專利名稱：：一種診斷前列腺癌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及檢測血清中游離形式前列腺特異抗原的試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
：前列腺癌是中老年男性的常見多發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在男性癌癥患者中，前列腺癌發(fā)病率最高，是除肺癌和大腸癌外的第三大死因。前列腺特異抗原PSA，分子量34KD的糖蛋白，具有高度的組織特異性，分布于正常的前列腺組織、前列腺增生組織、前列腺惡性組織和轉(zhuǎn)移癌及前列腺分泌液、精漿中。雖然近來發(fā)現(xiàn)其它癌組織如乳腺癌中存在少量PSA，但其目前仍是前列腺癌診斷中最為重要，應(yīng)用最為廣泛的前列腺癌標(biāo)志物。測量血清中的前列腺特異抗原PSA可以用于篩選和早期診斷前列腺癌。血清內(nèi)PSA有多種存在形式，大部分具有酶活性的PSA與al-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)和a2巨球蛋白(a2M)以復(fù)合物的形式存在，少量的無酶活性的PSA以游離形式存在。一般對(duì)于正常健康和非前列腺癌病變的男性病人來說，血清的PSA含量低于4.0ng/ml。前列腺癌(PCa)、前列腺增生(BPH)、前列腺炎癥患者血清內(nèi)PSA濃度會(huì)升高，大多數(shù)前列腺癌患者血清PSA升高顯著，高于IOng/ml。在4.0-lOng/ml的灰色區(qū)域，單獨(dú)檢測總PSA無法區(qū)分癌癥和良性增生，檢測血清中游離PSA與總PSA的比例可顯著提高前列腺癌和前列腺增生的辨別。比例越高，前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)越低，分界比例通常認(rèn)為是15%。游離的PSA可提供更好的生化指標(biāo)，用于區(qū)分PSA4-10ng/ral的前列腺癌和良性增生。血清PSA在2.5-4ng/ml的男性中，仍有部分人患有前列腺癌，檢測血清內(nèi)其它游離形式的PSA水平也可以幫助區(qū)分癌癥患者。目前用于血清PSA檢測的試劑盒有RIA、ELISA、化學(xué)發(fā)光等試劑盒，檢測游離PSA的試劑盒比較少，曾經(jīng)有人制備過酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒，但是現(xiàn)有技術(shù)中游離PSA的酶標(biāo)試劑盒用于測定時(shí)，不僅測定步驟多、時(shí)間長、使用不便，而且靈敏度低，準(zhǔn)確性參差不齊，這些因素大大限制了酶免試劑盒的推廣和應(yīng)用。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)更快速、更方便的游離PSA檢測試劑盒，以滿足臨床需求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測游離PSA的試劑盒及其用途。所述的試劑盒靈敏度高、檢測時(shí)間短且使用方便。.本發(fā)明的另一目的在于提供一種體外檢測f-PSA方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測f-PSA的試劑盒，所述的試劑盒含有一固相載體，所述的固相載體上包被有第一單克隆抗體，所述的第一單克隆抗體選自由保藏號(hào)為CCTCC-C200620的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，由保藏號(hào)為CCTCC-C200621的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，或由保藏號(hào)為CCTCC-C200622的雜交瘤產(chǎn)生的抗體；和容器a，所述的容器a中裝有第二單克隆抗體，所述的第二單克隆抗體選自由保藏號(hào)為CCTCC-C200620的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，由保藏號(hào)為CCTCC-C200621的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，或由保藏號(hào)為CCTCC-C200622的雜交瘤產(chǎn)生的抗體；且所述的第二單克隆抗體攜帶一標(biāo)記物；其中，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體不相同，且可同時(shí)結(jié)合于f-PSA。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的第一單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C200622的雜交瘤產(chǎn)生的抗體；且所述的第二單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C200621的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)記物選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、/3-D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包含(a)容器b，所述的容器b中裝有f-PSA的標(biāo)準(zhǔn)品；和域(b)容器c，所述的容器c中裝有f-PSA的質(zhì)控品。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包含(C)容器d，所述的容器d中裝有與標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的底物；(d)容器e，所述的容器e中裝有顯色劑；(e)容器f，所述的容器f中裝有洗滌液；和/或①容器g，所述的容器g中裝有終止液。6.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包含(h)容器h，所述的容器h中裝有增敏劑，所述的增敏劑的配方按照重量比為PEG60004%、甘油1%、蔗糖1%、明膠1%，余量為PBS。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的容器b-容器h可以是一個(gè)容器；也可以是多個(gè)容器，多個(gè)容器中裝有不同濃度的所述的試劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的固相載體選自微量滴定板、或微球。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒的線性范圍值為0.5-50ng/ml。在本發(fā)明的第二方面，提供一種體外檢測f-PSA方法，所述方法包括以下步驟(a)將待測樣品加樣于包被有第一單克隆抗體的固相載體，從而使待測樣品中的f-PSA與固相載體上的第一單克隆抗體結(jié)合，形成帶有"f-PSA-第一單克隆抗體"二元復(fù)合物的固相載體；(b)將第二單克隆抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二單克隆抗體-f-PSA-第一單克隆抗體"三元復(fù)合物的固相載體；且所述的第二單克隆抗體攜帶一標(biāo)記物；(c)檢測三元復(fù)合物中的標(biāo)記物，從而確定待檢測樣品中f-PSA的存在與否以及存在的量。附加條件是，步驟(a)和步驟(b)可依次進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的第一單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C200622的雜交瘤產(chǎn)生的抗體；且所述的第二單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C200621的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖l顯示了f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品濃度參考曲線。圖2顯示了f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品溶在陰性血清內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3顯示了f-PSA診斷試劑線性范圍及靈敏度測定。圖4顯示了本發(fā)明試劑盒和商品化試劑盒檢測血清f-PSA結(jié)果比對(duì)。圖5顯示了本發(fā)明試劑盒和商品化試劑盒檢測血清f-PSA結(jié)果相關(guān)分析。圖6顯示了f-PSA單抗配對(duì)效果比較試驗(yàn)的結(jié)果。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究和試驗(yàn)，找到了針對(duì)游離的前列腺特異抗原PSA(f-PSA)不同表位的三種高特異性單克隆抗體，選擇所述三種抗體中的任意兩種，根據(jù)雙抗夾心法原理，可制備出方便、快速且準(zhǔn)確地診斷早期前列腺癌以及區(qū)分前列腺癌和良性增生的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒解決的技術(shù)問題一靈敏檢測血清內(nèi)游離前列腺特異抗原，準(zhǔn)確鑒別前列腺癌和非癌患者；本發(fā)明的試劑盒解決的技術(shù)問題二快速檢測，大大縮短檢測時(shí)間，方便快捷。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員均了解，一種抗原可能含有多個(gè)表位(抗原決定簇)，因此，針對(duì)同一個(gè)抗原可以獲得不止一個(gè)抗體，這些抗體對(duì)抗原的結(jié)合特性(如特異性等)均可能是不同的。因此，針對(duì)同一個(gè)抗原，本領(lǐng)域人員還需要進(jìn)行比較和篩選，才能找到適合于特異性結(jié)合的單抗。本發(fā)明人作了大量的工作，同時(shí)開發(fā)了多種針對(duì)f-PSA的單克隆抗體(參見CN200610026505.0)，從中挑選出對(duì)f-PSA特異性高的單克隆抗體用于本發(fā)明。前列腺特異抗原(PSA)有總前列腺特異抗原(t-PSA)、結(jié)合前列腺特異抗原(c-PSA)、游離前列腺特異抗原(f-PSA)之分，且t-PSA=c-PSA+f-PSA。由于需要檢測的是f-PSA抗原，一般的抗f-PSA抗體在用于檢測時(shí)易于受到同時(shí)結(jié)合c-PSA的干擾，導(dǎo)致特異性差，結(jié)果偏差大。通常情況下，若是采用一種抗體來結(jié)合f-PSA，可能在測定過程中不可避免地發(fā)生非特異性結(jié)合；而本發(fā)明基于雙抗夾心法原理來制備所述的試劑盒，采用的是結(jié)合于f-PSA抗原不同表位的雙抗體，這種情況下出現(xiàn)非特異性結(jié)合的幾率是非常低的，因此結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度會(huì)大大提高。并且，采用兩種特異性非常高的抗體來將目標(biāo)抗原f-PSA吸附及定位，其定位和放大效果更好，從而使得特異性和精密度更高。且測定時(shí)僅需要很少的樣品量即可。此外，由于所述的單克隆抗體對(duì)于f-PSA具有極其優(yōu)異的結(jié)合特性，因此，待測樣品與第一單克隆抗體和第二單克隆抗體的混合可同時(shí)進(jìn)行(更優(yōu)選地，可采用增敏劑改進(jìn)抗原抗體動(dòng)力學(xué)過程)。這就大大降低檢測所需的時(shí)間，所需時(shí)間由約數(shù)個(gè)小時(shí)減少到約30分鐘；且大大簡化了操作步驟。如本文所用，所述的"捕獲抗體"、"包被抗體"、"第一單克隆抗體"、"第一抗體"、與"一抗"可互換使用，都是指用于固定于固相載體上的、特異性抗f-PSA的抗體。如本文所用，所述的"檢測抗體"、"第二單克隆抗體"、"第二抗體"、"酶標(biāo)(記)抗體"與"二抗"可互換使用，都是指特異性地抗f-PSA且對(duì)應(yīng)于所述試劑盒中相應(yīng)的第一抗體的抗體。對(duì)于抗原f-PSA而言，相應(yīng)的第一抗體和第二抗體是不同的，并且可同時(shí)結(jié)合于所述的f-PSA的不同表位(抗原決定簇)。如本文所用，所述的"標(biāo)記物"是指位于第二單克隆抗體上的，用于確定待檢測樣品中游離PSA的存在與否以及存在的量的標(biāo)志物。優(yōu)選的，所述的標(biāo)記物選自辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、/3-D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。如本文所用，所述的"與標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的底物"是指可被第二單克隆抗體的標(biāo)記物所催化顯色，用于顯示第二抗體與f-PSA發(fā)生結(jié)合的識(shí)別信號(hào)。所述的底物比如用于辣根過氧化物酶的鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、ABTS;用于堿性磷酸酯酶的對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP);等等。基本原理本發(fā)明的基本原理是雙抗夾心法。常規(guī)的做法是將一抗固定于載體，然后一抗與抗原反應(yīng)，洗滌后再與帶標(biāo)記的二抗反應(yīng)，洗滌，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測信號(hào)。雙抗夾心法特別適用于具有兩個(gè)或兩個(gè)以上表位的抗原的檢測。游離的前列腺特異抗原PSA游離的前列腺特異抗原PSA(f-PSA)是一種已知的蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列都是本領(lǐng)域已知的。例如，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。生產(chǎn)f-PSA的方法也是已知的。例如，通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984;224:1431)，可利用f-PSA的多聚核苷酸序列來表達(dá)或生產(chǎn)重組的f-PSA蛋白。一般來說有以下步驟(1).用編碼人f-PSA蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；和(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。上述獲得的重組f-PSA蛋白可被加工成具有一定純度的蛋白，用于配制標(biāo)準(zhǔn)品。此外，所述的f-PSA蛋白也可分離自人體。例如，可從人精液內(nèi)提取和純化f-PSA?？筬-PSA蛋白的單克隆抗體制備抗f-PSA蛋白的抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的。用于本發(fā)明的抗體是對(duì)人f-PSA具有特異性的單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結(jié)合于人f-PSA蛋白或其片段。更特別地，指那些能與人f-PSA蛋白或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明利用針對(duì)游離的前列腺特異抗原PSA(f-PSA)不同表位的高特異性單克隆抗體，根據(jù)雙抗夾心法原理，制備了可方便、快速且準(zhǔn)確地診斷早期前列腺癌以及區(qū)分前列腺癌和良性增生的試劑盒。本發(fā)明中涉及的三種高特異性單克隆抗體的獲得及其優(yōu)異特性在本申請(qǐng)人的在先申請(qǐng)CN200610026505.0中進(jìn)行了詳細(xì)的描述。三種抗體的代號(hào)以及保藏號(hào)對(duì)應(yīng)如下雜交瘤細(xì)胞系S-115-8，保藏號(hào)為CCTCC-C200620;雜交瘤細(xì)胞系S-191-5，保藏號(hào)為CCTCC-C200621;雜交瘤細(xì)胞系S-44-10，保藏號(hào)為CCTCC-C200622。上述的單克隆抗體的抗體亞型均為IgGl，K。本發(fā)明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256;495,1975;Kohler等人，Eur丄Imm畫l.6:511，1976;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976;Hammerling等人,InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.，1981)。本發(fā)明的單克隆抗體可以利用人f-PSA基因產(chǎn)物或片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。此外，還可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。本領(lǐng)域人員均了解，在得到了所述的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系或通過測序等手段得知所述的單克隆抗體后，本領(lǐng)域人員可以采用多種方法方便地獲得所述的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述的單克隆抗體可以由下列制備方法所制備，所述方法包括步驟(1)提供佐劑預(yù)處理的小鼠；(2)在小鼠腹腔內(nèi)接種所述的雜交瘤細(xì)胞并分泌單克隆抗體；(3)抽取腹水，分離獲得所述的單克隆抗體。作為一種優(yōu)選方式，從腹水中分離單克隆抗體的方法是收集腹水，用經(jīng)硫酸銨、辛酸沉淀，接著用ProteinG預(yù)裝層析柱純化，獲得高純度的PSA單克隆抗體。此外，也可按照常規(guī)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法，體外培養(yǎng)擴(kuò)增所述的雜交瘤細(xì)胞，從而使之分泌所述的單克隆抗體。試劑盒本發(fā)明提供一種檢測f-PSA的試劑盒，所述的試劑盒可用于前列腺癌和良性增生的鑒別診斷，特別是早期病人的篩查，也可用于前列腺癌術(shù)后化療的監(jiān)測及預(yù)后評(píng)估等。所述的試劑盒含有一固相載體，所述的固相載體上包被有第一單克隆抗體，所述的第一單克隆抗體選自由保藏號(hào)為CCTCC-C200620的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，由保藏號(hào)為CCTCC-C200621的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，或由保藏號(hào)為CCTCC-C200622的雜交瘤產(chǎn)生的抗體；容器a，該容器a中裝有第二單克隆抗體，所述的第二單克隆抗體選自由保藏號(hào)為CCTCC-C200620的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，由保藏號(hào)為CCTCC-C200621的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，或由保藏號(hào)為CCTCC-C200622的雜交瘤產(chǎn)生的抗體；且所述的第二單克隆抗體攜帶一標(biāo)記物；作為一個(gè)必要的條件，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體不相同，且可同時(shí)結(jié)合于f-PSA。作為本發(fā)明的一個(gè)最佳的方式，所述的第一單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C^00622的雜交瘤(S-44-10)產(chǎn)生的抗體；且所述的第二單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C200621(S-191-5的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，將由CCTCC-C200622的雜交瘤產(chǎn)生的抗體作為包被抗體，而將由保藏號(hào)為CCTCC-C200621的雜交瘤產(chǎn)生的抗體作為檢測抗體，這樣的一種組合能夠產(chǎn)生最好的f-PSA檢測效果，其檢測靈敏度約為0.5ng/ml。在確定了本發(fā)明的試劑盒所釆用的包被抗體和檢測抗體后，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)可用于與檢測抗體結(jié)合來進(jìn)行檢測的各種標(biāo)記物。本發(fā)明對(duì)所采用的標(biāo)記物沒有特別的限制，只要是能夠與所述的檢測抗體結(jié)合，且在適當(dāng)處理后能夠準(zhǔn)確地指示待檢測樣品中f-PSA的存在與否以及存在量的標(biāo)記物均是可用的。例如，所述的標(biāo)記物可以選自(但不限于)辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、/3-D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。當(dāng)采用如上所示的一些酶標(biāo)記物時(shí)，還需要采用一些與相應(yīng)的酶結(jié)合的底物，從而可通過顯色等方式來報(bào)導(dǎo)標(biāo)記物的存在情況或者存在量。所述的底物例如(但不限于)用于辣根過氧化物酶的鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、ABTS;用于堿性磷酸酯酶的對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)。為了消除假陽性和假陰性，宜在檢測過程中設(shè)置質(zhì)控(對(duì)照)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述的質(zhì)控品采用f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品、正常女性血清經(jīng)稀釋而制備。此外，為了獲得定量結(jié)果，可以在檢測過程中設(shè)置含已知濃度的多個(gè)f-PSA的標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)置方法可采用常規(guī)的方法。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)置如下標(biāo)準(zhǔn)品I:0ng/ml純化的f-PSA;標(biāo)準(zhǔn)品II:lng/ml純化的f-PSA;標(biāo)準(zhǔn)品III:2.5ng/ml純化的f-PSA;標(biāo)準(zhǔn)品IV:5ng/ml純化的f-PSA;標(biāo)準(zhǔn)品V:10ng/ml純化的f-PSA;和標(biāo)準(zhǔn)品VI:25ng/ml純化的f-PSA。利用所述的標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線如下設(shè)置用標(biāo)準(zhǔn)品的OD值檢測結(jié)果為縱坐標(biāo)(Y軸)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X軸)繪制成f-PSA試劑盒的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。從而，根據(jù)待測樣品檢測獲得的OD值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出待測樣品中f-PSA的濃度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，用于制備所述的標(biāo)準(zhǔn)品的f-PSA純品是從人精漿里純化獲取的。按照常規(guī)的純化方法，制備出f-PSA，SDS-PAGE驗(yàn)證純度，溶在PBS中，加入50%甘油，即得到成品。此外，為了使本發(fā)明的試劑盒在檢測時(shí)更方便，所述的試劑盒中優(yōu)選的還包含其它一些輔助試劑，所述的輔助試劑是雙抗夾心法中常規(guī)使用的一些試劑，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。所述的試劑例如(但不限于)顯色劑、洗滌液、終止液，增敏稀釋液。作為本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的方式，所述的試劑盒中還包含一種增敏劑，所述的增敏劑的配方為(按照重量比)PEG60004%、甘油1%、蔗糖1%、明膠1%，余量為PBS。在采用所述的增敏劑后，本發(fā)明的試劑盒中的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體對(duì)于f-PSA的識(shí)別和結(jié)合將更加敏感，并且本發(fā)明的試劑盒的檢測時(shí)間進(jìn)一步縮短。所述的第一單克隆抗體被包被在固相載體上。本發(fā)明對(duì)所采用的固相載體沒有特別的限制，只要其能夠與第一單克隆抗體相偶聯(lián)(連接)即可。例如，所述的固相載體選自微量滴定板、或微球。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，采用的固相載體是微量滴定板(酶標(biāo)板)，所述的微量滴定板是一種聚苯乙烯板，規(guī)格是12X8可拆卸條板。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述試劑盒中一些組分的制備方法如下(1)制備包被有包被抗體的固相載體a)制備單克隆抗體利用專利(參見專利CN200610026505.0)中制備篩選到的單克隆抗體細(xì)胞株，將上述雜交瘤細(xì)胞株按照常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增或者注射小鼠腹腔制備腹水，收集腹水經(jīng)硫酸銨、辛酸沉淀、ProteinG預(yù)裝層析柱純化后，即獲得高純度的PSA單克隆抗體。b)包被將上述的單克隆抗體用50mM、pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋后加入酶標(biāo)板各孔，100uL/孔，4'C包被過夜。用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板。c)封閉用封閉液封閉后，冼滌，甩干，干燥低溫保存。(2)制備酶標(biāo)的檢測抗體所述酶標(biāo)的檢測抗體釆用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記檢測抗體而制備。抗體標(biāo)記的方法在本領(lǐng)域是公知的，例如用簡易過碘酸鈉法或者戊二醛二步法進(jìn)行HRP標(biāo)記抗體。(3)制備質(zhì)控品采用混合人血清，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍要求進(jìn)行稀釋而制備的。一種質(zhì)控品制備方法步驟如下a)收集正常女性血清，-2(T(〕保存；b)將累積的各份血清混合，加入f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品用ELISA方法測定濃度，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線要求進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，制備f-PSA的濃度范圍分別在2±0.5ng/ml(低值)和10±lng/ml的兩種血清(高值)；c)將步驟b)所獲得的兩種血清按試劑盒需要量分裝，即制備成低、高值質(zhì)控品。(4)制備其它輔助試劑所述的輔助試劑包括底物液，顯色液，反應(yīng)終止液，20X洗滌液。一種配制輔助試劑的方法如下a)底物溶液磷酸-檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制的3%過氧化氫溶液；b)顯色液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)甲醇溶液，濃度為O.lmg/ml;C)反應(yīng)終止液2M硫酸；d)洗滌液(20X):PB(pH7.4)配制的0.05，土溫20溶液。檢測游離PSA方法本發(fā)明提供一種體外檢測f-PSA的方法，包括以下步驟(a)將待測樣品加樣于包被有第一單克隆抗體的固相載體，從而使待測樣品中的f-PSA固相載體上的第一單克隆抗體結(jié)合，形成帶有"f-PSA-第一單克隆抗體"二元復(fù)合物的固相載體；(b)將第二單克隆抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二單克隆抗體-f-PSA-第一單克隆抗體"三元復(fù)合物的固相載體；且所述的第二單克隆抗體攜帶一標(biāo)記物；(c)檢測三元復(fù)合物中的標(biāo)記物，從而確定待檢測樣品中f-PSA的存在與否以及存在的量。由于本發(fā)明的試劑盒采用的單克隆抗體對(duì)于f-PSA具有極其優(yōu)異的結(jié)合特性(高特異性)，因此，步驟(a)和(b)可同時(shí)進(jìn)行(S卩同時(shí)進(jìn)行待測樣品與第一單克隆抗體和第二單克隆抗體的混合)。將步驟(a)和步驟(b)同時(shí)操作，將大大降低檢測所需的時(shí)間(由約數(shù)個(gè)小時(shí)減少到約30分鐘)。當(dāng)然，步驟(a)和(b)也可分別進(jìn)行。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，定量檢測f-PSA的方法具體如下(i)抗原抗體反應(yīng)在試劑盒提供的抗體包被板的微孔內(nèi)分別加入IOO"L不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品，或待測血清樣品；(ii)酶聯(lián)反應(yīng)同時(shí)將服P-單克隆抗體溶液加入各孔，100uL/孔，再加入100uL增敏劑，放入溫控?fù)u床內(nèi)，37。C振蕩、孵育30min。洗滌液(1X)重復(fù)洗板3次；(iii)顯色反應(yīng)每孔加入底物溶液、顯色液各50iiL，37"孵育15min，每孔加入100uL反應(yīng)終止液，結(jié)束反應(yīng)；(iv)比色以空白對(duì)照孔的吸光值調(diào)零，酶標(biāo)儀在450nra測定0D值并打印結(jié)果。(V)結(jié)果計(jì)算A)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測定0D值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；計(jì)算曲線回歸系數(shù)R2，當(dāng)R2〉0.98時(shí)本次測驗(yàn)有效；B)評(píng)判質(zhì)控品濃度根據(jù)質(zhì)控品的OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出相應(yīng)的濃度值；質(zhì)控品測定濃度值處于給定范圍時(shí)，該次測定有效；C)計(jì)算待測血清樣品濃度當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品均被判定有效時(shí)，根據(jù)待測樣本的OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測血清樣品的f-PSA濃度。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)由于本發(fā)明的試劑盒采用對(duì)f-PSA具有高親和力，且高特異性識(shí)別f-PSA不同表位的單克隆抗體，靈敏度和準(zhǔn)確性非常高。其線性范圍值為0.5-50ng/ml，準(zhǔn)確性為94.0%。(2)由于采用的單克隆抗體對(duì)于f-PSA具有極其優(yōu)異的結(jié)合特性，因此本發(fā)明的試劑盒可以極其快速地檢測出血液中f-PSA，將現(xiàn)有技術(shù)中需數(shù)小時(shí)才能獲得檢測結(jié)果縮短到30分鐘左右，比普通的同類ELISA試劑盒更為快速。這對(duì)于臨床快速且準(zhǔn)確地診斷早期前列腺癌以及區(qū)分前列腺癌和良性增生而言具有極其重大的意義。(3)本發(fā)明試劑盒還具有簡便、穩(wěn)定等特點(diǎn)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例lf-PSA酶免試劑盒的制作一、從人精液內(nèi)提取純化f-PSA收集人的精液，10OOOXg離心20min，上清PBS透析，再次離心一次，0.22nm濾膜過濾，收集濾液。將上述獲得的濾液上疏水層析柱(77A^'/h7icge7c力r咖atograp力y)，峰內(nèi)收集到的目的產(chǎn)物。將目的產(chǎn)物上凝膠過濾層析柱(分離范圍5-70KD)，收集f-PSA所在的峰，得到f-PSA純品。采用SDS-PAGE驗(yàn)證純度，WesternBlot、ELISA驗(yàn)證特異性，獲得經(jīng)檢測合格的純化f-PSA。二、制備純化包被抗體使用經(jīng)典的單克隆抗體生產(chǎn)方法獲得S-44-10、S-191-5或S-115-8陽性雜交瘤細(xì)胞株(參見專利CN200610026505.0):在經(jīng)過佐劑預(yù)處理的小鼠腹腔內(nèi)接種所述的雜交瘤細(xì)胞，使之分泌單克隆抗體；抽取腹水；經(jīng)常規(guī)的硫酸銨、辛酸沉淀，ProteinG親和層析，收集抗體峰，PBS透析得單克隆抗體純品。SDS-PAGE驗(yàn)證純度>98%，效價(jià)12萬。三、酶標(biāo)記抗體制備采用常規(guī)的過碘酸鈉法，在酸性條件下，將抗f-PSA抗體S-191-5、S-115-8或S-44-10與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，用PBS充分透析，加等體積甘油，-2(TC保存。經(jīng)測定，效價(jià)>10000。四、f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品制備將前述"一"制備獲得的純化f-PSA溶解在PBS中，加入適量的50%甘油，分裝成f-PSA濃度分別是0、1、2.5、5、10、25ng/ml的溶液共6支，作為f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品。上述制備的f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度參考曲線如圖1所示。五、包被抗體和酶標(biāo)記抗體工作濃度選定采用常規(guī)的方陣滴定法，選擇對(duì)應(yīng)的抗體包被濃度和酶標(biāo)記抗體濃度。包被抗體從5ug/ml倍增稀釋，包被酶標(biāo)板，加梯度稀釋的酶標(biāo)抗體測定，以確定應(yīng)用濃度。經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，選擇的較佳工作濃度為10ug/ml-l:10000。六、預(yù)包被抗體板的制備(1)包被包被液——0.05MPH9.6碳酸鹽緩沖液500ml;Na2C:030.6g;Na線1.58g;將上述溶液調(diào)整PH9.6，定容至500ml;接著，加入適量的包被單抗，稀釋至10yg/ml，加入微孔板各孔中，封口膜加蓋，4'C過夜甩干。(2)洗滌洗滌液——1M/LTris20ml;Hcl16.8ml;Tween200.5ml;調(diào)整ra至7.2，用仏0定容至1L。洗滌液加入各孔內(nèi)，靜置3min后甩干，上述操作重復(fù)3次，以除去游離抗體。(3)封閉BSA3g;明膠l.lg;0.15MPBS定容100ral!=[>水浴加溫至呈透明溶液，冷卻至室溫i〉注入酶標(biāo)板各孔中，封口加蓋，37'C溫育2小時(shí)i>吸水紙拍干，重復(fù)一次，待干燥后放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4°C，備用。七、質(zhì)控血清制備收集正常女性血清，-2(TC保存。將累積的各份血清混合，加入f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品用ELISA方法測定濃度，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線要求，將兩份混合血清濃度調(diào)至2±0.5ng/ml、10土2ng/ml范圍。f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品溶在血清內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。將所獲得的兩份血清按試劑盒需要量分裝，即制備成低、高值質(zhì)控品。八、酶標(biāo)單抗稀釋液BSA0.5g;Tween-201%;0.15MPBS調(diào)PH7.2，定容至lOOml。將抗體標(biāo)記物按工作濃度稀釋，-2(TC凍存?zhèn)溆?。Na2HP0412H20檸檬酸H203%H202ddH201.7g;0.5g;200u1;100ml;調(diào)節(jié)PH至5.0<十、顯色液Na2HP0412H20檸檬酸H20ddH20調(diào)整PH至5.O后1.7g;0.5g;100ml;力卩入10mlDMSO含60mgTMB的溶液25u1。十一、反應(yīng)終止液濃硫酸10ml;ddH2080ml。十二、洗滌液(IOX)1M/LTris200ml;Hcl168ml;Tween205ml;調(diào)整PH至7.2，仏0定容至ILc十三、增敏劑PEG60004g;甘油lg;蔗糖lg;明膠lg;PBSlOOml。十四、半成品及成品的組裝將前述所得試劑分別裝入容器(如小瓶或離心管)中，將容器裝入試劑盒中，將獲得的預(yù)包被抗體板也裝入盒內(nèi)，備用。此外，也可在試劑盒中裝入所述的試劑盒的使用說明書。實(shí)施例2f-PSA酶免試劑盒的操作1.抗原抗體反應(yīng)在試劑盒提供的抗體包被板的微孔內(nèi)分別加入100uL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品，或待測血清樣品。2.酶聯(lián)反應(yīng)同時(shí)將HRP-單克隆抗體溶液加入各孔，100uL/L，再加入100uL增敏劑，放入溫控?fù)u床內(nèi)，37X:振蕩、孵育30min。采用洗滌液(1X)重復(fù)洗板3次。3.顯色反應(yīng)每孔加入底物溶液、顯色液各50uL，37'C孵育15min，每孔加入100"L反應(yīng)終止液，結(jié)束反應(yīng)。4.比色以空白對(duì)照孔的吸光值調(diào)零，酶標(biāo)儀在450nm測定0D值并打印結(jié)果。5.結(jié)果計(jì)算A)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測定OD值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；計(jì)算曲線回歸系數(shù)R2，當(dāng)R2>0.98時(shí)本次測驗(yàn)有效。B)評(píng)判質(zhì)控品濃度根據(jù)質(zhì)控品的0D值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出相應(yīng)的濃度值；質(zhì)控品測定濃度值處于給定范圍時(shí)，此次測定有效。C)計(jì)算待測血清樣品濃度當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品均被判定有效時(shí)，根據(jù)待測樣本的0D值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測血清樣品的f-PSA濃度。實(shí)施例3f-PSA酶免試劑盒的質(zhì)量檢測以前述的單克隆抗體S-44-10作為包被抗體，以前述的單克隆抗體S-191-5作為檢測抗體，其它試劑同實(shí)施例1，制備f-PSA酶免試劑盒。對(duì)該試劑盒進(jìn)行質(zhì)量檢測如下1)線性范圍將實(shí)施例1中制備的f-PSA純品稀釋成梯度濃度100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、Ong/ml。按照前述實(shí)施例2操作步驟進(jìn)行測定。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制曲線。所獲得的曲線見圖3。結(jié)果顯示，線性范圍內(nèi)最高檢測上限值為50ng/ml，最低檢測下限值為0.5ng/ml。試劑盒線性范圍為0.5-50ng/ml。2)檢測靈敏度根據(jù)上述線性范圍測定結(jié)果(圖3)，本發(fā)明上述制備的試劑盒的檢測靈敏度為0.5ng/ml。3)準(zhǔn)確性取三份待測正常女性血清，混合后分為三份混合血清標(biāo)本，分別加入f-PSA純品，配成濃度為O、2、10ng/m:L，制成回收試驗(yàn)血清標(biāo)本l共、2tt、3tt。按前述實(shí)施例2操作步驟進(jìn)行測定并計(jì)算結(jié)果。然后計(jì)算回收率。結(jié)果，2#、3tt標(biāo)本的回收率分別為104.9%和107.2%，平均回收率106.0%，即試劑盒的比例偏差為6.0%，準(zhǔn)確性為94.0%。4)精密度抽取IO份前述制備的相同類型的試劑盒，用同一份待測樣本前述實(shí)施例2操作步驟進(jìn)行重復(fù)測定。計(jì)算本次測定結(jié)果，求出均值、SD和變異系數(shù)CV。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，"變異系數(shù)(^=5.09%";批間CV〈15%。5)穩(wěn)定性為了驗(yàn)證試劑盒的穩(wěn)定性，本發(fā)明人將試劑盒各組分置37t:，保存1周，然后用于檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測的準(zhǔn)確性及精密度沒有顯著變化。實(shí)施例4f-PSA酶免試劑盒測定國家參照品f-PSA以前述的單克隆抗體S-44-10作為包被抗體，以前述的單克隆抗體S-191-5作為檢測抗體，其它試劑同實(shí)施例1，制備f-PSA酶免試劑盒。用于測定國家參照品f-PSA。將國家參照品(購自中國藥品生物制品檢定所)稀釋成一系列濃度梯度25、10、5、2.5、1、Ong/ml。使用本發(fā)明的試劑盒，按照前述的操作步驟，測定其吸光度值(0D450)，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，國家參照品和對(duì)應(yīng)濃度吸光度值成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。說明本發(fā)明試劑盒具有極其優(yōu)異的準(zhǔn)確性。表l檢測國家f-PSA參考品<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例5f-PSA酶免試劑盒測定正常人血清f-PSA含量一、臨床血清的獲得從臨床取得健康體檢者血清ll份，其中6份女性血清，5份男性血清。血清的制備釆用臨床檢驗(yàn)科常規(guī)方法，肘靜脈取血，血液置于室溫下lh，凝固后，置4。C，過夜(切勿冰凍)析出血清，離心，4000rpm，10min。在無菌條件，吸出血清，分裝(0.050.2ml)，貯于低溫冰箱。二、使用實(shí)本發(fā)明的試劑盒測定正常血清以前述的單克隆抗體S-44-10作為包被抗體，以前述的單克隆抗體S-191-5作為檢測抗體，其它試劑同實(shí)施例1，制備f-PSA酶免試劑盒。用于測定正常血清。按照前述實(shí)施例2操作步驟，測得各血清吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出血清內(nèi)f-PSA的含量。結(jié)果顯示，5份正常男性血清樣本中有一份的f-PSA含量為0.52ng/inl，其余均在檢測限下，男性平均水平為0.27ng/ml;而6份女性血清f-PSA水平均在檢測限下。表2用本發(fā)明的試劑盒檢測正常人血清f-PSA含量<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實(shí)施例6定量法f-PSA酶免試劑盒測定臨床陽性血清f-PSA含量一、臨床血清的獲得從長征醫(yī)院獲得8份臨床陽性血清。血清的制備方法同實(shí)施例4中所述方法。經(jīng)Abbott化學(xué)法光法自動(dòng)檢測儀檢測T-PSA均〉4ng/ml。二、使用本發(fā)明的試劑盒測定臨床陽性血清以前述的單克隆抗體S-44-l()作為包被抗體，以前述的單克隆抗體S-19卜5作為檢測抗體，其它試劑同實(shí)施例1，制備f-PSA酶免試劑盒。用于測定臨床陽性血清。按照前述實(shí)施例2操作步驟，測得各血清吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出血清內(nèi)f-PSA的含量。本次檢測中參考曲線中f-PSA參考品濃度和吸光度值0D450成線性關(guān)系，R2=0.9859。計(jì)算得到的臨床血清f-PSA濃度值占T-PSA的比例，6#在15%以上，提示前列腺癌的可能性較小，其它血清的比例均在15%以下，提示前列腺癌的可能性較大。表3檢測臨床陽性血清f-PSA含量標(biāo)準(zhǔn)參照品濃度(ng/ml)0D450臨床陽性血清編號(hào)0D450游離PSA含量(ng/ml)總PSA含量(ng/ml)游離PSA比例00.0874#0.2820.715.1613.7%10.3145tt0.3511.078.1513.1%2.50.6656#0.3771.205.7420.9%51.2517tt0.341.018.6911.6%101.9849#0.5071.8716.7911.2%253.146畫0.3030.826.3512.9%11H0.2410.5011.034.5%12tt1.33812.34135.79.1%實(shí)施例7定量法f-PSA酶免試劑盒和商品化試劑盒的比對(duì)一.臨床血清來源從健康體檢者處獲得5份正常血清；從長征醫(yī)院獲得6份臨床陽性血清。血清的制備方法同實(shí)施例4中所述方法。經(jīng)Abbott化學(xué)發(fā)光法自動(dòng)檢測儀檢測T-PSA均〉4ng/ml。二.本發(fā)明試劑盒和商品化試劑盒檢測血清結(jié)果比對(duì)以前述的單克隆抗體S-44-10作為包被抗體，以前述的單克隆抗體S-191-5作為檢測抗體，其它試劑同實(shí)施例1，制備f-PSA酶免試劑盒。按照前述實(shí)施例2操作，檢測血清f-PSA含量。購買BioCheckf-PSA檢測試劑盒(BioCheck公司，LotNO:RN-25907)按照其附帶說明書操作，所得結(jié)果分別用各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算F-PSA的濃度，比對(duì)兩份結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。表4血清f-PSA含量檢測結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>本發(fā)明試劑盒和商品化試劑盒檢測血清f-PSA結(jié)果比對(duì)見圖4和表4。本發(fā)明試劑盒和商品化試劑盒檢測血清f-PSA結(jié)果相關(guān)分析-線性回歸結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，兩種檢測方法的檢測結(jié)果具有非常顯著的相關(guān)性，從而證明本發(fā)明的試劑盒的檢測結(jié)果是非?？尚诺摹Ｈ?靈敏度和耗時(shí)的比較為了進(jìn)一步地比較前述的試劑盒和商品化試劑盒，本發(fā)明人檢測了兩者在0-1ng/ml范圍內(nèi)，對(duì)于f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品測定的吸光度。將純化制備的f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品用樣品稀釋液，稀釋成25、10、5、2.5、l、0ng/ral，分別按照本試劑盒和BioCheck試劑盒的說明書操作，測定在450nm的吸光度，并比較兩種試劑盒的測定結(jié)果。表5測定f-PSA的吸光度的比較本發(fā)明試劑盒；,&商品化試劑盒；吸光度f國PSA濃度(ng/ml)f-PSA濃度(ng/ml)00.054024吸光度0.05310.22610.1102.50.5222.50.19850.91650.453101.556100.816252.985251.958靈敏度由表5可見在0-lng/ml范圍內(nèi)，本發(fā)明的試劑盒l(wèi)ng吸光度是陰性值的4.2倍。而商品化試劑盒l(wèi)ng的吸光度是陰性值的2.1倍，這就顯示本試劑盒信噪比顯著更優(yōu)。此外，以"CUToff值=平均值+3乂標(biāo)準(zhǔn)差"公式計(jì)算所的的結(jié)果也顯示，本發(fā)明的試劑盒的靈敏度顯著高于對(duì)照商品化試劑盒。反應(yīng)時(shí)間上述商品化試劑盒在操作上要求樣品孵育和酶標(biāo)物孵育時(shí)間分別為60分鐘，顯色時(shí)間為15分鐘，加上其它洗滌操作的時(shí)間共150分鐘。本發(fā)明的試劑盒可采取樣品孵育和酶免反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行的操作，操作時(shí)間共30分鐘，顯色為10分鐘，完全可在50分鐘內(nèi)可以完成實(shí)驗(yàn)測定。實(shí)施例8f-PSA單抗配對(duì)效果比較將所述的單克隆抗體分成兩組來制備檢測試劑盒組I:包被抗體S-44-10抗體，檢測抗體S-191-5，采用的其它試劑如實(shí)施例l所制備；組II:包被抗體S-191-5抗體，檢測抗體S-44-10，采用的其它試劑如實(shí)施例l所制備。配對(duì)檢測時(shí)，將f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液稀釋成1000、100、10、1、Ong/ml，用上述組I和組II制備而成的兩種試劑盒，按照實(shí)施例2中的操作步驟，分別檢測這五種1000、100、10、1、Ong/ml稀釋度的f-PSA標(biāo)準(zhǔn)品，將比較組I和組II的試劑盒的檢測效果。結(jié)果見圖6，組II的檢測配對(duì)檢測容易出現(xiàn)HD-HOOK效應(yīng)，即在f-PSA的濃度增加時(shí)，吸光度值反而下降的現(xiàn)象，主要由于抗原抗體反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)決定，和抗體特性相關(guān)，且f-PSA在10-l()0ng/ml其吸光度值小于組I配對(duì)的檢測結(jié)果。在檢測更多的f-PSA稀釋度(100-0ng/ml)時(shí)，組II配對(duì)的檢測結(jié)果也小于組頂己對(duì)的檢測結(jié)果?？梢?，組I的兩種抗體配對(duì)檢測f-PSA效果更優(yōu)于組II的兩種抗體配對(duì)檢測效果。所以最優(yōu)選的情況是選擇S-44-10抗體作為包被抗體、S-191-5作為檢測抗體這一配對(duì)組合。菌種保藏雜交瘤細(xì)胞系S-115-8、雜交瘤細(xì)胞系S-191-5和雜交瘤細(xì)胞系S-44-10保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢)，保藏號(hào)分別為CCTCC-C200620、CCTCC-C200621和CCTCC-C200622，保藏日均為2006年4月29日。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110〉中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>—種診斷前列腺癌的試劑盒<130>067628<160〉1<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉261<212>PRT〈213〉智人(Homosapiens)<400>1MetTrpValProValValPheLeuThrL.euSerValThrT卬lieGly151015AlaAlaProLeulieLeuSerArglieValGlyGlyTrpGluCysGlu202530LysHisSerGinProTrpGinValLeuValAlaSerArgGlyArgAla354045ValCysGlyGlyValUuValHisProGinTrpValLeuThrAlaAla505560HisCyslieArgAsnLysSerVallieLeuLeuGlyArgHisSerLeu65707580PheHisProGluAspThrGlyGinValPheGinValSerHisSerPhe859095ProHisProLeuTyrAspMetSerLeuL,euLysAsnArgPheLeuArg100105110ProGlyAspAspSerSerHisAspLeuMetLeuLeuArgLeuSerGlu115120125ProAlaGluLeuThrAspAlaValLysValMetAspLeuProThrGin130135140GluProAlaLeuGlyThrThrCysTyrAlaSerGlyTrpGlySerlie145150155160GluProGluGluPheLeuThrProLysL,ysLeuGinCysValAspLeu165170175<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>權(quán)利要求1.一種檢測f-PSA的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有一固相載體，所述的固相載體上包被有第一單克隆抗體，所述的第一單克隆抗體選自由保藏號(hào)為CCTCC-C200620的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，由保藏號(hào)為CCTCC-C200621的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，或由保藏號(hào)為CCTCC-C200622的雜交瘤產(chǎn)生的抗體；和容器a，所述的容器a中裝有第二單克隆抗體，所述的第二單克隆抗體選自由保藏號(hào)為CCTCC-C200620的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，由保藏號(hào)為CCTCC-C200621的雜交瘤產(chǎn)生的抗體，或由保藏號(hào)為CCTCC-C200622的雜交瘤產(chǎn)生的抗體；且所述的第二單克隆抗體攜帶一標(biāo)記物；其中，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體不相同，且可同時(shí)結(jié)合于f-PSA。2.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的第一單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C200622的雜交瘤產(chǎn)生的抗體；且所述的第二單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C200621的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。3.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)記物選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。4.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包含(a)容器b，所述的容器b中裝有f-PSA的標(biāo)準(zhǔn)品；和/或(b)容器c，所述的容器c中裝有f-PSA的質(zhì)控品。5.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包含(C)容器d，所述的容器d中裝有與標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的底物；(d)容器e，所述的容器e中裝有顯色劑；(e)容器f，所述的容器f中裝有洗滌液；和/或(f)容器g，所述的容器g中裝有終止液。6.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包含(h)容器h，所述的容器h中裝有增敏劑，所述的增敏劑的配方按照重量比為PEG60004%、甘油1%、蔗糖1%、明膠1%，余量為PBS。7.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的固相載體選自微量滴定板、或微球。8.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒的線性范圍值為0.5-50ng/ml。9.一種體外檢測f-PSA方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將待測樣品加樣于包被有第一單克隆抗體的固相載體，從而使待測樣品中的f-PSA與固相載體上的第一單克隆抗體結(jié)合，形成帶有"f-PSA-第一單克隆抗體"二元復(fù)合物的固相載體；(b)將第二單克隆抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二單克隆抗體-f-PSA-第一單克隆抗體"三元復(fù)合物的固相載體；且所述的第二單克隆抗體攜帶一標(biāo)記物；(c)檢測三元復(fù)合物中的標(biāo)記物，從而確定待檢測樣品中f-PSA的存在與否以及存在的量。附加條件是，步驟(a)和步驟(b)可依次進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。10.如權(quán)利要求9所述的方法，，其特征在于，所述的第一單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C200622的雜交瘤產(chǎn)生的抗體；且所述的第二單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC-C200621的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測f-PSA的試劑盒，所述的試劑盒選用針對(duì)游離的前列腺特異抗原PSA(f-PSA)不同表位的高特異性單克隆抗體分別作為包被抗體和檢測抗體。本發(fā)明的試劑盒靈敏度和準(zhǔn)確性非常高。且可以極其快速地檢測出血液中的f-PSA，對(duì)于臨床快速且準(zhǔn)確地診斷早期前列腺癌以及區(qū)分前列腺癌和良性增生具有重要意義。文檔編號(hào)G01N33/577GK101210927SQ20061014873公開日2008年7月2日申請(qǐng)日期2006年12月30日優(yōu)先權(quán)日2006年12月30日發(fā)明者兵孫,季永庸,朱靜燕,蔡興鋒,黃超鋒申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院