專利名稱：：來自血漿的低聚糖的分析方法來自血漿的低聚糖的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的目的是來自血漿的低聚糖的分析方法，這些低聚糖構(gòu)成低分子量肝素和非常低分子量肝素。這些肝素是糖胺聚糖族的生物活性劑，它們具有特別有用的抗凝血性。將肝素多糖長鏈切成低分子量短鏈，制備出這些低分子量肝素(HBPM)和非常低分子量肝素(HTBPM)。構(gòu)成HBPM和HTBPM的低聚糖通常用宏觀參數(shù)(例如它們的平均分子量)或生物活性(例如aXa活性(IU/mg))進(jìn)行表征。測量與抗凝血酶III相互作用的方法是最常使用的方法。然而，測量這些宏觀參數(shù)與生物活性并不能回答幾個(gè)至關(guān)重要的問題。特別地，不可能基于這些標(biāo)準(zhǔn)分析構(gòu)成HBPM和HTBPM的不同低聚糖的藥物代謝動(dòng)力學(xué)分布圖。例如，aXa活性僅考慮了對(duì)ATIII有親和力的種類，即僅約20%混合物；因此，80%低聚糖的性能沒有測定。此外，構(gòu)成親和性混合物的每個(gè)種類的份額不可能測量到。因此，不可能精確地確定每種低聚糖的血漿濃度，更有理由地，通過簡單測定其aXa活性不可能精確地確定其藥物代謝動(dòng)力學(xué)分布圖。然而，這些分布圖為改進(jìn)HBPM和HTBPM基藥品劑量提供了非常有價(jià)值的信息。為了能夠分析血漿中構(gòu)成HBPM或HTBPM的不同低聚糖的性能，應(yīng)該能夠完全而再現(xiàn)地將血漿中的這些低聚糖與其它組分(特別是蛋白)分離。現(xiàn)在技術(shù)描述的方法利用強(qiáng)蛋白酶處理(Volpi等人，1995,《Biochim.Biophys.Acta.》，1243(1)，49-58)。色譜法或電泳法有可能分析HBPM的不同組分。例如，采用毛細(xì)管電泳法(EC)分離肝素低聚糖(Guerrini等人，《糖生物學(xué)》(Glycobiology)，2002，12，713-719;Linhardt等人，《BioMethods》，1997，2，183-197)。然而，EC的選擇性比液相色鐠法低得多。在某些情況下，還可能使用MALDI-TOF質(zhì)譜分析法分析肝素低聚糖，但這種方法不能應(yīng)用于復(fù)雜的混合物，更不用說它的高成本。因此，特別地采用高效液相色譜法(CLHP)分析硫酸化低聚糖，如構(gòu)成HBPM和HTBPM的硫酸化低聚糖。最近(WO2004/027087)描述了一種HBPM分析方法，該方法包括酶解聚作用，接著如果必要進(jìn)行還原反應(yīng)，與CLHP定量分析。最近歐洲申請(qǐng)(EP042卯789.9)公開了采用陰離子交換色譜法定量測定構(gòu)成HBPM和HTBPM的低聚糖的方法。該方法利用反相硅膠柱動(dòng)力學(xué)吸附季銨鹽，特別地鯨蠟基甲基銨的陰離子交換色譜法，它們?cè)趐H2-12范圍內(nèi)保持凈正電荷并且不變。在使用CTA-SAX柱進(jìn)行HBPM和HTBPM的CLHP分析之前，這種方法可能涉及預(yù)處理，解聚或采用排阻色譜法的分離。本發(fā)明的目的是血漿低聚糖的分析方法，其特征在于進(jìn)行下述兩個(gè)步驟誦處理血漿樣品，-CLHP的定量分析。在采用CLHP定量分析前，該方法既不涉及對(duì)血漿樣品中的低聚糖進(jìn)行酶解聚，也不涉及采用排阻色譜法進(jìn)行分離。另一方面，根據(jù)這種方法，采用過濾方法處理這種血漿樣品，以便分離這些低聚糖，讓它們?cè)跒V液中與血漿污染物，特別是留在濃縮物中的蛋白質(zhì)再接因此，本發(fā)明的目的更特別地是如前面所定義的方法，其中采用過濾方法處理這種血漿樣品。本發(fā)明的一個(gè)非常特別的目的是如前面所定義的方法，其特征在于分子量大于30kDa的分子留在該濃縮物中。為了能夠?qū)ρ獫{樣品處理方法進(jìn)行量化，并驗(yàn)證這種處理在樣品間的再現(xiàn)性，如果必要往樣品中添加內(nèi)標(biāo)。這個(gè)內(nèi)標(biāo)應(yīng)該是一種低聚糖，如果可能的話在結(jié)構(gòu)上接近定量產(chǎn)物，該產(chǎn)物在過濾前才與血漿混合。本發(fā)明的另一個(gè)目的因此是如前面所定義的方法，其特征在于在過濾前才往血漿樣品中添加對(duì)照低聚糖。盡管采用過濾方法將大多數(shù)低聚糖與蛋白質(zhì)分離，但可能的是一部分依然因與濃縮物的靜電相互作用而被捕獲。在這種情況下，必須使用鹽溶液對(duì)濃縮物進(jìn)行一次或多次洗滌。本發(fā)明的另一個(gè)目的因此是如前面所定義的方法，其特征在于該濃縮物使用鹽溶液進(jìn)行至少一次洗滌。根據(jù)本發(fā)明，該鹽溶液優(yōu)選地是氯化鉀溶液。更特別地，本發(fā)明的目的是如前面所定義的方法，其特征在于鹽溶液在添加到濃縮物之后的濃度大于或等于1M，非常特別地，是這樣一種方法，其中鹽濃度大于或等于2M。用鹽溶液洗滌一次或多次后，如果必要，該濃縮物再用水洗滌。因此本發(fā)明的目的是如前面所定義的方法，該方法包括該濃縮物在用鹽溶液洗滌至少一次之后再用水洗滌的步驟。原始濾液與來自洗滌操作的濾液合并，該合并濾液用水稀釋5倍。這種稀釋使所有的低聚糖在注入色諳柱后能夠再濃縮，同時(shí)防止由于鹽濃度過高造成峰加寬。注射后立即添加1NHC1將溶液的pH調(diào)節(jié)到3。根據(jù)本發(fā)明方法，直接注入全部的濾液，如果必要，還有全部洗液，并進(jìn)行CLHP分析。陰離子交換CLHP是最適合于這樣一種復(fù)雜混合物的分離方法。特別地，CLHP使用通過共價(jià)鍵接枝季銨的陰離子交換柱。這類色譜柱的優(yōu)點(diǎn)是能夠使用高氯酸鹽作為流動(dòng)相，而使用CTA-SAX色譜柱則是不可能的，因?yàn)楦呗人猁}與CTA有強(qiáng)絡(luò)合作用。因此，本發(fā)明的另一目的是如前面所定義的方法，其中采用陰離子交換CLHP定量測定低聚糖。更特別地，本發(fā)明的目的是如前面所定義的方法，其中采用CLHP，使用通過共價(jià)鍵接枝季銨的陰離子交換柱定量測定低聚糖.可以使用粒度9-13pm、長度25cm的IonPAcAS11型(Dionex)柱?？梢允褂弥睆絣-4.6mm的所有常用色譜柱，但優(yōu)選使用直徑2mm的色譜柱。在更一般的范圍內(nèi)，可以使用更小直徑(例如lmm)的柱，實(shí)際上需要更少量的血漿，還能夠提高分析靈敏度.使用的裝置可以是能形成洗脫梯度，使用UV檢測器的色譜儀。應(yīng)優(yōu)選使用裝有二極管陣列的檢測器，它能夠獲得這些成分的UV光譜，記錄由兩個(gè)不同波長的吸光度(absorbance)之差造成的復(fù)雜信號(hào)，該復(fù)雜信號(hào)使得檢測血漿源化合物中的乙酰化低聚糖成為可能。使用直到200nm都透明的移動(dòng)相能夠有利于區(qū)分這些成分。這里使用的移動(dòng)相優(yōu)選地應(yīng)是高氯酸鈉溶液，不過也可以使用甲磺酸鹽或磷酸鹽。因此，本發(fā)明的目的是如前面所定義的方法，其特征在于使用直到200nm都透明的移動(dòng)相。特別地，本發(fā)明的目的是如前面所定義的方法，其特征在于移動(dòng)相是高氯酸鈉溶液、甲磺酸鹽溶液或磷酸鹽溶液。非常特別地，本發(fā)明的的目的是如前面所定義的方法，其特征在于移動(dòng)相是高氯酸鈉溶液。這種分離所推薦的pH是2-6.5。優(yōu)選地使用pH約3。添加鹽(如磷酸鹽)可以達(dá)到該pH，磷酸鹽在pH-3的緩沖能力比高氯酸鹽的好。作為實(shí)例，下面給出色語分離的標(biāo)準(zhǔn)條件-溶劑a:2.5mmNaH2P04，添加H:jP04將pH調(diào)節(jié)到2.9，-溶劑B:lNNaC104，2.5mmNaH2P04，添加H3P04將pH調(diào)節(jié)到3.0，洗脫梯度可以如下T=0min:%B=3;T=40min:%B=60;T=60min:o/oB=80對(duì)于直徑2mm的色鐠柱，選擇的流量例如是0.22ml/min，柱溫度401C。采用uv檢測在過濾血漿樣品中的低聚糖。由于所有非乙?；嗵窃谝欢ǖ膒H下都具有幾乎相同的UV諮，所以以兩個(gè)選擇波長的吸光度(absorbance)之差取作信號(hào)，以便消除非乙酰化糖類的吸收率(absorptivit6)時(shí)，于是有可能選擇性地檢測乙酰化糖類。在下述情況下，選擇202nm和230nm作為參比波長，記錄202_230nm的信號(hào)。對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員顯而易見的是，選擇波長將取決于移動(dòng)相的pH，因此為了達(dá)到所述最佳條件，可能有必要調(diào)節(jié)幾個(gè)nm。最適合這種技術(shù)的檢測器是AgilentTechnologies公司的DAD檢測器.在這種情況下，每個(gè)樣品都進(jìn)行二次檢測，一次在234nm，另一次在202-230nm'還可以進(jìn)行三次檢測，每個(gè)樣品額外測定在280nm的吸光度，這樣能夠確認(rèn)該信號(hào)沒有被蛋白殘余物污染。因此，本發(fā)明的目的是如前面所定義的方法，其特征在于該檢測方法能夠選擇性地檢測乙酰化糖類。本發(fā)明的另一個(gè)目的是如前面所定義的方法，其特征在于以兩個(gè)選擇波長的吸光度之差取作信號(hào)，以便消除非乙?；穷惖奈章蕰r(shí)，進(jìn)行乙?；穷惖倪x擇性檢測。因而非常特別地，本發(fā)明的目的是如前面所定義的方法，其特征在于通過測定在202-230nm和234nm的吸光度時(shí)，進(jìn)行選擇性檢測乙酰化糖類的方法。因而非常特別地，本發(fā)明的目的是如前面所定義的方法，其特征在于通過測定在202-230nm、234nm和280nm的吸光度，進(jìn)行選擇性檢測乙?；穷惖姆椒?。如前面所定義的方法更特別地能夠分析所有(3-不飽和低聚糖。更特別地，它應(yīng)用于構(gòu)成依諾肝素、octaparine、貝米肝素(bemiparine)和亭扎肝素(tinzaparine)的低聚糖。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例操作方式血漿處理取出體積100-lOOOjil的血漿樣品，如果必要，往該血漿樣品添加內(nèi)標(biāo)。均化后，把得到的溶液加到預(yù)先用250nl水漂洗的30kDUUrafree05超濾管(Millipore)中，以10000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘.如果過濾量大于500^1，則血漿可一次或兩次加到離心管的上部。該離心管以速度10000轉(zhuǎn)/分離心1-2小時(shí)，然后取出濾液，如果必要，第二部分待過濾血漿加到離心管的上部，離心管再進(jìn)行離心。加入血漿準(zhǔn)確量進(jìn)行稱重。離心管進(jìn)行離心直到離心管上部的蛋白質(zhì)殘余物不到初始部分的約1%。取出濾液，往濃縮物里添加每ml過濾血漿為210jil3MKCl。均化后，該離心管以速度IO000轉(zhuǎn)/分離心1-4小時(shí).離心管進(jìn)行離心直到離心管上部中的蛋白質(zhì)殘余物不到初始部分的約10%.取出笫二次濾液，第二次往濃縮物里添加每ml過濾血漿為210|il3MKC1。均化后，該離心管以速度10000轉(zhuǎn)/分離心1-4小時(shí)。離心管進(jìn)行離心直到離心管上部中的蛋白質(zhì)殘余物不到初始部分的約10%。取出第三次濾液，添加每ml過濾血漿為2S0jd水。均化后，離心管以速度IO000轉(zhuǎn)/分離心l-4小時(shí)。離心管進(jìn)行離心直到離心管上部中的蛋白質(zhì)殘余不到初始部分的約10%。這些濾液合并，并用水稀釋5倍，全部濾液直接注入到陰離子交換CLHP中。在注入前添立即加1NHC1使注入溶液的pH調(diào)節(jié)到3。CXHP法過濾的血漿采用陰離子交換CLHP進(jìn)行分析。使用的柱是IonPAcAsll柱(Dionex)，長度25cm，內(nèi)徑2mm。使用的檢測器是裝有二極管陣列的UV分光光度計(jì)。添加NHC1將pH調(diào)整到3之后，注入全部pH。選擇流量是0.22ml/min;柱溫度是40匸。以梯度方式進(jìn)行洗脫。使用的兩種溶液是溶劑A:2.5mmNaH2P04，添加H3P04見pH調(diào)節(jié)到2.9，溶劑B:lNNaC104，2.5mmNaH2P04，添加H3P04將pH調(diào)節(jié)到3.0,洗脫梯度如下T-Omin:%B=3;T=40min:%B=60;T=60min:%B=80實(shí)施例1監(jiān)測雄性比格獵犬血液中三種八糖混合物的變化。表示為AIIaIIsIsIs、Alsllallsls和AIIalIsIsIs"6脫水的這三種八糖是Lovenox⑧八糖部分的主要親和力八糖。它們對(duì)ATIH具有高親和力，因此具有抗血栓形成活性。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>以這三種組分每種目標(biāo)劑量0.5mg/kg往3只雄性比格犬皮下給藥該混合物。給藥溶液是在0.5mg/ml目標(biāo)濃度時(shí)三種八糖混合物的0.9°/NaCl溶液。在給藥后O、0.25h、0.5h、lh、2h、4h、6h、8h、24h、30h和48h時(shí)間取出5ml血液樣品。取出的血液樣品收集在裝有400^1CTAD(檸檬酸鹽、茶堿、腺苷、雙嘧達(dá)莫)混合物的試管中。均化后，該溶液在15匸下在3000g離心lSmin?；厥昭獫{的上清液，在-20C儲(chǔ)存直到使用。為了在CLHP注入前處理血漿，取出約lml血漿并稱重，往該血漿里加入濃度約0.02g/l的5(HU內(nèi)標(biāo)溶液。內(nèi)標(biāo)這樣選擇，使得在結(jié)構(gòu)上盡可能地接近被分析產(chǎn)物。其結(jié)構(gòu)如下。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>使用的四糖能夠校正提取產(chǎn)率變化的可能影響。血漿進(jìn)行處理并采用CLHP分析。得到的結(jié)果列在表l中，相應(yīng)的色譜圖描繪在圖1中.表l:3種八糖的血漿濃度QtM)隨給藥后時(shí)間的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例2人類志愿者以目標(biāo)劑量1.4mg/kg給藥平均分子量2500Da的HTBPM。在給藥后0、0.25h、0.5h、0.75h、lh、1.25h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、12h、14h和24h時(shí)間取出血液樣品。由于使用的HTBPM是低聚糖的復(fù)雜混合物，其研究限于選自這種混合物的某些組分。此外，由于沒有找到在色譜水平不干擾混合物的其中一種組分的內(nèi)標(biāo)，所以取實(shí)施例1中用親和力八糖得到的摩爾應(yīng)答系數(shù)作為摩爾應(yīng)答系數(shù)，進(jìn)行了定量測定。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>結(jié)果證明，構(gòu)成所研究低分子量肝素的低聚糖之間在性能上有極大的差異。具有aXa活性的低聚糖比其它硫酸化低聚糖具有緩慢得多的除去動(dòng)力學(xué)，這由監(jiān)測aXa活性是不能覺察的。得到的結(jié)果列在表2中。相應(yīng)的色譜圖描繪在圖2中。表2:主要低聚糖的血漿濃度(HM)隨給藥后時(shí)間的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>圖1:犬l的3種八糖的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的色譜監(jiān)測。表2:構(gòu)成非常低分子量肝素的主要低聚糖色譜監(jiān)測隨給藥后時(shí)間的變化。權(quán)利要求1.來自血漿的低聚糖的分析方法，其特征在于進(jìn)行下述兩個(gè)步驟a、處理樣品，然后b、采用高效液相色譜法(CLHP)的定量測定。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于采用過濾方法處理血漿樣品。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于分子量大于30kDa的分子留在濃縮物中。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于在過濾前往血漿里添加對(duì)照低聚糖。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于該濃縮物在鹽溶液中洗、滌至少一次。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于鹽溶液是氯化鉀溶液。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于添加濃縮物后鹽溶液的濃度高于或等于1M。8.根據(jù)權(quán)利要求5或6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于添加濃縮物后鹽溶液的濃度等于或高于2M。9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于該濃縮物在鹽溶液中洗滌至少一次，然后再用水洗滌。10.根據(jù)權(quán)利要求l-9中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于注入全部濾液，如果必要，注入全部洗滌液，并采用CLHP進(jìn)行分析.11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于該色諮法是陰離子交換色譜法。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于該色謙法是使用陰離子交換柱與通過共價(jià)鍵接枝季銨的陰離子交換色譜法.13.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于使用直到200nm是透明的移動(dòng)相。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于該移動(dòng)相是高氯酸鈉溶液、曱磺酸鹽溶液或磷酸鹽溶液。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于該移動(dòng)相是高氯酸鈉溶液。16.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于它包括能夠選擇性檢測乙?；穷惖臋z測方法。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于以兩個(gè)波長的吸光度之差取作信號(hào)，以便除去非乙酰化糖類的吸收率，進(jìn)行選擇性檢測乙?；穷惖姆椒?。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于通過測定在202-230nm和234nm的吸光度，進(jìn)行選擇性檢測乙酰化糖類的方法。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于通過測定在202-230nm、234nm和280nm的吸光度，進(jìn)行選擇性檢測乙酰化糖類的方法。20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法在(3-不飽和低聚糖定量測定中的用途。21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法在依諾肝素、octaparine、貝米肝素或亭扎肝素定量測定中的用途。22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法在下述一種或多種八糖定量測定中的用途<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法在下述一種或多種低聚糖定量測定中的用途<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>全文摘要本發(fā)明涉及血漿低聚糖的分析方法，這些低聚糖構(gòu)成低分子量肝素和非常低分子量肝素。文檔編號(hào)G01N33/66GK101107526SQ200680002555公開日2008年1月16日申請(qǐng)日期2006年1月18日優(yōu)先權(quán)日2005年1月19日發(fā)明者C·維斯科夫,P·莫里爾申請(qǐng)人:艾文蒂斯藥品公司