專利名稱：：一種新型檢測評估危重病人的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種非侵入性檢測、評估危重病人試劑盒的新方法，其特征是采用質(zhì)譜法對樣品中己被磁珠或抗體捕獲的e2-微球蛋白進行精確地鑒別、檢測的方法。本發(fā)明提供的方法能夠檢測ICU危重病人及十種不同腫瘤的危重病人，其靈敏度為94%，特異性為100%。
背景技術(shù)：
：隨著人類基因組計劃的實施和完成,科學(xué)家們提出了后基因組(post-genome)計劃的概念，研究要點轉(zhuǎn)移到功能基因組學(xué)上，而生物功能主要體現(xiàn)物質(zhì)是蛋白質(zhì)。1994年，澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wi]kins和Williams首先提出蛋白質(zhì)組(proteome)的概念，指的是"--種基因組所表達的全部蛋白質(zhì)"，即包括--種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)。對于蛋白質(zhì)組的研究是功能基因組學(xué)研究的核心，稱為蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)。蛋白質(zhì)組學(xué)被認為是后基因組硏究中最主要的部分。與基閑組相比，蛋白質(zhì)組的組成更復(fù)雜，功能更活躍，應(yīng)用前景更廣泛。蛋白質(zhì)組學(xué)從細胞整體水平進行蛋白質(zhì)屬性的研究，如表達水平、翻譯后修飾及相IL作用等，并由此獲得對于疾病過程、細胞生理生化特征和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的廣泛完整的認識。所以，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)正在逐步成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及制藥學(xué)等的重要研究手段。不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質(zhì)功能。閑此，鑒定人體內(nèi)表達的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本診斷及篩查，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進行蛋白質(zhì)表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進行化學(xué)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列鑒定分析。用抗體及質(zhì)譜聯(lián)合可克服這技術(shù)缺點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立一種在生物樣品中檢測正常人與某種或多種疾病在離體血液中生物標(biāo)志的試劑盒和方法。該力法為疾病的早期檢測提供了新的途徑，并為進一步發(fā)現(xiàn)新的變異的或修飾的生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明涉及-種非侵入性檢測、評估危重病人的新方法，其特征是采用質(zhì)譜法對樣品中已被WCX/SAX磁珠或抗體捕獲的變異的e2-微球蛋白進行精確地鑒別、檢測的方法。本發(fā)明中的變異的P2-微球蛋白生物標(biāo)志是利用一臺質(zhì)譜儀來發(fā)現(xiàn)的。該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為+/-0.1%。P2-微球蛋白生物標(biāo)志物首先能夠被具有能與生物標(biāo)志物結(jié)合的抗體或磁珠基質(zhì)WCX/SAX吸附表面捕獲，非吸附物能從基質(zhì)上洗脫，吸附到底基的生物標(biāo)志物在飛行質(zhì)譜儀中被檢測。生物標(biāo)志物通過離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產(chǎn)生的離子被-個離子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1Da或6634.0Da強度調(diào)至509b質(zhì)譜信號強度的最大值。生物標(biāo)志物的檢測明顯地將與信號強度的檢測有關(guān)。這樣，生物標(biāo)志物的數(shù)量與質(zhì)量都可以被檢測出來。飛行質(zhì)譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個樣本產(chǎn)生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干擾，并增加了動態(tài)范圍。該飛行時間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾髙頻噪音而減輕高頻噪音。通過對生物標(biāo)志物的吸附和檢測而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計算機的數(shù)據(jù)分析程序進行分析。該計算機程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測出的標(biāo)記物的數(shù)量，并顯示信號的強度和確定被檢測的每個生物標(biāo)志物的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括--系列的確定生物標(biāo)志物的信號強度和矯正數(shù)據(jù)對預(yù)定統(tǒng)計分布狀態(tài)的偏離。例如，通過計算與某些參數(shù)相關(guān)的每個峰值的高度，可規(guī)范觀測到的峰。該參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學(xué)成分產(chǎn)生的不重要的干擾，這可以設(shè)置調(diào)零。計算機可以將計算結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式來表現(xiàn)。其標(biāo)準(zhǔn)譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質(zhì)量信息可以在譜帶中保留，產(chǎn)生--個較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標(biāo)志物更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便于突顯獨特的生物標(biāo)記物和那些高于或低于校準(zhǔn)樣本的生物標(biāo)志物。分析--般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進行選擇，軟件是可用的，它可自動檢測峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于一個選擇閾值并標(biāo)記出在峰信號的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個版本聚集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的峰指定一個質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。對生物標(biāo)志的檢測需要將一個樣本放基質(zhì)的一個吸附點上，接著進行清洗。向吸附點上加入SINAPINIC酸等并讓其千燥。而后，用質(zhì)譜測定法對基質(zhì)進行分析，而-個顯示了蛋白質(zhì)分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量-電荷比的基礎(chǔ)上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。因為本項發(fā)明中的生物標(biāo)記是通過質(zhì)量和抗體來標(biāo)識的，因而它們可通過質(zhì)譜測定法進行檢測而直接知道它們特定的身份。這種方法比抗體為基礎(chǔ)的ELISA及免疫熒光法更準(zhǔn)確。然而，如果有必要，這些生物標(biāo)志也可通過，比如，確定多肽的氨基酸序列來進行鑒別。例如，一個生物標(biāo)志能用許多酶描繪出來，例如V8蛋白酶(V8protease)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestionfragments)的分子量可被用來在數(shù)據(jù)庫中搜索序列，這些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合?；蛘?如果此生物標(biāo)志不是已知數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)分子，在生物標(biāo)志的N極氨基酸序列(N-terminalAminoAcidSequence)的基礎(chǔ)上，可使用降解探針.而后，這些探針會被用來描繪由探測到了生物標(biāo)志的樣本所生成的基因組或cDNA庫。最后，蛋白質(zhì)生物標(biāo)志可用蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片并將碎片用酶解作用或其他可按H腐序從碎片末端除去一個爭個氨基酸分子的方法進行處理后，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對此梯度進行分析。階梯狀碎片(ladderfragments)在質(zhì)量上的差異可鑒別出從分子末端被除去的氨基酸。特異性是指某一物質(zhì)或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質(zhì)或某種疾病的特征。通過某些特征可以識別某種物質(zhì)或某種疾病，從而把它和其他物質(zhì)或疾病區(qū)分開來。對專有特征的識別往往依賴于特殊的檢測方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就要用有關(guān)特異性抗體來檢測。自蛋白質(zhì)組學(xué)研究有新發(fā)展以來，這種傳統(tǒng)意義上特異性檢測和界定方法有了很大的突破。如一個蛋白質(zhì)不同片段變異是不同類型腫瘤的標(biāo)志。根據(jù)基因到蛋白質(zhì)表達的復(fù)雜過程，一種特異性基因的產(chǎn)物一蛋白質(zhì)必定有相關(guān)多組分蛋白質(zhì)的表達。通過對這些不同組分的檢測形成--個綜合模式圖(蛋白指紋圖譜)，將這種圖譜(如某種腫瘤)與其他圖譜(如正常人或其他疾病)相比較，進而識別這種特異蛋白(如腫瘤抗原或其片段)，從而將正常人與患某種疾病病人血液區(qū)分開來。具體操作步驟以下是用本發(fā)明提供的--個操作方案實例。1.樣品處理及標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中，視需要離心澄清樣品。質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備定義符合如下標(biāo)準(zhǔn)供血者l')人，5男5女，血型為0型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標(biāo)正常，包括總膽固醉、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢查、腎功檢査無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。2.樣品上樣將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清及樣品點樣在磁性珠子(磁珠)作為支持物的基質(zhì)上[a.可用WCX或SAX基質(zhì)的磁珠，陰離子表面(WCX，WeakCationicExchanger,—羧酸基團)基質(zhì)磁珠(實施例1)及陽離子表面(SAX,StrongAnionicExchanger,—氨基基團)或用b.已標(biāo)記上抗e2-微球蛋白抗體基質(zhì)的磁珠(實施例2)]?？梢詫①|(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清用于質(zhì)譜的定量方法。基質(zhì)的支持物可以是陶瓷珠、磁性珠、多聚體或S印harosebeads。3.洗滌用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。0.5~29&三氟乙酸徹底洗滌整個磁珠陣列點，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3ram圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5p丄吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。吸會巨分子可用Sin印inicadd或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等。4.質(zhì)譜的定量控制及測試用激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析滯留與各位點的生物標(biāo)志或蛋白質(zhì)。用計算機分析數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)重疊展示。定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1Da或6634.0Da強度調(diào)至50%信號強度的最大值。本發(fā)明與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(1)準(zhǔn)確及精確用抗體及質(zhì)譜聯(lián)合精確檢測多種生物標(biāo)志方法的一個特點是能夠從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出分析物?？贵w與抗原結(jié)合的準(zhǔn)確率超過95%。這是ELISA及免疫熒光試劑盒等的基楚。質(zhì)譜直接分析有很強的精確性，一般誤差率只有0.1Da。因為蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質(zhì)量是已知的，如果知道了抗原或生物標(biāo)志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。但ELISA及免疫熒光試劑盒無法知道抗原的變異。所以，用抗體及質(zhì)譜聯(lián)合精確檢測生物標(biāo)志方法可提供被分析物(抗原或生物標(biāo)志)化學(xué)或結(jié)構(gòu)特征的直接信息。舉例已知纖維蛋白肽A分子的分子量為1536Da,化學(xué)結(jié)構(gòu)為16個氨基酸(N端Ala-Asp-Ser-Gly-Ghi-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Va卜ArgC端)。纖維蛋白肽A的抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)分子量為1536Da的纖維蛋白肽A。則100%可確定被分析物是纖維蛋白肽A，即最精確鑒別(金標(biāo)準(zhǔn))。用纖維蛋白肽A的抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)被分析物是分子量為1465±1Da變異的纖維蛋白肽A。則化學(xué)結(jié)構(gòu)可以(從N端至C端)推測為15個氨基酸N端Asp-Ser-(；1y-Glu-(;Jy-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Giy-Val-ArgC端。(2)方便本方法將蛋白質(zhì)分成了陰離子、陽離子、抗體作用的蛋白質(zhì)。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進行分析。蛋白質(zhì)被鑒定以后可以用數(shù)碼格式(條碼帶)永遠地保留下來。這樣可以節(jié)省標(biāo)本庫的面積。(3)快捷用本發(fā)明提供的已知抗體及質(zhì)譜聯(lián)合精確檢測生物標(biāo)志方法進行疾病血清檢測時，無需對蛋白質(zhì)進行測序即可知"變異的或修飾的生物標(biāo)志"。不像免疫熒光法試劑盒，無法知道"變異的或修飾的生物標(biāo)志"。修飾的生物標(biāo)志指甲基化、乙?；?、羥基化、磷酸化修飾等的高表達或低表達變化。用本發(fā)明提供的蛋白指紋法進行疾病血清診斷時，無需對蛋白質(zhì)進行測序。圖1正常人、ICU感染的危重病人、十種不同腫瘤的危重病人血清中U465土15及11648土15Da蛋白指紋峰值具體實施方式本發(fā)明將結(jié)合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用于說明日的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例1一種新型檢測評估危重病人的試劑盒和方法(1)實驗方法一、材料1.標(biāo)本來源A.50例正常人對照組的血清；B.20例ICU感染的危重病人的血清；C.30例十種不同腫瘤的危重病人(患者死亡前兩個月內(nèi))的血清。2.質(zhì)量控制八.人標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清B.質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用上述標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清。二、方法1.樣品的收集全血采集后吸取血清，置于一80t:保存；-8ox:冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解；以IO，000轉(zhuǎn)/分，4t:離心2分鐘；取上清液。2.樣品的準(zhǔn)備每個吸附劑基質(zhì)支持物點需要血清3W,將血清用2倍體積U9緩沖液(9MUrea，2%CHAPS,50raMTris-HCL,pH9.0)稀釋(例如:3W血清用6W緩沖液稀釋)。將樣品充分混勻。將9W上述樣品加入111J4相應(yīng)的結(jié)合緩沖液，使得血清的總稀釋倍數(shù)達到約40倍。將處理好的血清樣品40W上樣到吸附劑基質(zhì)上。3.樣品檢測上:樣，在W(:X基質(zhì)磁珠陣列點中加入40J4處理好的樣品，置振蕩器，400-600轉(zhuǎn)/分，4'C震蕩1小時。甩出樣品，每孔加入20(Hil的結(jié)合緩沖液50mMNaAC,pH4.0-5.0。室溫置振蕩器400-600轉(zhuǎn)/分，震蕩5分鐘，甩去孔中液體，再次加入結(jié)合緩沖液200W，重復(fù)操作-次。每孔加入200WHPLC水，立刻甩出。1%三氟乙酸徹底洗滌整個WCX磁珠陣列點，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)..t，自然干燥金屬片，加().5iliL吸能分子SINAPINIC酸(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。4.將..匕述樣品加入質(zhì)譜中，就會生成飛行時間質(zhì)譜。外部使用多肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來校正質(zhì)量精確性。(2)實驗結(jié)果用統(tǒng)計學(xué)方法，通過分析血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述一種分子量為1M65土15及11648土15I)a蛋白指紋(圖1A和1B)可以用于區(qū)分正常人血清、ICU危重病人的血清、腫瘤危重病人的血清<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>50例正常人對照組的血清陰性19例ICU危重病人的血清陽性28例腫瘤危重病人的血清陽性發(fā)現(xiàn)分子量為il465土15及11648土15Da蛋白指紋的變化對于鑒別危重病人具有重要意義。通過這個峰的鑒別，本實驗中20例ICU危重病人的血清樣品中有19例被準(zhǔn)確的檢出30例腫瘤危重病人的血清樣品中有28例被準(zhǔn)確的檢出。此結(jié)果表明，該方法的靈敏度為94%(47/50),特異性100%(50/50)。査已知cDNA數(shù)據(jù)庫中的血02-微球蛋白分子的分子量(99個氨基酸時，分子量為11729Da,pl6.07)。實施例2血液中P2-微球蛋白分子鑒定用Carbodiimide方法((arbodiimideMethod)將帶有羧酸基團標(biāo)記的磁性珠上基質(zhì)與抗P2-微球蛋白抗體的氨基基團結(jié)合(GunnDL，etal.Pr印arationofsensitiveandstableerythrocytesby.hecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972;1(4):38卜389.)。將樣品點樣在-個抗e2-微球蛋白抗體基質(zhì)的位點上。用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用1%三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3ram圓孔)上，自然千燥金屬片，加0.5Sinapinicacid吸能分子(以50%乙腈，0.596三氟乙酸的制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析各位點的生物標(biāo)志或蛋白質(zhì)。用計算機分析數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)重疊展示。(3)實驗結(jié)果用抗e2-微球蛋白抗體基質(zhì)與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)被分析物是分子量與實施例i一致，而非已知cDNA數(shù)據(jù)庫中的血液中P2-微球蛋白分亍的分子量(11729Da)。則11鄰5土15及土15Da化學(xué)結(jié)構(gòu)可以推測為變異的P2-微球蛋白。發(fā)現(xiàn)下述變異的P2-微球蛋白可以用于區(qū)分正常人血淸、ICU危重病人的血清、腫瘤危重病人的血清篩選試驗正常人ICU危寬病人腫瘤危重病人變異的P2-微球蛋白(-,(+)(+)合計(例)50192850例正常人對照組的血清陰性19例ICU危重病人的血清陽性28例腫瘤危重病人的血清陽性結(jié)論將來自具有統(tǒng)計意義TOJ危重病人和腫瘤危重病人群的樣品與對照組(正常樣品)比較，用WCX磁珠所捕獲的U46fii15及11648土15Da組或抗P2-微球蛋白抗體吸附表面所捕獲的P2-微球蛋白生物標(biāo)志是一致的。抗02-微球蛋白抗體吸附表面所捕獲的新型變異02-微球蛋白或用WCX磁珠所捕獲的11465及11648i15Da組的試劑盒可檢測、評估危重病人。本發(fā)明提供方法能夠檢測ICU危重感染病人及十種不同腫瘤的危重病人，其靈敏度為94%，特異性為100%。本方法用WCX基質(zhì)、02-微球蛋白抗體吸附表面基質(zhì)及質(zhì)譜法進行鑒別檢測發(fā)現(xiàn)一種新型變異的e2-微球蛋白。變異的e2-微球蛋白可用于危重病人的檢測及評估。變異的e2-微球蛋白升高者提示預(yù)后差。通過wcx基質(zhì)及被抗體吸附表面基質(zhì)上捕獲的變異的e2-微球蛋白，用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清控制下的定量性質(zhì)譜分析來檢測，可以應(yīng)用到已經(jīng)脫離人體的體液中的生物標(biāo)志組合的檢測方法或試劑盒開發(fā)。本方法準(zhǔn)確、方便且快捷。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.本發(fā)明涉及一種檢測、評估危重病人的試劑盒和新方法，其特征是采用質(zhì)譜法對樣品中已被基質(zhì)捕獲的變異的β2-微球蛋白生物標(biāo)志進行精確地鑒別、檢測的方法。該方法通過以下步驟實現(xiàn)(1)樣品處理及質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備；(2)樣品上樣至磁珠基質(zhì)上；(3)洗滌；(4)質(zhì)譜的定量控制及質(zhì)譜測試；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清；所述步驟(2)將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清及樣品點樣在磁珠基質(zhì)上。所述步驟(3)用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用0.5～2％三氟乙酸徹底洗滌磁珠，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用的金屬片上，自然干燥金屬片，加0.5μL以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制備的吸能分子標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等；所述步驟(4)用激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析變異的β2-微球蛋白生物標(biāo)志。用計算機分析數(shù)據(jù)為11465±15及11648±15Da峰值。定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1Da或6634.0Da強度調(diào)至50％信號強度的最大值。2.權(quán)利要求1所述的微球蛋白生物標(biāo)志試劑盒和分析方法，所捕獲的變異的e2-微球蛋白生物標(biāo)志來源于已經(jīng)脫離人體的全血、血清和血漿。3.權(quán)利要求1所述的基質(zhì)包含陰離子表面基質(zhì)、陽離子表面基質(zhì)、抗32-微球蛋白抗體基質(zhì)。基質(zhì)的支持物包含陶瓷珠、磁性珠、多聚體或S印harosebeads。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測、評估危重病人的試劑盒和新方法，為一種非侵入性危重蛋白的體外檢測方法。本方法用抗體吸附表面基質(zhì)及質(zhì)譜法進行鑒別檢測發(fā)現(xiàn)一種新型變異的β2-微球蛋白。變異的β2-微球蛋白或11465±15及11648±15Da峰值可用于危重病人的檢測及評估。變異的β2-微球蛋白或11465±15及11648±15Da峰值升高者提示預(yù)后差。本發(fā)明提供方法能夠檢測ICU危重病人及十種不同腫瘤的危重病人，其靈敏度為94％，特異性為100％。通過11465±15及11648±15Da峰值或被抗體吸附表面基質(zhì)上捕獲的變異的β2-微球蛋白，用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清控制下的定量性質(zhì)譜分析來檢測，可以應(yīng)用到已經(jīng)脫離人體的體液中的生物標(biāo)志組合的檢測方法或試劑盒開發(fā)。本方法準(zhǔn)確、方便且快捷。文檔編號G01N33/543GK101153872SQ200610152579公開日2008年4月2日申請日期2006年9月29日優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日發(fā)明者洋許申請人:洋許