專利名稱：實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片、檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲(chóng)分類檢測(cè)技術(shù)，特別是涉及實(shí)蠅科的分類檢測(cè)生物芯片、檢測(cè)方法以及試劑盒。
背景技術(shù)：
地中海實(shí)蠅Ceratitis capitata和桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis是雙翅目Diptera，實(shí)蠅科Tepheitida昆蟲(chóng)。這兩種昆蟲(chóng)是世界上公認(rèn)的農(nóng)業(yè)大害蟲(chóng)，食性雜寄主，非常廣泛，主要危害水果和蔬菜。
地中海實(shí)蠅和桔小實(shí)蠅分別是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫禁止進(jìn)境的危險(xiǎn)性害蟲(chóng)。地中海實(shí)蠅是一種對(duì)水果和蔬菜最具破壞性的危險(xiǎn)性有害生物，可以危害所有對(duì)人類有價(jià)值的水果作物(已報(bào)道352種)，被稱為“果蔬頭號(hào)殺手”。地中海實(shí)蠅原產(chǎn)西非，現(xiàn)已隨果蔬等傳播到世界90多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。地中海實(shí)蠅曾使地中海地區(qū)一些國(guó)家種植的核果受害率高達(dá)100％，希臘的柑橘損失50％，意大利的杏、蘋(píng)果和柑橘損失高達(dá)80％；自1975年地中海實(shí)蠅傳入美國(guó)加利福尼亞州以來(lái)，1986-1991年每年都有發(fā)生，期間共進(jìn)行了10多次大規(guī)模的根除行動(dòng)，耗資達(dá)1.5億美元，與此同時(shí)，世界上34個(gè)國(guó)家和地區(qū)中斷了與美國(guó)的水果、蔬菜的貿(mào)易關(guān)系，使美國(guó)蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
桔小實(shí)蠅寄主范圍很廣泛，是一種嚴(yán)重的果蔬害蟲(chóng)?？蔀楹Ω探?、橙、番石榴、芒果、桃、番荔枝、枇杷、木瓜、黃皮、沙田柚、楊桃、火龍果、龍眼、荔枝、黃皮、香蕉、咖啡、李、杏、櫻桃、番茄、茄子、辣椒等250余種水果和蔬菜。該蟲(chóng)現(xiàn)分布美國(guó)(夏威夷)和亞洲部分地區(qū)(中國(guó)南部、印度、斯里蘭卡、尼泊爾、不丹、緬甸、泰國(guó)、老撾、越南、柬埔寨等)，近幾年我國(guó)的實(shí)蠅監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，桔小實(shí)蠅在我國(guó)的分布有向長(zhǎng)江以北擴(kuò)散的跡象，我國(guó)農(nóng)業(yè)部已公布上海已是桔小實(shí)蠅的分布區(qū)，桔小實(shí)蠅問(wèn)題也是世界果蔬貿(mào)易最常用的技術(shù)壁壘措施之一，我國(guó)因部分地區(qū)是桔小實(shí)蠅疫區(qū)而導(dǎo)致水果和蔬菜出口受到許多國(guó)家的限制，經(jīng)濟(jì)損失巨大。
在亞洲太平洋地區(qū)，已知的桔小實(shí)蠅復(fù)合種達(dá)75種之多，其中有重要經(jīng)濟(jì)意義的有8種，較為常見(jiàn)的5種包括B.(B.)dorsalis及其四個(gè)重要復(fù)合種(木瓜實(shí)蠅B.(B.)papayae、楊桃實(shí)蠅B.(B.)carambolae、菲律賓實(shí)蠅B.(B.)philippinensis、芒果實(shí)蠅B.(B.)occipitalis復(fù)合種之間形態(tài)學(xué)差異非常小，不易區(qū)分開(kāi)來(lái)，桔小實(shí)蠅復(fù)合種的分類鑒定一直是實(shí)蠅科害蟲(chóng)的難點(diǎn)之一，國(guó)內(nèi)外專家意見(jiàn)還未取得完全一致。
目前實(shí)蠅的種類鑒定方法多數(shù)采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定，主要是通過(guò)成蟲(chóng)的形態(tài)特征來(lái)鑒定種類，而不能對(duì)幼蟲(chóng)及卵進(jìn)行鑒定，而且對(duì)近源種間的鑒定存在誤差。但在口岸檢疫中截獲的主要以幼蟲(chóng)和蛹等蟲(chóng)態(tài)為主，果實(shí)蠅屬的幼蟲(chóng)、蛹的特征非常相似，難以鑒定到種，傳統(tǒng)的方法是將幼蟲(chóng)或蛹飼養(yǎng)至成蟲(chóng)再作種類鑒定，這一過(guò)程需要20天以上的時(shí)間且不適合口岸檢疫快速驗(yàn)放的工作程序。因此實(shí)蠅的快速種類區(qū)分是進(jìn)出口果蔬實(shí)蠅貿(mào)易和植物檢疫中最大的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了解決以上問(wèn)題，提供一種能快速、準(zhǔn)確、高通量地進(jìn)行實(shí)蠅物種鑒定和區(qū)分的生物芯片。
本發(fā)明另一目的在于提供一種進(jìn)行實(shí)蠅物種鑒定和區(qū)分的檢測(cè)方法。
本發(fā)明再一目的在于提供一種能快速、準(zhǔn)確、高通量地進(jìn)行實(shí)蠅物種鑒定和區(qū)分的試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開(kāi)了一種實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片，包括固相載體及固定在載體上的探針，所述探針包括科通用探針、屬通用探針以及種通用探針中的至少一種，所述科通用探針為teph，其具有如序列表中Seq ID No.1所示的序列；所述屬通用探針選自anst、cera、bact中的至少一種，其分別具有如序列表中Seq IDNo.2～4所示的序列；所述種通用探針選自以下中的至少一種ccca-1、ccca-2、ccco、cpro、anlu、anob、bboc-1、bboc-2、bbal、bbdi、bbla-1、bbla-2、bbfr、bbne、bbps、bbco-1、bbco-2、bbzo-1、bbzo-2、bbmu、bbum、bgca、baja、bdol-1、bdol-2、bpex、bzta、bzcu-1、bzcu-2、bzis，其分別具有如序列表中Seq ID No.26～55所示的序列。
優(yōu)選的，所述探針還包括亞屬通用探針和/或復(fù)合種/近緣種特異探針；所述亞屬通用探針選自subbact、subzeug中的至少一種，其分別具有如序列表中Seq ID No.5～6所示的序列；所述復(fù)合種/近緣種特異探針選自以下中的至少一種caro、caco-1、caco-2、dor-comp-1、dor-comp-2、dor-comp-3、dor-comp-4、dor-comp-5、dor-comp-6、tyne、tycu、bbcu、coza、tacu、sais-1、sais-2、bpde、bacu-1、bacu-2，其分別具有如序列表中Seq ID No.7～25所示的序列。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述探針還包括定位探針、陽(yáng)性對(duì)照探針、陰性對(duì)照探針中的至少一種。
所述定位點(diǎn)探針具有如序列表中Seq ID No.56所示的序列；所述陽(yáng)性對(duì)照探針具有如序列表中Seq ID No.57所示的序列；所述陰性對(duì)照探針具有如序列表中Seq ID No.58所示的序列。
本發(fā)明還公開(kāi)了一種實(shí)蠅分類鑒定方法，所述方法包括步驟從實(shí)蠅科昆蟲(chóng)卵、幼蟲(chóng)、蛹或成蟲(chóng)提取基因組DNA，用通用引物COI3/COI5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物與上述的實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片雜交，所述通用引物COI3/COI5分別具有如序列表中SeqID No.59～60所示的序列。
所述PCR擴(kuò)增過(guò)程中利用熒光摻入法進(jìn)行熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增。
優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94℃/1.5min；94℃/30s-55℃/30s-72℃/30s，40個(gè)循環(huán)；72℃/5min。
本發(fā)明還公開(kāi)了一種實(shí)蠅分類檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒含有上述的實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片。
由于采用了以上的方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明的生物芯片，通過(guò)選用實(shí)蠅科通用探針、屬通用探針以及種特異探針，或者進(jìn)一步選用亞屬通用探針以及復(fù)合種/近緣種特異探針，能夠快速、準(zhǔn)確、高通量的鑒定實(shí)蠅物種，并且不僅對(duì)實(shí)蠅成蟲(chóng)，對(duì)實(shí)蠅卵、幼蟲(chóng)以及蛹也能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確分類鑒定。


圖1是32種實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片探針點(diǎn)陣示意圖(15×16)。
圖2是桔小實(shí)蠅五個(gè)復(fù)合種分類檢測(cè)生物芯片探針點(diǎn)陣示意圖(8×16)。
圖3為地中海實(shí)蠅及其近緣種分類檢測(cè)生物芯片探針點(diǎn)陣示意圖(6×16)。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的技術(shù)之前，雖然AFLP和PCR-RFLP、特異性引物PCR和SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)等分子生物學(xué)方法先后被嘗試應(yīng)用于實(shí)蠅的分類鑒定，但只能對(duì)單個(gè)實(shí)蠅或少數(shù)種類的鑒定和區(qū)分，還未建立大規(guī)模、高通量的實(shí)蠅鑒定方法。生物芯片技術(shù)以其可高通量、高靈敏度和高特異性等優(yōu)勢(shì)可解決實(shí)蠅種類多，復(fù)合種形態(tài)學(xué)鑒定難以區(qū)分的問(wèn)題，是一種理想的實(shí)蠅分子鑒定技術(shù)平臺(tái)。用生物芯片技術(shù)不僅能在不同蟲(chóng)態(tài)水平快速、準(zhǔn)確進(jìn)行物種分子鑒定，而且能快速、準(zhǔn)確、高通量的進(jìn)行實(shí)蠅物種鑒定和區(qū)分。
本發(fā)明的生物芯片，通過(guò)選用實(shí)蠅科通用探針、屬通用探針以及種特異探針，或者進(jìn)一步選用亞屬通用探針以及復(fù)合種/近緣種特異探針，能夠快速、準(zhǔn)確、高通量的鑒定實(shí)蠅物種，并且不僅對(duì)實(shí)蠅成蟲(chóng)，對(duì)實(shí)蠅卵、幼蟲(chóng)以及蛹也能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確分類鑒定。
本發(fā)明根據(jù)我國(guó)新修訂的進(jìn)境植物檢疫性病蟲(chóng)雜草名錄，并結(jié)合我國(guó)口岸植物檢疫危險(xiǎn)性實(shí)蠅的截獲頻率、國(guó)內(nèi)外實(shí)蠅的發(fā)生危害情況，擬定了地中海實(shí)蠅和桔小實(shí)蠅等危險(xiǎn)性實(shí)蠅(包括3屬12亞屬32種)的生物芯片檢測(cè)方法，32種實(shí)蠅種類名錄如下地中海實(shí)蠅Ceratitis(C.)capitata、納塔爾實(shí)蠅Ceratitis(Pterandrus)rosa、非洲芒果實(shí)蠅Ceratitis(Ceratalaspis)cosyra；桔小實(shí)蠅Bactrocera(Bactrocera)dorsalis、木瓜實(shí)蠅Bactrocera(B.)papayae、楊桃實(shí)蠅Bactrocera(B.)carambolae、菲律賓實(shí)蠅Bactrocera(B.)pilippinensis、芒果實(shí)蠅Bactrocera(B.)occipitalis、番石榴實(shí)蠅Bactrocera(B.)correcta、蒲桃實(shí)蠅Bactrocera(B.)albistrigatus、短條面包果實(shí)蠅Bactrocera(B.)frauenfeldi、迪奧氏實(shí)蠅Bactrocera(B.)diospyiri、大洋洲桔實(shí)蠅Bactrocera(B.)curvipennis、辣椒實(shí)蠅Bactrocera(B.)latifrons、香蕉實(shí)蠅Bactrocera(B.)musae、小昆士蘭實(shí)蠅Bactrocera(Bactrocera)neohumeralis、黑肩角桔實(shí)蠅Bactrocera(B.)psidii、昆士蘭實(shí)蠅Bactrocera(B.)tryoni、三帶實(shí)蠅Bactrocera(B.)umbrosa、桃實(shí)蠅Bactrocera(B.) zonata；扎維斯實(shí)蠅Bactrocera(Afrodacus)jarvisi、黃瓜實(shí)蠅Bactrocera(Austrodacus)cucumis、橄欖實(shí)蠅Bactrocera(Daculus)oleae、艷實(shí)蠅Bactrocera(Gymnodacus)calophylli、日本南瓜實(shí)蠅Bactrocera(Paradacus)depressa、平展實(shí)蠅Bactrocera(Paratridacus)expandens、瓜實(shí)蠅Bactrocera(Zeugodacus)cucurbitae、石垣島實(shí)蠅Bactrocera(Z.)ishigahiensis、具條實(shí)蠅Bactrocera(Z.)scutellata、南瓜實(shí)蠅Bactrocera(Z.)tau、墨西哥按實(shí)蠅Anastrepha ludens、西印度按實(shí)蠅Anastrepha obliqua。
下表1中列出了本發(fā)明所用到的探針。
表1實(shí)蠅生物芯片探針


上述表1中的檢測(cè)探針均為20～30nt的寡核苷酸，序列分別為實(shí)蠅科、屬、種的特異性序列，能夠準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出包含這些特異性序列的不同種類實(shí)蠅，實(shí)現(xiàn)實(shí)蠅的分類鑒別。這些檢測(cè)探針的5’端氨基修飾。
本發(fā)明的生物芯片中，除了上述檢測(cè)探針外，通常還可以包括定位點(diǎn)探針、陽(yáng)性對(duì)照探針以及陰性對(duì)照探針等質(zhì)控探針。本發(fā)明定位點(diǎn)探針、陽(yáng)性對(duì)照探針以及陰性對(duì)照探針優(yōu)選用以下表2中的序列。表2中，定位點(diǎn)探針是一條30nt的寡核苷酸，序列與現(xiàn)知的實(shí)蠅序列無(wú)同源性，3′端氨基修飾，5′端Cy3熒光標(biāo)記。陽(yáng)性對(duì)照探針是一條20nt的寡核苷酸，序列與現(xiàn)知實(shí)蠅序列無(wú)同源性，5′端氨基修飾，其作用是監(jiān)控PCR擴(kuò)增標(biāo)記過(guò)程和雜交過(guò)程是否正常。本發(fā)明中的陰性對(duì)照是也一條23nt的寡核苷酸，序列與現(xiàn)知實(shí)蠅序列無(wú)同源性，5′端氨基修飾，其作用是監(jiān)控雜交過(guò)程非特異性結(jié)合情況，并作為檢測(cè)探針位點(diǎn)陽(yáng)性與否的參照。本發(fā)明的生物芯片還優(yōu)選包括空白對(duì)照，本發(fā)明中的空白對(duì)照是50％DMSO緩沖液，用于檢測(cè)雜交背景。
表2質(zhì)控探針序列

本發(fā)明生物芯片的固相載體可以選用本領(lǐng)域已知可用的載玻片、硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯等。
以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
實(shí)施例1(一)32種危險(xiǎn)性實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片一種地中海實(shí)蠅、桔小實(shí)蠅等32種危險(xiǎn)性實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片，其是在固相載體介質(zhì)表面上固定有寡核苷酸探針點(diǎn)陣。每張基片包括四個(gè)相同的探針點(diǎn)陣區(qū)，每一探針點(diǎn)陣區(qū)包括15行16列點(diǎn)陣。每個(gè)探針點(diǎn)陣內(nèi)部分成四個(gè)功能探針區(qū)，即按實(shí)蠅屬Anastrepha檢測(cè)探針區(qū)、果實(shí)蠅屬Bactrocera檢測(cè)探針區(qū)、小條實(shí)蠅屬Ceratitis檢測(cè)探針區(qū)和質(zhì)控對(duì)照探針檢測(cè)區(qū)(質(zhì)控對(duì)照探針由陽(yáng)性對(duì)照探針、陰性對(duì)照探針和空白對(duì)照探針組成)。探針點(diǎn)陣第1行和第1列由定位點(diǎn)探針組成，檢測(cè)探針和質(zhì)控探針點(diǎn)陣分布如表3及圖1所示。檢測(cè)探針和質(zhì)控探針的每條探針橫向重復(fù)3點(diǎn)。檢測(cè)探針的核苷酸序列及探針特性如表1，質(zhì)控探針和定位點(diǎn)探針如表2所示。
檢測(cè)探針包括科通用探針1條、屬通用探針3條、亞屬通用探針2條、復(fù)合種/近緣種探針19條、種特異探針30條?？蓪?shí)現(xiàn)包括實(shí)蠅科按實(shí)蠅屬Anastrepha spp.、果實(shí)蠅屬Bactrocera spp.和小條實(shí)蠅屬Ceratitis spp.等三個(gè)屬實(shí)蠅種類的初篩以及地中海實(shí)蠅、納塔爾實(shí)蠅、非洲芒果實(shí)蠅；桔小實(shí)蠅、木瓜實(shí)蠅、楊桃實(shí)蠅、菲律賓實(shí)蠅、芒果實(shí)蠅、番石榴實(shí)蠅、蒲桃實(shí)蠅、短條面包果實(shí)蠅、迪奧氏實(shí)蠅、大洋洲桔實(shí)蠅、辣椒實(shí)蠅、香蕉實(shí)蠅、小昆士蘭實(shí)蠅、黑肩角桔實(shí)蠅、昆士蘭實(shí)蠅、三帶實(shí)蠅、桃實(shí)蠅；扎維斯實(shí)蠅、黃瓜實(shí)蠅、橄欖實(shí)蠅、艷實(shí)蠅、日本南瓜實(shí)蠅、平展實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、石垣島實(shí)蠅、具條實(shí)蠅、南瓜實(shí)蠅；墨西哥按實(shí)蠅、西印度按實(shí)蠅等32種實(shí)蠅的鑒定。
表3.32種危險(xiǎn)性實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片探針排布示意圖

(二)生物芯片的制備實(shí)蠅生物芯片的制備包括探針點(diǎn)陣的設(shè)計(jì)、探針的準(zhǔn)備、點(diǎn)樣、固定、洗片和圍欄粘貼等步驟，現(xiàn)分述如下探針點(diǎn)陣的設(shè)計(jì)每張芯片包括4個(gè)相同的探針點(diǎn)陣區(qū)，每個(gè)探針點(diǎn)陣區(qū)根據(jù)設(shè)計(jì)的探針排布(表3)和探針點(diǎn)陣位置(圖1)進(jìn)行點(diǎn)樣。每條探針橫向重復(fù)3點(diǎn)，每點(diǎn)約0.4nL，點(diǎn)直徑約200μm，點(diǎn)間距370μm，點(diǎn)樣均勻度(SV值)約為7％。
探針的準(zhǔn)備探針用50％DMSO點(diǎn)樣緩沖液溶解，濃度為50μM，按探針點(diǎn)樣的順序?qū)⑻结樔芤?100μL)加入96孔板。
點(diǎn)樣利用點(diǎn)樣儀(GeSim NANO plotter 2)將各寡核苷酸探針固化在醛基化玻璃片，經(jīng)過(guò)水合、固定和洗片，獲得帶探針矩陣的芯片。每張基片包括四個(gè)相同的探針點(diǎn)陣區(qū)(15×16)，每個(gè)探針點(diǎn)陣內(nèi)部分成四個(gè)功能探針區(qū)，即按實(shí)蠅屬Anastrepha檢測(cè)探針區(qū)、果實(shí)蠅屬Bactrocera檢測(cè)探針區(qū)、小條實(shí)蠅屬Ceratitis檢測(cè)探針區(qū)和質(zhì)控對(duì)照探針檢測(cè)區(qū)(由陽(yáng)性對(duì)照探針、陰性對(duì)照探針和空白對(duì)照探針組成)。探針點(diǎn)陣第1行和第1列由定位點(diǎn)探針組成。探針由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成和標(biāo)記。
固定點(diǎn)樣后將基片放在保濕盒37℃恒溫固定12小時(shí)以上。
洗片固定后的基片先在0.2％SDS洗液中攪拌清洗2min；水中攪拌清洗2min，重復(fù)三次；然后在0.2％NaBH4封閉液中攪拌封閉5min；再用去離子水中攪拌清洗2min，重復(fù)三次，2000rpm離心2min，晾干。
預(yù)掃描點(diǎn)完片針的芯片，放入GenePix4200A基因芯片掃描儀，用遠(yuǎn)紅外光區(qū)532nm對(duì)基因芯片進(jìn)行預(yù)掃描質(zhì)檢，通過(guò)軟件GenePix Pro5.0(或更高的版本)分析芯片點(diǎn)樣結(jié)果，主要檢查定位點(diǎn)和檢測(cè)探針位點(diǎn)的均勻性，有無(wú)少點(diǎn)或漏點(diǎn)探針等。
圍欄粘貼利用芯片粘貼工具將四孔芯片圍欄小心貼在芯片正面，放入芯片盒，避光室溫保存。
(三)32種危險(xiǎn)性實(shí)蠅分類檢測(cè)方法1、實(shí)蠅基因組DNA的提取利用動(dòng)物/昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒或其它相關(guān)方法獲得實(shí)蠅標(biāo)本基因組DNA，DNA模板必須滿足下游PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)的要求。實(shí)蠅基因組DNA推薦Dneasy Tissue Kit(QIAGEN德國(guó))提取方法，從卵、幼蟲(chóng)、蛹或成蟲(chóng)部分組織如腹部等實(shí)蠅樣本中均可提取得到。
2、熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增分別用實(shí)蠅科mtDNA COI基因通用引物COI3/COI5(表4)，利用熒光摻入法進(jìn)行熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增，即在PCR擴(kuò)增體系中加入含Cy3/Cy5-dCTP。PCR反應(yīng)體系如表5，其中體系中各試劑的量可根據(jù)反應(yīng)體系的總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。標(biāo)記PCR反應(yīng)條件94℃/1.5min；94℃/30s；55℃/30s；72℃/30s，40個(gè)循環(huán)；72℃/5min。引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為430bp。
表4熒光標(biāo)記PCR引物序列

表5熒光標(biāo)記PCR反應(yīng)體系

3、標(biāo)記PCR產(chǎn)物與芯片的雜交反應(yīng)分別各取熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和50℃預(yù)熱的雜交緩沖液(1∶1的10×SSPE與2％SDS)10μl混合(表6)，95℃變性5min后，迅速放入冰水混合物中冰浴5min。
表6雜交反應(yīng)體系

在芯片雜交盒(北京博奧)兩側(cè)小槽中加入200μL去離子水(保持雜交盒內(nèi)濕度)，將已制備完備的芯片(制備方法參見(jiàn)上文)正面朝上放進(jìn)雜交盒中，對(duì)準(zhǔn)方向放入4圍欄蓋片，通過(guò)加樣孔將冰浴的熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物和雜交液混合物一次注入，使其充滿蓋片和芯片之間空隙，封閉雜交盒，置于46℃恒溫環(huán)境3小時(shí)。
雜交完畢后棄去蓋片，芯片探針面向下在少量50℃預(yù)熱的雜交洗液I(表7)中漂去殘余雜交液(注意避免四個(gè)矩陣的雜交液交叉污染)，在42℃預(yù)熱的雜交洗液I攪拌清洗2min，再在50℃預(yù)熱的雜交洗液II攪拌清洗2min，2000rpm離心1min，置暗盒室溫保存。
表7芯片雜交洗液

4、芯片掃描在基因芯片掃描儀(GenePix4200A，Axon)在遠(yuǎn)紅外光區(qū)532nm處對(duì)基因芯片進(jìn)行掃描，PMT值為800。再通過(guò)軟件GenePix Pro 5.0分析芯片掃描的結(jié)果，得出相關(guān)的數(shù)據(jù)，并保存。
5、數(shù)據(jù)分析和信號(hào)判讀雜交信號(hào)依據(jù)下述原則進(jìn)行判讀(1)每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)信號(hào)值＝該點(diǎn)熒光強(qiáng)度值-該點(diǎn)背景強(qiáng)度值；(2)空白對(duì)照平均信號(hào)值＝3個(gè)空白對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值的平均值；(3)陰性對(duì)照平均信號(hào)值＝3個(gè)陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值的平均值-空白對(duì)照平均信號(hào)值；(4)每條探針的每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)信號(hào)值—空白對(duì)照平均信號(hào)值＞10倍陰性對(duì)照平均信號(hào)值即判讀該檢測(cè)點(diǎn)為陽(yáng)性；(5)每條探針的3個(gè)重復(fù)檢測(cè)點(diǎn)均為陽(yáng)性即判讀該條探針為陽(yáng)性；(6)如定位探針部分或全部為陰性，則表明探針與片基結(jié)合有問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確；(7)如陽(yáng)性對(duì)照為陰性，則表明擴(kuò)增標(biāo)記或雜交環(huán)節(jié)存在問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確；
6、結(jié)果判定原則在質(zhì)控探針和定位點(diǎn)探針均正常情況下，檢測(cè)結(jié)果和判斷原則如下當(dāng)teph出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為實(shí)蠅科Tephritidae；Anastepha屬實(shí)蠅的鑒定當(dāng)teph，anst同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為按實(shí)蠅屬Anastrepha spp.；當(dāng)teph，anst，anlu同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為墨西哥按實(shí)蠅Anastrepha lundes；當(dāng)teph，anst，anob同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為西印度按實(shí)蠅Anastrepha obliqua。
Bactrocera屬實(shí)蠅的鑒定當(dāng)teph，bact同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為果實(shí)蠅屬Bactrocera spp.；當(dāng)teph，bact，subbact同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為果實(shí)蠅亞屬Bactrocera sp.；桔小實(shí)蠅、木瓜實(shí)蠅、楊桃實(shí)蠅、菲律賓實(shí)蠅和芒果實(shí)蠅的結(jié)果判定見(jiàn)以下實(shí)例2。
當(dāng)teph，bact，subbact，coza.，bbco-1，bbco-2同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為番石榴實(shí)蠅Bactrocera correcta；當(dāng)teph，bact，subbact，coza，bbzo-1，bbzo-2同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為桃實(shí)蠅Bactrocera(B.)zonata；當(dāng)teph，bact，subbact，bbal同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為蒲桃實(shí)蠅Bactrocera(B.)albistrigatus；當(dāng)teph，bact，subbact，bbdi同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為迪奧氏實(shí)蠅Bactrocera(B.)diospyiri；當(dāng)teph，bact，subbact，bbla-1，bbla-2同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為辣椒實(shí)蠅Bactrocera(B.)latifrons；當(dāng)teph，bact，subbact，bbfr同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為短條面包果實(shí)蠅Bactrocera(B.)frauenfeldi；當(dāng)teph，bact，subbact，bbps同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為黑肩角桔實(shí)蠅Bactrocera(B.)psidii；當(dāng)teph，bact，subbact，tyne，bbne同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為小昆士蘭實(shí)蠅Bactrocera(B.)neohumeralis；當(dāng)teph，bact，subbact，tyne，tycu同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為昆士蘭實(shí)蠅Bactrocera(B.)tryoni；當(dāng)teph，bact，subbact，bbcu同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，但tyne，bbne不出現(xiàn)信號(hào)，判定為大洋洲桔實(shí)蠅Bactrocera(B.)curvipennis；當(dāng)teph，bact，subbact，bbmu同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為香蕉實(shí)蠅Bactrocera(B.)musae；當(dāng)tcph，bact，subbact，bbum同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為三帶實(shí)蠅Bactrocera(B.)umbroa；當(dāng)teph，bact，subbact，baja同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為扎維斯實(shí)蠅Bactrocera(Afrodacus)jarvisi；當(dāng)teph，bact，subbact，bacu-1，bacu-2同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為黃瓜實(shí)蠅Bactrocera(Austrodacus)cucumis；當(dāng)teph，bact，subbact，bgca同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，bbcu也出現(xiàn)信號(hào)，判定為艷實(shí)蠅Bactrocera(Gymnodacus)calophylli；當(dāng)teph，bact，subbact，bpde同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，但bgca，bbcu不出現(xiàn)信號(hào)，判定為日本南瓜實(shí)蠅Bactrocera(Paradacus)depressa；當(dāng)teph，bact，subbact，bpex同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為平展實(shí)蠅Bactrocera(Paratridacus)expandens；當(dāng)teph，bact，subbact，bdol-1，bdol-2同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為橄欖實(shí)蠅Bactrocera(Daculus)oleae；當(dāng)teph，bact，subzeug同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為亞屬Zeugodacus sp.；當(dāng)teph，bact，subzeug，tacu，bzta同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為南瓜實(shí)蠅Bactrocera(Z.)tau；當(dāng)teph，bact，subzeug，tacu，bzcu-1，bzcu-2同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為瓜實(shí)蠅Bactrocera(Z.)cucurbitae；當(dāng)teph，bact，subzeug，sais-1，sais-2同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為具條實(shí)蠅Bactrocera(Z.)scutellata；teph，bact，subzeug，sais-1，sais-2，bzis同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為石垣島實(shí)蠅Bactrocera(Z.)ishigahiensis；Ceratitits屬實(shí)蠅的鑒定當(dāng)teph，cera同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為小條實(shí)蠅屬Ceratitis spp.；當(dāng)?shù)刂泻?shí)蠅、納塔爾實(shí)蠅和非洲芒果實(shí)蠅的結(jié)果判定見(jiàn)以下實(shí)例3。
實(shí)施例2 桔小實(shí)蠅五個(gè)復(fù)合種分類檢測(cè)生物芯片及其檢測(cè)方法桔小實(shí)蠅B.(B.)dorsalis及其四個(gè)重要復(fù)合種(木瓜實(shí)蠅B.(B.)papayae、楊桃實(shí)蠅B.(B.)carambolae、菲律賓實(shí)蠅B.(B.)philippinensis、芒果實(shí)蠅B.(B.)occipitalis)生物芯片檢測(cè)探針排布如表8及圖2所示。探針包括科通用探針1條、屬通用探針1條、亞屬通用探針1條、復(fù)合種特異探針6條、種特異探針2條，一組質(zhì)控探針(陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照探針)和定位點(diǎn)探針。探針點(diǎn)陣如圖2，檢測(cè)探針和質(zhì)控探針的每條探針橫向重復(fù)3點(diǎn)。探針序列參照表1、表2。上述探針可實(shí)現(xiàn)果實(shí)蠅屬Bactrocera spp.種類初篩和區(qū)分鑒定桔小實(shí)蠅五個(gè)復(fù)合種。
表8桔小實(shí)蠅五個(gè)復(fù)合種生物芯片檢測(cè)探針排布示意列表

除探針排列方式以外，該實(shí)施例中桔小實(shí)蠅五個(gè)復(fù)合種生物芯片的制備及檢測(cè)方法與實(shí)施例1中所描述方法的基本相同。
此外，利用本實(shí)施例的生物芯片對(duì)桔小實(shí)蠅五個(gè)復(fù)合種進(jìn)行分類檢測(cè)時(shí)，結(jié)果判定按照以下描述的方法進(jìn)行。
在質(zhì)控探針和定位點(diǎn)探針均正常的情況下，檢測(cè)結(jié)果和判斷原則如下當(dāng)teph出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為實(shí)蠅科Tephritidae；當(dāng)teph，bact同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為果實(shí)蠅屬Bactrocera spp.；當(dāng)teph，bact，subbact同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為果實(shí)蠅亞屬Bactrocera sp.；當(dāng)teph，bact，subbact，dor-comp-1同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為桔小實(shí)蠅五個(gè)復(fù)合種Bactrocera dorsalis complex；當(dāng)teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-3，dor-comp-4，dor-comp-5同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為楊桃實(shí)蠅Bactrocera carambolae；當(dāng)teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-2，dor-comp-3，dor-comp-4，dor-comp-5同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為菲律賓實(shí)蠅Bactrocera philippinensis；當(dāng)teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-2，dor-comp-3，dor-comp-4，dor-comp-6同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis；當(dāng)teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-2，dor-comp-3，dor-comp-4，dor-comp-5，dor-comp-6同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為木瓜實(shí)蠅Bactrocera papayae。
當(dāng)teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-2，dor-comp-4，dor-comp-6，bboc-1，bboc-2同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為芒果實(shí)蠅Bactrocera occipitalis；
實(shí)施例3 地中海實(shí)蠅及其近緣種分類檢測(cè)生物芯片及其檢測(cè)方法地中海實(shí)蠅C.capitata及其二個(gè)近緣種納塔爾實(shí)蠅C.rosa和非洲芒果實(shí)蠅C.cosary生物芯片檢測(cè)探針排布如表9所示。探針組除定位點(diǎn)探針外，還包括科通用探針1條、屬通用探針1條、近緣種特異探針2條、種特異探針4條和一組質(zhì)控(陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照)探針。檢測(cè)探針、質(zhì)控探針和定位點(diǎn)探針的探針點(diǎn)陣如圖3所示，檢測(cè)探針和質(zhì)控探針的每條探針橫向重復(fù)3點(diǎn)。上述探針組可實(shí)現(xiàn)小條實(shí)蠅屬Ceratitis spp.種類初篩和地中海實(shí)蠅、納塔爾實(shí)蠅和非洲芒果實(shí)蠅的種類鑒定。
表9地中海實(shí)蠅及其近緣種生物芯片檢測(cè)探針排布示意列表

除探針排列方式以外，該實(shí)施例中地中海實(shí)蠅及其近緣種生物芯片的制備及檢測(cè)方法與實(shí)施例1中所描述方法的基本相同。
此外，利用本實(shí)施例的生物芯片對(duì)地中海實(shí)蠅及其近緣種進(jìn)行分類檢測(cè)時(shí)，結(jié)果判定按照以下描述的方法進(jìn)行。
在質(zhì)控探針和定位點(diǎn)探針均正常情況下，檢測(cè)結(jié)果和判斷原則如下當(dāng)teph出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為實(shí)蠅科Tephritidae.；當(dāng)teph，cera同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為小條實(shí)蠅屬Ceratitis spp.；當(dāng)teph，cera，caro，cpro同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為納塔爾實(shí)蠅Ceratitis rosa；當(dāng)teph，cera，caco-1，caco-2，ccco同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為非洲芒果實(shí)蠅Ceratitiscosyra；當(dāng)teph，cera，caro，caco-1，caco-2，ceca-1，ccca-2同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判定為地中海實(shí)蠅Ceratitis capitata.
實(shí)施例4 實(shí)蠅生物芯片的檢測(cè)試劑盒本發(fā)明提供了對(duì)實(shí)蠅科昆蟲(chóng)卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)快速鑒定或初篩的生物芯片檢測(cè)試劑盒。試劑盒包括試劑和芯片。根據(jù)需要，芯片可以選用實(shí)施例1～3中的任意一種芯片。
試劑盒組成與貯存條件實(shí)蠅芯片試劑盒由芯片、芯片蓋片、標(biāo)記PCR試劑、陽(yáng)性對(duì)照樣品、2×雜交緩沖液等組分組成，同時(shí)還附1份使用手冊(cè)，各組分的數(shù)量或容積、貯存條件見(jiàn)表4。
表10實(shí)蠅芯片檢測(cè)試劑盒

實(shí)蠅芯片試劑盒可實(shí)現(xiàn)地中海實(shí)蠅及其近緣種的鑒定和區(qū)分、桔小實(shí)蠅5個(gè)復(fù)合種的鑒定與區(qū)分，同時(shí)還可實(shí)現(xiàn)32種危險(xiǎn)性實(shí)蠅的種類鑒定和按實(shí)蠅屬Anastrepha、果實(shí)蠅屬Bactrocera和小條實(shí)蠅屬Ceratitis三個(gè)屬實(shí)蠅的種類初篩。試劑盒具有快速、靈敏和高通量并行檢測(cè)的能力，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，可應(yīng)用于出入境檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)、食品衛(wèi)生監(jiān)督系統(tǒng)以及農(nóng)業(yè)植保部門(mén)對(duì)實(shí)蠅的檢測(cè)和監(jiān)控工作，也可用于進(jìn)行實(shí)蠅物種鑒定和區(qū)分。
實(shí)驗(yàn)例 實(shí)蠅生物芯片檢測(cè)芯片及試劑盒在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用實(shí)蠅生物芯片的主要檢測(cè)對(duì)象是從水果蔬菜中發(fā)現(xiàn)的實(shí)蠅類卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)等，其中卵、幼蟲(chóng)和蛹不能作為常規(guī)方法中種類鑒定的依據(jù)，需經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)到成蟲(chóng)才能最后鑒定其種類；上述實(shí)蠅樣品用實(shí)蠅生物芯片檢測(cè)的結(jié)果，可以與用從卵、幼蟲(chóng)和蛹人工飼養(yǎng)的成蟲(chóng)鑒定結(jié)果比較，檢驗(yàn)生物芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性。成蟲(chóng)則可用整頭或部分蟲(chóng)體進(jìn)行種類復(fù)合性檢測(cè)，如發(fā)現(xiàn)為地中海實(shí)蠅需要復(fù)核檢測(cè)時(shí)，可用實(shí)蠅生物芯片過(guò)到上述目的。
實(shí)蠅芯片檢測(cè)蟲(chóng)樣的收集和種類鑒定。舉例說(shuō)明進(jìn)口龍眼實(shí)蠅檢疫鑒定。從進(jìn)口泰國(guó)龍眼檢疫中發(fā)現(xiàn)一個(gè)蟲(chóng)果有實(shí)蠅卵27粒，收集5-8粒卵，用無(wú)水酒精浸泡-4℃保存用于實(shí)蠅芯片檢測(cè)樣品，其余卵粒接種在龍眼果實(shí)上，26-28℃培養(yǎng)2-3天，卵孵化成幼蟲(chóng)，期間補(bǔ)充幼蟲(chóng)所需的寄主(新鮮龍眼)，待幼蟲(chóng)長(zhǎng)成2-3齡，取幼蟲(chóng)2-3頭(用無(wú)水酒精浸泡-4℃保存用于實(shí)蠅芯片檢測(cè)樣品)，其余幼蟲(chóng)繼續(xù)飼養(yǎng)一周左右后老熟幼蟲(chóng)化蛹，取蛹1-2頭(用無(wú)水酒精浸泡-4℃保存用于實(shí)蠅芯片檢測(cè)樣品)；其余繼續(xù)飼養(yǎng)，10-15天蛹羽化成蟲(chóng)并確保形態(tài)特征成熟穩(wěn)定，成蟲(chóng)置體視顯微鏡鑒定為桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis。
期間，將從泰國(guó)龍眼上收集的實(shí)蠅的卵、幼蟲(chóng)和蛹樣品分別按照實(shí)施例1中所描述的方法進(jìn)行分類檢測(cè)，生物芯片檢測(cè)與結(jié)果判定同樣為桔小實(shí)蠅。
采用相同方法驗(yàn)證其余31種實(shí)蠅，結(jié)果均證明采用本發(fā)明的生物芯片檢測(cè)方法進(jìn)行分類的結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，但比傳統(tǒng)方法更加快速、準(zhǔn)確且易于推廣應(yīng)用。
序列表<110>深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心<120>實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片、檢測(cè)方法及試劑盒<130>0610867<160>60<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>teph探針<400>1agcaaagact gctcctattg ataat25<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>anst探針<400>2ggaagtgtgc tactacataa taagtatcg29<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>cera探針<400>3agctggtgag tagtttaatt gtg 23<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>bact探針<400>4cacaatatgg ctggtgaata gttt 24<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>subbact探針<400>5gggtatcagt gaacgaatcc t21<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>subzeug探針<400>6aatgagctac tacgtagtaa gtgtc25<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>caro探針<400>7cgttaaacct ccaactgtaa a 21<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>caco-1探針<400>8atagctgggg aataatttaa ttg 23<210>9
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>caco-2探針<400>9ggggaataat ttaattgagt ccc 23<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-1探針<400>10ataatagcaa agattgctcc tattga26<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-2探針<400>11ccgataaata tgataatgaa ctgactt 27<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-3探針<400>12ttactccgat agacatgata ataaattg 28<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>dor-comp-4探針<400>13ctacgtaata tgtgtcatga agaa 24<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-5探針<400>14aaaccctagg gcttacaata tgg 23<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-6探針<400>15atcatttagg attcaatact agccc 25<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>tyne探針<400>16agtgggtacc agtgaacaaa c 21<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>tycu探針<400>17ctcatagcat agctggggaa taa23<210>18
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>coza探針<400>19caatgaatta gctaggacaa ctcct 25<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>tacu探針<400>20tgaagaataa tatcaacaga agagt 25<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>sais-1探針<400>21ataaatatga tgataaattg gctt 24<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>sais-2探針<400>22ataatgtcta cggaagaatt agc 23<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bpde探針<400>23atgaattagc aaggacgact c 21<210>24<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bacu-1探針<400>24gctcataaca tagctggtga ataatt 26<210>25<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bacu-2探針<400>25ccagttaatc ctccgactgt aaa23<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>ccca-1探針<400>26agaacaacgc ccgttaaacc20<210>27
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>ccca-2探針<400>27aacaaatcct gctatgatag caaat25<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>ccco探針<400>28ctgttaaacc cccaactgtg a21<210>29<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>cpro探針<400>29acataatgga agtgtgctac aac 23<210>30<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>anlu探針<400>30gtaaataaga agacaaaccc tagagct 27<210>31<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>anob探針<400>31cagatgagtt agcaagtatt actccag27<210>32<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bboc-1探針<400>32tatgataatg aactgacttt ttaatc 26<210>33<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bboc-2探針<400>33ctccgataaa tatgataatg aactgac27<210>34<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbal探針<400>34gtcctgtaaa tagcgggtat caa 23<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbdi探針<400>35gaaatgtgcc acgacatagt a 21<210>36
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbla-1探針<400>36tatcgttggg gaataattca att 23<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbla-2探針<400>37tttagtcagg ttgggtttag ta22<210>38<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbfr探針<400>38tttagtacta atcctgtaaa tagtgg26<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbne探針<400>39tagttgagtg ccgtgtaatg t 21<210>40<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>bbps探針<400>40ccctattgat aacacatagt gga 23<210>41<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc feature<223>bbco-1探針<400>41gaaatgagca acaacataat atgtgt26<210>42<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbco-2探針<400>42cctgtaaata gagggtatca gtg 23<210>43<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbzo-1探針<400>43cgataaatat ggtaataaat tgac 24<210>44<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbzo-2探針<400>44aaatgagcta caacataata tgtatcgt 28<210>45
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbmu探針<400>45actccgataa atatggtaat aaattgac28<210>46<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbum探針<400>46ctcagatgat aaataggaat aataagattc 30<210>47<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bgca探針<400>47actagccctg taaacagtgg gtat24<210>48<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>baja探針<400>48ggatttagta ccagtcctgt gaataa 26<210>49<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>bdol探針<220>
<221>misc_feature<223>bdol-1探針<400>49gtctacagaa gaataagcaa gtacaactc29<210>50<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bdol探針<220>
<221>misc_feature<223>bdol-2探針<400>50atttagtccg gtgaataggg g 21<210>51<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bpex探針<400>51ccagatcggg tttagagtga gt22<210>52<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bzta探針<400>52tacaaatccg gctataatag caaa 24<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bzcu-1探針<400>53caaaacctaa agctcatagc a 21<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bzcu-2探針<400>54tactccagtt agtcccccaa 20<210>55<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bzis探針<400>55ctataatagc gaacactgct cctata26<210>56<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>定位點(diǎn)探針<400>56tggataccca acttagctat taatagtc 28<210>57<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>陽(yáng)性對(duì)照探針<400>57tgagaccaac caactgaaac g 21
<210>58<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>陰性對(duì)照探針<400>58gactatagta taagcgcggt cca23<210>59<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>COI3引物<400>59ttttagttga ctggctacat tacatgg27<210>60<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>COI5引物<400>60ctggaggggt attttgaagt catt 2權(quán)利要求
1.一種實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片，包括固相載體及固定在載體上的探針，其特征在于所述探針包括科通用探針、屬通用探針以及種通用探針中的至少一種，所述科通用探針為teph，其具有如序列表中Seq ID No.1所示的序列；所述屬通用探針選自anst、cera、bact中的至少一種，其分別具有如序列表中Seq IDNo.2～4所示的序列；所述種通用探針選自以下中的至少一種ccca-1、ccca-2、ccco、cpro、anlu、anob、bboc-1、bboc-2、bbal、bbdi、bbla-1、bbla-2、bbfr、bbne、bbps、bbco-1、bbco-2、bbzo-1、bbzo-2、bbmu、bbum、bgca、baja、bdol-1、bdol-2、bpex、bzta、bzcu-1、bzcu-2、bzis，其分別具有如序列表中Seq ID No.26～55所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片，其特征在于所述探針還包括亞屬通用探針和/或復(fù)合種/近緣種特異探針；所述亞屬通用探針選自subbact、subzeug中的至少一種，其分別具有如序列表中Seq ID No.5～6所示的序列；所述復(fù)合種/近緣種特異探針選自以下中的至少一種caro、caco-1、caco-2、dor-comp-1、dor-comp-2、dor-comp-3、dor-comp-4、dor-comp-5、dor-comp-6、tyne、tycu、bbcu、coza、tacu、sais-1、sais-2、bpde、bacu-1、bacu-2，其分別具有如序列表中Seq ID No.7～25所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片，其特征在于所述探針還包括定位探針、陽(yáng)性對(duì)照探針、陰性對(duì)照探針中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片，其特征在于所述定位點(diǎn)探針具有如序列表中Seq ID No.56所示的序列；所述陽(yáng)性對(duì)照探針具有如序列表中SeqID No.57所示的序列；所述陰性對(duì)照探針具有如序列表中Seq ID No.58所示的序列。
5.一種實(shí)蠅分類鑒定方法，所述方法包括步驟從實(shí)蠅科昆蟲(chóng)卵、幼蟲(chóng)、蛹或成蟲(chóng)提取基因組DNA，用通用引物COI3/COI5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物與權(quán)利要求1～4任意一項(xiàng)所述的實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片雜交，所述通用引物COI3/COI5分別具有如序列表中Seq ID No.59～60所示的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種實(shí)蠅分類鑒定方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增過(guò)程中利用熒光摻入法進(jìn)行熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種實(shí)蠅分類鑒定方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94℃/1.5min；94℃/30s-55℃/30s-72℃/30s，40個(gè)循環(huán)；72℃/5min。
8.一種實(shí)蠅分類檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有權(quán)利要求1～4任意一項(xiàng)所述的實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種實(shí)蠅分類檢測(cè)生物芯片、檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的生物芯片，通過(guò)選用實(shí)蠅科通用探針、屬通用探針以及種特異探針，或者進(jìn)一步選用亞屬通用探針以及復(fù)合種/近緣種特異探針，能夠快速、準(zhǔn)確、高通量地鑒定實(shí)蠅物種，并且不僅對(duì)實(shí)蠅成蟲(chóng)，對(duì)實(shí)蠅卵、幼蟲(chóng)以及蛹也能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確分類鑒定。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1995393SQ20061015780
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月20日
發(fā)明者余道堅(jiān), 章桂明, 李建光, 任魯風(fēng), 楊偉東, 汪萬(wàn)春, 陳枝楠, 周琦, 徐浪 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心