專利名稱：豬圓環(huán)病毒2型抗原或抗體檢測試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速診斷器具，特別是涉及一種豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗原或抗體檢測試紙條。
背景技術(shù)：
PCV2是引發(fā)豬斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，該病主要以患畜生長遲緩、進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病理損傷為特征。除了引發(fā)PMWS外，PCV2還與豬皮炎與腎病綜合征、新生仔豬先天性腦震顫、增生性壞死肺炎以及懷孕母豬的繁殖障礙等病的發(fā)生有關(guān)。目前認(rèn)為，PCV2可誘發(fā)一系列的圓環(huán)病毒病。自1996年在加拿大首次發(fā)現(xiàn)PMWS以來，PCV2感染引起的相關(guān)疾病已在全世界廣泛存在，我國也不例外，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)PMWS的流行病學(xué)，臨床癥狀和剖檢病理變化可對PCV2感染作出初步診斷，但確診仍需要以實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)檢測PCV2抗原及其抗體。PCV2的衣殼蛋白是該病毒的主要免疫原，檢測PCV2衣殼蛋白抗體從而可反映PCV2的抗體水平。對豬群PCV2抗體水平進(jìn)行監(jiān)測，可確切了解豬體免疫水平或感染狀況，制定最適免疫程序或淘汰選育，有效預(yù)防和控制PCV2的侵襲和傳播，避免因此而引起的重大經(jīng)濟(jì)損失。
目前，國內(nèi)外采用的PCV2檢測技術(shù)主要有病毒分離培養(yǎng)，間接免疫熒光(IFA)，免疫酶單層試驗(yàn)(IMPA)，原位雜交(ISH)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等等。上述技術(shù)和方法雖然可以檢測PCV2及其抗體水平，在實(shí)踐中也取得一定的效果，但均存在試驗(yàn)操作復(fù)雜，耗時長，需要特定的專業(yè)技能和儀器設(shè)備等，成本昂貴，常限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，很難在基層普及和推廣。因此，研制開發(fā)適用于養(yǎng)殖基層的快捷、簡便的PCV2抗體檢測器具，對豬群PCV2免疫水平進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，建立科學(xué)的、靈活的豬群疫病免疫程序，對疫病的預(yù)防和控制有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的是克服上述已知技術(shù)存在的不足，提供一種豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗原或抗體檢測試紙條?？捎行z測豬的PCV2抗原或抗體，用于PCV2感染的抗原、抗體診斷。
本設(shè)計的豬圓環(huán)病毒2型抗原或抗體檢測試紙條由支撐層1、反應(yīng)試劑載體吸附層和覆蓋的保護(hù)膜所組成；所述支撐層為不吸水薄片層，反應(yīng)試劑載體吸附層固定在支撐層上，反應(yīng)試劑載體吸附層從樣品端依次為樣品纖維層2、金標(biāo)纖維層3、纖維素膜層4、手柄端吸水材料層5，在纖維素膜層4上印制有條狀的檢測印跡6和條狀的對照印跡7。
所說不吸水薄片層的支撐層采用的是硬質(zhì)塑膠片條，或不吸水的硬紙條，樣品纖維層采用玻璃棉，手柄端吸水材料層采用吸水紙，纖維素膜層采用硝酸纖維素膜，金標(biāo)纖維層采用吸附金標(biāo)蛋白的玻璃棉，在樣品纖維層與金標(biāo)纖維層及手柄端吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在樣品纖維層與金標(biāo)纖維層交界處的保護(hù)膜上偏向樣品纖維層一側(cè)0.5cm處印制樣品標(biāo)記線。
用于抗原檢測的試紙條的所述玻璃棉吸附的金標(biāo)蛋白為膠體金標(biāo)記抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1，在纖維素膜層上的檢測印跡6為抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb2，對照印跡7為山羊抗小鼠IgG多克隆抗體。
用于抗體檢測試紙條的所述玻璃棉吸附的金標(biāo)蛋白為膠體金標(biāo)記重組PCV2去核定位信號衣殼蛋白，在纖維素膜層上的檢測印跡6為山羊抗豬IgG多克隆抗體，對照印跡7為抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1。
所說的重組PCV2去核定位信號衣殼蛋白為利用原核高效表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化的基因工程重組蛋白，可與PCV2陽性血清特異結(jié)合。
所說的抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體特異識別PCV2衣殼蛋白，與豬圓環(huán)病毒1型衣殼蛋白無交叉反應(yīng)，可有效區(qū)分豬圓環(huán)病毒1型和2型病毒。
本實(shí)用新型有益的積極效果是PCV2抗原或抗體檢測試紙條操作簡單，人人都可操作，能較好滿足不同層次人員的需要，如疫病監(jiān)測、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、集約化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會效益。PCV2抗原或抗體檢測試紙條具有下列各項優(yōu)點(diǎn)(1)特異性強(qiáng)，敏感性高。PCV2抗原或抗體檢測試紙條以抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體或重組表達(dá)的PCV2去核定位信號衣殼蛋白為基礎(chǔ)制備而成；單克隆抗體為高親和力的抗PCV2衣殼蛋白特異性均質(zhì)抗體，特異識別PCV2衣殼蛋白，與PCV1無交叉反應(yīng)；重組去核定位信號衣殼蛋白蛋白為非全病毒抗原、安全性好，不含無關(guān)雜蛋白，具有良好抗原性，因此具有很高的特異性和敏感性。
(2)操作簡便快速。使用PCV2抗原或抗體檢測試紙條檢測PCV2抗原或抗體時，無需另配其它試劑，在2-10分鐘內(nèi)即可判定檢測結(jié)果。
(3)顯示檢測結(jié)果形象、直觀準(zhǔn)確。PCV2抗原或抗體檢測試紙條以一條紅棕色條狀印跡和兩條紅棕色條狀印跡作為檢測的陰性和陽性標(biāo)記，即在纖維素膜上顯示一條棕紅色“|”印跡表示在被檢測樣品液中PCV2病毒或抗體為陰性，兩條棕紅色“||”印跡表示在被檢樣品中PCV2病毒或抗體為陽性，結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽性誤判。
(4)成本低，投資少。PCV2抗原或抗體檢測試紙條可在檢測現(xiàn)場完成操作，檢測一步到位，成本低廉，投資少，見效快。


圖1是PCV2抗原及抗體檢測試紙條側(cè)視結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是PCV2抗原及抗體檢測試紙條俯視結(jié)構(gòu)示意圖，圖中支撐層1，樣品端纖維層2，金標(biāo)玻璃棉3，纖維素膜層4，手柄端吸水材料層5，檢測印跡6，對照印跡7，樣品端保護(hù)膜8，標(biāo)記線9，手柄端保護(hù)膜10。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種PCV2抗原或抗體檢測試紙條，具有支撐層1，反應(yīng)試劑載體吸附層，支撐層為不吸水薄片層，吸附層固定在支撐層上，吸附層從樣品端依次為纖維層2，金標(biāo)纖維層3，纖維素膜層4，手柄端為吸水材料層5，在纖維素膜層4上印制有檢測印跡“|”6和對照印跡“|”7，其排列組合為“||”。不吸水的支撐層薄片層用硬質(zhì)塑膠片條，或不吸水的硬紙條，纖維層用玻璃棉，吸水材料層用吸水紙，纖維素膜層用硝酸纖維素膜，金標(biāo)纖維層用吸附金標(biāo)蛋白的玻璃棉，在玻璃棉與金標(biāo)玻璃棉及吸水紙層上覆蓋有保護(hù)膜，在玻璃棉與金標(biāo)玻璃棉交界處對應(yīng)的保護(hù)膜偏向玻璃棉一側(cè)0.5cm處印制樣品標(biāo)記線。
PCV2抗原檢測試紙條的金標(biāo)蛋白為膠體金標(biāo)記抗PCV2 dCap蛋白單克隆抗體mAb1，在纖維素膜層上的檢測印跡6為抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb2，對照印跡7為山羊抗小鼠IgG多克隆抗體，PCV2抗體檢測試紙條的金標(biāo)蛋白為膠體金標(biāo)記PCV2重組去核定位信號衣殼蛋白，在纖維素膜層上的檢測印跡6為山羊抗豬IgG多克隆抗體，對照印跡7為抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1。
PCV2抗原或抗體檢測試紙條的實(shí)施結(jié)構(gòu)PCV2抗原或抗體檢測試紙條實(shí)施結(jié)構(gòu)參見圖1，圖2。圖中，1為支撐層用不吸水薄片條，實(shí)施中可采用塑膠薄片條或采用不吸水的硬質(zhì)紙片材，反應(yīng)試劑載體吸附層由2，3，4，5，組合而成，從樣品端2開始，到手柄端5依次粘貼在支撐層1上面；其中2為樣品端纖維層，實(shí)施中可使用玻璃纖維棉簡稱玻璃棉，3為吸附金標(biāo)蛋白的纖維層，可采用精制玻璃纖維棉，簡稱為金標(biāo)玻璃棉，4為纖維素膜層，實(shí)施中可采用硝酸纖維素膜，5為手柄端吸水材料層，采用吸水紙，如濾紙或其它吸水紙均可，試紙條總長8cm，寬度0.4cm，6為用抗PCV2dCap單克隆抗體mAb2或山羊抗豬IgG多克隆抗體在硝酸纖維素膜上印制的檢測印跡“|”，7為用山羊抗小鼠IgG多克隆抗體或抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1在硝酸纖維素膜上印制的對照印跡“|”，在纖維素膜層上的檢測印跡和對照印跡組合排列為“||”。8，10為保護(hù)膜，覆蓋在玻璃棉及金標(biāo)玻璃棉的保護(hù)膜為8，在玻璃棉和金標(biāo)玻璃棉交界處對應(yīng)位置的白色保護(hù)膜上偏向玻璃棉一方0.5cm處的保護(hù)膜上印有一條標(biāo)記線9，在標(biāo)記線9右邊印有箭頭和Max字樣，覆蓋在吸水層濾紙上的保護(hù)膜為10，保護(hù)膜可用黃色或其它顏色，2，3，4，5各層彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。
PCV2抗原或抗體檢測試紙條實(shí)施檢測反應(yīng)原理PCV2抗原檢測試紙條檢測反應(yīng)原理為PCV2抗原檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品溶液后，待檢溶液通過虹吸帶動待檢抗原與金標(biāo)蛋白一起向硝酸纖維素膜擴(kuò)散，并最終滲透到濾紙層中，在擴(kuò)散過程中待檢抗原與金標(biāo)蛋白相結(jié)合，形成金標(biāo)蛋白-抗原復(fù)合物，該復(fù)合物可與檢測印跡中的抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb2相結(jié)合，生成紅棕色“|”標(biāo)記，部分未與抗體結(jié)合的金標(biāo)蛋白不能與檢測印跡結(jié)合而繼續(xù)擴(kuò)散，在纖維膜上與對照印跡中的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體結(jié)合，生成紅棕色標(biāo)記“|”兩種標(biāo)記組合疊加，形成兩條紅棕色陽性標(biāo)記“||”，反之只有金標(biāo)蛋白與對照印跡相結(jié)合，沒有金標(biāo)蛋白-抗原復(fù)合物形成，不能與檢測印跡結(jié)合，則生成陰性標(biāo)記“|”。如果纖維素膜上沒有紅棕色標(biāo)記顯示，則表明試紙條已失效。
PCV2抗體檢測試紙條檢測反應(yīng)原理為PCV2抗體檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品溶液后，待檢溶液通過虹吸帶動待檢抗體與金標(biāo)蛋白一起向硝酸纖維素膜擴(kuò)散，并最終滲透到濾紙層中，在擴(kuò)散過程中待檢抗體與金標(biāo)蛋白相結(jié)合，形成金標(biāo)蛋白-抗體復(fù)合物，該復(fù)合物可與檢測印跡中的山羊抗豬IgG多克隆抗體相結(jié)合，生成紅棕色“|”標(biāo)記，部分未與抗體結(jié)合的金標(biāo)蛋白不能與檢測印跡結(jié)合而繼續(xù)擴(kuò)散，在纖維膜上與對照印跡中的抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1結(jié)合，生成紅棕色標(biāo)記“|”兩種標(biāo)記組合疊加，形成兩條紅棕色陽性標(biāo)記“||”，反之只有金標(biāo)蛋白與對照印跡相結(jié)合，沒有金標(biāo)蛋白抗體復(fù)合物形成，不能與檢測印跡結(jié)合，則生成陰性標(biāo)記“|”。如果纖維素膜上沒有紅棕色標(biāo)記顯示，則表明試紙條已失效。
PCV2抗原或抗體檢測試紙條檢測實(shí)例操作方法檢測樣品溶液的制備采集待檢豬淋巴結(jié)，脾，肺或血清，以樣品稀釋液或生理鹽水1∶5，1∶10，1∶20倍比稀釋，制備梯度稀釋樣品溶液。
PCV2抗原或抗體檢測試紙條檢測實(shí)例操作方法將PCV2抗原或抗體檢測試紙條樣品端分別插入梯度稀釋待檢測樣品液中，插入深度不超過標(biāo)記線9，約10秒后取出檢測試紙條，水平放置約2分鐘，觀察結(jié)果，在纖維素膜上顯現(xiàn)兩條紅棕色標(biāo)記“||”表示檢測結(jié)果呈陽性，顯現(xiàn)一條標(biāo)記“|”為陰性，檢測試紙條呈陽性的樣品最大稀釋度為待檢樣品的抗原或抗體滴度，如果檢測試紙條在待檢樣品各個稀釋度均呈陰性，則表明待檢樣品中不含PCV2病毒或抗體，如果檢測試紙條沒有標(biāo)記顯示，則表明試紙條失效。
實(shí)施例1 PCV2抗原檢測試紙條使用PCV2抗原檢測試紙條檢測豬PCV2感染時，采集待檢豬肉樣或病變組織，充分研磨后，以生理鹽水1∶10或1∶20稀釋，制備待檢樣品溶液，將PCV2抗原檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品液中，插入深度不超過標(biāo)記線9，約10秒后取出檢測試紙條，水平放置約2分鐘，觀察結(jié)果，在纖維素膜上顯現(xiàn)兩條紅棕色標(biāo)記“||”的樣品為PCV2陽性，表明待檢樣品感染PCV2，顯現(xiàn)一條標(biāo)記“|”為PCV2陰性，則表明待檢樣品沒有PCV2感染，如果檢測試紙條沒有標(biāo)記顯示，則表明試紙條失效。
實(shí)施例2 PCV2抗體檢測試紙條使用PCV2抗體檢測試紙條檢測豬血清PCV2抗體水平時，采集待檢豬血液，分離血清，以生理鹽水1∶10，1∶20，1∶40倍比稀釋，制備梯度稀釋樣品溶液，將PCV2抗體檢測試紙條樣品端分別插入梯度稀釋待檢測樣品液中，插入深度不超過標(biāo)記線9，約10秒后取出檢測試紙條，水平放置約2分鐘，觀察結(jié)果，在纖維素膜上顯現(xiàn)兩條紅棕色標(biāo)記“||”的樣品為PCV2抗體陽性，顯現(xiàn)一條標(biāo)記“|”為PCV2抗體陰性，PCV2陽性的樣品最大稀釋度即為待檢血清樣品的PCV2抗體滴度，如果檢測試紙條在待檢血清各個稀釋度均呈陰性，則表明待檢血清不含PCV2抗體，如果檢測試紙條沒有標(biāo)記顯示，則表明試紙條失效。
權(quán)利要求1.豬圓環(huán)病毒2型抗原或抗體檢測試紙條，其特征在于它由支撐層(1)、反應(yīng)試劑載體吸附層和覆蓋的保護(hù)膜所組成；所述支撐層為不吸水薄片層，反應(yīng)試劑載體吸附層固定在支撐層上，反應(yīng)試劑載體吸附層從樣品端依次為樣品纖維層(2)、金標(biāo)纖維層(3)、纖維素膜層(4)、手柄端吸水材料層(5)，在纖維素膜層(4)上印制有條狀的檢測印跡(6)和條狀的對照印跡(7)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬圓環(huán)病毒2型抗原或抗體檢測試紙條，其特征在于所說不吸水薄片層的支撐層采用的是硬質(zhì)塑膠片條，或不吸水的硬紙條，樣品纖維層采用玻璃棉，手柄端吸水材料層采用吸水紙，纖維素膜層采用硝酸纖維素膜，金標(biāo)纖維層采用吸附金標(biāo)蛋白的玻璃棉，在樣品纖維層與金標(biāo)纖維層及手柄端吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在樣品纖維層與金標(biāo)纖維層交界處的保護(hù)膜上偏向樣品纖維層一側(cè)0.5cm處印制樣品標(biāo)記線。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原或抗體檢測試紙條，其特征在于用于抗原檢測的試紙條的所述玻璃棉吸附的金標(biāo)蛋白為膠體金標(biāo)記抗豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白單克隆抗體mAb1，在纖維素膜層上的檢測印跡(6)為抗豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白單克隆抗體mAb2，對照印跡(7)為山羊抗小鼠IgG多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原或抗體檢測試紙條，其特征在于用于抗體檢測試紙條的所述玻璃棉吸附的金標(biāo)蛋白為膠體金標(biāo)記重組豬圓環(huán)病毒2型去核定位信號衣殼蛋白，在纖維素膜層上的檢測印跡(6)為山羊抗豬IgG多克隆抗體，對照印跡(7)為抗豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白單克隆抗體mAb1。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原或抗體檢測試紙條，其特征在于所說的重組豬圓環(huán)病毒2型去核定位信號衣殼蛋白為利用原核高效表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化的基因工程重組蛋白，可與豬圓環(huán)病毒2型陽性血清特異結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的豬圓環(huán)病毒2型抗原或抗體檢測試紙條，其特征在于所說的抗豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白單克隆抗體特異識別豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白，與豬圓環(huán)病毒1型衣殼蛋白無交叉反應(yīng)，可有效區(qū)分豬圓環(huán)病毒1型和2型病毒。
專利摘要本實(shí)用新型提供一種豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗原或抗體檢測試紙條。本設(shè)計的檢測試紙條由不吸水薄片的支撐層、反應(yīng)試劑載體吸附層和覆蓋的保護(hù)膜所組成。反應(yīng)試劑載體吸附層從樣品端依次為采用玻璃棉的樣品纖維層、吸附金標(biāo)蛋白(抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1或去核定位信號衣殼蛋白)的纖維層、印制檢測印跡(抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb2或山羊抗豬IgG多克隆抗體)和對照印跡(山羊抗小鼠IgG多克隆抗體或抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體mAb1)的纖維素膜層、手柄端吸水材料層，在樣品纖維層與金標(biāo)纖維層交界處的保護(hù)膜上印制樣品標(biāo)記線。本實(shí)用新型用于PCV2抗原或抗體檢測操作簡單，能較好滿足不同層次人員的需要。
文檔編號G01N33/558GK2911690SQ20062010442
公開日2007年6月13日 申請日期2006年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月7日
發(fā)明者周繼勇, 郭軍慶, 商紹彬, 申會剛 申請人:浙江大學(xué)