專利名稱：Mhc寡聚體及其制備方法
MHC寡聚體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及MHC寡聚體，其中單個(gè)的功能性MHC復(fù)合物單體們 通過其結(jié)合于所述復(fù)合物的肽結(jié)合溝中的肽發(fā)生寡聚化，本發(fā)明還涉及 制備這種MHC寡聚體的方法及各種使用所述MHC寡聚體的方法。
背景技術(shù)：
存在于組織的細(xì)胞表面上的主要相容性復(fù)合物(MHC)分子在通過與 T細(xì)胞表面上的T細(xì)胞受體(TCR)的相互作用將短的線性肽形式的細(xì)胞 抗原呈遞給T細(xì)胞方面起到了重要作用。MHC分子是由a和P鏈、以及 結(jié)合于當(dāng)這些鏈正確折疊時(shí)所述鏈所形成的溝的肽組成。
已經(jīng)知道分離或重組形式的MHC肽分子可以用于依據(jù)T細(xì)胞所識(shí) 別的特異性肽抗原來檢測、分離和加工處理這些T細(xì)胞。也已經(jīng)了解到 MHC分子和跨細(xì)胞表面的TCR之間的相互作用在本質(zhì)上都是多聚體的 相互作用，且單個(gè)MHC分子和給定TCR的親和力通常是相當(dāng)?shù)偷摹?br> 因此，盡可能開發(fā)出多聚體形式的具有增加的功能親和力的分離或 重組的MHC肽分子，以便使得這些分子在上面所述的應(yīng)用中是更有用 的。
歐洲專利申請(qǐng)EP 812 331描述了用于依據(jù)T細(xì)胞抗原受體特異性標(biāo) 記、檢測和分離哺乳動(dòng)物T細(xì)胞的多聚體的結(jié)合復(fù)合物，所述復(fù)合物具 有結(jié)構(gòu)式(ot-(3-P)n，其中(a-P-P)是MHC肽分子，n2 2， a包含I類MHC 或II類MHC分子的a鏈，P包含MHC蛋白的p鏈，以及P是基本上同質(zhì) 的肽抗原。通過將MHC分子的a或P鏈中的其中一條鏈的C末端生物素 化并將MHC單體與四價(jià)的鏈霉抗生物素/抗生物素蛋白相結(jié)合使得 MHC肽分子發(fā)生多聚化，或者通過提供其中a或p鏈中的其中一條鏈的
c末端被修飾成包含被作為多聚化實(shí)體的相應(yīng)抗體所識(shí)別的表位的 MHC分子的嵌合蛋白使得MHC肽分子發(fā)生多聚化。該文獻(xiàn)還披露了 MHC寡聚體用于依據(jù)T細(xì)胞的TCR特異性來檢測、標(biāo)記和分離特異性 T細(xì)胞的用途。
WO 93/10220披露了嵌合MHC分子，其包含MHC的可溶性部分， 這可以是與免疫球蛋白恒定區(qū)融合的I型或II類MHC。分子的MHC部 分包含互補(bǔ)的a和/或p鏈以及結(jié)合于MHC分子的相應(yīng)的結(jié)合溝的肽。因 為存在二聚體的免疫球蛋白構(gòu)架，這些嵌合MHC-Ig分子可以自我組裝 成二聚體結(jié)構(gòu)。
歐洲專利申請(qǐng)EP 665 289披露了特異肽、結(jié)合這些肽的MHC分 子、以及通過使具有結(jié)合于其內(nèi)的特異肽的相應(yīng)的MHC分子發(fā)生交聯(lián) 而獲得的寡聚體。通過使用交聯(lián)劑或者通過提供包含被免疫球蛋白例如 IgG或IgM識(shí)別的表位的MHC嵌合蛋白可以實(shí)現(xiàn)寡聚化。MHC分子可 以包含標(biāo)記，并被用于依據(jù)T細(xì)胞的特異性受體結(jié)合來標(biāo)記、檢測和分 離T細(xì)胞，并最終可以應(yīng)用于人類治療。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，EP 665 289描述了寡聚體的MHC復(fù)合物， 其通過使用寡聚體形式的MHC結(jié)合肽發(fā)生寡聚化。通過肽上面的化學(xué) 修飾可以連接寡聚體肽，或者寡聚體肽可能己經(jīng)形成線性的寡聚體，即 一個(gè)肽鏈具有多個(gè)MHC結(jié)合部分。
US 2002/0058787披露了肽寡聚體，其包含至少兩個(gè)經(jīng)柔性分子接 頭連接的MHC結(jié)合肽。MHC結(jié)合肽可以是I類MHC結(jié)合肽或II類 MHC結(jié)合肽。也披露了用于生產(chǎn)這種寡聚體的定向克隆方法。所闡述 的寡聚體例如可以被用于特異性激活或抑制CD4+或CD8+ T細(xì)胞的活 性的方法。這種方法提供了用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、同種異體 移植物排斥和過敏反應(yīng)的治療手段。但是這些肽寡聚體并不是非常適合 于形成分離的MHC肽多聚體，因?yàn)橥ǔ１仨氃诖嬖谀栠^量的肽的條 件下孵育可溶性MHC復(fù)合物或其鏈。這會(huì)造成復(fù)合物的非常不完全的
寡聚化以及且所形成的復(fù)合物中的MHC結(jié)合肽的多個(gè)節(jié)段沒有與MHC 肽復(fù)合物結(jié)合的情況，這反過來會(huì)造成這些復(fù)合物的特異性減低以及更 高的背景結(jié)合力。
在構(gòu)建MHC多聚體時(shí)，首先需要構(gòu)建出MHC肽單體，然后通過 將它們附著到多價(jià)實(shí)體(例如如US5，635，363所述)或者彼此附著將這些 單體多聚化。但是US 5,635,363所述的方法需要MHC肽復(fù)合物的a或p 鏈具有用于單體與多價(jià)實(shí)體特異性附著的表位或位點(diǎn)。事實(shí)上，提供這 種特異性附著位點(diǎn)的便利方法還很少。
最簡單的方法可能是提供MHC分子的C末端上的抗體結(jié)合表位， 然后通過特異于表位的一個(gè)或多個(gè)抗體將分子多聚化。這種技術(shù)的缺點(diǎn) 是單體的抗體表位相互作用通常不像要求的那樣強(qiáng)烈，且如果多聚化是 通過兩步方法實(shí)現(xiàn)的，例如首先通過結(jié)合表位特異性抗體，其次是通過 所形成的MHC抗體復(fù)合物的同種型特異性抗體，則所形成的分子可能 很大。
對(duì)通過重組蛋白表達(dá)生成的多肽的任一化學(xué)位點(diǎn)特異性修飾都是困 難的，因?yàn)榻^大多數(shù)已知的靶向結(jié)合方法都特異于一或多種氮基酸。因 此， 一些氨基酸常常同時(shí)被修飾，包括在單體復(fù)合物形成之后結(jié)合于 MHC分子的抗原肽的那些氨基酸。這對(duì)復(fù)合物與其互補(bǔ)的T細(xì)胞受體 成功結(jié)合的能力具有無法控制的影響。對(duì)于任何隨機(jī)的交聯(lián)過程來說更 是如此。
作為另一種選擇方案，已經(jīng)推薦利用生物素-鏈霉抗生物素系統(tǒng)將 MHC復(fù)合物寡聚化(見例如US 5,635,363)。這個(gè)方法要求在接近所述 MHC的其中一個(gè)羧基末端上對(duì)MHC進(jìn)行酶性生物素化。大約14個(gè)氨 基酸的酶識(shí)別肽序列與一個(gè)MHC肽鏈的C末端融合，然后容許復(fù)合物 通過應(yīng)用能夠識(shí)別這個(gè)位點(diǎn)的生物素化酶發(fā)生生物素化。生物素化因此 包括大量的操作步驟，包括多輪蛋白純化、和造成活性MHC復(fù)合物大 量丟失的酶性生物素化反應(yīng)。此外，對(duì)單體MHC亞基的生物素化效率
以及最終多聚體產(chǎn)物的質(zhì)量的控制都是困難的。例如，在合成包含同質(zhì)
的肽的特異性MHC復(fù)合物且合成產(chǎn)率非常低的情況下，生物素化反應(yīng) 中的蛋白丟失以及低于100%的生物素化效率可以使得最終產(chǎn)物的產(chǎn)率 要低于可接受的水平。
這個(gè)方法學(xué)也將生物素化復(fù)合物的多聚化方法局限于所述復(fù)合物與 抗生物素蛋白家族蛋白或這種蛋白的交聯(lián)變體的結(jié)合，所述抗生物素蛋 白家族蛋白例如是鏈霉抗生物素，其使得所述復(fù)合物發(fā)生四聚體化。但 是，對(duì)于交聯(lián)的抗生物素蛋白家族蛋白變體而言，難以準(zhǔn)確地控制復(fù)合 物的效價(jià)。對(duì)于不想要四聚體的或不一致效價(jià)的多聚體或者不想使用鏈 霉抗生物素或鏈霉抗生物素相關(guān)分子的情況，這個(gè)方法也有嚴(yán)重的局限 性。
本發(fā)明的目的是通過提供容許發(fā)生任何所需程度的寡聚化的MHC
寡聚體實(shí)現(xiàn)對(duì)已有技術(shù)的改進(jìn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供寡聚體，所 述寡聚體可以合適的產(chǎn)率和優(yōu)越的純度進(jìn)行制備。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上面提及的和其他的已有技術(shù)的缺點(diǎn)，以及為了實(shí)現(xiàn)上面 的目的，本發(fā)明的第一個(gè)方面因此提供了 MHC寡聚體，其包含至少兩 個(gè)具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個(gè)MHC復(fù)合物都具有結(jié)合 于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝中的肽，其中每個(gè)肽都具有容許所述功 能性MHC復(fù)合物通過一核心結(jié)構(gòu)發(fā)生高度特異性寡聚化的修飾。
優(yōu)選地，MHC寡聚體基本上不含未與MHC肽復(fù)合物結(jié)合的MHC 結(jié)合肽的節(jié)段。
優(yōu)選地，MHC寡聚體所含的MHC肽復(fù)合物中的所述肽的MHC結(jié) 合部分的氨基酸側(cè)鏈和/或MHC a或(3鏈的氨基酸側(cè)鏈在寡聚化的過程中 基本上都沒有被修飾。
在第一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及MHC寡聚體，其包含至少 兩個(gè)具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個(gè)MHC復(fù)合物都具有結(jié) 合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的肽，在所述包含肽的功能性單體 MHC復(fù)合物發(fā)生組裝后，MHC復(fù)合物在其肽位置發(fā)生寡聚化。
在第二個(gè)具體實(shí)施方式
中，發(fā)明涉及MHC寡聚體，其包含至少兩 個(gè)具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個(gè)MHC復(fù)合物都具有結(jié)合 于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的肽，其中每個(gè)肽都包含選自由特異性 附著位點(diǎn)(specific attachment site)禾卩寡聚化結(jié)構(gòu)域(oligomerisation domain)組成的組中的修飾，
其中通過以下方式實(shí)現(xiàn)功能性MHC復(fù)合物的寡聚化
(i) 每個(gè)肽在每個(gè)肽上所提供的或附著于其的特異性附著位點(diǎn)與多價(jià) 實(shí)體結(jié)合，或者
(ii) 所述的肽通過每個(gè)肽上所提供的或附著于其的寡聚化結(jié)構(gòu)域進(jìn) 行排列，
其中寡聚體中的MHC復(fù)合物與多價(jià)實(shí)體或肽排列所提供的核心結(jié) 構(gòu)相連接。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供藥物組合物或診斷組合物，其包含上面 所定義的MHC寡聚體，任選地與藥學(xué)可接受載體組合，每個(gè)肽都具有 容許發(fā)生寡聚化的修飾，所述修飾選自由附著位點(diǎn)或寡聚化結(jié)構(gòu)域組成 的組。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一些依據(jù)T細(xì)胞抗原受體能夠結(jié)合功 能性MHC復(fù)合物的特異性來標(biāo)記和/或檢測和/或分離哺乳動(dòng)物T細(xì)胞的 方法。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了形成MHC寡聚體的方法，所述MHC 寡聚體包含至少兩個(gè)具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個(gè)MHC 復(fù)合物都具有結(jié)合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的肽，其中每個(gè)肽都
具有容許所述功能性MHC復(fù)合物通過一核心結(jié)構(gòu)發(fā)生高度特異性寡聚
化的修飾，所述方法包括步驟
(i) 提供一或多種能夠結(jié)合于每個(gè)功能性MHC復(fù)合物的肽溝的肽，
所述肽通過以下方式被修飾
(a) 提供特異性附著位點(diǎn)，或
(b) 提供寡聚化結(jié)構(gòu)域；
(ii) 提供包含(i)的肽的單體功能性MHC肽復(fù)合物；和
(iii) 通過以下方式使功能性MHC復(fù)合物發(fā)生寡聚化
(a) 提供多價(jià)實(shí)體且所述單體功能性MHC肽復(fù)合物在每個(gè)肽所 具有的特異性附著位點(diǎn)與多價(jià)實(shí)體結(jié)合，或
(b) 所述的肽通過每個(gè)肽上所提供的或附著于其的寡聚化結(jié)構(gòu)域 進(jìn)行排列。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)方面的方法形成的MHC寡聚體是本 發(fā)明的其他適用方面和/或它們的相應(yīng)實(shí)施方式中之一的MHC寡聚體和/ 或如在此所述的MHC寡聚體。


圖1顯示了單體的II類MHC肽復(fù)合物，其包含適合于隨后發(fā)生多 聚化的本發(fā)明的修飾的肽。
圖2顯示了單體的I類MHC肽復(fù)合物，其包含適合于隨后發(fā)生多 聚化的本發(fā)明的修飾的肽。
圖3顯示了適合于根據(jù)本發(fā)明使得MHC復(fù)合物單體在其結(jié)合肽處 發(fā)生多聚化的分支肽；和
圖4顯示了適合于根據(jù)本發(fā)明使得MHC復(fù)合物單體在其結(jié)合肽處 發(fā)生多聚化的環(huán)狀寡核苷酸。
圖5顯示了在沒有獨(dú)立的多價(jià)實(shí)體的情況下能夠形成多聚體MHC 復(fù)合物的修飾的肽。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的MHC寡聚體通過MHC結(jié)合肽發(fā)生寡聚化，在所述包含 肽的功能性單體MHC復(fù)合物通過所述肽上所具有的修飾發(fā)生組裝后， 所述MHC肽復(fù)合物以高度特異方式發(fā)生寡聚化。為了形成寡聚化，每 個(gè)單體MHC肽復(fù)合物所含的肽通過所述肽以高度特異方式與核心結(jié)構(gòu) 發(fā)生寡聚化。為此，肽與多價(jià)實(shí)體相附著或者肽進(jìn)行自我組裝或寡聚 化，據(jù)此生成了所形成的寡聚體的核心結(jié)構(gòu)。
術(shù)語"核心結(jié)構(gòu)"在此打算表示任何容許同時(shí)結(jié)合所述肽和MHC 單體的實(shí)體。也可通過獨(dú)立的多聚體實(shí)體提供核心結(jié)構(gòu)，肽與所述實(shí)體 相附著?；蛘?，肽本身可以通過寡聚化生成這樣的核心結(jié)構(gòu)。這包括肽 寡聚化結(jié)構(gòu)域，MHC結(jié)合部分結(jié)合并懸掛于此。換句話說，肽的修飾 容許肽進(jìn)行自我組裝或排列，據(jù)此生成能同時(shí)所有肽可與之結(jié)合的新的 核心結(jié)構(gòu)。
術(shù)語"多聚化"或"寡聚化"在此表示生成至少一種在所需時(shí)間內(nèi) 穩(wěn)定的包含至少兩個(gè)功能性MHC單體的復(fù)合物的現(xiàn)象。兩個(gè)術(shù)語是可 以相互替換的。
根據(jù)所選的多聚化的類型，本發(fā)明的MHC寡聚體可以具有很好的 可控的預(yù)定效價(jià)以及非常高的純度，因?yàn)閱蝹€(gè)的單體MHC肽復(fù)合物可 以被分別地純化和組裝，以及之后發(fā)生多聚化。另外，在一些實(shí)施方式 中，本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)是利用公知的合成方法可以合成單體MHC肽 復(fù)合物，如果需要還可以對(duì)其進(jìn)行修飾。在單體合成之后就可以進(jìn)行多 聚化，不需要同時(shí)對(duì)單體進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，因此在這個(gè)階段避免了額 外的蛋白丟失。另外，只需要對(duì)結(jié)合于MHC肽結(jié)合溝的小肽進(jìn)行修飾 以用于隨后發(fā)生多聚化的目的。但是，通過使用例如固相技術(shù)可以便利 地完成修飾，這為引入定點(diǎn)修飾提供了極大的靈活性。因此，本發(fā)明所形成的MHC寡聚體可以被設(shè)計(jì)成具有有利的立體 構(gòu)象，因?yàn)樗鼈兛梢员蝗菀椎囟ㄎ粸槠矫鏄?gòu)型，其中復(fù)合物中所有的 MHC肽結(jié)合面都面向于抗原特異性T細(xì)胞表面上的T細(xì)胞受體。也可 以用精確的和受很好控制的化學(xué)計(jì)量法制備出這些MHC寡聚體。另 外，所形成的寡聚體基本上不含未與MHC分子結(jié)合的肽MHC-結(jié)合部 分。
在本發(fā)明中，首先形成功能性單體MHC復(fù)合物。它們可以是通過 來自包涵體材料的相關(guān)的MHC ot和(3鏈在存在相關(guān)的修飾肽時(shí)發(fā)生重折 疊、或者是通過優(yōu)選地在存在相關(guān)的修飾肽時(shí)在真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出天 然的單體MHC肽復(fù)合物而形成的。在兩種情況中，與這種相關(guān)的修飾 肽的肽交換也可以發(fā)生于重折疊之后。
在己經(jīng)形成單體MHC肽復(fù)合物之后，通過部分地因所述肽提供的 修飾而得以進(jìn)行合適的反應(yīng)化學(xué)或機(jī)制使得MHC復(fù)合物發(fā)生寡聚化。 通常在不會(huì)破壞或更改單體MHC肽復(fù)合物的結(jié)合性能的生理緩沖液條 件下進(jìn)行寡聚化。本發(fā)明因此也提供了高產(chǎn)率的方法，其保留了寡聚化 的MHC復(fù)合物單體功能性。
為了清楚起見，在此對(duì)單體MHC肽復(fù)合物的引用不排除這種單體 復(fù)合物在其肽發(fā)生進(jìn)一步的寡聚化之前已經(jīng)被預(yù)先多聚化到一定程度。 例如，在被寡聚化成更高效價(jià)的MHC肽寡聚體之前，可以以MHC-Ig 融合二聚體的形式提供單體MHC肽復(fù)合物，例如WO9310220所述的那 樣。因此，單體MHC肽復(fù)合物在此只表示在所述肽發(fā)生進(jìn)一步的寡聚 化之前首先要形成包含相關(guān)肽的功能性單體亞基的事實(shí)。但是，優(yōu)選 地，通過形成第一種情況中的真正的單體MHC肽復(fù)合物生成本發(fā)明的 寡聚體的MHC復(fù)合物。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明因此提供了 MHC寡聚體，其包含至少兩個(gè) 具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個(gè)MHC復(fù)合物都含有結(jié)合于 所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝內(nèi)的肽，每個(gè)肽都具有容許發(fā)生高度特異
性寡聚化的修飾。修飾可以優(yōu)選地選自由附著位點(diǎn)或寡聚化結(jié)構(gòu)域組成
的組。根據(jù)所選的修飾，功能性MHC復(fù)合物可以通過以下方式實(shí)現(xiàn)寡
聚化(i)每個(gè)肽在其所提供的或與之相連的特異性結(jié)合位點(diǎn)與多價(jià)實(shí)體 結(jié)合；或(ii)所述的肽通過每個(gè)肽上所提供的或附著于其的寡聚化結(jié)構(gòu) 域進(jìn)行排列。在各種情況中，寡聚體中的MHC復(fù)合物與多價(jià)實(shí)體或肽 排列所提供的核心結(jié)構(gòu)相連接。
術(shù)語"高度特異性"寡聚化在此表示形成寡聚體(通過附著或排列)
的特異性和/或選擇性優(yōu)選地高于10倍，以及更優(yōu)選地高于100倍，最 優(yōu)選地高于1000倍，優(yōu)選地是在生理?xiàng)l件下、以避免在寡聚化反應(yīng)中 對(duì)單體MHC肽復(fù)合物的a或j3鏈的氨基酸或MHC結(jié)合肽的MHC結(jié)合部 分的氨基酸進(jìn)行任何修飾的預(yù)定方式形成。
為了圖解說明的目的，圖1顯示了相應(yīng)的在其溝內(nèi)具有抗原肽的單 體II類MHC復(fù)合物。該圖分別顯示了 MHCa和p鏈的al、 a2和(31、 P2 區(qū)。相應(yīng)多肽鏈的氨基末端和羧基末端分別被標(biāo)記為N和C。用S-S表 示二硫鍵的位置。顯示出MHC a鏈具有一個(gè)標(biāo)簽區(qū)(E)。在肽(P)的一個(gè) 末端用接頭(未顯示)以及該接頭末端的修飾(H)合成了肽(P)的抗原或 MHC結(jié)合部分，所述修飾的形式為附著位點(diǎn)或寡聚化結(jié)構(gòu)域。
對(duì)于II類MHC結(jié)合肽而言，已知結(jié)合肽可以超出MHC結(jié)合溝的 范圍，可以在肽的N或C末端或其鄰近部位對(duì)其進(jìn)行修飾。
與圖1相似，圖2顯示了具有結(jié)合于其溝內(nèi)的修飾抗原肽的單體I 類MHC復(fù)合物(用圖1中的相應(yīng)命名標(biāo)記圖2)。對(duì)于I類MHC分子而 言，特異性附著位點(diǎn)或寡聚化結(jié)構(gòu)域形式的修飾(H)優(yōu)選地位于肽的C 末端或其鄰近部位，因?yàn)樵谠摬课话宇^的MHC結(jié)合肽比N末端的 結(jié)合肽具有更強(qiáng)的懸掛MHC結(jié)合溝的柔性。
在一個(gè)實(shí)施方式中，通過肽與多價(jià)實(shí)體的附著發(fā)生寡聚化。這種附 著可以通過多價(jià)實(shí)體提供的互補(bǔ)的識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別肽提供的或與之相連的 特異性附著位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。識(shí)別位點(diǎn)將容許分別在特異性附著位點(diǎn)和互補(bǔ)
的識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生肽與多價(jià)實(shí)體的共價(jià)的或非共價(jià)的結(jié)合。多價(jià)實(shí)體的效 價(jià)取決于多價(jià)實(shí)體所提供的以及結(jié)合所能接近的互補(bǔ)的識(shí)別位點(diǎn)的數(shù)目 以及它們的單個(gè)效價(jià)。
如果附著是非共價(jià)的，就從特異性結(jié)合對(duì)中選出特異性附著位點(diǎn)和 識(shí)別位點(diǎn)。具有所必需的特異性的合適的結(jié)合對(duì)在本領(lǐng)域是已知的。這 些結(jié)合對(duì)的非限制性實(shí)例是半抗原/抗體、表位/抗體、配體/受體、底物 或底物類似物/酶、輔因子或輔因子類似物/酶、核酸/互補(bǔ)核酸、糖/凝集 素、生物素/抗生物素蛋白家族蛋白例如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、
neutravidin 、 Streptag /Streptactin 。
例如對(duì)于生物素/鏈霉抗生物素結(jié)合對(duì)而言，可以通過便利的化學(xué)合 成將生物素引入到MHC結(jié)合肽的預(yù)定的氨基酸位點(diǎn)上，消除了麻煩的 酶的生物素化的需要。然后通過鏈霉抗生物素的寡聚化生成四聚體的 MHC復(fù)合物。
或者，可以通過肽與多價(jià)實(shí)體的共價(jià)結(jié)合實(shí)現(xiàn)肽與多價(jià)實(shí)體的附 著。在這種情況中，附著位點(diǎn)和識(shí)別位點(diǎn)是優(yōu)選地能夠在生理?xiàng)l件下形 成共價(jià)鍵或彼此偶聯(lián)的互補(bǔ)部分。特殊的偶聯(lián)方法包括但不限于以下類 型的共價(jià)鍵(a)肟鍵、(b)腙鍵、(c)噻唑烷鍵、(d)噁唑烷鍵、(e)硫醚 鍵、(f)二硫鍵、和(g)肽鍵。用本領(lǐng)域已知的一些化學(xué)方法可以形成這些 類型的鍵。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，能夠形成共價(jià)鍵或偶聯(lián)的部分可以有(i) 天然氨基酸側(cè)鏈和域(ii)氨基酸羧基或氨基末端基團(tuán)和(iii)(i)和(ii)的組合 等不同。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用了其中任何一種最近開發(fā)出的利 用巰基化學(xué)或碳?；瘜W(xué)的特異的化學(xué)選擇性連接化學(xué)。更多的細(xì)節(jié)應(yīng)當(dāng) 參照Weng C. Chan禾口 Peter D. White主編的"Fmoc solid phase peptide synthesis, A Practical Approach" (Oxford University Press)(2000)中J,R Tam 和Y.A. Lu編寫的第ll章，在此通過引用將其并入本申請(qǐng)。可以應(yīng)用于
本發(fā)明的商品化可獲得的特異的交聯(lián)工具是例如從EMD Biosciences, Inc., Darmstadt, Germany獲得的HydraLinK⑧(商標(biāo)名)。
這些化學(xué)選擇性連接特征性地(i)使用了未受保護(hù)的肽片段和(ii)在水 性條件下進(jìn)行反應(yīng)。為了實(shí)現(xiàn)這些化學(xué)反應(yīng)，在它們各自的合成過程 中，將由親核劑和親電子劑組成的反應(yīng)對(duì)放置于P肽和多價(jià)實(shí)體上。親 核劑通常是弱堿，其具有比天然氨基酸的a或s氨基明顯更低的pKa，或 者其親核性明顯強(qiáng)于這些a氨基，使得在pH值近似為7的水性緩沖溶液 中發(fā)生的連接是選擇性連接。當(dāng)將這些相互反應(yīng)的基團(tuán)與作為唯一親核 劑的弱堿都一起放在水溶液中與親電子劑發(fā)生反應(yīng)時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)化學(xué)選 擇性。因此，對(duì)所涉及的肽的其他功能基團(tuán)的保護(hù)變成是不必要的。
一般優(yōu)選地使用化學(xué)選擇性連接化學(xué)，使得MHC結(jié)合肽的特異性 附著位點(diǎn)和多價(jià)實(shí)體的互補(bǔ)的識(shí)別位點(diǎn)作為互補(bǔ)部分發(fā)生反應(yīng)，可以在 環(huán)境條件下進(jìn)行彼此之間的反應(yīng)，使得沒有一個(gè)天然存在的氨基酸的氨 基酸側(cè)鏈在這個(gè)反應(yīng)中會(huì)被修飾，以及基本上不會(huì)破壞天然MHC肽復(fù) 合物的功能完整性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，特異性結(jié)合位點(diǎn)或互補(bǔ)識(shí)別位點(diǎn)包含醛
基，可以如Tam和Lu (見上)所述的那樣將其引入到多肽骨架。在更優(yōu)
選的實(shí)施方式中，特異性附著位點(diǎn)或互補(bǔ)識(shí)別位點(diǎn)包含與醛基相互反應(yīng)
形成(a)肟鍵、(b)腙鍵、(c)噻唑烷鍵、(d)噁哇烷鍵、(e)硫醚鍵的基團(tuán)。
在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，肽(P)所提供的特異性附著位點(diǎn)包含醛基。
形成上面的類型(a)到(d)的鍵的反應(yīng)化學(xué)的實(shí)例如下
(a) 月虧鍵<formula>formula see original document page 17</formula>O
(b) 腙鍵 <formula>formula see original document page 17</formula>
<formula>formula see original document page 18</formula>
(c)噻唑烷鍵 <formula>formula see original document page 18</formula>(d)噁唑垸鍵 Ri—+ H2N」
其中R,是(a)未受保護(hù)的肽(P)或(b)多價(jià)實(shí)體中的任意一個(gè)，112是 相應(yīng)的另一個(gè)。
在各種情況中，多價(jià)實(shí)體都可以被修飾成摻入可控?cái)?shù)目拷貝的識(shí)別 位點(diǎn)?；パa(bǔ)結(jié)合伴侶系統(tǒng)將具有高的特異性和選擇性。具體地，識(shí)別位 點(diǎn)與附著位點(diǎn)的結(jié)合將使得在不會(huì)降低單體MHC肽復(fù)合物的穩(wěn)定性和 活性的條件下發(fā)生所述結(jié)合，這意味著通常要在水性條件和近中性pH 值下進(jìn)行所述結(jié)合。
也優(yōu)選地是，選出兩個(gè)位點(diǎn)使得在寡聚化的過程中不會(huì)修飾肽P的 MHC結(jié)合部位或MHC ot或(3鏈的任何殘基。
識(shí)別位點(diǎn)和附著位點(diǎn)之間的共價(jià)偶聯(lián)是優(yōu)選的，以便使得寡聚體的 MHC復(fù)合物的穩(wěn)定性最大化。為了開發(fā)這些共價(jià)偶聯(lián)化學(xué)，肽的附著 位點(diǎn)提供了其中一個(gè)必需的反應(yīng)部分，而多價(jià)實(shí)體的識(shí)別位點(diǎn)提供了另 一個(gè)必需的反應(yīng)部分。整合這種反應(yīng)部分的簡單方法是在肽合成期間或 之后用如Tam和Lu (見上)所描述的方案將合適的修飾整合到多價(jià)實(shí)體 和/或肽的氨基或羧基末端或鄰近部位。
化學(xué)選擇性的非酰胺連接對(duì)于偶聯(lián)是優(yōu)選的，因?yàn)樗俏稽c(diǎn)特異 的，以及在水性條件、pH值為7或非常接近于7的條件下進(jìn)行反應(yīng)，這 不會(huì)干擾天然MHC肽復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，附著位點(diǎn)和識(shí)別位點(diǎn)分別是2-肼吡啶基
和苯甲醛基，它們可以在pH4.7時(shí)發(fā)生最佳反應(yīng)，形成二芳香腙。也可 以在pH值最大到7.3的條件下進(jìn)行這個(gè)反應(yīng)，這保證了 MHC肽單體的 穩(wěn)定性，不過在較高的pH值下這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得更為緩慢。為了兼顧結(jié) 合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的速度和不會(huì)破壞MHC分子的綴合條件，6.5到6.8左右 的緩沖pH值是最佳的pH值。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，用固相合成技術(shù)將附著位點(diǎn)和識(shí)別位 點(diǎn)引入到至少一個(gè)肽(P)和多價(jià)實(shí)體中。 一些用于引入合適基團(tuán)的方法是 如Tam和Lu (見上)所述的方法。
如何將上面的化學(xué)轉(zhuǎn)變成其中多價(jià)實(shí)體不是多肽而是寡核苷酸的情 況對(duì)于本領(lǐng)域熟練的實(shí)踐人員是顯而易見的。
在進(jìn)行本發(fā)明的寡聚化的第一種和第二種方法中所用的多價(jià)實(shí)體可 以是任一多價(jià)實(shí)體，只要它們不會(huì)過分地干擾T細(xì)胞受體與MHC復(fù)合 物單體的結(jié)合即可。多價(jià)實(shí)體的效價(jià)即識(shí)別位點(diǎn)或反應(yīng)部分的數(shù)目以及
它們的間距將決定寡聚化的程度。例如，四價(jià)實(shí)體例如鏈霉抗生物素將 形成四聚體。但是，明顯更高的效價(jià)是可能的。實(shí)體的效價(jià)優(yōu)選地是在 2到20的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地是4到10。
多價(jià)實(shí)體優(yōu)選地是天然聚合物或其衍生物例如蛋白、分支多肽(樹狀 聚合物)、多聚體蛋白、核酸、多糖例如葡聚糖、淀粉、纖維素、透明質(zhì) 酸、甲殼質(zhì)、或海藻酸或這些多糖的衍生物、寡核苷酸、環(huán)狀寡核苷 酸；合成聚合物例如聚丙二醇、聚乙二醇(PEG);磷脂膜例如小泡或脂 質(zhì)體、和無機(jī)顆粒例如聚苯乙烯或丙烯酸珠或磁珠。識(shí)別位點(diǎn)可以由多 價(jià)實(shí)體例如其骨架提供或者可以與其附著。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，多價(jià)實(shí)體是天然聚合物(例如蛋白或多聚 體蛋白例如鏈霉抗生物素、抗生物素蛋白、免疫球蛋白、透明質(zhì)酸、纖 維素)或合成聚合物(例如聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚乳酸)，而識(shí)別位點(diǎn)由 多價(jià)實(shí)體的骨架提供或者與之相附著。
在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，多價(jià)實(shí)體是分支多肽(所謂的樹狀聚合
物)?？梢愿鶕?jù)Tam和Lu (見上)所述的方案制備出這些樹狀聚合物。一 些用于合成分支多肽的其他方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。
優(yōu)選地，分支多肽在其兩個(gè)或多個(gè)分支的預(yù)定位點(diǎn)上摻入特異性識(shí) 別位點(diǎn)或特異性結(jié)合對(duì)的成員。肽的每個(gè)分支都可以具有所需的長度。 每個(gè)分支的長度優(yōu)選地小于24個(gè)氨基酸。通過在肽合成期間用已知的 方法在Lys殘基上使肽分支可以實(shí)現(xiàn)肽的分支化。通過這種方式，肽在 第一個(gè)賴氨酸殘基上被分支成兩個(gè)分支，之后在更多的賴氨酸殘基上被 進(jìn)一步分支形成四價(jià)實(shí)體。通過包括更多的或更少的分支步驟可以實(shí)現(xiàn) 其他的效價(jià)例如八聚體。通過僅僅部分地分支合成肽也可以得到奇數(shù)效 價(jià)。
作為多價(jià)實(shí)體的樹狀聚合物的化學(xué)合成將容許非常精確地控制寡聚 體的性質(zhì)和化學(xué)計(jì)量。這反過來造成了在寡聚體的各種用途例如T細(xì)胞 標(biāo)記或檢測中的更高的精確度。
圖3顯示了適用于使得本發(fā)明的MHC復(fù)合物單體在其肽位置發(fā)生 多聚化的分支肽或樹狀聚合物。該圖舉例說明了多肽骨架，其分支兩 次，生成了四聚體結(jié)構(gòu)。合成了在其每個(gè)末端分支上都摻入互補(bǔ)識(shí)別位 點(diǎn)(H')的樹狀聚合物，所述識(shí)別位點(diǎn)可以在不影響MHC穩(wěn)定性的條件 下與特異性附著位點(diǎn)(H)結(jié)合，據(jù)此生成四價(jià)實(shí)體。該圖還顯示了熒光 標(biāo)記部分(F),其被整合于樹狀聚合物的非分支部分。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，多價(jià)實(shí)體是寡核苷酸或環(huán)狀寡核苷酸。寡核 苷酸的長度通常是50到150個(gè)核苷酸，但是也可以短到3個(gè)核苷酸。多 價(jià)實(shí)體優(yōu)選地是環(huán)狀寡核苷酸，甚至更優(yōu)選地其周長小于150個(gè)堿基。 圖4顯示了這個(gè)實(shí)施方式，其顯示了這種環(huán)狀寡核苷酸的骨架。與圖3 相類似，在其合成期間或之后，寡核苷酸在此已經(jīng)被修飾成包含6個(gè)不 同核苷酸位置上的互補(bǔ)識(shí)別位點(diǎn)(H，)，因此形成了六價(jià)實(shí)體。另外，環(huán) 狀寡核苷酸也包括兩個(gè)熒光標(biāo)記的部分(F)。
根據(jù)第二種寡聚化方案，MHC寡聚體通過肽在其寡聚化結(jié)構(gòu)域的 排列發(fā)生寡聚化。排列最廣義地表示(大)分子之間的任何自我組織的結(jié) 合現(xiàn)象，這至少形成了兩個(gè)或多個(gè)這種(大)分子的暫時(shí)連接。這種類型 排列的實(shí)例是核酸雜交、兩種或多種蛋白(或蛋白區(qū))例如免疫球蛋白Fc 區(qū)、巻曲螺旋區(qū)的自我組裝、角蛋白纖維和類似物的自我組裝以及化學(xué) 部分的共價(jià)結(jié)合。寡聚化結(jié)構(gòu)域事實(shí)上可以形成肽骨架的一部分或者與 之相附著。它們在性質(zhì)上可以是肽或核酸。因此，在第一個(gè)實(shí)施方式 中，每個(gè)肽都包含肽寡聚化結(jié)構(gòu)域，其優(yōu)選地與肽骨架融合。在另一個(gè) 實(shí)施方式中，每個(gè)肽都與寡聚化結(jié)構(gòu)域相附著。在這種情況中，寡聚化 結(jié)構(gòu)域可以選自由肽寡聚化結(jié)構(gòu)域和核酸組成的組。
肽寡聚化結(jié)構(gòu)域可以選自由抗體恒定區(qū)、酶單體和形成寡聚體的巻 曲螺旋蛋白的寡聚化結(jié)構(gòu)域組成的組。優(yōu)選地，這是形成寡聚體的巻曲 螺旋蛋白的寡聚化結(jié)構(gòu)域，所述蛋白選自由膠原蛋白家族、C型凝集素 和血小板反應(yīng)蛋白家族蛋白組成的組。
形成寡聚體的巻曲螺旋蛋白的實(shí)例包括各種類型的膠原、C型凝集 素例如甘露糖結(jié)合蛋白(MBP)的三巻曲螺旋區(qū)、Clq、肌球蛋白、亮氨 酸拉鏈例如存在于p53、 GCN4、噬菌體P22Mnt抑制子中的亮氨酸拉 鏈、和血小板反應(yīng)蛋白家族蛋白例如COMP。寡聚化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地源自 軟骨寡聚體基質(zhì)蛋白(COMP)。更優(yōu)選地，寡聚化結(jié)構(gòu)域是人類的 COMP。
對(duì)于巻曲螺旋蛋白而言，本發(fā)明的MHC寡聚體所包含的MHC復(fù) 合物的數(shù)目(m)通常依賴于肽寡聚化結(jié)構(gòu)域所來源的類型， 一般是2個(gè) 或更多，優(yōu)選地m=2到10，最優(yōu)選地m=3或5。如果被寡聚化的肽的 修飾例如源自COMP的五聚體化區(qū)，該數(shù)目通常是5，使得該寡聚體是 五聚體(m-5)，而當(dāng)這些寡聚化結(jié)構(gòu)域源自膠原時(shí)，該數(shù)目是3(m-3)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，每個(gè)肽依次包含兩個(gè)非重疊的寡聚化結(jié)構(gòu)域。 寡聚體中的第n個(gè)肽的第二個(gè)寡聚化結(jié)構(gòu)域與寡聚體中的第(n+l)個(gè)肽的
第一個(gè)寡聚化結(jié)構(gòu)域形成二聚體或排列。然后，寡聚體中的第(n+l)個(gè)肽 的第二個(gè)寡聚化結(jié)構(gòu)域與寡聚體中的第(n+2)個(gè)肽的第一個(gè)寡聚化結(jié)構(gòu)域 形成二聚體或排列等等。在這種情況中，最優(yōu)選地是，寡聚體中的最后
一個(gè)肽的第二個(gè)寡聚化結(jié)構(gòu)域與寡聚體中的第一個(gè)肽的第一個(gè)寡聚化結(jié) 構(gòu)域形成二聚體，以便提供環(huán)狀結(jié)構(gòu)。盡管對(duì)于本實(shí)施方式而言，理論
上可以使用任何形式的能夠發(fā)生二聚體化的寡聚化結(jié)構(gòu)域，但是第一個(gè) 和第二個(gè)寡聚化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地是核酸，通過它們的雜交發(fā)生寡聚化。
待寡聚化的功能性單體MHC復(fù)合物常常是可溶性的分離的或重組 的MHC復(fù)合物，其可以源自I型或II類MHC復(fù)合物，優(yōu)選地分別是如 圖1或圖2所示的I類MHC復(fù)合物的胞外部分或者II類MHC復(fù)合物的 胞外部分。這些復(fù)合物中的每個(gè)復(fù)合物都由a鏈和P鏈組成。功能性復(fù)合 物還包含結(jié)合于相應(yīng)的由其a和(3鏈形成的溝的修飾肽。
MHC蛋白可以來自任何脊椎動(dòng)物物種，例如靈長類物種(特別是 人)、嚙齒類動(dòng)物包括小鼠、大鼠、倉鼠和兔、馬、牛、犬、貓等。特別 相關(guān)的是人HLA蛋白和小鼠H-2蛋白。HLA蛋白包含II型亞基HLA-DPa、 HLA-DP(3、 HLA曙DQa、 HLA畫DQJ3、 HLA-DRa和HLA-DR(3，以 及I型蛋白HLA-A、 HLA-B、 HLA-C、和{32-微球蛋白。小鼠H-2蛋白 亞基包含I型亞基H-2K、 H-2D、 H-2L，和II型亞基I-Aa、 I-AP、 I-Ea 和I-E(3，以及(32-微球蛋白。 一些代表性MHC蛋白的氨基酸序列參照 EP 812 331 。非經(jīng)典的實(shí)例例如HLA-E、 HLA-F、 HLA-G、 Qal、和 CD1也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。CD1單體可以在其溝內(nèi)結(jié)合有脂質(zhì)而非 肽。本發(fā)明也適用于其中脂質(zhì)代替肽被結(jié)合的情況，本領(lǐng)域技術(shù)人員能 夠?qū)⑸厦娴墓丫刍桨皋D(zhuǎn)換到這個(gè)情況中。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，MHC肽鏈對(duì)應(yīng)于可溶性形式的正常膜 結(jié)合蛋白。對(duì)于I型亞基而言，通過缺失天然形式的跨膜區(qū)和胞漿區(qū)形 成可溶性形式。對(duì)于I型蛋白而言，可溶性形式包括a鏈的al、 oc2和cx3
區(qū)區(qū)。對(duì)于II型蛋白而言，可溶性形式分別包含oc鏈或l3鏈的al和cx2或 Pl和P2區(qū)區(qū)。
包含的跨膜區(qū)氨基酸不超過約10個(gè)、通常不超過約5個(gè)、優(yōu)選地 不包含跨膜區(qū)的氨基酸。缺失可以延伸約10個(gè)氨基酸到達(dá)oc3區(qū)內(nèi)。優(yōu) 選地，不缺失a3區(qū)的氨基酸。缺失要使得其不會(huì)干擾ot3區(qū)折疊成功能 性二硫鍵結(jié)構(gòu)的能力。I型(3鏈、P2m的天然形式都缺少跨膜區(qū)，因此不 必被截短。II型亞基一般都不與I型亞基綴合。
上述缺失同樣適用于II型亞基。所述缺失可以延伸約10個(gè)氨基酸 到達(dá)a2或p2區(qū)內(nèi)。優(yōu)選地，不缺失a2或p2區(qū)的氨基酸。缺失要使得其 不會(huì)干擾a2或p2區(qū)折疊成功能性二硫鍵結(jié)構(gòu)的能力。
可以在多肽末端引入少數(shù)氨基酸，通常不超過25個(gè)氨基酸，更通 常地不超過20個(gè)氨基酸。氨基酸的缺失或插入通常是克隆需要的結(jié) 果，例如提供便利的限制性位點(diǎn)等的結(jié)果，以便解決分子組裝過程中可 能的空間問題。另外，基于同樣的原因，可以用不同的氨基酸取代一個(gè) 或多個(gè)氨基酸，通常不取代任一區(qū)內(nèi)的5個(gè)以上的氨基酸。
一般而言，因此，除了在此所含的一個(gè)或多個(gè)蛋白或蛋白鏈，寡聚 體還包含一個(gè)或多個(gè)附加區(qū)例如一個(gè)或多個(gè)接頭、標(biāo)簽區(qū)和純化區(qū)。附 加區(qū)例如不僅可以由多價(jià)實(shí)體或肽提供，還可以存在于MHC的a和/或(3 鏈中。
出于說明的目的，圖1和圖2中的復(fù)合物是融合多肽，額外具有與 其蛋白鏈之一融合的蛋白標(biāo)簽(E)，所述標(biāo)簽可以進(jìn)一步地容許標(biāo)記、純 化或附著這些蛋白。標(biāo)簽E可以是表位標(biāo)簽或者經(jīng)修飾的蛋白序列。多 肽接頭可以將這個(gè)標(biāo)簽與MHC a或p鏈的多肽分開。這個(gè)接頭和其他任 何接頭一般都包含不超過25個(gè)氨基酸，優(yōu)選地不超過20個(gè)氨基酸。
在所述復(fù)合物中任選包含的蛋白標(biāo)簽(E)可以是任何容許標(biāo)記蛋白的 區(qū)域。優(yōu)選地，標(biāo)簽區(qū)包括標(biāo)記。這個(gè)標(biāo)記本身可以包含于標(biāo)簽區(qū)內(nèi)， 例如被抗體所識(shí)別的表位或光可檢測或放射性標(biāo)記。優(yōu)選地，標(biāo)記選自
由熒光標(biāo)記物例如FITC、藻膽蛋白例如R-或B-藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋 白、Cy3、 Cy5、 Cy7、發(fā)光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記例如1251或3卞、酶例如 辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶例如蝦堿性磷酸酶、表位、凝集素、生物 素或鏈霉抗生物素。
當(dāng)標(biāo)記本身是蛋白時(shí)，用作標(biāo)記的蛋白的多肽鏈可以與肽融合，形 成嵌合蛋白，優(yōu)選地在其C末端。例如，該嵌合蛋白可以使用熒光蛋白 例如綠熒光蛋白(GFP)或藻膽蛋白的亞基。GFP嵌合蛋白技術(shù)在本領(lǐng)域 是公知的。例如在WO 01/46395中描述了包含源自藻膽蛋白的合適區(qū)域 的嵌合蛋白。
或者，可以通過經(jīng)合適標(biāo)記的抗體、或抗體片段例如經(jīng)標(biāo)記的F(ab) 片段與標(biāo)簽(E)的合適表位結(jié)合實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。
在本發(fā)明的寡聚體中任選包含的純化區(qū)可以是有助于純化本發(fā)明的 蛋白的任何區(qū)域，例如通過提供特異性結(jié)合表征。適當(dāng)?shù)男蛄袑?duì)于本領(lǐng) 域技術(shù)人員是已知的，只要它們不會(huì)干擾復(fù)合物的功能部分就可以釆 用。優(yōu)選地，純化區(qū)是六組氨酸序列。
被寡聚化的功能性單體MHC復(fù)合物包含結(jié)合于它們的肽結(jié)合溝內(nèi) 的肽。該肽至少包含MHC結(jié)合部分以及形成或攜帶附著位點(diǎn)或寡聚化 結(jié)構(gòu)域形式的修飾的獨(dú)立部分。除了任何接頭和修飾之外，對(duì)于具有I 類MHC蛋白的復(fù)合物而言，MHC結(jié)合部分的長度是從約6個(gè)到14個(gè) 氨基酸，通常是從約8個(gè)到ll個(gè)氨基酸。具有II類MHC蛋白的復(fù)合物 的長度是從約6個(gè)到35個(gè)氨基酸，通常是從約10個(gè)到20個(gè)氨基酸。
肽的MHC結(jié)合部分可以具有源自多種蛋白的序列。在多種情況 中，都需要使用作為T細(xì)胞表位的肽。多種抗原的表位序列在本領(lǐng)域是 已知的。或者，可以通過分離和測序結(jié)合于天然MHC蛋白的肽、從靶 序列合成一系列推測的抗原肽、然后測定不同肽的T細(xì)胞反應(yīng)性，或者 通過用這些肽生成一系列MHC肽復(fù)合物并定量出T細(xì)胞結(jié)合力可以經(jīng) 驗(yàn)地確定出表位序列。肽的制備包括合成肽的合成、鑒定序列以及鑒定
相關(guān)的最小抗原序列在本領(lǐng)域都是已知的。在各種情況中，寡聚體的
MHC復(fù)合物中所含的肽優(yōu)選地是基本上均一的，意思是所述肽在它們 的MHC結(jié)合部分優(yōu)選地具有至少80%、更優(yōu)選地具有至少90%以及最 優(yōu)選地具有至少95%的相同性。
接頭多肽序列通常被插入于肽(P)的MHC結(jié)合部分序列和修飾位點(diǎn) (H)之間。為了其靈活性和可溶性，這種接頭可以是例如插入于脯氨酸 或絲氨酸之間的甘氨酸殘基重復(fù)，(GGPGG)n或(GGSGG)n，其中n的范 圍通常是1到6之間。要明白其他的柔性的、具有足夠可溶性并且不會(huì) 形成顯著的二級(jí)結(jié)構(gòu)的接頭也適用于這個(gè)目的。 一般可以使用長度為1 到30個(gè)、優(yōu)選的3到20個(gè)和最優(yōu)選的3到IO個(gè)氨基酸的多肽。對(duì)于非 肽接頭，可以相應(yīng)地調(diào)整它們的長度。非肽接頭還可包括PEG或聚環(huán)氧 乙垸(PEO)重復(fù)。
優(yōu)選地選擇接頭的長度，使得寡聚化結(jié)構(gòu)域或附著位點(diǎn)至少要遠(yuǎn)離 MHC肽復(fù)合物與T細(xì)胞受體(TCR)和CD4、 CD8或其他輔助受體的結(jié)合 部位，這樣它就基本上不會(huì)干擾相應(yīng)的MHC肽復(fù)合物與TCR的相互作 用。為了實(shí)現(xiàn)前述目的，接頭長度也要盡可能短，因?yàn)檫@會(huì)有助于降低 肽合成的費(fèi)用。
本發(fā)明的MHC寡聚體也可以包含標(biāo)記。這種標(biāo)記例如可以選自由 光可檢測標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶、表位、凝集素或生物素組成的組。上 面已經(jīng)列出了針對(duì)標(biāo)簽區(qū)的其他標(biāo)記。同樣可以使用這些標(biāo)記。如果存 在這樣的實(shí)體，標(biāo)記在一個(gè)實(shí)施方式中優(yōu)選地是由多價(jià)實(shí)體或寡聚化結(jié) 構(gòu)域排列形成的結(jié)構(gòu)提供的。在組裝寡聚體期間或之后或者甚至在應(yīng)用 或使用所述寡聚體期間可以整合標(biāo)記。當(dāng)多價(jià)實(shí)體本身是通過化學(xué)合成 形成時(shí)，可以在多價(jià)實(shí)體的預(yù)定位置上化學(xué)地引入標(biāo)記，其容許標(biāo)記具 有精確化學(xué)計(jì)量的寡聚體的MHC復(fù)合物。當(dāng)標(biāo)記是熒光標(biāo)記時(shí)，這容 許獲得具有高度均一的亮度和最大信號(hào)噪音比的復(fù)合物。本發(fā)明也涉及藥物組合物或診斷組合物，其包含如上定義的MHC 寡聚體，任選地與藥學(xué)可接受載體組合。
包含本發(fā)明的寡聚體的藥物組合物可以用于例如腸外給藥即皮下、 肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。另外，開發(fā)出了大量新的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)方法。本發(fā)明 的藥物組合物同樣適用于利用這些新方法給藥。
用于腸外給藥的組合物常常包含溶解于可用載體的寡聚體溶液，優(yōu)
選地是水性載體?？梢允褂酶鞣N水性載體，例如緩沖水、0.4%鹽水、 0.3%甘氨酸等。這些溶液是無菌的， 一般都不含顆粒物質(zhì)?？梢杂脗鹘y(tǒng) 的、公知的滅菌技術(shù)將這些組合物滅菌。組合物可以包含近似生理?xiàng)l件 所需的藥學(xué)可接受的輔助物，例如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等、 例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。根據(jù)所選的具體給 藥模式，這些劑型中的寡聚體濃度可以有著極大的不同，即從小于約 lpg/ml，通常至少約0.1mg/ml至U 10-100mg/ml，主要根據(jù)液體體積、粘 度等選擇寡聚體濃度。
用于肌肉內(nèi)注射的常用藥物組合物通常被制劑成包含lml無菌的緩 沖水和O.lmg寡聚體蛋白。用于靜脈內(nèi)輸注的常用組合物可以被制劑成 包含250ml無菌林格液和10mg寡聚體復(fù)合物蛋白。用于制備可腸外給 藥的組合物的實(shí)際方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的或顯而易見的。
本發(fā)明的MHC寡聚體可以被凍干儲(chǔ)存，并在使用前用合適的載體 重構(gòu)。這個(gè)技術(shù)已經(jīng)顯示出是有效的，可以采用常用的凍干和重構(gòu)技 術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員要明白凍干和重構(gòu)可以造成不同程度的活性丟失， 需要調(diào)整施用水平進(jìn)行補(bǔ)償。
本發(fā)明也涉及依據(jù)T細(xì)胞抗原受體的特異性來標(biāo)記和/或檢測哺乳動(dòng) 物T細(xì)胞的方法，方法包括
(i) 組合本發(fā)明的MHC寡聚體和包含T細(xì)胞的懸浮液或生物學(xué)樣 品，禾口
(ii) 檢測是否存在所述復(fù)合物和T細(xì)胞的特異性結(jié)合。
本發(fā)明也涉及依據(jù)T細(xì)胞抗原受體的特異性來分離哺乳動(dòng)物T細(xì)胞 的方法，方法包括
(i) 組合本發(fā)明的MHC寡聚體和包含T細(xì)胞的懸浮液或生物學(xué)樣
品，禾口
(ii) 將與所述復(fù)合物結(jié)合的T細(xì)胞與未結(jié)合的細(xì)胞分離。 本發(fā)明還涉及用于如上所述標(biāo)記和/或檢測和/或分離細(xì)胞的方法，
其中依據(jù)與MHC分子特異性結(jié)合的特殊類型的細(xì)胞表面分子來標(biāo)記、 檢測或分離一種非T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞類型。例如，已知人非經(jīng)典MHC 分子HLA-E可以通過與NK表面受體CD94/NKG2的特異性結(jié)合與自然 殺傷(NK)細(xì)胞結(jié)合(D.S丄Allan W "/., J. Immunol. Meth. 268 (2002) 43-50)。同樣，HLA-G和HLA-F顯示出能染色CD14+細(xì)胞上的ILT2和 ILT4受體，以及HLA-F也顯示出能染色CD19+亞群(Allan a/.,見 上)。技術(shù)人員能夠?qū)⑸厦嫠龅姆椒ǚg到這種情況。
本發(fā)明最后涉及一種生成MHC寡聚體的方法，所述寡聚體包含至 少兩個(gè)具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個(gè)復(fù)合物都具有結(jié)合于 所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝內(nèi)的肽，其中每個(gè)肽都包含容許發(fā)生高度 特異性寡聚化的修飾，所述方法包括步驟
(i) 提供一種或多種能夠結(jié)合于每個(gè)功能性MHC復(fù)合物的肽溝的 肽，所述肽可以通過以下方式進(jìn)行修飾
(a) 提供特異性附著位點(diǎn)，或
(b) 提供寡聚化結(jié)構(gòu)域；
(ii) 提供包含(i)的肽的單體功能性MHC肽復(fù)合物，和
(iii) 可以通過以下方式使功能性MHC復(fù)合物發(fā)生寡聚化 (a)提供多價(jià)實(shí)體以及所述單體功能性MHC肽復(fù)合物在每個(gè)肽
上所提供的或附著于其的特異性結(jié)合位點(diǎn)與多價(jià)實(shí)體的結(jié) 合，或
(b)所述的肽通過每個(gè)肽上所提供的或附著于其的寡聚化結(jié)構(gòu)域
進(jìn)行排列。
優(yōu)選地，在存在如步驟(i)所修飾的肽時(shí)，通過重折疊MHC a和卩鏈 提供步驟(ii)中的單體功能性MHC復(fù)合物。
例如可以從真核或原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得MHC a和p鏈，任選地可以 在重折疊之前將其純化?；蛘?，可以從其他來源中分離出a和p鏈或折疊 復(fù)合物。在需要或者合適的時(shí)候，該方法也可以包含重折疊的功能性 MHC復(fù)合物的肽交換步驟。通過如上所述的固相合成通?？梢蕴峁┎?驟(i)中的肽?？梢栽谒龊铣善陂g或之后修飾所述肽。合成期間的修飾 是例如通過向骨架中添加肽區(qū)或者整合經(jīng)修飾(例如硫代-)的氨基酸。合 成后的修飾例如可以是連接核酸寡聚化結(jié)構(gòu)域。
在圖5中，經(jīng)修飾的肽(P)顯示出在沒有獨(dú)立的多價(jià)實(shí)體時(shí)能夠形成 多聚體MHC肽復(fù)合物?？乖耐ǔ＞哂?0個(gè)氨基酸甘氨酸絲氨酸接 頭，以便為寡聚體提供足夠多的空間。在5個(gè)變體P(l)到P(5)中合成了 包含5種不同寡核苷酸的肽。優(yōu)選地，P(1)到P(5泡含相同的MHC結(jié)合 部分。
每個(gè)附著的寡核苷酸都具有兩個(gè)區(qū)(1,2')、 (2,3')、 (3，4')、 (4，5')、和 (5,1')，其中每個(gè)區(qū)與另一個(gè)寡核苷酸上的一個(gè)且僅僅一個(gè)其他區(qū)互補(bǔ)。 第5個(gè)寡核苷酸具有與第一個(gè)寡核苷酸的第一個(gè)區(qū)1互補(bǔ)的第二個(gè)區(qū) 1，。每個(gè)區(qū)對(duì)可以具有約為20。C的退火溫度。通過已知的寡核苷酸設(shè)計(jì) 技術(shù)將非互補(bǔ)區(qū)之間的交叉反應(yīng)性最小化。每個(gè)寡核苷酸上的兩個(gè)區(qū)可 以直接連接或者具有非退火的寡核苷酸接頭，以便增加區(qū)之間的空間。 接頭可以包含合成標(biāo)記，例如在前所述的標(biāo)記?？梢栽谝粋€(gè)單一過程中 合成偶聯(lián)的多肽-寡核苷酸，或者可以分別合成，之后進(jìn)行偶聯(lián)，其中通 過如上所述的修飾肽與寡核苷酸的化學(xué)選擇性連接可以實(shí)現(xiàn)肽與寡核苷 酸的連接。用HPLC將5種寡核苷酸/肽產(chǎn)物都純化到足夠高的純度。
寡核苷酸/肽在被加熱到30°C 5分鐘后，在20。C退火。然后重新純 化出寡核苷酸/肽五聚體。然后根據(jù)已知的方案，用變性的MHCoc和(3鏈 重折疊成寡核苷酸/肽五聚體。這將生成具有所形成的不均一效價(jià)的異多 聚體，因?yàn)镸HC分子的重折疊是不完整的，所給定的合理的過量的肽 將主要生成具有經(jīng)寡核苷酸偶聯(lián)附著的4個(gè)附加肽的MHC肽單體 (MHC-Ps)。然后用凝膠過濾色譜法濃縮并純化所形成的產(chǎn)物，以便主要 地選擇出MHC-P5單體。然后通過將單體加熱到30°C 5分鐘，消除P5 相互作用，生成MHC-P，單體和游離肽。然后在30°C、 PD10柱 (Amersham Biosciences, Chalfont St. Giles, UK)中快速地純化出肽。然后 從柱中洗脫出所形成的MHC-P單體。當(dāng)在純化產(chǎn)物中存在粗等量摩爾 比的單體P(l)到P(5)肽時(shí)，單個(gè)的MHC-P單體可以被重新退火形成 MHC五聚體。在第二次凝膠過濾步驟中，純化去除不正確退火的產(chǎn) 物，使得純化產(chǎn)物基本上只包含MHC五聚體。
實(shí)施例
實(shí)施例l:形成摻入流感血凝素A肽HA(306-318): PKYVKQNTLKLAT 的經(jīng)標(biāo)記的II類MHC肽八聚體HLA-DRB"OIOI
HA'-肽被合成為HA-(GGGSG)2-K"，其中K"是被修飾包含苯甲醛 的賴氨酸，其純度>95%。
一般可以如下合成肽P'-K"-P"，其中P'、 P"是兩個(gè)多肽亞片段。引 入Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(ivDde)-OH作為需要被修飾的位置， 其中Fmoc是9-芴甲氧羰基，Mtt是4-甲基三苯甲基，以及ivDde是1-(4,4-二甲基-2，6-二氧環(huán)己-1 -亞基)-3-甲丁基。然后用丁氧羰基(Boc)封閉 肽的N末端，使得可以選擇性地去除Mtt或ivDde。然后可以用丙酮5-(琥珀酰亞胺基氧羰基)-吡啶-2-基腙(SANH)或琥珀酰亞胺基-4-甲?；?甲酸酯(SFB)修飾暴露的氨基，以便引入2-肼基吡啶基或苯甲醛基。 按照Cameron et al., J. Immunol. Meth. 268: (2002) 51-69所述的方案 從可溶性oc鏈HLA-DRA1*0101禾叩鏈HLA-DRB1*0101和HA'肽的包涵 體材料中重折疊出單體的HLA-DRB1*0101 HA'復(fù)合物，有所不同的是 每個(gè)蛋白鏈都不需要生物素化的融合標(biāo)簽。按照該相同方案中所述的那 樣實(shí)現(xiàn)單體復(fù)合物的純化。用Bradford法測定出復(fù)合物的蛋白濃度。
合成下面的八價(jià)肽(F)MV8。
(F)MV8.1: (KmGGSGGGGSGG)8(K'G)4(K'G)2K'GKFGA
這個(gè)肽的分支出現(xiàn)在各個(gè)賴氨酸K'處，數(shù)字說明了每個(gè)階段的肽的 分支的數(shù)目。KF是經(jīng)異硫氰酸熒光素FITC修飾的賴氨酸殘基，以提供 熒光標(biāo)記物。K"'是經(jīng)2-hydrazinopyridyl修飾的賴氨酸殘基，提供了分 支肽上的8個(gè)能與HA'肽上的醛基反應(yīng)形成穩(wěn)定的二芳香腙的2-hydrazinopyridyl基團(tuán)。
將單體HLA-DRB1*0101 HA'與(F)MV8.1按8:1摩爾比混合于PBS (pH 6.8)中，形成FITC標(biāo)記的HLA-DRB1*0101 HA'八聚體。
用凝膠過濾色譜法在Sephadex S 300柱(Amersham Biosciences, Chalfont St.Giles, UK)上純化所形成的產(chǎn)物，以主要回收八聚體。
實(shí)施例2:形成摻入CMV pp65肽(495-503): NLVPMVATV的標(biāo)記的I類 MHC肽八聚體HLA-A*0201
合成純度>95%的肽NLV':NLVPMVATV-(GGGSG)rK"，其中K"如
上所述。
按照Garboci & a/., PNAS 89 (1992), 3429-3433所述的方案從可溶性 a鏈HLA-A*0201和P2微球蛋白和NLV'肽的包涵體材料中重折疊出單 體的HLA-AW201/NLV'復(fù)合物。按照該相同方案中所述的那樣實(shí)現(xiàn)單體 復(fù)合物的純化。用Bradford法測定出復(fù)合物的蛋白濃度。
根據(jù)在此前所述的優(yōu)選方法合成(F)MV8.2， 一種96個(gè)堿基的環(huán)狀 寡核苷酸，其中依照標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸合成方法，每第12個(gè)堿基都被2-
hydrazinopyridyl修飾，且各個(gè)位于兩個(gè)2-hydrazinopyridyl部分之間中心 處的堿基都被修飾成包含(FITC)。選擇堿基以便于修飾并使得二級(jí)結(jié)構(gòu) 最小化。
將單體HLA-A8180201 NLV'與(F)MV8,2按8:1摩爾比混合于反應(yīng)緩沖 液(pH 6.8)中，形成FITC標(biāo)記的HLA-A*0201 NLV'八聚體。
用凝膠過濾色譜法例如在Sephadex S 300柱(Amersham Biosciences, Chalfont St.Giles, UK)上純化所形成的產(chǎn)物，以主要回收八聚體。
在上面的每個(gè)實(shí)施例中，都用凝膠過濾色譜法在Sephacryl S-300柱 (Amersham Biosciences, Chalfont St.Giles, UK)上純化所得產(chǎn)物，以主要 回收八聚體?？梢詽饪s所純化的產(chǎn)物，或者直接使用，例如用于流式細(xì) 胞術(shù)。
要知道多價(jià)實(shí)體(F)MV8.1或(F)MV8.2可以互換地分別用于I型和II 類MHC復(fù)合物的多聚化。
權(quán)利要求
1.MHC寡聚體，包含至少兩個(gè)具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個(gè)MHC復(fù)合物都具有結(jié)合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的肽，其中每個(gè)肽都具有容許所述功能性MHC復(fù)合物通過一核心結(jié)構(gòu)發(fā)生高度特異性寡聚化的修飾。
2. MHC寡聚體，包含至少兩個(gè)具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合 物，每個(gè)MHC復(fù)合物都具有結(jié)合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的 肽，在所述包含肽的功能性單體MHC復(fù)合物發(fā)生組裝后，所述MHC 復(fù)合物通過它們的肽發(fā)生寡聚化。
3. MHC寡聚體，包含至少兩個(gè)具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合 物，每個(gè)MHC復(fù)合物都具有結(jié)合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的 肽，其中每個(gè)肽都包含選自由特異性附著位點(diǎn)和寡聚化結(jié)構(gòu)域組成的組 的修飾，其中功能性MHC復(fù)合物通過以下方式發(fā)生寡聚化，(i) 每個(gè)肽在每個(gè)肽上所提供的或附著于其的特異性附著位點(diǎn)與多價(jià) 實(shí)體結(jié)合，或者(ii) 所述的肽通過每個(gè)肽上所提供的或附著于其的寡聚化結(jié)構(gòu)域進(jìn) 行排列，其中寡聚體中的MHC復(fù)合物與由多價(jià)實(shí)體或肽排列所提供的核心 結(jié)構(gòu)相連接。
4. 權(quán)利要求3的MHC寡聚體，其中寡聚化通過肽與多價(jià)實(shí)體的 結(jié)合而發(fā)生。
5. 權(quán)利要求4的MHC寡聚體，其中結(jié)合通過多價(jià)實(shí)體所提供的 識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別所述肽所具有的特異性附著位點(diǎn)而發(fā)生。
6. 權(quán)利要求3到5中任一項(xiàng)的MHC寡聚體，其中肽包含MHC 結(jié)合部分和一攜帶或形成所述修飾的獨(dú)立部分。
7. 權(quán)利要求6的MHC寡聚體，其中肽還包含其MHC結(jié)合部分 和所述獨(dú)立部分之間的多肽接頭，所述接頭的長度優(yōu)選地是3到10個(gè) 氨基酸。
8. 權(quán)利要求5的MHC寡聚體，其中特異性附著位點(diǎn)和識(shí)別位點(diǎn) 選自特異性結(jié)合對(duì)的成員。
9. 權(quán)利要求8的MHC寡聚體，其中特異性結(jié)合對(duì)選自由半抗原/ 抗體、表位/抗體、配體/受體、底物或底物類似物/酶、輔因子或輔因子 類似物/酶、核酸/互補(bǔ)核酸、糖/凝集素、生物素/抗生物素蛋白家族蛋白 例如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、neutravidin 、和 Streptag⑧/Streptactin⑧組成的組。
10. 權(quán)利要求4到7中任一項(xiàng)的MHC寡聚體，其中附著通過肽與 多價(jià)實(shí)體的共價(jià)結(jié)合而發(fā)生，所述附著位點(diǎn)和識(shí)別位點(diǎn)是能夠彼此形成 共價(jià)鍵的部分。
11. 權(quán)利要求IO的MHC寡聚體，其中所形成的共價(jià)鍵是選自由躬 鍵、腙鍵、噻唑烷鍵、噁唑烷鍵、硫醚鍵、二硫鍵、和肽鍵組成的組中 的類型。
12. 權(quán)利要求4至U 11中任一項(xiàng)的寡聚體，其中多價(jià)實(shí)體選自由天 然聚合物或其衍生物例如蛋白質(zhì)、分支多肽(樹狀聚合物)、多聚體蛋 白、核酸、多糖例如葡聚糖、淀粉、纖維素、透明質(zhì)酸、甲殼素、或海 藻酸或這些多糖的衍生物、寡核苷酸、環(huán)狀寡核苷酸；合成聚合物；磷 脂膜例如小泡或脂質(zhì)體；和無機(jī)顆粒組成的組。
13. 權(quán)利要求12的MHC寡聚體，其中多價(jià)實(shí)體是天然的或合成的 聚合物，所述識(shí)別位點(diǎn)是由多價(jià)實(shí)體的骨架提供的或者是與所述多價(jià)實(shí) 體相連的。
14. 權(quán)利要求11的MHC寡聚體，其中多價(jià)實(shí)體是分支多肽(樹狀 聚合物)，優(yōu)選地在其兩個(gè)或多個(gè)分支的預(yù)定位點(diǎn)上摻入識(shí)別位點(diǎn)。
15. 權(quán)利要求14的MHC寡聚體，其中肽的每個(gè)分支的長度都小于 24個(gè)氨基酸。
16. 權(quán)利要求IO的MHC寡聚體，其中多價(jià)實(shí)體是寡核苷酸或環(huán)狀 寡核苷酸，環(huán)狀寡核苷酸的周長優(yōu)選地小于150個(gè)堿基。
17. 權(quán)利要求3的MHC寡聚體，其中寡聚化通過肽的排列而發(fā)生。
18. 權(quán)利要求17的寡聚體，其中每個(gè)肽都附著有寡聚化結(jié)構(gòu)域， 所述寡聚化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地選自由肽寡聚化結(jié)構(gòu)域和核酸組成的組。
19. 權(quán)利要求18的MHC寡聚體，其中寡聚化結(jié)構(gòu)域是肽寡聚化結(jié) 構(gòu)域，所述寡聚化結(jié)構(gòu)域選自由抗體恒定區(qū)、角蛋白和形成寡聚體的巻 曲螺旋蛋白的寡聚化結(jié)構(gòu)域組成的組。
20. 權(quán)利要求18的MHC寡聚體，其中每個(gè)肽都依次包含兩個(gè)非重 疊的寡聚化結(jié)構(gòu)域，其中所述寡聚體中的第n個(gè)肽的第二個(gè)寡聚化結(jié)構(gòu) 域與所述寡聚體中的第(n+l)個(gè)肽的第一個(gè)寡聚化結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚體化。
21. 權(quán)利要求20的MHC寡聚體，其中進(jìn)一步地，所述寡聚體中的 最后一個(gè)肽的第二個(gè)寡聚化結(jié)構(gòu)域與所述寡聚體中的第一個(gè)肽的第一個(gè) 寡聚化結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚體化，以提供環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
22. 權(quán)利要求20或21的MHC寡聚體，其中第一個(gè)和第二個(gè)寡聚 化結(jié)構(gòu)域是核酸。
23，前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的MHC寡聚體，其中MHC寡聚體基 本上不包含未結(jié)合于MHC肽復(fù)合物的MHC結(jié)合肽區(qū)段。
24. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的MHC寡聚體，其中MHC復(fù)合物源 自I類MHC復(fù)合物的胞外部分。
25. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的MHC寡聚體，其中MHC復(fù)合物源 自II類MHC復(fù)合物的胞外部分。
26. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的MHC寡聚體，其中所述肽的MHC 結(jié)合部分基本上是均一的。
27. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的MHC寡聚體，其中至少一個(gè)單體功 能性MHC復(fù)合物是CD1，以及相應(yīng)的肽是脂質(zhì)。
28. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的MHC寡聚體，其中寡聚體所包含的 MHC-肽復(fù)合物中的所述肽的MHC結(jié)合部分的氨基酸側(cè)鏈和/或MHC a 或(3鏈的氨基酸側(cè)鏈在寡聚化過程中基本上都沒有被修飾。
29. 藥物或診斷組合物，包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的MHC寡聚 體，任選地與藥學(xué)可接受載體組合。
30. 依據(jù)T細(xì)胞抗原受體的特異性來標(biāo)記和/或檢測哺乳動(dòng)物T細(xì) 胞的方法，方法包括(i) 組合權(quán)利要求1到28中任一項(xiàng)的MHC寡聚體和包含T細(xì)胞的 懸浮液或生物學(xué)樣品，和(ii) 檢測是否存在所述復(fù)合物和T細(xì)胞的特異性結(jié)合。
31. 依據(jù)T細(xì)胞抗原受體的特異性來分離哺乳動(dòng)物T細(xì)胞的方法， 方法包括(i) 組合權(quán)利要求1到28中任一項(xiàng)的MHC寡聚體和包含T細(xì)胞的懸浮液或生物學(xué)樣品，和(ii) 將結(jié)合于所述復(fù)合物的T細(xì)胞與未結(jié)合的細(xì)胞分離。
32. 權(quán)利要求30或31的方法，其中依據(jù)特異結(jié)合MHC分子的特 殊類型的細(xì)胞表面分子來標(biāo)記、檢測或分離出非T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞類 型。
33. 形成如權(quán)利要求1到28中任一項(xiàng)所定義的MHC寡聚體的方 法，所述MHC寡聚體包含至少兩個(gè)具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合 物，每個(gè)復(fù)合物都具有結(jié)合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的肽，其中 每個(gè)肽都具有容許功能性MHC復(fù)合物通過一核心結(jié)構(gòu)發(fā)生高度特異性 寡聚化的修飾，所述方法包括步驟(i)提供一種或多種能夠結(jié)合于每個(gè)功能性MHC復(fù)合物的肽溝的 肽，所述肽通過以下方式被修飾 (a) 提供特異性附著位點(diǎn)，或(b) 提供寡聚化結(jié)構(gòu)域；(ii)提供包含在(i)中被修飾的肽的單體功能性MHC肽復(fù)合物，禾口 (m)通過以下方式使功能性MHC復(fù)合物發(fā)生寡聚化(a) 提供多價(jià)實(shí)體并將所述單體功能性MHC肽復(fù)合物在每個(gè) 肽上所提供的或附著于其的特異性附著位點(diǎn)與多價(jià)實(shí)體結(jié)合，或(b) 通過每個(gè)肽上所提供的或附著于其的寡聚化結(jié)構(gòu)域?qū)λ?的肽進(jìn)行排列。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中在存在在步驟(i)中被修飾的肽的情 況下，通過重折疊MHC a和P鏈來提供步驟(ii)中的單體功能性MHC-肽 復(fù)合物。
35. 權(quán)利要求33的方法，其中在存在在步驟(i)中被修飾的肽的情 況下，通過被重折疊的功能性MHC復(fù)合物的肽交換提供步驟(ii)中的單 體功能性MHC-肽復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了MHC寡聚體及其制備方法，所述MHC寡聚體包含至少兩個(gè)具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個(gè)MHC復(fù)合物都具有結(jié)合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝內(nèi)的肽，其中每個(gè)肽都具有容許所述功能性MHC復(fù)合物通過一核心結(jié)構(gòu)發(fā)生高度特異性寡聚化的修飾。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101111520SQ200680003922
公開日2008年1月23日 申請(qǐng)日期2006年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月4日
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