專利名稱：一種臨床質(zhì)譜診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的生物樣品中蛋白質(zhì)分析方法的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及試劑盒。一種通過能與 蛋白質(zhì)結(jié)合的基質(zhì)去捕獲生物標(biāo)志，并用有定量控制的質(zhì)譜分析來檢溯生物標(biāo)志。在此 提及的此項(xiàng)發(fā)明涉及蛋白質(zhì)檢測領(lǐng)域，為一種新的非侵入性的體外質(zhì)譜檢測方法。本發(fā)明 可以應(yīng)用到已經(jīng)脫離人體的體液中的生物標(biāo)志組合的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測方法或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)試劑盒開發(fā)。背衆(zhòng)技術(shù)隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和完成，科學(xué)家們提出了后基因組(post-gen咖e)計(jì)劃的 概念，研究要點(diǎn)轉(zhuǎn)移到功能基因組學(xué)上，而生物功能主要體現(xiàn)物質(zhì)是蛋白質(zhì)。1994年， 澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams肖'先提出蛋白質(zhì)組(proteorae)的概念， 指的是"一種基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)"，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部 蛋白質(zhì)。對于蛋白質(zhì)組的研究是功能基因組學(xué)研究的核心，稱為蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)。 蛋白質(zhì)組學(xué)被認(rèn)為是后基R組研究中最主要的部分。與基因組相比，蛋白質(zhì)組的組成更復(fù) 雜，功能更活躍，應(yīng)用前景更廣泛。蛋白質(zhì)組學(xué)從細(xì)胞整體水平進(jìn)行蛋白質(zhì)屬性的研究， 如表達(dá)水平、翻譯后修飾及相互作用等，并由此獲得對于疾病過程、細(xì)胞生理生化特征和 調(diào)控M絡(luò)的廣泛完整的認(rèn)識。所以，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)正在逐步成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及制藥學(xué) 等的重要研究手段。不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功 能。閔此，鑒定人體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本診斷及篩査，并最終用 于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì) 胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的 方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列鑒定分析。 用質(zhì)譜聯(lián)合可克撒這一技術(shù)缺點(diǎn)。血液，由于易采集性和對機(jī)體的生理狀況的易記錄性，成為研究生物標(biāo)記物的最好的 來源之一。蛋白指紋圖譜(質(zhì)譜)技術(shù)(MALDI-T0F-MS、 SELDI-TOF-MS)是近幾年發(fā)展起 來的實(shí)驗(yàn)室診斷新技術(shù)，它且具有操作較簡便、多樣本檢測、檢測快速、靈敏性和特異性
高等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)紫診斷技術(shù)革命性的進(jìn)展。蛋白指紋圖譜技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，主要 用于多種疾病，特別是腫瘤的早期診斷。蛋白指紋圖譜技術(shù)是一項(xiàng)發(fā)展前景非常好的診斷 技術(shù)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。使用蛋白指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)成為研究比較蛋白質(zhì)組學(xué)和 發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物可選用的方法，尤其在多肽及低分子量蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的研究中非常有 用。但是，我們在進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)沒有一個(gè)臨床質(zhì)譜診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的試 劑盒。血液樣本離體后如不及對分離血清(漿)，對結(jié)果影響很大，因而及時(shí)分離血清(漿) 成為實(shí)驗(yàn)的首要保障。接下來便是血清(漿)樣本的質(zhì)量和保存的穩(wěn)定性問題了，這對一 些外院或外地送檢的樣本顯得尤其重要。然而，很少有人就血清樣本的收集過程對研究蛋 白質(zhì)組的影響做過深入的研究，為此，以下用基于蛋白指紋圖譜技術(shù)的方法，對標(biāo)本的處 理和血液不同儲存條件等因素導(dǎo)致血液中蛋白質(zhì)質(zhì)譜的影響做了系統(tǒng)的分析。國家高技術(shù) 研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)在2006年已將人類重要生物標(biāo)志物圖譜的實(shí)驗(yàn)確證和分析技 術(shù)研究列為國家目標(biāo)導(dǎo)向類專題課題。研究血清(漿)樣品分離、多肽圖譜快速掃描和疾 病特征峰測序等系列用于惡性腫瘤血清標(biāo)志物圖譜發(fā)現(xiàn)的質(zhì)譜診斷關(guān)鍵技術(shù)，創(chuàng)建具有自 主知識產(chǎn)權(quán)的健康人群和3-4種我國常見惡性腫瘤人群"血清質(zhì)譜多肽屈譜"的任務(wù)即 將拉開戰(zhàn)幕。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種在生物樣品中檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法。'該方法為疾病的早期檢 測提供了新的途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明涉及一種通過生物標(biāo)志結(jié)合的基質(zhì)表面，并用定量性質(zhì)譜分析來同時(shí)檢測多種 生物標(biāo)志狀態(tài)。本發(fā)明中的生物標(biāo)志是利用一臺質(zhì)譜儀來發(fā)現(xiàn)的。該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為+/-0. 1%。 基質(zhì)是任何能與生物標(biāo)志選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)。舉例說明，WCX陰離子，SAX 陽離子，C8/C18疏水作用基質(zhì)吸附劑，分離生物化學(xué)中的這些方法和由這些方法產(chǎn)生的 吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質(zhì)，配位共價(jià)金屬螯合劑上 滯留說明多肽分析物內(nèi)存在組氨酸殘基)。底基洗去未吸附的物質(zhì)。任何適宜的洗液均可 使用。生物標(biāo)志首先能夠被具有能與生物標(biāo)志物結(jié)合基質(zhì)吸附表面捕獲，非吸附物能從基質(zhì) 上洗脫，吸附到底基的生物標(biāo)志物在質(zhì)譜儀中被檢測。生物標(biāo)志通過離子發(fā)生源，如激
光，被離子化，產(chǎn)生的離子被一個(gè)離子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分柝那些通過的 離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控-每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091. 1Da 或6634.0 Da強(qiáng)度調(diào)至50先質(zhì)譜信號強(qiáng)度的最大值。生物標(biāo)志的檢測明顯地將與信號強(qiáng)度 的檢測有關(guān)。這樣，生物標(biāo)志的數(shù)量與質(zhì)量都可以被檢測出來。飛行質(zhì)譜對待分析物的分析生成飛行時(shí)間譜。該飛行時(shí)間譜的最終分析并不表示離子 化能量攻擊一個(gè)樣本產(chǎn)生的單獨(dú)的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了千 擾，并增加了動態(tài)范圍。該飛行時(shí)間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包 括轉(zhuǎn)換飛行時(shí)間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而 減輕高頻噪音。通過對生物標(biāo)志的吸附和檢測而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)分析程序進(jìn)行分析。 該計(jì)算機(jī)程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測出的生物標(biāo)志的數(shù)量，并顯示信號的強(qiáng)度和確定被 檢測的每個(gè)生物標(biāo)志的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定生物標(biāo)志的信號強(qiáng)度和矯 正數(shù)據(jù)對預(yù)定統(tǒng)計(jì)分布狀態(tài)的偏離。例如，通過計(jì)算與某些參數(shù)相關(guān)的每個(gè)峰值的髙度， 可規(guī)范觀測到的峰。該參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學(xué)成分產(chǎn)生的不重要的 T擾，這可以設(shè)置調(diào)零。計(jì)算機(jī)可以將計(jì)算結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式來表現(xiàn)。其標(biāo)準(zhǔn)譜可以表示，但在一種形 式中只有峰高和質(zhì)量信息可以在譜帶中保留，產(chǎn)生一個(gè)較清晰的圖，并使具有幾乎相同分 子量的生物標(biāo)志物更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個(gè)或更多的譜比較，便于突顯獨(dú)特的生 物標(biāo)志物和那些高于或低于校準(zhǔn)樣本的生物標(biāo)志物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進(jìn)行選 擇，軟件是可用的，它可自動檢測峰。 一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于 一個(gè)選擇閾值并標(biāo)記出在峰信號的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個(gè)有效的程序 中，比較許多譜錢以認(rèn)定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個(gè)版本 聚集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的 峰指定一個(gè)質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。發(fā)明中使用的生物標(biāo)志是基質(zhì)所捕。這些生物標(biāo)記是進(jìn)一步通過質(zhì)譜(mass spectrometry)測定其不同分子量來知道它們特定的身份。對生物標(biāo)志的檢測需要將一個(gè)樣本放基質(zhì)的一個(gè)吸附點(diǎn)上，接著進(jìn)行清洗-電噴1^電 離質(zhì)譜(electrospray ionizsation mass spectrometry, ESI-MS) ;fe在毛細(xì)管的出口處 施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著裕劑 蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致 使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相?；|(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (matrix-assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)的基本原理是向吸附點(diǎn)上加入SINAPINIC酸等并讓其干燥，將分析物分散 在分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能 量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使連同分析物一起進(jìn)入氣相。而后，用質(zhì)譜 測定法對基質(zhì)進(jìn)行分析，而一個(gè)顯示了蛋白質(zhì)分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質(zhì) 分子的質(zhì)量-電荷比的基礎(chǔ)上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。然而，如果有必要，這些生物標(biāo)志也可通過，比如，確定多肽的氨基酸序列來進(jìn)行鑒 別。在蛋白質(zhì)化學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，為了增加蛋白質(zhì)鑒定的可信度，獲得一段蛋白 質(zhì)肽片段內(nèi)部序列信息通常是非常重要的。對于蛋白質(zhì)及多肽的序列測定，傳統(tǒng)的方 法是采用Edman降解方法，而該方法最大的不足之處在于費(fèi)時(shí)太長(一個(gè)殘基需花費(fèi) 30-40分鐘)。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，尤其是多級質(zhì)譜(MS/MS)以及源后 裂解(PSD)等技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用質(zhì)譜測序已成為一種流行的方法。例如， 一個(gè)生物標(biāo)志能用許多酶描繪出來，例如V8蛋白酶(V8 protease)或胰蛋白 酶，而且消化片段(digestion fragments)的分子量可被用來在數(shù)據(jù)庫中搜索序列，這 些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合?；蛘?，如果此生物標(biāo)志不是己知數(shù)鋸 庫中的蛋白質(zhì)分子，在生物標(biāo)志的N極氨基酸序列(N-terminal Amino Acid Sequence) 的基礎(chǔ)上，可使用降解探針，而后，這些探針會被用來描繪由探測到了生物標(biāo)志的樣本所 生成的基閑組或cDNA庫。最后，蛋白質(zhì)生物標(biāo)志可用蛋白質(zhì)梯狀排序法(protein ladder sequencing)進(jìn)行排序。通過將分子碎成碎片并將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片 末端除去一個(gè)單個(gè)氨基酸分子的方法進(jìn)行處理后，可生成蛋白質(zhì)梯度(protein ladders)。 然后，用質(zhì)譜對此梯度進(jìn)行分析。階梯狀碎片(ladder fragments)在質(zhì)量上的差異可鑒 別出從分子末端被除去的氨基酸。閑此，本發(fā)明可以用于生物標(biāo)志鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。特異性是指某一物質(zhì)或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質(zhì)或某種疾病的特征。 通過某些特征可以識別某種物質(zhì)或某種疾病，從而把它和其他物質(zhì)或疾病區(qū)分開來。對專 有特征的識別往往依賴于特殊的檢測方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就 要用有關(guān)特異性抗體來檢測。自蛋白質(zhì)組學(xué)研究有新發(fā)展以來，這種傳統(tǒng)意義上特異性檢 測和界定方法有了很大的突破。如一個(gè)蛋白質(zhì)不同片段變異是不同類型腫癯的標(biāo)志。
本發(fā)明利用WCX陰離子基質(zhì)及利用C8/C18疏水基質(zhì)芯片/磁珠為例對正常人血清(漿) 進(jìn)行蛋白質(zhì)對比分析。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì) 控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091. 1Da或6634.0 Da強(qiáng)度 調(diào)至50%質(zhì)譜信號強(qiáng)度的最大值。一種臨床質(zhì)譜診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的試劑盒和方法的具體操作步驟 以下是用本發(fā)明提供的一個(gè)操作方案及試劑盒實(shí)例。1. 樣品處理及標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備 將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中，視需要離心澄清樣品。質(zhì)潛的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備定義符合如下標(biāo)準(zhǔn)供血者10人，5男5女，血 型為O型年齡為18-30歲；民族漢。生化指標(biāo)正常，包括總膽同醇、甘油二酯、空 腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢查、腎功檢查；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女 性不能懷孕，男性為不吸煙者。2. 基質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備、樣品上樣抽取O型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液(a) 4'C下待血液凝圃后馬上離 心，4'C離心5min。 (b) 4。C下馬上離心，4'C離心5min分離血漿。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì) 控血清(漿)樣品分裝lOOpl—小管，于一8(TC儲存；或取混合血清(漿)1:2稀釋于U9 緩沖液(9MUrea， 2%CHAPS， 50mM Tris-HCL， pH9.0) —小管，25'C儲存。即成為標(biāo)準(zhǔn)化 質(zhì)控血清(漿)試劑盒。將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清及樣品點(diǎn)樣在有支持物的基質(zhì)中的一個(gè) 位點(diǎn)上。支持物可用金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子 或S印harose beads等?；|(zhì)是用于標(biāo)記、結(jié)合血清(漿)的。標(biāo)記至液相色譜柱子上的 基質(zhì)可用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)的標(biāo)準(zhǔn)方法丄分析。將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控0血清 (漿)用于質(zhì)譜儀試劑盒的定量方法。3. 洗滌用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全千燥前將第一份洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位 點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。以下可 有不同步驟(1) 用水徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)，自然千燥基質(zhì)及滯留的生物標(biāo)志，加0.5pL吸 能分子(以50%乙腈，0. 5%三氟乙酸的制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)瀋液)(2) 或用0.05% 1%二氟乙酸徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)(當(dāng)用陶瓷珠、磁性珠、多 聚體或S印harose beads為支持物時(shí))，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片 (有3x3 nra圓孔)上，自然干燥金屬片，加0. 5 pL吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)。 吸能分子可用Si卿inic acid或alpha-Cyano-4-hydroxycinn柳ic acid等。 3.質(zhì)譜的定量控制及測試用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337 nm)和80 cm或120 cm飛行 管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標(biāo)志后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)標(biāo)準(zhǔn) 方法去分析滯留于各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或蛋白質(zhì)。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中 用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091. IDa或6634. 0 Da等強(qiáng)度調(diào)至50%信號強(qiáng)度的最大值。本發(fā)明將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即WCX陰離子、SAX陽離子、C8/C18疏水作用等蛋白。 這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析及定量。本發(fā)明可用于體外細(xì)胞和非侵入性的體外質(zhì)譜檢測方法的定量控制，如離體體液的試 劑盒用于臨床疾病的質(zhì)譜檢測方法?？梢詸z測多個(gè)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志群及正常人群血清(漿) 質(zhì)譜多肽圖譜(圖l正常人群血清(漿)質(zhì)譜多肽圖譜)。所捕獲的生物標(biāo)志群可來源于已經(jīng)脫離人體或動物體的血液，體液，分泌物，細(xì)胞溶 解物，組織溶解物和器官溶解物。本發(fā)明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(diǎn)a)準(zhǔn)確質(zhì)譜直接分析有很強(qiáng)的精確性， 一般誤差率只有0. 1 Da。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是由氨基酸組 成的，而氨基酸的平均質(zhì)量是己知的，如果知道了抗原或生物標(biāo)志的總分子量，那么抗原 的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。(2) 方便本方法將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即陰離子、陽離子、親水、疏水或配位共價(jià)金屬螯合 劑作用蛋白(圖l正常人群血清(漿)質(zhì)譜多肽圖譜)。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析。(3) 快捷用本發(fā)明提供的蛋白指紋法進(jìn)行疾病診斷時(shí)，無需對蛋白質(zhì)進(jìn)行測序。本發(fā)明采用了 計(jì)算機(jī)"條碼格式"，信號強(qiáng)度沿著線性軸以暗度強(qiáng)度值顯示。此強(qiáng)度可以用掃描儀記錄 并用分析軟件自動分析對比強(qiáng)弱，從而有助于臨床復(fù)雜的診斷，如可用此"蛋白指紋"或 條碼格式進(jìn)行醫(yī)學(xué)分析(

圖1)。本發(fā)明提供的一個(gè)試劑盒方法用于質(zhì)譜檢測定量控制。從而有助于臨床復(fù)雜的檢測。 說明書附l正常人群[ftl.清(漿)質(zhì)譜多肽圖譜。同一樣本同時(shí)在蛋白芯片上做8點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn), 所有峰值的CV值均〈10%，顯示了較好的重復(fù)性。圖2血清(漿)存放在4'C條件下不同時(shí)間對蛋白質(zhì)譜的影響 圖3血清(漿)反復(fù)凍溶對蛋白質(zhì)譜的影響 圖4用U9稀釋血清(漿)后不同保存時(shí)間對蛋白質(zhì)譜的影響 圖5溶血對蛋白質(zhì)譜的影響具體實(shí)施方式
本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明，這些實(shí)例僅用于說明目的，而不用于限制本 發(fā)明范圍。實(shí)施例1貭譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備(1)實(shí)驗(yàn)方法 一、材料標(biāo)本來源質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備定義符合如下標(biāo)準(zhǔn)，供血者男女各半， 血型為0型；年齡為18-30歲；民族，漢。生化指標(biāo)正常，包括總膽固醇、甘油三酯、 空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢査、腎功檢查；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。 女性無懷孕，男性無吸煙史者。抽取IO位O型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液，4t:下待血液凝固后馬上離心，10,000 rpm， 4'C離心5min;樣品的處理和儲存。取混合血 清(漿)lOpl，用20nlU9緩沖液(9M Urea， 2%CHAPS， 50mM Tris-HCL, pH9.0)稀釋， 而后，將以上標(biāo)本冰浴振蕩30min。將上述變性后標(biāo)本加入360^1相應(yīng)的結(jié)合緩沖液， 待用。所有樣本均進(jìn)行雙份檢測以減少實(shí)驗(yàn)誤差。簡要操作步驟將200jal結(jié)合緩沖液(50 raM NaAC, pH 4.0)加至己裝好WCX陰離子 芯片的Bioprocessor中，置振蕩器(MSI Minishaker) 400-600 r卿，震
緩沖液。重復(fù)上述操作兩次。在芯片處理器每孔中加入lOOpl處理好的標(biāo)本，置振蕩器 400-600 rpm， 4'C震蕩lh。甩出標(biāo)本。每孔加入200pl的結(jié)合緩沖液，室溫置振蕩器 400-600 rpm,震蕩5min,甩去孔中液體，再次加入結(jié)合緩沖液200|n，重復(fù)操作一次。 立刻拆開芯片處理器，取出芯片，待丁后，在每個(gè)加樣孔上加SPA 0.5 千燥后再重 復(fù)加SPA 0. 5 nl —次。或用0. 05% 1%二氟乙酸徹底洗滌整個(gè)WCX陰離子磁珠陣列點(diǎn)， 將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3圓圓孔)上，自然T燥金厲片，加0.5^吸 能分子(以50%乙腈，0.5%二氟乙酸制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)。然后用質(zhì)譜分析閱讀。定量 性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì) 控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091. 1Da或6634.0 Da強(qiáng)度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強(qiáng)度的 最大值。數(shù)據(jù)收集在每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集前，用All-in-one蛋白校正儀器，使蛋白質(zhì)分子量誤 差<0.1%。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用t檢驗(yàn)軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白指紋圖譜。所有的圖譜都進(jìn) 行了標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)一到它們自己全部的離子總數(shù)(峰血積的總和)。將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用 于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091. 1Da或6634. 0 Da強(qiáng)度調(diào)至50%信號強(qiáng)度的最大值，并且用最顯著 的峰進(jìn)行了校正，而后又進(jìn)行了 "減少基線"，定義蛋白峰(s/n>5，最小的峰強(qiáng)度〉1.6)。 分析了所有700 30000Da之間的蛋白峰，并且仔細(xì)檢查了每個(gè)相應(yīng)的峰，計(jì)算出峰的平 均數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)和變異系數(shù)(CV%)。用t檢驗(yàn)比較配對樣本(溶血與否)的蛋白峰， 計(jì)算P值。峰值CV〉309i或者p<0. 01為有顯著性差異。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠/芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠/芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。實(shí)施例2分析血清(漿)蛋白質(zhì)組具有良好的可重復(fù)性將上述混合血清(漿)點(diǎn)樣在同一條芯片的8個(gè)點(diǎn)上做重復(fù)性檢測，分析了血清(漿) 中的多肽及低分子量蛋白質(zhì)組。如圖l所示，在被定義分析的79個(gè)主要峰中，其峰值強(qiáng) 度的變異系數(shù)(CV)均在10%以下，說明用這種方法來分析蛋白質(zhì)組有良好的重復(fù)性。實(shí)施例3血清(漿)儲存條件不同對蛋白質(zhì)組的結(jié)果影響我們把血清(漿)放置4。C不同的時(shí)間0， 2， 4， 6， 8, 12， 24， 72小時(shí)，發(fā)現(xiàn)在112小時(shí)之內(nèi)，血淸(漿)蛋白質(zhì)組基本未發(fā)生變化，血清(漿)中被定義的79個(gè)峰中沒 有一個(gè)峰CV>30%。，僅有2個(gè)峰值(占2. 5%)CV〉20% 。至4小時(shí)，有2個(gè)峰(占2. 5%) CV>30% 和5個(gè)峰(占6. 4%) CV>20% ; 12小時(shí)后，分別有5個(gè)峰值(占6. 4%) CV〉3(m和10個(gè)峰 值(占12. 7%) CV濕。時(shí)間延長至72小時(shí)，有10個(gè)峰值(占12. 7%) CV雇和19個(gè) 峰值(占24. 1%) CV〉20% (圖2)。實(shí)施例4反復(fù)凍溶對血清(漿)蛋白質(zhì)組的結(jié)果影響將混合血清(漿)樣本一8(TC冰凍2小時(shí)以上，然后室溫(25°C)融化放置，反復(fù)l, 2， 3， 4次，在每次融化后檢測蛋白質(zhì)譜峰，發(fā)現(xiàn)1次凍融后，在80個(gè)定義了的主要蜂 中，沒有1個(gè)峰值CV〉309G或者只有1個(gè)峰值(占1. 2%) CV>20%。 2次凍融后，有4個(gè)峰 值(占5. 0%) CV〉30免和8個(gè)(占10. 0%) CV〉20%。經(jīng)4次反復(fù)凍融，發(fā)現(xiàn)8個(gè)峰值(占 10.0%) CV〉3(m和14個(gè)(占17.5%) CV>20% (圖3)。實(shí)施例5用U9稀釋血清(漿)后不同保存時(shí)間對血清蛋白質(zhì)組的影響 將混合lili清(漿)和U9緩沖液以1: 2稀釋后室溫(25°C)保存1天，2天至7天， 觀察對血清(漿)蛋白質(zhì)組結(jié)果的影響。發(fā)現(xiàn)至24小時(shí)在定義的79個(gè)主要峰中沒有1個(gè) 峰值CV>30%,僅有1個(gè)峰(占1. 3%) CV>20%;至48小時(shí)，有5個(gè)峰值(占6. 4%)和9個(gè) 峰(占11. 4%) CV>20%;至第7天，24. 1%的峰值(^>30%和57.0%的峰值(^>20% (圖4)。實(shí)施例6溶血對血清(槳)蛋白質(zhì)組結(jié)果的影響隨機(jī)選擇了一份血樣分離血清(漿)后又進(jìn)行機(jī)械性溶血得到一份溶血的樣本，同時(shí) 進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)的試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)36.0%的峰經(jīng)配對1檢驗(yàn)有顯著性差異(P<0.05)。(圖5)實(shí)施例7 —8(TC放置對血清(漿)蛋白質(zhì)組的結(jié)果的影響比較了新鮮血清(漿)和放置于一80'C長達(dá)24個(gè)月以上的血清蛋白質(zhì)組的變化，發(fā) 現(xiàn)變化很小，沒有1個(gè)峰值CV〉309()或者僅有1個(gè)峰值CV〉20%。結(jié)論在對疾病的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)中，血液應(yīng)用最為廣泛，但是血液離體后放置在玻璃試 管的過程中，隨著血細(xì)胞持續(xù)不斷的新陳代謝，細(xì)胞膜完整性的改變導(dǎo)致了代謝產(chǎn)物的不
斷釋放，以及血凝塊降解產(chǎn)物的釋放必然會對結(jié)果有所影響。丙此我們在進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜 分析時(shí)，采血之后必須立即盡快離心得到血清(漿)。然而即便如此，臨床血清(漿)樣 本也經(jīng)常由于運(yùn)送等問題不能被及時(shí)檢測。本研究主要是對血清(漿)樣本的儲存穩(wěn)定性 等作了系統(tǒng)分析，旨在更好地做好蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的質(zhì)量控制。U9緩沖液(9MUrea， 2%CHAPS， 50rnM Tris-HCL， pH9.0)是一種蛋白質(zhì)裂解液。發(fā)現(xiàn) 血清與U9緩沖液以1: 2稀釋后在室溫(25°C)、 24小時(shí)內(nèi)保存具有良好的穩(wěn)定性，這為 實(shí)驗(yàn)提供了很好的運(yùn)送及保存方法和便利。溶血導(dǎo)致血細(xì)胞的機(jī)械性損傷。這在采血和血樣運(yùn)輸過程中經(jīng)常會發(fā)生。溶血會導(dǎo)致 血液細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)外逸干擾血清(漿)蛋白質(zhì)組，引起質(zhì)譜的分析結(jié)果的改變。發(fā)現(xiàn)36. 0% 的被定義了的峰p〈0.01，這表明，發(fā)生溶血的樣本不能用于蛋白質(zhì)組的比較，亦不能用 于生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。總之，發(fā)現(xiàn)血樣本的質(zhì)量，儲存情況的變化對蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析有著 不同的影響。溶血樣本以及在4'C或者25'C放置12小時(shí)以上的樣本對于多肽及低分子量 血清(漿)蛋白質(zhì)組的結(jié)果有著很大影響。相比之下，凍溶l次以及4"C或25t:進(jìn)行短期 儲存，甚至在一8(TC長期儲存或者用U9緩沖液稀釋室溫保存1天以內(nèi)結(jié)果較穩(wěn)定。本研 究為如何吏好地保證血清(漿)蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析中血樣本質(zhì)量以及運(yùn)輸、保存提供了一個(gè) 客觀的依據(jù)。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠/芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠/ 芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。建議血液標(biāo)本的處理、運(yùn)送、操作及儲存的蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的標(biāo)準(zhǔn)條件是4'C下處 理血液標(biāo)本，2小時(shí)內(nèi)盡快分離血清(漿)及細(xì)胞。用U9緩沖液稀釋血清后，可以24小 時(shí)內(nèi)在宰溫下運(yùn)送或?qū)ρ?漿)及芯片結(jié)合過程進(jìn)行操作。血清(漿)可長期儲存在一 8(TC，但限凍溶1次。對溶血標(biāo)本，應(yīng)重新取血。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為 參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本 發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定約范圍。
權(quán)利要求
1.一種臨床質(zhì)譜診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的試劑盒和蛋白質(zhì)分析方法，用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)控制下的定量性質(zhì)譜分析來檢測。該方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)樣品處理及質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備；(2)基質(zhì)與血清(漿)結(jié)合試劑盒制備、樣品上樣；(3)洗滌；(4)質(zhì)譜的定量控制及質(zhì)譜檢測；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)；所述步驟(2)將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)及樣品點(diǎn)樣在有支持物的基質(zhì)中的一個(gè)位點(diǎn)上。支持物可用金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或Sepharose beads等?；|(zhì)是任何能與血清選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)；所述步驟(3)用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用水徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)，自然干燥基質(zhì)及滯留的生物標(biāo)志；或用三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)(當(dāng)用陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或Sepharosebeads為支持物時(shí))，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片或位點(diǎn)上。所述步驟(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)用質(zhì)譜儀去分析滯留與各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或用電噴霧電離已洗脫的生物標(biāo)志后用質(zhì)譜儀去分析。本發(fā)明用WCX陰離子基質(zhì)磁珠及用C8/C18疏水基質(zhì)磁珠對血液進(jìn)行蛋白質(zhì)對比分析，用計(jì)算機(jī)分析血液中質(zhì)荷比數(shù)據(jù)。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1Da或6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50％質(zhì)譜信號強(qiáng)度的最大值。
2. 權(quán)利要求1所述的基質(zhì)是用于捕獲多種蛋白質(zhì)的，所述的分析方法，可以檢測多 個(gè)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志群及正常人群血清(漿)質(zhì)譜多肽圖譜。
3. 權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)分析方法，所用的基質(zhì)包括WCX陰離子、SAX陽離子、親 水、C8/C18疏水或配位共價(jià)金屬螯合劑作用吸附劑。
4. 權(quán)利要求1所述的分析方法，所捕獲的生物標(biāo)志群來源于已經(jīng)脫離人鉢或動H體 的血液，體液，分泌物，細(xì)胞溶解物，組織溶解物和器官溶解物。
5. 權(quán)利要求1中基質(zhì)的支持物可以是金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、 多聚體、液相色譜柱子或S印harose beads。
6. —種權(quán)利要求1所述標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)的用途，其特征在于，用于制備質(zhì)譜 檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的試劑盒。
7. —種權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，它包括 一容器以及裝于容 器中的權(quán)利要求6所述的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)樣品分裝10(Hil 一小管，于—80TC儲存或取混合血清(漿)l:2稀釋于一小管U9緩沖液(9MUrea， 2%CHAPS, 50mM Tris-HCL, pH9.0), 25。C儲存。
8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征于，所述的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):為O型血的血清或血漿。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種臨床質(zhì)譜診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的試劑盒和方法。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)試劑盒為標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)樣品分裝于小管，在-80℃儲存或取混合血清(漿)1∶2稀釋于U9緩沖液在25℃儲存。用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控O型血清(漿)控制下的定量性質(zhì)譜分析來檢測。本方法精確、方便且快捷。
文檔編號G01N30/00GK101165482SQ20061014051
公開日2008年4月23日 申請日期2006年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月16日
發(fā)明者洋 許 申請人:洋 許