專利名稱：直接膽紅素測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物制劑技術(shù)領域，具體涉及一種直接膽紅素測定試劑盒。
背景技術(shù)：
膽紅素的測定，傳統(tǒng)采用的是重氮試劑法，該法歷史悠久，測值較準，其主要缺點即試劑穩(wěn)定性差、反應特異性差等，雖經(jīng)過了無數(shù)的改良，至今仍無滿意結(jié)果。酶法測定直接膽紅素具有特異的特點，但其試劑盒由于酶熱穩(wěn)定性差、保存時間短、價格過高不利于推廣應用。
目前，化學氧化法測直接膽紅素試劑盒已在市場上占領了很大份額，主要包括釩酸氧化劑試劑盒和亞硝酸鈉氧化劑試劑盒。釩酸氧化劑試劑盒測低值樣本時，副反應較明顯而影響結(jié)果；在自動生化儀上測定時可嚴重干擾其它項目測定；有一定毒性，尤其是廢棄物可能被還原成劇毒的偏釩酸鹽。亞硝酸鹽作為一種溫和的氧化劑，較釩酸鹽等更能減少因氧化性產(chǎn)生的干擾和副反應，且有較好的環(huán)境安全性。但現(xiàn)有亞硝酸鈉氧化劑試劑盒仍存在對于低值樣本的準確度差，抗干擾性弱，靈敏度不高等局限性，影響了其推廣應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有亞硝酸鈉氧化劑試劑盒的不足，提供一種對于低值樣本的測量準確度好，具有較寬線性測試范圍，精確度高，抗干擾性佳，靈敏度高的直接膽紅素測定試劑盒。
本發(fā)明的直接膽紅素測定試劑盒，是由試劑1和試劑2組成的液體型雙試劑，其中試劑1為酒石酸-氫氧化鈉緩沖液(PH 2.6～3.4)7.5～37.5g/L乙二胺四乙酸二鈉 0.2～1g/L硫脲 0.1～1.4g/L鹽酸羥胺 0.2～1.2g/L曲通100 1.5～7.5ml/L試劑2為磷酸氫二鈉1～5.5g/L磷酸二氫鉀0.25～1.5g/L亞硝酸鈉 0.15～0.7g/L
乙二胺四乙酸二鈉2～13g/L氯化鈉 4～22.5g/L硫柳汞 0.04～0.3g/L本發(fā)明的直接膽紅素測定試劑盒的優(yōu)選為試劑1為酒石酸-氫氧化鈉緩沖液(PH 2.8～3.2) 11～22.5g/L乙二胺四乙酸二鈉0.3～0.6g/L硫脲0.2～0.7g/L鹽酸羥胺0.3～0.7g/L曲通100 2.2～4.5ml/L試劑2為磷酸氫二鈉 1.5～3.5g/L磷酸二氫鉀 0.4～0.85g/L亞硝酸鈉0.2～0.4g/L乙二胺四乙酸二鈉3.5～7.5g/L氯化鈉 6.6～13.5g/L硫柳汞 0.07～0.15g/L本發(fā)明的直接膽紅素測定試劑盒的最優(yōu)選為試劑1為酒石酸-氫氧化鈉緩沖液(PH 3.0) 16g/L乙二胺四乙酸二鈉0.5g/L硫脲0.4g/L鹽酸羥胺0.4g/L曲通100 3.5ml/L試劑2為磷酸氫二鈉 2g/L磷酸二氫鉀 0.5g/L亞硝酸鈉0.35g/L乙二胺四乙酸二鈉6g/L氯化鈉 10g/L
硫柳汞0.1g/L本發(fā)明的直接膽紅素測定試劑盒試劑1和試劑2中的原料選擇依據(jù)是酒石酸-氫氧化鈉緩沖液形成適當pH的緩沖液。酸性過大易促使膽紅素發(fā)生自氧化，所以不能使反應pH太低，但pH太高，亞硝酸鹽的氧化性不足，需要更長的反應時間，而反應時間過長又增加了非結(jié)合型膽紅素的氧化反應，導致測量不準確。因此，本發(fā)明控制酒石酸-氫氧化鈉緩沖液的pH值在2.6～3.4。
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)，可絡合測試樣本中的二價金屬離子，減少樣本中膽紅素的自氧化。
鹽酸羥胺，間接膽紅素與亞硝酸鈉反應的抑制劑，作用強。
硫脲，絡合間接膽紅素，作為間接膽紅素與亞硝酸鈉反應的抑制劑。
曲通100，表面活性劑，促進樣本中各種物質(zhì)溶解，減少樣本脂濁等對測定結(jié)果影響，可促進直接膽紅素與亞硝酸鈉的反應。
亞硝酸鈉，具有氧化性，作為氧化劑氧化樣本中的直接膽紅素成膽綠素。
氯化鈉，增強溶液的離子強度，產(chǎn)生原鹽效應，加速測定反應速率。
硫柳汞，作為防腐劑，防止由于細菌硝化作用將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛猁}等。
本發(fā)明試劑盒試劑1和試劑2的制備采用常規(guī)方法混合攪勻即可。
測試樣本中加入本試劑盒試劑1，表面活性劑曲通100可促進樣本中各種物質(zhì)溶解，鹽酸羥胺或硫脲可與間接膽紅素絡合，抑制其反應，乙二胺四乙酸二鈉可絡合樣本中的二價金屬離子；當加入試劑2時，亞硝酸鈉在酸性條件下產(chǎn)生氧化性而將膽紅素氧化成膽綠素，由此測定亞硝酸鈉作用前后吸光度差異，以求得樣品中的直接膽紅素的濃度。
應用本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒測定樣本中直接膽紅素的方法如下樣品(校準管以校準品作樣品)加試劑1混勻，30～40℃反應3～5min后讀取吸光度A1；加入試劑2，混勻，30～45℃反應5min后讀取吸光度A2；根據(jù)公式膽紅素的含量＝測定吸光度(A2-A1)×校準液濃度/校準吸光度(A2-A1)得出直接膽紅素的含量。其中，樣品(校準品)用量8μL，試劑1用量180～320μL，試劑2用量40～120μL。
相對于現(xiàn)有的測定直接膽紅素的試劑盒，本發(fā)明的試劑盒對于低值樣本的測量準確度好，具有線性測試范圍寬，精確度高，抗干擾性佳，靈敏度高的優(yōu)點，適用于全自動生化分析儀，有較大的臨床實用價值。


圖1是本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒的測定直接膽紅素的實時反應曲線圖。
圖2是對比例試劑盒的測定直接膽紅素的實時反應曲線圖。
圖中橫坐標為全自動生化分析儀反應監(jiān)測的時刻，按10分鐘分為35個時段；縱坐標為吸光度A。
具體實施例方式
以下結(jié)合附圖、實施例和對比例對本發(fā)明進行進一步的說明。
實施例1試劑1(R1)酒石酸-氫氧化鈉緩沖液(pH3.4) 7.5g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2) 0.2g硫脲((NH2)2CS) 1.4g鹽酸羥胺 0.2g曲通100(TritonX-100) 7.5mlH2O加至 1L試劑2(R2)磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O) 1g磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.25g亞硝酸鈉(NaNO2) 0.7g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2) 2g氯化鈉(NaCl) 22.5g硫柳汞(C9H9O2HgNaS) 0.04gH2O加至 1L實施例2試劑1(R1)酒石酸-氫氧化鈉緩沖液(pH2.6) 37.5g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2) 1g硫脲((NH2)2CS) 0.1g鹽酸羥胺 1.2g曲通100(TritonX-100) 1.5mlH2O加至 1L
試劑2(R2)磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 5.5g磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.5g亞硝酸鈉(NaNO2) 0.15g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2) 13g氯化鈉(NaCl) 4g硫柳汞(C9H9O2HgNaS) 0.3gH2O加至 1L實施例3試劑1(R1)酒石酸-氫氧化鈉緩沖液(pH2.8) 11g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2) 0.4g硫脲((NH2)2CS) 0.2g鹽酸羥胺 0.7g曲通100(TritonX-100) 2.2mlH2O加至 1L試劑2(R2)磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 1.5g磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.4g亞硝酸鈉(NaNO2) 0.4g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2) 3.5g氯化鈉(NaCl) 13.5g硫柳汞(C9H9O2HgNaS) 0.07gH2O加至 1L實施例4試劑1(R1)酒石酸-氫氧化鈉緩沖液(pH3.2) 22.5g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2) 0.6g
硫脲((NH2)2CS)0.7g鹽酸羥胺0.3g曲通100(TritonX-100)4.5mlH2O加至1L試劑2(R2)磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 3.5g磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.85g亞硝酸鈉(NaNO2)0.2g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2) 7.5g氯化鈉(NaCl)6.6g硫柳汞(C9H9O2HgNaS) 0.15gH2O加至1L實施例5試劑1為酒石酸-氫氧化鈉緩沖液(PH 3.0) 16g乙二胺四乙酸二鈉0.5g硫脲0.4g鹽酸羥胺0.4g曲通100 3.5mlH2O加至1L試劑2為磷酸氫二鈉 2g磷酸二氫鉀 0.5g亞硝酸鈉0.35g乙二胺四乙酸二鈉6g氯化鈉 10g硫柳汞 0.1gH2O加至1L
對比例對比例試劑盒為一種國內(nèi)市售的直接膽紅素測定試劑盒，其成分及配方為試劑1檸檬酸鹽緩沖液(pH＝2.9)1000mmol/LEDTA-Na2 5mmol/L試劑2亞硝酸鈉 4mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0) 10mmol/L本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒的性能測試如下試驗1.線性范圍實驗配制0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μmol/L直接膽紅素標準溶液，分別用本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒和對比例試劑盒來測定其濃度，結(jié)果見表1。
本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒和對比例試劑盒測定樣本中直接膽紅素的方法如下樣品(校準管以校準品作樣品)加試劑1混勻，30～40℃反應3～5min后讀取吸光度A1；加入試劑2，混勻，30～45℃反應5min后讀取吸光度A2；根據(jù)公式膽紅素的含量＝測定吸光度(A2-A1)×校準液濃度/校準吸光度(A2-A1)得出直接膽紅素的含量。其中，樣品(校準品)用量8μL，試劑1用量180～320μL，試劑2用量40～120μL。
表1本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒和對比例試劑盒測定線性范圍對比

本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒的線性范圍較對比例試劑盒的高156％。在直接膽紅素濃度大于250μmol/L時，對比例試劑盒不能檢出，線性范圍過小，這是由于試劑結(jié)構(gòu)性成分決定的?？梢姡景l(fā)明直接膽紅素測定試劑盒具有較大的線性測試范圍。
試驗2靈敏度實驗通過試劑盒與待測膽紅素樣本的實時反應曲線來評價本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒的靈敏度，并與對比例進行比較說明，見附圖1，2。測定樣本中直接膽紅素的方法同試驗1。
可見，本發(fā)明試劑盒的實時反應曲線規(guī)范，樣本經(jīng)與試劑2氧化后產(chǎn)生的吸光度下降明顯，且經(jīng)監(jiān)測時刻10min后吸光度基本穩(wěn)定；而對比例試劑盒經(jīng)與樣本反應后產(chǎn)生的吸光度下降較弱，且經(jīng)監(jiān)測時刻10min后吸光度仍存在下降趨勢。
因此得出本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒具有較高的靈敏度。
試驗3準確度實驗以羅氏校正品定標，測定羅氏高值和低值質(zhì)控品。連續(xù)用本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒和對比例試劑盒進行準確度比較，結(jié)果見表2。測定樣本中直接膽紅素的方法同試驗1。
表2本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒和對比例試劑盒測定準確度對比1

由表2可看出，本發(fā)明試劑盒的準確度較高。
除了對測定羅氏高值和低值質(zhì)控品外，還對臨床大量樣本進行測試。由于J-G重氮試劑法測值較準，我們采用其測值作為標準對比。用J-G重氮試劑法嚴格操作，對提供的樣本進行測定，小于15μmol/L為低值，N＝20。
表3本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒和對比例試劑盒測定準確度對比2

由表3可看出，本發(fā)明試劑盒的準確度較高。
試驗4精確度實驗精確度，也即重現(xiàn)性，以羅氏校正品定標，測定羅氏高值和低值質(zhì)控品，連續(xù)用本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒測定20次，測量其精確度。和對比例試劑盒進行準確度比較，結(jié)果見表4。測定樣本中直接膽紅素的方法同試驗1。
表4本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒和對比例試劑盒測定精確度對比

從表4可以看出，二試劑盒對羅氏高值質(zhì)控品測值準確度和精密度均較高，但對于測定低值質(zhì)控品本發(fā)明試劑盒的精密度更高。
試驗5抗干擾性能實驗在羅氏質(zhì)控品(38.3μmol/L)中加入表5中四種干擾物，再分別用本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒和對比例試劑盒進行直接膽紅素的濃度測定及比較，結(jié)果見表5。測定樣本中直接膽紅素的方法同試驗1。
表5本發(fā)明直接膽紅素測定試劑盒和對比例試劑盒測定抗干擾性能對比

從表5可以看出本發(fā)明試劑盒比實施例試劑盒的抗干擾性能好，尤其是對抗Hb的干擾能力要優(yōu)。
權(quán)利要求
1.一種直接膽紅素測定試劑盒，其特征在于該試劑盒是由試劑1和試劑2組成的液體型雙試劑，其中試劑1為酒石酸—氫氧化鈉緩沖液(PH2.6～3.4)7.5～37.5g/L乙二胺四乙酸二鈉 0.2～1g/L硫脲 0.1～1.4g/L鹽酸羥胺 0.2～1.2g/L曲通100 1.5～7.5ml/L試劑2為磷酸氫二鈉1～5.5g/L磷酸二氫鉀0.25～1.5g/L亞硝酸鈉 0.15～0.7g/L乙二胺四乙酸二鈉 2～13g/L氯化鈉4～22.5g/L硫柳汞0.04～0.3g/L
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接膽紅素測定試劑盒，其特征在于試劑1為酒石酸—氫氧化鈉緩沖液(PH2.8～3.2)11～22.5g/L乙二胺四乙酸二鈉 0.3～0.6g/L硫脲 0.2～0.7g/L鹽酸羥胺 0.3～0.7g/L曲通100 2.2～4.5ml/L試劑2為磷酸氫二鈉1.5～3.5g/L磷酸二氫鉀0.4～0.85g/L亞硝酸鈉 0.2～0.4g/L乙二胺四乙酸二鈉 3.5～7.5g/L氯化鈉6.6～13.5g/L硫柳汞0.07～0.15g/L
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接膽紅素測定試劑盒，其特征在于試劑1為酒石酸—氫氧化鈉緩沖液(PH3.0) 16g/L乙二胺四乙酸二鈉 0.5g/L硫脲 0.4g/L鹽酸羥胺 0.4g/L曲通100 3.5ml/L試劑2為磷酸氫二鈉2g/L磷酸二氫鉀0.5g/L亞硝酸鈉 0.35g/L乙二胺四乙酸二鈉 6g/L氯化鈉10g/L硫柳汞0.1g/L
全文摘要
本發(fā)明公開了一種直接膽紅素測定試劑盒，該試劑盒是由試劑1和試劑2組成的液體型雙試劑，其中試劑1為酒石酸－氫氧化鈉緩沖液(pH 2.6～3.4)7.5～37.5g/L，乙二胺四乙酸二鈉0.2～1g/L，硫脲0.1～1.4g/L，鹽酸羥胺0.2～1.2g/L，曲通1001.5～7.5ml/L；試劑2為磷酸氫二鈉1～5.5g/L，磷酸二氫鉀0.25～1.5g/L，亞硝酸鈉0.15～0.7g/L，乙二胺四乙酸二鈉2～13g/L，氯化鈉4～22.5g/L，硫柳汞0.04～0.3g/L。本發(fā)明試劑盒具有線性測試范圍寬，精確度和準確度高，抗干擾性佳，靈敏度高的優(yōu)點，有較大的臨床實用價值。
文檔編號G01N21/25GK1967252SQ20061015448
公開日2007年5月23日 申請日期2006年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者鄒炳德 申請人:寧波美康生物科技有限公司