專利名稱：：診斷原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌的方法專利說明診斷原發(fā)性惡性肝肝瘤肝細胞癌的方法交叉參考相關(guān)申請〖0002本申請要求2005年11月28日申請的U.S.臨時申請No.60〃40,223的利益，將其公開的內(nèi)容引入本文作為參考。發(fā)明背景HCC的單個最重要的胂瘤標記物為a-胎兒球蛋白(AFP)。用血清AFP水平和超聲檢查法檢測的HCC已被推薦用于肝硬化的患者。盡管4艮好地建立起了在HCC的篩查和診斷過程中本全測血清AFP水平，但是其主要缺點是血清AFP對早期癌的檢測不靈敏。存在其它有希望的腫瘤標記物，例如脫-y凌基凝血素、乒豆凝集素活性AFP(lensculinarisagglutinin-reactiveAFP)、胰腺炎相關(guān)蛋白和胰島素樣生長因子-1，但是這些標記物中沒有一種被批準用于臨床應(yīng)用。0006人類肝細胞生長因子(HGF)第一次描述為肝營養(yǎng)因子是在八十年代早期，發(fā)現(xiàn)于部分肝切除的大鼠血漿中，其在1986-1987從患有暴發(fā)性肝功能衰竭的患者和大鼠血小板中純化。已顯示HGF為與散射因子和肺瘤細胞毒素因子相同的蛋白，現(xiàn)在已知其為光鐠生長因子，其不僅剌激肝細胞生長，還刺激許多其它類型的上皮和內(nèi)皮細胞生長。在人類中，在嚴重肝病例如暴發(fā)性肝功能衰竭期間，HGF的血漿水平增長至高于10ng/ml,當患者的疾病康復(fù)后，其快速降低至正常水平。在不特別嚴重的肝損傷例如急性肝炎中，血漿中HGF的水平增加至0.5-1ng/ml,其接近用于刺激培養(yǎng)基中人類肝細胞DNA合成的半數(shù)最大濃度。因此，認為HGF參與控制肝再生。也表明HGF與包括HCC的某些人類癌癥有關(guān)。白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-IO)為由一定范圍的細胞生成的多功能細胞因子，在宿主防御機制和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中起重要作用。最近，表明IL"6由表皮細胞和表皮樣癌細胞系以及其它上皮細胞瘤生成，所迷其它上皮腫瘤包括膀胱癌、腎細胞癌和卵巢癌。在患有多發(fā)性骨髓瘤、腎細胞癌、膀胱癌、頭癌和頸部癌、卵巢癌和膽管癌的患者中發(fā)現(xiàn)血清IL-6水平增加。在患有晚期HCC的患者中觀察到高血清IL-6水平(Malaguarnera等人，"Rolede卩interleukine6danslecarcinomahepatocellulaire，"(1996)81///Cancer83:379-384)。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供鑒別肝細胞癌(HCC)與其它肝病的方法，包括測定患有肝病的患者血液中白細胞介素"6(IL《)的水平，其中高于正常水平的IL-6水平為HCC的診斷指示。0013]根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供鑒別肝細胞癌(HCC)與其它肝病的方法，包括確定患有肝病的患者血液中白細胞介素-10(IL-10)的水平，其中高于正常水平的IL-10水平為HCC的診斷指示。發(fā)明詳述如本文使用的術(shù)語"高于正常水平的水平"指高于在正常個體中觀察到的標記物水平的標記物水平，所述正常個體即未患有HCC的個體。對某些標記物而言，通常在個體血液中不存在或存在很低水平的標記物。而對其它人而言，通常在血液中存在可檢測到的水平。因此，該術(shù)語指顯著高于在個體中發(fā)現(xiàn)的常規(guī)水平的水平。術(shù)語"顯著地(明顯地)"指統(tǒng)計學(xué)顯著性，通常指存在高于正?；蚋邩擞浳餄舛鹊膬蓚€標準偏差(SD)。0018用于測定本發(fā)明的腫瘤標記物即IL-6和IL-10水平的測定方法必須對能夠測定到的標記物水平非常靈敏，也必須是高度特異性的，所迷水平指高于能夠高于感興趣的濃度范圍的水平。適宜的方法為免疫測定技術(shù)，例如sandwich醉聯(lián)免疫測定(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、竟爭性結(jié)合測定、均質(zhì)測定(homogeneousassays)和非均質(zhì)測定(heterogeneousassays〉?？衫萌我膺m宜的免疫測定法，包括市售的那些。本文不需要廣泛討論已知的免疫技術(shù)，因為這些技術(shù)是本領(lǐng)域人員已知的?！?019在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，患者血液中IL"6或IL-10的7jc平可通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)確定。00201通常，sandwichELISA包括下述步驟1.制備表面，其與已知量的抗體結(jié)合；2.將包含靶向抗原的樣品應(yīng)用于平皿；3.洗滌平皿，以便除去未結(jié)合的抗原；4.應(yīng)用也對靶向抗原有特異性的酶聯(lián)抗體；5.洗滌平皿，以便除去未結(jié)合的抗體；6.應(yīng)用被酶轉(zhuǎn)化成熒光信號的化學(xué)藥品；和7.觀察結(jié)果焚光信號指樣品包含可檢測量的抗原。0021根據(jù)本發(fā)明，可重排用于EIJSA的測定裝置以提供半定量或定量結(jié)果。術(shù)語"半定量"指鑒別高于升高的標記蛋白值的水平和沒有高于閾值的水平。0022在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，用于IL"6或IL-10的ELISA為半定量的，靈敏度為3pg/mL。在另一方面，本申請?zhí)峁╄b別HCC與其它肝病的方法，包括測定肝病患者血液中IL-6或IL-10水平，其中水平高于正常水平為HCC的診斷指示。0024與前述結(jié)果一致，下述實施例中描述的結(jié)果表明不僅在HCC患者中，而且在非HCC腫瘤或慢性肝炎患者中，血液HGF水平升高(即，血液HGF水平高于正常水平)。因此，測定HGF水平不能用于鑒別HCC與其它肝病。在本發(fā)明優(yōu)選的一個實施方案中，疑為患有HCC的患者具有高血漿水平的HGF，優(yōu)選高于1000pg/mL。本發(fā)明的方法特別用于診斷早期HCC,當患者仍舊具有低血清水平的AFP時。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，疑為患有HCC的患者具有低血清水平的AFP，優(yōu)選低于20ng/mL。0026根據(jù)本發(fā)明的診斷方法可包括由醫(yī)學(xué)專業(yè)人員慎重確定IL-6、IL-10或兩者的水平。0027]本申請還可通過下述實施例來進一步闡述，提供這些實施例用于證實的目的，而不是限定。實施例受試者和方法受試者和診斷0028在2002年10月至2004年9月的2年期間，可能總共有128名成年人參與了這項研究。根據(jù)不同的臨床特征將這些受試者分為4組第1組包括29名具有正常肝功能的健康受試者；第2組包括50名具有已知慢性乙型肝炎或丙型肝炎史但沒有肝腫瘤的受試者；第3組包括15名良性肝血管瘤患者、6名肝轉(zhuǎn)移至結(jié)腸或卵巢的患者，和2名患有膽管癌的患者；第4組包括26名患有HCC的受試者。測定所有研究受試者的血清AFP和血漿IL"6、IL-10、HGF水平。根據(jù)Helsinki公告將該研究的性質(zhì)完全解釋給受試者，該研究符合目前倫理準則。0029如果患者對乙型肝炎表面抗原(HBsAg，RIAkits,AbbottLaboratories,NorthChicago,IL，USA)血清反應(yīng)陽性，則認為患者患慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，如果患者對抗KCV抗體(anti-HCV)血清反應(yīng)陽性，則i人為患者患丙型肝炎病毒(HCV)感染，其通過二代酶免疫測定(AbbottLaboratories,IL)至少兩次且測定至少6個月?；加新砸倚透窝谆虮透窝赘腥镜幕颊哐逯懈蚊杆秸；蜉p微升高(增長小于正常上限的兩倍)。在超聲檢查法和造影劑強化的X線斷層攝影術(shù)掃描中，診斷肝血管瘤具有典型的特征。核磁共振成像用于確定可疑病例中是否存在肝血管瘤。所有診斷患膽管癌或單生的轉(zhuǎn)移性肝癌患者經(jīng)過肝腫瘤外科切除和證實的組織學(xué)診斷。在26名HCC患者中，22名經(jīng)過外科切除且有HCC的病理學(xué)證據(jù)；剩余的4名患者已在超聲波檢查、計算機體層4聶影掃描和肝血管造影中建立診斷有特征性診斷發(fā)現(xiàn)，伴有血清AFP水平升高，這些診斷符合EuropeanAssociation用于肝的研究的診斷標準，其也在臺灣應(yīng)用(Bruix等人，EASLPanelofExpertsonHCC.Clinicalmanagementofhepatocellularcarcinoma:conclusionsoftheBarcelona-2000EASLconference.(2001)JHepato/35:421"430;andYeh等人，HepaticresectionforhepatocellularcarcinomainTaiwan.(2002)￡wrJSi/rgOnco/28:652-6)。測定IL-6、IL-10和HGF0030在診斷和外科切除時，采集所有研究受試者的血漿樣品。將樣品保存在-8crc下，在測定細胞因子水平前立即解凍。才艮據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定IL-10和IL>6水平(e-Biosc'舊nce，SanDiego,CA，USA),并使用ELISA試劑盒測定HGF水平(DuoSet，R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN，USA)。對所有細胞因子而言，每次反應(yīng)使用一百毫升的血漿。對IL-6和IL-10而言，測定的靈敏度為3pg/mL,而對HGF而言，其為125pg/mL。認為低于這些水平下的血漿濃度不能檢測到。由沒有獲知臨床信息的實驗室人員獨立完成所有的測定。統(tǒng)計方法0031對分類數(shù)據(jù)使用卡方檢驗(Chi-squaredtest)或Fisher^準確測試(兩側(cè)(two-tailed))來。當適宜用于連續(xù)數(shù)據(jù)時，使用曼-懷二氏分類總數(shù)檢驗(Mann-Whitneyrankedsumtest)或克(魯斯卡爾)-瓦(利斯)二氏單向ANOVA檢驗(Kmskal-Wallisone-wayANOVA)。Pearson's相關(guān)分析用于評價AFP和細胞因子水平之間的關(guān)系，或腫瘤大小和細J包因子水平之間的關(guān)系。結(jié)果患HCC、非-HCC腫瘤、慢性肝炎患者和正常受試者中IL-6、IL-10和HGF的比較0032比較四組患者的細節(jié)顯示在表1中。僅在0-3%的正常受試者中觀察到IL"6或IL-103pg/mL)或高水平的HGF(>1000pg/mL)或AFP(>20ng/mL)的表達。在患HCC的患者中，分別為46%、50%和62%的他們具有可檢測到的IL"6、IL-10和AFP〉20ng/mL，相比的其他三組有0-16%的患者具有可檢測到的IL-6、IL-10和AFP(p值都小于《0.05)。對于HGF的表達而言，盡管60%的HCC患者具有的HGF水平>1000pg/mL，52%的慢性肝炎患者*=0.809)和35%的非一HCC肺瘤患者(p-0.154)也具有高HGF水平。對IL-6和IL-10而言，與正常受試者、患慢性肝炎和非HCC腫瘤患者相比，HCC組的患者具有顯著較高水平的HGF(p值都《0.05)。與正常受試者相比，HCC患者具有顯著較高的HGF水平；然而，在HCC和慢性肝炎組之間，或HCC和非HCC腫瘤組之間，HGF水平?jīng)]有顯著性差異(p值都>0.05)。表1.健康受試者、慢性肝炎患者、非HCC腫瘤患者和HCC腫瘤患者中IL-6、IL-10和HGF的檢測比較健康受試者慢性肝炎非-HCC腫瘤患者數(shù)量29502326年齡(歲)a41±1060±1556±1459±13男性45%72%70%69%IL-6b可檢測到的3%4%9%46%不可檢測到的967%96%91%54%IL-10C可檢測到的02%9%50%不可檢測到的100%■91%50%AFPd>20ng/mL016%4%62%<20ng/mL100%84%96%38%HGFe>1000pg/mL3%52%35%58%<1000pg/mL97%48%65%42%a:p-0.001;b:p<0.001;c:p<0.001;d:p<0.001;e:p<0.001.P值表示4組受試者之間的統(tǒng)計學(xué)差異。0033在99名慢性肝炎(第2組)患者、非HCC腫瘤患者(第3組)和HCC患者(第4組)中測定這些細胞因子對檢測HCC的靈敏度和特異性。IL-6、IL-10、HGF(>1000pg/mL)和AFP(〉20ng/mL)的靈敏度分別為46%、50%、58%和62%，特異性分別為95%、96%、530/。和88%。根據(jù)血清AFP進一步細化分析，顯示在表2中。具有低(〈20ng/mL)AFP水平的患者中，40。/o的10名HCC患者具有可檢測到的IL-6或IL-10,IL"6或IL-10的表達與存在的HCC明顯相關(guān)(分別地，p-0.005和0.001)。然而，HGF和HCC的表達之間沒有顯著性差異。相反，具有高^20ng/mL)AFP水平的患者中，所有細胞因子和HCC的表達之間沒有顯著性差異。表2.根據(jù)血清水平檢測99名HCC、慢性肝炎或非-HCC患者中的IL-6、IL-10和HGFYesNoAFP<20ng/mL(n=74)"L-6可檢測到的不可檢測到的blL-10可檢測到的不可檢測到的eHGF>1000pg/mL4366141663327737<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>我們以前的研究表明，與正常對照組相比，HCC患者中IL-6和IL-10水平升高，在外科手術(shù)后，該高水平通常降低。而且，高IL-10水平預(yù)示著經(jīng)過外科手術(shù)治療后差的無瘤生存率(Chau等人，"Seruminterleukin-10butnotinterleukin—6isrelatedtoclinicaloutcomeinpatientswithresectablehepatocellularcarcinoma,"(2000)細S呵231:552-558)。在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)，與其它疾病范疇的患者相比，HCC患者中l(wèi)U6和IL-10表達通常更高。令人感興趣地是，在具有低(<20ng/mL)AFP水平和不同肝病范疇的患者中，我們的數(shù)據(jù)表明IL-6和IL-10的表達，但不是HGF的表達，與HCC的存在密切相關(guān)。據(jù)估計，達75%的小HCC患者和20%的大HCC患者可能具有正常的血清AFP水平，其可能避開HCC檢測。在目前的研究中，39%(10/26)的HCC患者具有的血清AFP水平〈20ng/mL。由于在高?；颊咧蠬CC的診斷可能非常困難，其中這些患者具有低AFP水平或腫瘤模仿性HCC(tumorsmimickingHCC),我們的結(jié)果提出IL-6和IL-10有助于鑒別具有低AFP水平的HCC亞型患者，其可起補充性腫瘤標記物作用，并有助于這些患者的鑒別診斷。IL-6、IL-10和AFP與腫瘤大小的關(guān)系0038我們的結(jié)果也表明在HCC患者中IL-6、IL-10和AFP的表達密切相關(guān)。進一步支持IL"6和IL-10作為HCC的肺瘤標記物起作用的證據(jù)為大量的HCC患者顯著地更常見具有可檢測到的lU6和IL-10,然而腫瘤大小械j人為是與經(jīng)過切除和肝移植的患者中AFP生成和總存活數(shù)有關(guān)的最主要因素。而且，在檢測HCC方面，IL-6、IL-10和AFP具有相當類似的診斷敏感性和特異性特征?？v而言之，我們的數(shù)據(jù)表明IL《和IL-10,以及AFP，也可用于HCC的腫瘤標記物。[0039應(yīng)當理解，本領(lǐng)域那些技術(shù)人員在不背離其廣泛的發(fā)明概念下可以對上述實施方案進行改變。因此，可以理解，本發(fā)明并不限于公開的具體實施方案，而是意味著覆蓋如附加的權(quán)利要求定義的本申請的精神和范圍。[0040將上述提及的引證公開的內(nèi)容4^P引入本文作為參考。權(quán)利要求1.一種確診疑為患有原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)的患者中原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)存在的檢驗試劑，包括測定所述患者血液中白細胞介素-6(IL-6)水平的測定套組(ASSAYKIT)，其中當所檢測出白細胞介素-6(IL-6)的水平高于正常水平診斷為原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)。2.根據(jù)權(quán)利要求l的檢驗試劑，其中白細胞介素-6(IL-6)水平等于或高于3pg/mL診斷為原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-6(IL-6)水平的測定套組為利用得自所述患者的血樣通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。3.根據(jù)權(quán)利要求l的檢驗試劑，其中所述患者具有低血清水平的a-胎兒球蛋白(AFP)。4.根據(jù)權(quán)利要求3的檢驗試劑，其中所述a-胎兒球蛋白(AFP)的血清水平低于20ng/mL之測定值。5.根據(jù)權(quán)利要求1的檢驗試劑，其中所述患者具有高血清水平的肝細胞生長因子(HGF)。6.根據(jù)權(quán)利要求5的檢驗試劑，其中所述肝細胞生長因子(HGF)的血漿水平為高于IOOOpg/mL之測定值。7.根據(jù)權(quán)利要求l的檢驗試劑，進一步包含測定所述患者血液中白細胞介素-10(IL-10)水平的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-10(IL-10)的水平高于正常水平診斷為原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)。8.才艮據(jù)權(quán)利要求7的檢驗試劑，其中白細胞介素-10(IL-10)水平等于或高于3pg/mL診斷為原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-10(IL-IO)水平的測定套組為利用得自所述患者的血樣通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。9.確診疑為患有原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)的患者中原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)存在的檢驗試劑，包括測定所述患者血液中白細胞介素-10(IL-10)的水平的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-l0(IL-10)的水平高于正常水平診斷為原發(fā)性惡性肝腫痼肝細胞癌(HCC)。10.根據(jù)權(quán)利要求9的檢驗試劑，其中白細胞介素-10(IL-IO)的水平等于或高于3pg/m診斷為原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-10(IL-10)水平的測定套組為利用得自所迷患者的血樣通過酶聯(lián)免疫吸附測定(BLISA)。11.根據(jù)權(quán)利要求9的檢驗試劑，其中所述患者具有低水平的a-胎兒球蛋白(AFP)。12.根據(jù)權(quán)利要求11的檢驗試劑，其中所述a-胎兒球蛋白(AFP)的血清水平低于20ng/mL之測定值。13.根據(jù)權(quán)利要求9的檢驗試劑，其中所述患者具有高水平的肝細胞生長因子(HGF)。14.根據(jù)權(quán)利要求3的檢驗試劑，其中所iilf細胞生長因子(HGF)的血漿水平高于1000pg/mL之測定值'15.根據(jù)權(quán)利要求9的檢驗試劑，還包括測定所述患者血液中白細胞介素-6(IL-6)水平的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-6(IL-6)的水平高于正常水平診斷為原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)。16.根據(jù)權(quán)利要求15的檢驗試劑，其中白細胞介素-6(IL-6)的水平等于或高于3pg/mL診斷為原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-6(IL-6)水平的測定套組為利用得自所述患者的血樣通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。17.鑒別肝細胞癌(HCC)與其它肝病的檢驗試劑，包括測定患有肝病的患者血液中白細胞介素-6(IL-6)的的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-6(IL-6)的水平高于正常水平診斷為原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)。18.根據(jù)權(quán)利要求17的檢驗試劑，其中不同于原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)的肝病選自慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝血管瘤、膽管癌和轉(zhuǎn)移性肝癌。19.根據(jù)權(quán)利要求17的檢驗試劑，其中白細胞介素-6(IL-6)的水平等于或高于3pg/mL診斷為原發(fā)性慈性肝胖瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-6(IL-6)水平的測定套組為利用得自所述患者的血樣通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。20.根據(jù)權(quán)利要求17的檢驗試劑，還包括測定所述患者血液中白細胞介素-10(IL-10)水平的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-10(IL-l0)的水平高于正常水平診斷為原發(fā)性惡性肝肺瘤肝細胞癌(HCC)。21.根據(jù)權(quán)利要求17的檢驗試劑，其中白細胞介素-IO(IL-IO)的水平等于或高于3pg/mL診斷為原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)，測定IL-10水平的測定套組為利用得自所述患者的血樣通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。22.鑒別肝細胞癌(HCC)與其它肝病的檢驗試劑，包括測定患有肝病的患者血液中白細胞介素-10(IL-10)水平的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-10(IL-10)的水平高于正常水平診斷為原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)。23.根據(jù)權(quán)利要求22的檢驗試劑，其中不同于原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)的其它肝病選自慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝血管瘤、膽管癌和轉(zhuǎn)移性肝癌。24.根據(jù)權(quán)利要求22的檢驗試劑，其中白細胞介素-10(IL-10)的水平等于或高于3pg/mL診斷為原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-10(IL-(ELISA)。25.根據(jù)權(quán)利要求22的檢驗試劑，進一步包括測定所述患者血液中白細胞介素-6(IL-6)的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-6(IL-6)高于正常水平診斷為原發(fā)性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)。26.根據(jù)權(quán)利要求25的檢驗試劑，其中白細胞介素-6(1卜6)的水平等于或高于3pg/mL診斷為原發(fā)性惡性肝肺瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-6(IL-6)水平的測定套組為利用得自所述患者的血樣通過酴聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。全文摘要提供用于肝細胞癌(HCC)診斷的方法。該方法通過測定得自患者血漿樣品中的IL-6或IL-10的水平確診疑為患有HCC的患者中HCC的存在。也提供通過測定得自患有肝病的患者血漿樣品中的IL-6或IL-10的水平來鑒別HCC與其它肝病的方法。文檔編號G01N33/574GK101221178SQ20061016344公開日2008年7月16日申請日期2006年11月28日優(yōu)先權(quán)日2006年11月28日發(fā)明者呂銘峰,蔣淑嬡申請人:創(chuàng)盛科技股份有限公司