專利名稱：測定鴨腳樹葉堿含量的高效液相色譜方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種色譜分析方法，具體是一種測定鴨腳樹葉堿(Picrinine)含量的高效液相色譜(HPLC)方法，屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
燈臺樹Alstonia Scholaris(L.)R.Bro.，也稱鴨腳樹、糖膠樹等，為夾竹桃科雞骨常山屬植物，高大長綠喬木，生于海拔850米以下的丘陵山地、疏林。國內(nèi)分布于云南、廣西、福建等，國外分布于印度、斯里蘭卡、緬甸、泰國、越南、菲律賓等，資源豐富。
在云南省內(nèi)，燈臺樹是多民族使用的天然藥物，其根、莖、皮、葉均可入藥應(yīng)用。漢族稱“理肺散”，是治療呼吸系統(tǒng)疾病的有效藥物；傣族稱“買擔(dān)別”，主治肺熱咳嗽痰多，腮腺、頜下淋巴結(jié)腫痛；拉祜族、佤族等均用葉代茶飲治支氣管炎、咳嗽、哮喘等。
經(jīng)過長期的應(yīng)用，來自燈臺樹的藥材已為《云南省藥品標準》、《中國藥典》收載。利用燈臺樹藥材為原料，已開發(fā)了燈臺葉顆粒劑、片劑、膠囊劑、煎膏劑、口服液等制劑產(chǎn)品。
對于燈臺樹的化學(xué)研究，朱偉明在其博士論文“五種藥用植物資源化學(xué)的初步研究”(中國科學(xué)院昆明植物研究所，2001年)中進行了比較全面的文獻綜述，結(jié)果表明①燈臺樹各部位(根、莖、皮、葉)均含有生物堿，在結(jié)構(gòu)上多屬吲哚類生物堿；②生物堿是燈臺樹重要的有效成分；③鴨腳樹葉堿(picrinine)是燈臺樹各部位普遍含有，且含量最高的生物堿成分。鴨腳樹葉堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。
在藥物質(zhì)量分析方面，《云南省藥品標準》對燈臺葉藥材僅用簡單的生物堿沉淀反應(yīng)進行鑒別，無含量測定項目。在制劑產(chǎn)品中，衛(wèi)生部頒中藥標準燈臺葉片(WS-10280)采用酸堿滴定法測生物堿，并折算為指標成分鴨腳樹葉堿含量，但測定方法的專屬性差，已經(jīng)不能適應(yīng)中藥現(xiàn)代化的技術(shù)要求。
高效液相色譜(HPLC)適用于復(fù)雜成分分析，目前已成為中藥質(zhì)量分析的主流方法，得到廣泛應(yīng)用。公開號為CN 1818636A，申請人為朱光榮的中國專利申請采用HPLC方法測定鴨腳樹葉堿含量來控制藥材及制劑的質(zhì)量。其確定的主要條件為用2％氨水為提取溶劑，提取液用氯仿萃??；HPLC流動相用鹽酸水溶液(濃鹽酸1→100)-乙腈(80∶20)，檢測波長232nm。
經(jīng)過本發(fā)明人系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明，上述專利申請所確定的主要技術(shù)條件存在嚴重缺陷，難以實際應(yīng)用于燈臺葉藥材及其制劑的質(zhì)量分析。為準確地分析測定燈臺樹藥材及其制劑中主要生物堿成分鴨腳樹葉堿(picrinine)的含量，更好地控制藥品質(zhì)量，保障臨床用藥安全有效，需要有一種新的測定燈臺樹藥材及其制劑中鴨腳樹葉堿含量的高效液相色譜方法，發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種能準確地分析測定鴨腳樹葉堿含量的高效液相色譜方法，可以用于測定燈臺樹藥材(根、枝、皮、葉)、制劑(顆粒劑、片劑、膠囊劑、煎膏劑、口服液)中鴨腳樹葉堿含量，也可用于測定其他材料中含有的鴨腳樹葉堿含量。
本發(fā)明方法的特征是液相色譜條件為色譜柱以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑，流動相為甲醇或乙腈與稀三乙胺或二乙胺水溶液組成的混合溶劑，檢測波長287nm。柱溫可以為30～40℃，流速可以為0.5～5ml/min，進樣體積可以為10～20μl。柱溫最佳為35℃，流速最佳為1ml/min。
當(dāng)流動相為甲醇與稀三乙胺或稀二乙胺水溶液組成的混合溶劑時，其組成的體積比可以為甲醇∶稀三乙胺或稀二乙胺水溶液等于40∶60～60∶40，稀三乙胺或稀二乙胺水溶液含三乙胺或二乙胺的濃度可以為0.01％～0.015％。作為最優(yōu)化條件，混合溶劑組成的體積比為甲醇∶稀三乙胺或稀二乙胺水溶液等于50∶50。
當(dāng)流動相為乙腈與稀三乙胺或稀二乙胺水溶液組成的混合溶劑，其組成的體積比為乙腈∶稀三乙胺或稀二乙胺水溶液等于25∶75～30∶70，稀三乙胺或稀二乙胺水溶液含三乙胺或稀二乙胺的濃度為0.01％～0.015％。
通過以下的試驗研究對本發(fā)明進行進一步說明。
1、鴨腳樹葉堿(picrinine)的制備(1)提取分離鴨腳木堿燈臺樹藥材粉碎后用95％乙醇回流提取，回收溶劑；浸膏加水?dāng)嚿⒑笥脻獍彼{(diào)pH為9，氯仿萃取，回收溶劑，得總生物堿。
生物堿部分經(jīng)氧化鋁柱色譜，用環(huán)己烷-乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫(100∶5～100∶100)，用薄層色譜檢查后合并含鴨腳木堿的流份，再用硅膠柱色譜多次分離，以氯仿-丙酮混合溶劑梯度洗脫(100∶0～100∶30)，結(jié)合重結(jié)晶制備，得到鴨腳木堿，HPLC檢查純度約95％。
(2)純化鴨腳木堿上述鴨腳木堿純度未達中藥質(zhì)量標準用對照品要求(98％以上)，進一步用葡聚糖凝膠LH-20柱色譜純化，以甲醇為洗脫溶劑，合并僅含有鴨腳木堿的流份，回收溶劑至小體積，放置過夜，析出無色針晶，HPLC檢查其純度為99.94％，即為鴨腳木堿對照品。圖2為鴨腳樹葉堿對照品的HPLC圖譜。
(3)化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定無色針狀晶體，易溶于甲醇、氯仿、丙酮，可溶于乙酸乙酯、乙醇，不溶于水和石油醚，但可溶于稀鹽酸及稀硫酸溶液。熔點222～224℃。旋光度為[a]D-48(c 0.21，CHCl3，25℃測定)。
紅外光譜IRv(KBr)cm-13430、3391(vs，NH)，3009-2866(s，C-H)，1724(s，C＝O)，1610、1481、1465(s，C＝C)，1203-1167(s，C-O及C-N)，提示其結(jié)構(gòu)屬生物堿類化合物。
紫外光譜UVλ(CH3OH)nm有三個主要吸收峰，分別為205，235.5，287.5，提示該化合物結(jié)構(gòu)中有雙鍵和取代的苯環(huán)。
質(zhì)譜正離子FAB MS m/z338[M]+，239+。其中m/z 338的峰為分子離子峰，質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合NMR光譜數(shù)據(jù)分析，其對應(yīng)化合物的分子式應(yīng)為C20H22N2O3。
核磁共振譜經(jīng)過測試，其1H NMR及13C NMR(CDCl3，ppm)數(shù)據(jù)如表一及表二。參照文獻報道(朱維明五種藥用植物資源化學(xué)的初步研究.博士學(xué)位論文，中科院昆明植物所，2001年)，其結(jié)構(gòu)確證為鴨腳樹葉堿(picrinine)。
表一 鴨腳樹葉堿的1H NMR數(shù)據(jù)及歸屬

表二 鴨腳樹葉堿的13C NMR數(shù)據(jù)及歸屬

2、燈臺樹藥材及其制劑供試溶液的制備(1)燈臺樹藥材供試溶液的制備生物堿溶解性的一般規(guī)律是生物堿易溶于有機溶劑及酸水，不溶于水及堿水；生物堿鹽易溶于水，不溶于有機溶劑。因此，從藥材中提取生物堿不宜用水為溶劑，而應(yīng)該用有機溶劑提取。不同提取方法測定比較見表三，其中實驗1是朱光榮在其專利申請(公開號CN 1818636A)中確定的方法。
結(jié)果表明，甲醇對植物組織有較強滲透力，對目標化合物有很好的溶解性，因此提取效果最好；水或2％氨水對植物組織有很強的滲透力，但對目標化合物難溶解，因而提取效果不好；丙酮和氯仿對目標化合物有很好的溶解性，但對植物組織的滲透力差，故提取不完全，效果亦不好。由此確定，燈臺樹藥材供試液的制備方法為取藥材，粉碎，加甲醇回流提取，濾過，即得。
表三 燈臺樹藥材的提取方法比較

根據(jù)生物堿溶解性一般規(guī)律，結(jié)合上述實驗研究結(jié)果表明，朱光榮在專利申請(公開號CN 1818636A)所確定的“以pH＝9氨水提取”的技術(shù)條件存在嚴重缺陷，不能完全提取藥材中的生物堿成分，后期測定結(jié)果也就不能反映藥材的真實情況，難以準確的應(yīng)用于燈臺葉藥材的質(zhì)量分析工作。
(2)燈臺樹制劑供試溶液的制備燈臺樹制劑產(chǎn)品是以浸膏加輔料制成，根據(jù)一般經(jīng)驗，含量測定可用水溶散制劑后調(diào)節(jié)pH值，再以氯仿萃取生物堿。篩選適當(dāng)?shù)妮腿l件以保證萃取完全、操作可行是要點，主要影響因素是pH值的調(diào)節(jié)方法和程度，試驗結(jié)果如表四。
表四 燈臺樹制劑的提取方法比較

對比結(jié)果表明，制劑溶液用2％的氨水調(diào)pH＝7，萃取時不乳化，操作容易，萃取徹底。由此，確定制劑產(chǎn)品供試品溶液制備方法為取制劑，加水振搖溶散，以2％氨水調(diào)pH＝7，置分液漏斗中以氯仿萃取，氯仿液蒸干，殘渣用甲醇溶解即得。
3、高效液相色譜條件(1)色譜柱選擇確定考慮到應(yīng)用普遍性，選用HPLC測定最常用的碳十八烷基鍵合硅膠柱進行試驗。比較了Phenomenex公司Luna C-18柱、Merck公司STAR RP-18柱、Agilent公司XDB-C18柱等，均有較好分離效果，因此確定選用以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱。
(2)檢測方法及檢測波長確定鴨腳樹葉堿具紫外吸收，可用紫外檢測器檢測。鴨腳樹葉堿分別溶于甲醇、HPLC流動相測定紫外光譜，數(shù)據(jù)見表五。結(jié)果顯示有三個吸收峰，209.0nm的峰靠近末端且隨溶劑變化大，不宜選作檢測波長；235.5、287.0nm的峰分離度均較好，且不隨溶劑變化，均可用于檢測。對比這二個波長檢測的HPLC圖譜，以287nm波長圖譜中的干擾峰較小，因此確定用紫外檢測法，檢測波長287nm。
表五 鴨腳樹葉堿的紫外光譜數(shù)據(jù)

(3)流動相的選擇確定鴨腳樹葉堿結(jié)構(gòu)復(fù)雜，選擇合適的流動相以得到良好的分離效果是分析方法的關(guān)鍵?；谝话愕墓聦嵑凸ぷ鹘?jīng)驗，在HPLC分析中調(diào)節(jié)流動相的酸堿性，采用的酸主要是稀磷酸、稀硫酸、乙酸、甲酸；采用的堿主要是二乙胺、三乙胺、稀氨水。
朱光榮在專利申請(公開號CN 1818636A)中確定“HPLC流動相用鹽酸水溶液(濃鹽酸1→100)-乙腈(80∶20)”。該流動相難以應(yīng)用于實際工作，一是液相色譜儀的連接管道、色譜柱體等均為不銹鋼材料，不能耐受稀鹽酸溶液腐蝕；二是酸性太強(pH小于1)，容易導(dǎo)致碳十八烷基鍵合硅膠填料的降解。
根據(jù)理化性質(zhì)和經(jīng)驗，我們選擇甲醇-水、乙腈-水(均可調(diào)節(jié)酸堿)溶劑系統(tǒng)對比篩選。色譜柱用Luna C-18柱(Φ4.6×150mm，5μm，使用pH范圍為1.5～10)；流速1.0ml/min；柱溫35℃；檢測波長287nm。對比研究數(shù)據(jù)及其分析結(jié)果見表六。
表六 流動相對比篩選試驗評價結(jié)果


用優(yōu)選的最佳條件實驗8[甲醇-0.012％三乙胺(50∶50)]、實驗14[乙腈-0.01％二乙胺(25∶75)]進行分析測試，結(jié)果如表七。
結(jié)果表明流動相以甲醇-稀有機胺類(三乙胺，二乙胺)組成的混合溶劑具有最好分離效果；稀有機胺溶液的適宜濃度為0.01％～0.015％；甲醇和稀有機胺溶液的體積組成比在60∶40～40∶60之間均可，優(yōu)化的比例是50∶50見附圖4和5，分別為燈臺樹藥材、制劑的HPLC圖譜。
其次，以乙腈-稀有機胺類(三乙胺，二乙胺)組成的混合溶劑也可用于分析，稀有機胺溶液的適宜濃度為0.01％～0.015％；乙腈和稀有機胺溶液的體積組成比例在25∶75～30∶70之間均可。
表七 優(yōu)選最佳流動相分析藥材及制劑的結(jié)果

(4)測定的專屬性研究①對照品加入在燈臺樹及其制劑的供試液中，混入對照品溶液進樣測定，和供試液色譜對照，無新的吸收峰出現(xiàn)，鴨腳樹葉堿吸收峰相對面積增大。②三維掃描以二極管陣列檢測器(DAD)，掃描樣品色譜中和對照品峰相同位置的吸收峰，峰純度950以上，紫外光譜和對照品一致。以上試驗證明測定的吸收峰對應(yīng)的物質(zhì)是鴨腳樹葉堿，該含量測定方法具有高度的專屬性。
4、測定方法考察確定(1)穩(wěn)定性試驗對照品、供試品溶液于放置后不同時間測定，結(jié)果表明對照品溶液至少在72h內(nèi)穩(wěn)定(峰面積RSD＝0.98％，n＝7)，供試品溶液至少在48h內(nèi)穩(wěn)定(峰面積RSD＝1.02％，n＝5)，可滿足含量測定需求。
表八 穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)

(2)檢測限和線性關(guān)系確定取鴨腳樹堿適量，用流動相制成1mg/ml儲備液，不斷稀釋后測定最低檢測限為30ng(信號/噪聲＝3)，測定方法靈敏。在分別取儲備液稀釋為不同濃度，測定，進樣量和峰面積的關(guān)系見表九。
在進樣量0.1μg～14μg范圍內(nèi)，鴨腳樹葉堿峰面積和進樣量呈良好線性關(guān)系。回歸方程截距(1202)為吸收系數(shù)(227514)的0.53％，回歸線幾乎過原點，為簡化計算方法，可用外標一點法定量，見圖3，鴨腳樹葉堿測定標準曲線。
表九 檢測限和線性關(guān)系數(shù)據(jù)及回歸方程

(3)重現(xiàn)性試驗取同一批號燈臺樹藥材(20051001)，燈臺葉顆粒(20060204)，同時稱取6份，照供試液制備方法平行制備供試溶液，測定鴨腳樹葉堿的含量，數(shù)據(jù)見表十。藥材六次測定含量的RSD＝1.88％，制劑燈臺葉顆粒六次測定含量的RSD＝1.32％，測定方法重現(xiàn)性良好。
表十 方法學(xué)考察----重現(xiàn)性試驗

(4)加樣回收試驗取已知含量燈臺葉顆粒(20060204，0.107mg/g)，共9份，精密稱定，分別分為三組。取適量鴨腳樹葉堿對照品，以甲醇制成0.22mg/ml的溶液，分別按照相當(dāng)于樣品中鴨腳樹葉堿含量的80％、100％、120％，加入到三組樣品中。照供試液制備方法提取，測定含量，數(shù)據(jù)見表十一。結(jié)果表明，測定方法平均回收率為98.6％，RSD＝1.43％(n＝9)。加入的對照品能準確、重現(xiàn)的回收，測定方法準確可靠。
表十一 方法學(xué)考察----加樣回收試驗數(shù)據(jù)

5、分析方法耐用性試驗(1)流速變化對測定結(jié)果的影響保持色譜柱、柱溫、檢測波長、流動相不變。流速設(shè)定為0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min，分別進行測定，數(shù)據(jù)見表十二。結(jié)果表明流速改變達到±20％時，仍可準確測定樣品中燈臺樹葉堿的含量。
表十二 方法耐用性試驗----流速變化對測定結(jié)果的影響

(2)檢測波長偏移對測定結(jié)果的影響保持色譜柱、柱溫、流動相、流速不變。檢測波長設(shè)定為284nm、287nm、290nm，分別測定，數(shù)據(jù)見表十三。結(jié)果表明在檢測波長偏移達到±3nm時，仍可準確測定樣品中燈臺樹葉堿的含量。
表十三 耐用性試驗----檢測波長偏移對測定結(jié)果的影響

(3)流動相比例改變對測定結(jié)果的影響保持色譜柱、柱溫、檢測波長、流速不變。適當(dāng)改變流動相的組成比例進行試驗，數(shù)據(jù)見十四。結(jié)果表明流動相比例改變達到±3％的情況下，仍可準確測定樣品中燈臺樹葉堿的含量。
表十四 耐用性試驗----流動相比例改變對測定結(jié)果的影響

(4)不同色譜柱測定結(jié)果的比較保持柱溫、檢測波長、流動相、流速不變。換用不同色譜柱進行測定及系統(tǒng)評價分析，數(shù)據(jù)見表十五。結(jié)果表明該分析方法在不同的色譜柱上，均有較好的峰形和分離效果，用不同的色譜柱，均可準確測定樣品中燈臺樹葉堿的含量。比較的色譜柱有以下三種Luna C-18柱Phenomenex公司，規(guī)格Φ4.6mm×150mm，使用pH范圍1.5～10，柱子序列號339618-40。
Purospher Star C-18柱Merck公司，規(guī)格Φ4.6mm×150mm，使用pH范圍1.5～11.5，柱子序列號147565。
Zorbax C-18柱Agilent公司，規(guī)格Φ4.6mm×150mm，使用pH范圍1～12，規(guī)格Φ4.6mm×150mm，柱子序列號USKH009350。
表十五 耐用性試驗----不同色譜柱測定結(jié)果的比較

上述結(jié)果表明，該分析方法具有較好的耐用性①能適用于不同廠牌的C-18色譜柱，均有較好的峰形和分離效果。②能適應(yīng)流動相組成比例在±3％范圍內(nèi)的改變。③能適應(yīng)流速在±20％范圍內(nèi)的改變。④可寬容檢測波長在±3nm范圍內(nèi)的偏移。
(5)分析方法在不同廠家液相色譜儀器上的驗證上述研究在島津LC-10AvP高效液相色譜儀上完成，為進一步驗證該分析方法的耐用性，再選擇現(xiàn)使用較多的Agilent1100、Waters1525液相色譜儀，進行了該分析方法在不同廠家液相色譜儀器上的驗證測定。儀器條件分別為①島津LC-10AvP；②Agilent1100；③Waters1525。測定數(shù)據(jù)見表十六。
結(jié)果表明，該方法在不同廠牌的高效液相色譜儀上測定結(jié)果具有一致性，對分析儀器具有較廣泛的適應(yīng)性，耐用性好。
表十六 耐用性試驗----不同廠家PLC儀測定結(jié)果比較

測定方法取鴨腳樹葉堿適量，精密稱定，以HPLC流動相溶解制成每1ml含有10μg～100μg的對照品溶液。按照上述研究確定的方法，制備燈臺樹藥材，及其制劑的供試溶液。精密吸取對照品溶液、供試溶液，注入液相色譜儀(HPLC)，測定，即得。


圖1為鴨腳樹葉堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
圖2為鴨腳樹葉堿對照品的HPLC圖譜。
圖3為鴨腳樹葉堿測定標準曲線。
圖4為燈臺樹藥材的HPLC圖譜。
圖5為燈臺樹制劑的HPLC圖譜。
本發(fā)明的有益效果和技術(shù)進步在于①經(jīng)過系統(tǒng)的比較研究，建立了一種測定鴨腳樹葉堿含量的高效液相色譜方法，既可用于測定燈臺樹藥材(根、莖、皮、葉)、制劑(顆粒劑、片劑、膠囊劑、煎膏劑、口服液)中鴨腳樹葉堿的含量，也可用于測定其他材料中含有的鴨腳樹葉堿含量。
②分析方法具有分離效果好，測定準確、靈敏，專屬性強，測定快速等技術(shù)特點。燈臺樹藥材、制劑中各成分吸收峰可在40分鐘內(nèi)全部流出色譜柱，完成分析工作。
本發(fā)明可直接應(yīng)用于實際生產(chǎn)過程及產(chǎn)品的質(zhì)量分析。
具體實施例方式
以下的具體實施例可進一步說明本發(fā)明及其應(yīng)用，但并不構(gòu)成對本發(fā)明權(quán)利要求所保護的范圍的限制。
工作原理和過程供試液注入液相色譜儀，流動相載著鴨腳樹葉堿等成分進入色譜柱，分離各成分，使它們依次到達檢測器并被識別；檢測器測定樣品中鴨腳樹葉堿峰的響應(yīng)值，并根據(jù)響應(yīng)值的大小和鴨腳樹葉堿標樣的比較來計算樣品中鴨腳樹葉堿的含量。
實施例1燈臺樹葉中鴨腳樹葉堿的含量測定取燈臺樹葉，粉碎，過60目篩網(wǎng)，精密稱取2g，置100ml圓底燒瓶中，準確加入甲醇50ml，稱重，水浴回流提取1小時，放冷，以甲醇補足減失的重量，過濾，即得供試溶液。取鴨腳樹葉堿適量，精密稱定，以HPLC流動相溶解制成每1ml含有50μg的對照品溶液。
按照上述研究確定的方法(表六-實驗8)，精密吸取對照品溶液、供試溶液，注入液相色譜儀，測定，即得。不同產(chǎn)地的燈臺樹葉藥材中鴨腳樹葉堿含量測定的結(jié)果見表十七。
表十七 不同產(chǎn)地?zé)襞_樹葉中鴨腳樹葉堿含量測定結(jié)果

實施例2燈臺樹根中鴨腳樹葉堿的含量測定方法同實施例1，測定的藥用部位為燈臺樹的根，不同產(chǎn)地的燈臺樹根中鴨腳樹葉堿含量測定的結(jié)果見表十八。
表十八 不同產(chǎn)地?zé)襞_樹根藥材中鴨腳樹葉堿含量測定結(jié)果

實施例3燈臺樹枝中鴨腳樹葉堿的含量測定方法同實施例1，測定的藥用部位為燈臺樹的枝，不同產(chǎn)地的燈臺樹莖中鴨腳樹葉堿含量測定的結(jié)果見表十九。
表十九 不同產(chǎn)地?zé)襞_樹枝中鴨腳樹葉堿含量測定結(jié)果

實施例4燈臺樹皮中鴨腳樹葉堿的含量測定方法同實施例1，測定的藥用部位為燈臺樹的皮，不同產(chǎn)地的燈臺樹皮中鴨腳樹葉堿含量測定的結(jié)果見表二十。
表二十 不同產(chǎn)地?zé)襞_樹皮中鴨腳樹葉堿含量測定結(jié)果

實施例5用不同流動相測定燈臺樹葉中鴨腳樹葉堿的含量方法同實施例1，分別選用上述表六中實驗-6～7、9～14流動相組成進行測定，結(jié)果見表二十一(樣品批號S-20051101葉)。
表二十一 用不同流動相測定燈臺樹葉中鴨腳樹葉堿的含量

實施例6燈臺葉片中鴨腳樹葉堿的含量測定取燈臺葉片20片，除去包衣，片芯研細過60目篩，精密稱取2g，置100ml圓底燒瓶中，準確加入甲醇50ml，稱重，水浴回流提取1小時，放冷，以甲醇補足減失的重量。濾過，取續(xù)濾液25ml蒸干，殘渣加25ml水振搖溶散，以2％氨水調(diào)pH＝7，置分液漏斗中以50ml氯仿分三次萃取，合并氯仿液，蒸干，殘渣用流動相溶解并定容至5ml量瓶中，搖勻，即得供試溶液。
按照上述研究確定的方法(表六-實驗8)，精密吸取對照品溶液、供試溶液，注入液相色譜儀，測定。燈臺葉片中鴨腳樹葉堿含量測定的結(jié)果為0.128mg/g。
實施例7燈臺葉顆粒中鴨腳樹葉堿的含量測定取燈臺葉顆粒5g，精密稱定，加25ml水振搖溶化，加2％氨水調(diào)pH＝7，置分液漏斗中以50ml氯仿分三次萃取，合并氯仿液，蒸干，殘渣用流動相溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。
精密吸取對照品溶液、供試溶液，注入液相色譜儀，測定。燈臺葉片中鴨腳樹葉堿含量測定的結(jié)果為0.149mg/g。
實施例8燈臺葉膠囊中鴨腳樹葉堿的含量測定取燈臺葉膠囊內(nèi)容物5g，以下測定操作同實施例7。燈臺葉膠囊中鴨腳樹葉堿含量測定的結(jié)果為0.117mg/g。
實施例9燈臺葉煎膏中鴨腳樹葉堿的含量測定取燈臺葉煎膏5g，加25ml水溶化，以下測定操作同實施例7。燈臺葉煎膏中鴨腳樹葉堿含量測定的結(jié)果為0.153mg/g。
實施例10燈臺葉口服液中鴨腳樹葉堿的含量測定取燈臺葉口服液10ml，加15ml稀釋，以下測定操作同實施例7。燈臺葉口服液中鴨腳樹葉堿含量測定的結(jié)果為0.161mg/ml。
權(quán)利要求
1.一種測定鴨腳樹葉堿含量的高效液相色譜方法，其特征是液相色譜條件為色譜柱以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑，流動相為甲醇或乙腈與稀三乙胺或二乙胺水溶液組成的混合溶劑，檢測波長287nm。
2.如權(quán)利要求1所說高效液相色譜方法，其特征是柱溫為30～40℃，流速為0.5～5ml/min，進樣體積為10～20μl。
3.如權(quán)利要求2所說高效液相色譜方法，其特征是柱溫為35℃，流速為1ml/min。
4.如權(quán)利要求1所說高效液相色譜方法，其特征是流動相為甲醇與稀三乙胺或稀二乙胺水溶液組成的混合溶劑，組成的體積比為甲醇∶稀三乙胺或稀二乙胺水溶液等于40∶60～60∶40，稀三乙胺或稀二乙胺水溶液含三乙胺或二乙胺的濃度為0.01％～0.015％。
5.如權(quán)利要求4所說高效液相色譜方法，其特征是混合溶劑組成的體積比為甲醇∶稀三乙胺或稀二乙胺水溶液等于50∶50。
6.如權(quán)利要求1所說高效液相色譜方法，其特征是流動相為乙腈與稀三乙胺或稀二乙胺水溶液組成的混合溶劑，組成的體積比為乙腈∶稀三乙胺或稀二乙胺水溶液等于25∶75～30∶70，稀三乙胺或稀二乙胺水溶液含三乙胺或稀二乙胺的濃度為0.01％～0.015％。
全文摘要
測定鴨腳樹葉堿含量的高效液相色譜方法，屬藥物分析技術(shù)領(lǐng)域。其特征是液相色譜條件為色譜柱以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑，流動相為甲醇或乙腈與稀三乙胺或二乙胺水溶液組成的混合溶劑，檢測波長287nm。本發(fā)明克服了已有避免了方法的缺陷，可直接應(yīng)用于實際生產(chǎn)過程及產(chǎn)品的質(zhì)量分析。既可用于測定燈臺樹藥材(根、莖、皮、葉)、制劑(顆粒劑、片劑、膠囊劑、煎膏劑、口服液)中鴨腳樹葉堿的含量，也可用于測定其他材料中含有的鴨腳樹葉堿含量。該方法具有分離效果好，測定準確、靈敏，專屬性強，測定快速等技術(shù)特點。燈臺樹藥材、制劑中各成分吸收峰可在40分鐘內(nèi)全部流出色譜柱，完成分析工作。
文檔編號G01N30/26GK1975412SQ20061016385
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月28日
發(fā)明者郭文, 孫赟, 朱麗萍, 龔云麒 申請人:昆明振華制藥廠有限公司