGF-1R和IRS-1相互作用的實(shí)驗(yàn)方法步驟①抗體捕獲標(biāo)準(zhǔn)的氨基固定方法(見(jiàn)www.biacore.com)，用0.2MEDC/0.05MNHS作用CM5芯片(研究級(jí))，激活表面羧基。②抗IGF-1Ralpha亞基單克隆抗體，作用表面，抗體通過(guò)氨基與CM5芯片表面激活的羧基共價(jià)鍵合。③過(guò)表達(dá)IGF-1R的細(xì)胞裂解液作用于固定有抗體的表面，除去非特異性結(jié)合的蛋白，基線達(dá)到穩(wěn)定。此捕獲的IGF-1R可用來(lái)研究IGF-1R與不同純度的純化的胞內(nèi)各信號(hào)蛋白相互作用。⑤每一輪后，芯片表面再生，以備下一次實(shí)驗(yàn)。5、動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的分析根據(jù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，可得出IGF—1R與胞內(nèi)各信號(hào)蛋白相互作用的結(jié)合速率常數(shù)(Ka)解離速率常數(shù)(Kd)、結(jié)合常數(shù)(KA)和解離常數(shù)(KD)等參數(shù)。本發(fā)明的有益效果在于從細(xì)胞裂解物中實(shí)時(shí)獲得芯片上受體蛋白與信號(hào)分子的相互作用信息，不需要對(duì)受體蛋白進(jìn)行復(fù)雜的分離純化和標(biāo)記。既可以測(cè)量受體蛋白與胞外上游信號(hào)分子相互作用，也可以測(cè)量受體蛋白與胞內(nèi)下游信號(hào)分子相互作用。本發(fā)明有望用于抗癌藥物的篩選，以及對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中類胰島素受體半定量分析。本發(fā)明所述的實(shí)施例是以類胰島素受體(IGF-1R)的蛋白質(zhì)芯片并用此芯片研究IGF-1R和與其直接相互作用信號(hào)蛋白間相互作用，以對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。圖1是表面等離子體共振生物傳感器原理圖(a)和共振信號(hào)發(fā)生的變化(b)圖1中l(wèi).玻璃基底層，2.金表面膜，3.葡聚糖凝膠層，4.消減波，5.樣品液，6.棱鏡，7.入射偏振光，8.入射角，9.反射偏振光及反射光偏離角度隨衰減波的折射率而變化后的反射偏振光。插圖ii中，橫坐標(biāo)t表示時(shí)間，縱坐標(biāo)Ru為共振單位，1000RU相當(dāng)于lng/ml圖2是基于表面等離子體生物傳感器的受體芯片結(jié)構(gòu)(a)及(a)中A區(qū)域放大A，A圖為葡聚糖凝膠表面的放大圖2中l(wèi).玻璃基底層，2.金表面膜，3.葡聚糖凝膠表面；14.抗表面受體胞外亞基(或胞內(nèi)亞基)的單克隆抗體；15.表面受體胞外亞基(或胞內(nèi)亞基)，16.表面受體胞內(nèi)亞基(或胞外亞基)，17.受體胞內(nèi)(或胞外)信號(hào)分子，18.其它信號(hào)分子或抑制劑；其中玻璃層，金膜和葡聚糖凝層是芯片表面從入射光面到流動(dòng)室的三層結(jié)構(gòu)。圖3利用本發(fā)明制備的受體芯片與下游信號(hào)分子的相互作用過(guò)程的傳感圖。(a)為固定在芯片表面的受體是IGF-1R，與流過(guò)表面的溶液中不同濃度IRS-1相互作用，其中a，b，c代表IRS-l的不同濃度分別為1.0nM,0.25nM，0.1nM。(b)為用1:1langmuir結(jié)合加基線平移模型擬和的結(jié)果，其中Chi2即5c2為0.414。躺錢(qián)誠(chéng)下面通過(guò)具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著性進(jìn)步，但本發(fā)明決非僅局限于實(shí)施例。實(shí)施例本發(fā)明所述的芯片制備步驟是①按標(biāo)準(zhǔn)的EDC/NHS化學(xué)處理過(guò)程固定抗體于研究級(jí)CM5芯片上。②細(xì)胞培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組即過(guò)表達(dá)人源重組IGF-1R的NIH3T3細(xì)胞(從NationalinstituteofDiabetesandDigestiveandKidneydisease,NIH,Bethesda，MA，USA獲得)，培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基并含10%胎牛血清、100ug/ml青霉素、100單位/ml的硫酸鏈霉素及500ug/ml的G-418。除培養(yǎng)基不含G-418外對(duì)照組細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)條件相同。兩種細(xì)胞系均用直徑10毫米的培養(yǎng)皿并在95%空氣和5%二氧化碳，37。C條件下培養(yǎng)。③細(xì)胞裂解及含IGF-IR細(xì)胞膜裂解片收獲-細(xì)胞裂解液成分為1%TritonX-100,20mMHEPES,150mMNaCl，1mMEGTA，pH7.4,新鮮加入正釩酸鈉Na3V04和(phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)分別至1mM和0.5mM,及按抑制劑說(shuō)明書(shū)加入Proteaseinhibitorcocktailtablet(目錄號(hào):11836153001)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到鋪滿平皿時(shí)，500ul/平皿收獲，具體量可雖細(xì)胞密度不同調(diào)整，并用細(xì)胞刮刀刮到平皿的一角，再用移液槍頭轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解液到1.5ml的Eppendorf管中，整個(gè)操作都在冰上進(jìn)行。細(xì)胞裂解液順序在4攝氏度，12，000轉(zhuǎn)高速離心15分鐘(高速離心機(jī)eppendorfcentrifiige5810R)，70，000轉(zhuǎn)(超速離心機(jī)HITACHI公司的GXserieshimacCS150GXL)超速離心30分鐘。④基于表面等離子體生物傳感器的IGF-1R和IRS-1相互作用的實(shí)驗(yàn)使用方法的步驟為a)抗體捕獲標(biāo)準(zhǔn)的氨基固定方法(見(jiàn)www.biacore.com)，即0.2MEDC/0.05MNHS作用CM5芯片(研究級(jí))表面7分鐘，激活表面羧基。b)抗IGF-lRalpha亞基單克隆抗體20-100ug/ml[目錄號(hào)MS-641-PIABX或MS-641-PABX]抗體溶液中不能含有Tris-HCl等一級(jí)胺及牛血清白蛋白或白明膠等作為穩(wěn)定劑的保存蛋白]，流過(guò)表面7分鐘，抗體通過(guò)氨基與CM5芯片表面激活的羧基共價(jià)鍵合，固定量為2000-10000RU。c)過(guò)表達(dá)IGF-1R的細(xì)胞裂解液70ul通過(guò)固定有抗體的表面7分鐘，HBS-EP溶液通過(guò)此表面平衡一個(gè)小時(shí)左右，沖掉非特異性結(jié)合的蛋白，基線達(dá)到穩(wěn)定，捕獲到600-800RU左右的類胰島素受體(IGF-1R)。d)此捕獲的IGF-1R可用來(lái)研究IGF-1R與胞內(nèi)各信號(hào)蛋白相互作用，不同濃度的純化的胞內(nèi)信號(hào)蛋白通過(guò)芯片表面150s-300s。e)每一輪實(shí)驗(yàn)后，芯片表面用含0.1。/。SDS的HBS-EP溶液再生30秒，以上實(shí)驗(yàn)步驟除非特別說(shuō)明，都是在25。C，流速5pl/min。⑤動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的分析根據(jù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，結(jié)合軟件模擬分析，可得出IGF—1R與胞內(nèi)各信號(hào)蛋白相互作用的結(jié)合速率常數(shù)(Ka)解離速率常數(shù)(Kd)、結(jié)合常數(shù)(KA)和解離常數(shù)(KD)等參數(shù)(見(jiàn)表l，圖3)。表1是圖3(傳感圖)經(jīng)1:1langmuir結(jié)合加基線平移模型擬和后所得到IGFR-1與IRS-1相互作用的結(jié)合速率常數(shù)(Ka)解離速率常數(shù)(Kd)、結(jié)合常數(shù)(KA)和解離常數(shù)(KD)等參數(shù)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本實(shí)施例是以類胰島素受體為例，制備的類胰島素受體芯片可用于IGF-1R與其直接相互作用胞內(nèi)信號(hào)蛋白的研究，如IGF-1R與IRS-1，IGF-1R與SHC,IGF-1R與PI3K,IGF-1R與GRB2相互作用，本實(shí)施例所述的方法也可以用于其它表面受體例如胰島素受體、雌激素受體等，與其信號(hào)分子、抑制劑等相互作用和藥物篩選工作。改用其他抗跨受體胞內(nèi)部分抗體，可用于表面受體與其胞外信號(hào)分子相互作用蛋白的結(jié)合解離過(guò)程動(dòng)力學(xué)研究。權(quán)利要求1、一種基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片，其特征在于所述的芯片在玻璃基底上有金表面鍍膜，金表面上固定有葡聚糖凝膠層，在葡聚糖凝膠層上固定抗類胰島素受體Beta亞基的單克隆抗體，通過(guò)抗體捕獲并固定表面受體。2、按權(quán)利要求1所述的基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片，其特征在于抗類胰島素受體Beta亞基的單克隆抗體是NeoMarkers公司的MS-641-PIABX或MS-641-PABX，其緩沖液中不含一級(jí)胺，且其固定量在1000-2000RU,或用Calbiochem公司的抗類胰島素受體Beta亞基的單克隆抗體Ab-l，固定量為3000-5000RU。3、制備如權(quán)利要求1所述的基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片，其特征在于抗類胰島素受體Beta亞基的單克隆抗體，采用抗體捕獲的方法，固定于基于表面等離子體生物傳感器的CM5芯片表面，制成類胰島素受體的蛋白質(zhì)芯片，具體步驟是①抗類胰島素受體beta亞基的單克隆抗體固定于CM5芯片按照標(biāo)準(zhǔn)的EDC/NHS化學(xué)處理過(guò)程固定抗體于CM5芯片上；②細(xì)胞培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，對(duì)照組細(xì)胞的培養(yǎng)基中不加G418，實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)組一致；③細(xì)胞裂解及含IGF-1R細(xì)胞膜裂解片收獲當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到鋪滿平皿時(shí)，500ul/平皿收獲，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，超速離心，上清液即細(xì)胞裂解液低溫保存。4、按權(quán)利要求3所述的基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片的制備方法，其特征在于實(shí)驗(yàn)組即過(guò)表達(dá)人源重組IGF-1R的NIH3T3細(xì)胞的培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基并含10')/。胎牛血清、100ug/ml青霉素、100單位/ml的硫酸鏈霉素及500ug/ml的G-418，除培養(yǎng)基不含G-418外對(duì)照組細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)條件相同；兩種細(xì)胞系均用直徑10毫米的培養(yǎng)皿并在95%空氣和5%二氧化碳，37"C條件下培養(yǎng)。5、按權(quán)利要求4所述的基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片的制備方法，其特征在于所述的IGF-1R表達(dá)細(xì)胞裂解液中類胰島素受體的直徑10mm平皿鋪滿80%的過(guò)表達(dá)重組人源IGF-1R的細(xì)胞需500pL裂解液，順序12，OOO轉(zhuǎn)高速離心15分鐘和70，000轉(zhuǎn)超速離心30分鐘，制備含有過(guò)表達(dá)的類胰島素受體的細(xì)胞裂解液上清液，所述的上清液直接通過(guò)固定有抗體的CM5表面，IGF-1R的固定量為600-800RU。6、使用由權(quán)利要求1所述的基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片的方法，其特征在于基于表面等離子體生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片IGF-1R和IRS-1相互作用的方法步驟為①抗體捕獲標(biāo)準(zhǔn)的氨基固定方法，用0.2MEDC/0.05MNHS作用CM5芯片，激活表面羧基。②抗IGF-1Ralpha亞基單克隆抗體，作用表面，抗體通過(guò)氨基與CM5芯片表面激活的羧基共價(jià)鍵合；③過(guò)表達(dá)IGF-1R的細(xì)胞裂解液作用于固定有抗體的表面，除去非特異性結(jié)合的蛋白，基線達(dá)到穩(wěn)定；④此捕獲的IGF-1R可用于研究IGF-1R與不同純度的純化的胞內(nèi)各信號(hào)蛋白相互作用；◎每一輪實(shí)驗(yàn)后，芯片表面再生，以備下一次實(shí)驗(yàn)。7、按權(quán)利要求6所述的基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片的使用方法，其特征在于所述CM5芯片為研究級(jí)，作用表面時(shí)間為7分鐘。8、按權(quán)利要求6所述的基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片的使用方法，其特征在于所述的IGF-1Ralpha亞基單克隆抗體濃度為20-100ug/ml，作用表面7分鐘；且共價(jià)鍵合固定量為2000-10000RU。9、按權(quán)利要求6所述的基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片的使用方法，其特征在于①過(guò)表達(dá)IGF-1R的細(xì)胞裂解液作用于固定有抗體的表面為7分鐘基線達(dá)到穩(wěn)定，捕獲到600-800RU的IGF-1R類胰島素受體；②所述的不同濃度的純化的胞內(nèi)信號(hào)蛋白通過(guò)芯片表面150s-300s;③芯片表面用含0.P/。SDS的HBS-EP溶液再生30秒。10、使用權(quán)利要求1所述的基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片的方法，其特征在于還適用于IGF-1R與SHC，IGF-1R與PI3K,IGF-1R與GRB2的相互作用。全文摘要本發(fā)明涉及一種基于表面等離子體共振生物傳感器的細(xì)胞表面受體生物芯片、制備方法及應(yīng)用，其特征在于所述的芯片在玻璃基底上有金表面鍍膜，金表面上固定有葡聚糖凝膠層，在葡聚糖凝膠層上固定抗類胰島素受體Beta亞基的單克隆抗體，通過(guò)抗體捕獲并固定表面受體。制備方法是抗類胰島素受體Beta亞基的單克隆抗體，采用抗體捕獲的方法，固定于基于表面等離子體生物傳感器的CM5芯片表面，制成類胰島素受體的蛋白質(zhì)芯片，所制作的芯片適用于IGF-1R與IRS-1、SHC、PI3K或GRB2的相互作用，有望用于抗癌藥物的篩選。文檔編號(hào)G01N33/543GK101303354SQ20061011936公開(kāi)日2008年11月12日申請(qǐng)日期2006年12月8日優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日發(fā)明者曹慧敏,李雪嶺,楊夢(mèng)蘇,趙建龍,黃明輝申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所;香港城市大學(xué)深圳研究院