專利名稱：用于實體腫瘤預(yù)后的藥物基因組學(xué)標志的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因標志和使用這些標志用于實體腫瘤的預(yù)后的方法。

背景技術(shù)：
初生組織中的表達分布研究已證明正常與惡性組織之間存在轉(zhuǎn)錄差異。參見，例如Su，等人，Cancer Res.，617388-7393(2001)；和Ramaswamy，等人，Proc.NATL.ACAD.Sci.U.S.A.，9815149-15151(2001)。新近臨床分析也已鑒別似乎與臨床結(jié)果的某些量度高度相關(guān)的腫瘤表達分布。某研究已證明原發(fā)性腫瘤活檢的表達分布產(chǎn)生比得上或甚至可能勝過目前采納的癌癥患者中風(fēng)險的標準量度的預(yù)后性“信號”。參見van de Vijver，等人，N Engl J Med，3471999-2009(2002)。
雖然原發(fā)性腫瘤組織中的轉(zhuǎn)錄或其他生物化學(xué)變化可代表鑒別預(yù)后證據(jù)的最佳機會，但在許多腫瘤學(xué)情況中，原發(fā)性腫瘤已在化學(xué)療法開始之前切除。在這些境況中，因此，希望確定某些其他“替代”組織中的反應(yīng)是否能提供患者結(jié)果的指示。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的特征在于可提供實體腫瘤患者的最終臨床結(jié)果線索的外周血單核細胞(PBMC)中的基因標志?？拱┲委熼_始后，實體腫瘤患者的PBMC中，各基因標志均具有改變的表達模式，且這一改變的量值在統(tǒng)計上與實體腫瘤患者的臨床結(jié)果顯著相關(guān)。在許多實施例中，PBMC中的基因表達變化與患者結(jié)果之間的相關(guān)性通過Cox成比例危險模型、Spearman相關(guān)分析(Spearman correlation)或基于等級的相關(guān)性量度(class-based correlation metric)判定。本發(fā)明的基因標志可用作實體腫瘤預(yù)后的替代標志。其也可用作抗癌藥物功效的藥物基因組學(xué)指標。
一方面，本發(fā)明提供用于所關(guān)注的患者的實體腫瘤的預(yù)后或評估所關(guān)注的患者的實體腫瘤的治療效力的方法。所述方法包含檢測抗癌治療期間所關(guān)注的患者的外周血細胞中至少一個基因的表達水平的變化，和比較所檢測的變化與參考變化。罹患相同實體腫瘤且接受與所關(guān)注的患者相同的治療的患者的PBMC中基因的表達水平變化與這些患者的臨床結(jié)果相關(guān)。因此，所關(guān)注的患者的表達水平變化的量值指示患者治療的預(yù)后或效力。在許多實施例中，參考變化具有經(jīng)驗上或?qū)嶒炆洗_定的值。如果所關(guān)注的患者的表達水平變化大于或小于參考變化，那么視為所關(guān)注的患者具有良好或不良預(yù)后。在許多其他實施例中，參考變化為罹患相同實體腫瘤且接受與所關(guān)注的患者相同的治療的參考患者的外周血細胞中基因的表達水平變化。也可使用其他量度或標準計算參考變化。
可使用多種類型的血樣確定所關(guān)注的患者的基因表達變化。這些血樣的實例包括(但不限于)全血樣品或包含高濃度或純化PBMC的樣品。也可使用其他類型的血樣。在適當(dāng)?shù)南嚓P(guān)模型下，這些樣品中的基因表達水平變化在統(tǒng)計上與患者結(jié)果顯著相關(guān)。
符合本發(fā)明的實體腫瘤包括(但不限于)腎細胞癌(RCC)、前列腺癌或頭/頸癌?？筛鶕?jù)本發(fā)明加以評定的抗癌治療包括(但不限于)藥物療法、化學(xué)療法、激素治療、放射療法、免疫療法、手術(shù)、基因療法、抗血管生成療法、姑息療法或其他常規(guī)或?qū)嶒灟煼ɑ蚱浣M合?？墒褂萌魏闻c時間相關(guān)的臨床指標評估所關(guān)注的患者的治療的預(yù)后或效力。這些臨床指標的非限定性實例包括疾病進展時間(TTP)或死亡時間(TTD)。
可使用多種相關(guān)法或統(tǒng)計法評定抗癌治療期間外周血基因表達變化與患者結(jié)果之間的相關(guān)性。這些方法包括(但不限于)Cox成比例危險模型、最近鄰體分析(nearest-neighbor analysis)、微陣列顯著性分析(significance analysis of microarrays)(SAM)法、支持向量機(support vector machines)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neuralnetwork)或其他秩檢驗(rank test)、生存分析(survival analysis)或相關(guān)性量度(correlationmetric)。
在一個實施例中，使用單變量Cox成比例危險模型確定CCI-779治療開始后RCC患者的PBMC中基因表達水平變化與這些患者的臨床結(jié)果的時間量度(例如，TTP或TTD)之間的相關(guān)性。Cox成比例危險模型所鑒別的預(yù)后性基因的非限定性實例描述于表4A、4B、5A及5B中。這些預(yù)后性基因可用于預(yù)測臨床結(jié)果或評估所關(guān)注的RCC患者的抗癌治療的效力。
在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的預(yù)后性基因的估計危險比率小于1。因此，所關(guān)注的患者的外周血細胞中較高值的基因表達水平的變化暗示患者的較佳預(yù)后。相反地，所關(guān)注的患者的較低值的變化指示較差預(yù)后。
在另一實施例中，本發(fā)明中所使用的預(yù)后性基因的危險比率大于1。結(jié)果，所關(guān)注的患者的外周血細胞中較高值的基因表達水平的變化指示患者的較差預(yù)后，且所關(guān)注的患者的較低值的變化暗示較佳預(yù)后。
所關(guān)注的患者的表達水平變化可從任何參考點起度量。在適當(dāng)?shù)南嚓P(guān)模型下，所度量的表達水平變化在統(tǒng)計上與患者結(jié)果顯著相關(guān)。在許多情況下，預(yù)后性基因的表達水平變化通過度量抗癌治療開始后特定時間基因的外周血表達水平與基因的基線外周血表達水平之間的改變來確定。在一非限定性實例中，特定時間為治療開始后約16周。也可使用小于或大于16周(例如，治療開始后4、8、12、20、24或28周)的特定時間。
本發(fā)明的特征也在于兩個或兩個以上基因標志或多變量Cox模型用于實體腫瘤的預(yù)后的用途。另外，本發(fā)明的特征在于適用于RCC或其他實體腫瘤的預(yù)后的試劑盒。各試劑盒包括至少一個用于本發(fā)明的預(yù)后性基因的探針或大體上由其組成。
另一方面，本發(fā)明的特征在于使用羅吉斯回歸(logistic regression)、ANOVA(方差分析(analysis of variance))、ANCOVA(協(xié)方差分析(analysis of covariance))、MANOVA(方差多重分析(multiple analysis of variance))或其他用于所關(guān)注的患者的實體腫瘤的預(yù)后或評估其治療效力的相關(guān)法或統(tǒng)計法。這些方法包含檢測抗癌治療開始后特定時間所關(guān)注的患者的外周血細胞中至少一個實體腫瘤預(yù)后性基因的表達水平和將表達水平輸入相關(guān)模型或統(tǒng)計模型中以確定所關(guān)注的患者的治療的預(yù)后或效力。相關(guān)模型或統(tǒng)計模型描述罹患相同實體腫瘤且接受與所關(guān)注的患者相同的治療的患者的PBMC中實體腫瘤預(yù)后性基因的表達水平與這些患者的臨床結(jié)果之間的統(tǒng)計上顯著的相關(guān)性。在許多實例中，相關(guān)模型或統(tǒng)計模型能夠產(chǎn)生所關(guān)注的患者的臨床結(jié)果的定性預(yù)測(例如，良好或不良預(yù)后)。適于此目的的統(tǒng)計模型或分析包括(但不限于)羅吉斯回歸或基于等級的相關(guān)性量度。在許多其他實例中，相關(guān)模型或統(tǒng)計模型能夠產(chǎn)生所關(guān)注的患者的臨床結(jié)果的定量預(yù)測(例如，估計TTD或TTP)。適于此目的的統(tǒng)計模型或分析包括(但不限于)多種回歸、ANOVA或ANCOVA模型。
用于預(yù)測所關(guān)注的患者的表達水平可為從基線或抗癌治療開始后另一參考時間點起度量的相對表達水平。也可使用絕對表達水平預(yù)測所關(guān)注的患者。在后一種情況中，可使用基線或另一特定參考時間的表達水平作為預(yù)測模型中的協(xié)變量。
本發(fā)明的其他特征、目標及優(yōu)點易見于下文具體實施方式
中。然而，應(yīng)理解當(dāng)實施方式說明本發(fā)明的實施例時，其僅以說明的方式而非限定性方式給出。由具體實施方式
，本發(fā)明的范疇內(nèi)的多種變化和修改對所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將變得顯而易見。



無
具體實施例方式 本發(fā)明提供用于RCC或其他實體腫瘤的預(yù)后的方法和系統(tǒng)。實體腫瘤預(yù)后性基因可通過本發(fā)明加以鑒別。抗癌治療開始后，實體腫瘤患者的PBMC中各預(yù)后性基因均具改變的表達分布，且這些改變的量值與此等患者的臨床結(jié)果相關(guān)。在許多實施例中，表達分布改變從基線起度量，且表達分布改變與患者結(jié)果之間的相關(guān)性通過Cox成比例危險模型加以評定。
可使用本發(fā)明的預(yù)后性基因作為替代標記，以用于所關(guān)注的實體腫瘤患者的預(yù)后或監(jiān)測所關(guān)注的實體腫瘤患者的治療效力。歸因于疾病的分子機理的個別異質(zhì)性，不同患者對治療可能會具有不同臨床反應(yīng)。與患者反應(yīng)相關(guān)的基因表達模式的鑒別使得臨床醫(yī)師得以基于預(yù)測的患者反應(yīng)選擇治療且從而避免不利反應(yīng)。此提供改進的臨床試驗安全性和增加的藥物及其他抗癌治療的效益/風(fēng)險比。外周血為通常以最低侵襲性的方式從患者獲得的組織。通過確定患者結(jié)果與外周血中基因表達變化之間的相關(guān)性，本發(fā)明代表臨床藥物基因組學(xué)和實體腫瘤治療的重大發(fā)展。
本發(fā)明的多個方面更詳細地描述于以下分部中。使用分部并不旨在限制本發(fā)明。各分部可適用于本發(fā)明的任何方面。在本申請案中，除非上下文另有明確規(guī)定，否則單數(shù)形式“一”包括復(fù)數(shù)涵義，且除非另有說明，否則使用“或”意謂“和/或”。
I.鑒別實體腫瘤預(yù)后性基因的一般方法 本發(fā)明鑒別外周血基因表達分布的改變與實體腫瘤患者的臨床結(jié)果之間的統(tǒng)計上顯著的相關(guān)性。可鑒別具有所述相關(guān)性的基因。這些基因為實體腫瘤預(yù)后性基因且可用作替代標記，以用于實體腫的預(yù)后或評估實體腫瘤的治療效力。
適于本發(fā)明的相關(guān)性分析包括(但不限于)Cox成比例危險模型(Cox，Journal of theRoyal Statistical Society，Series B 34187(1972))、Spearman秩相關(guān)性(Snedecor和Cochran，Statistical Methods(第8版，Iowa State University Press，Ames，Iowa，第503頁，1989))、最近鄰體分析(Golub，等人，Science，286531-537(1999)；和Slonim，等人，Procs.of theFourth Annual International Conference on Computational Molecular Biology，Tokyo，Japan，4月8-11日，第263-272頁(2000))、微陣列顯著性分析(SAM)法(Tusher，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，985116-5121(2001))、支持向量機及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。也可使用其他秩檢驗、生存分析、相關(guān)性量度或統(tǒng)計法。
Cox成比例危險模型為最常使用的檢查生存資料的回歸模型。參見，例如Tibshirani，Clinical&Investigative Medicine，563-68(1982)；Allison，Survival Analysis Using the SASSystemA Practical Guide(Gary NCSAS Institute，1995)；及Therneau和Grambsch，Modeling Survival DataExtending the Cox Model(New YorkSpringer，2000)。Cox模型檢查生存與一個或一個以上協(xié)變量或預(yù)測因子之間的關(guān)系。如本文所使用，術(shù)語“生存”不限于真正的死亡或生存。實情為術(shù)語應(yīng)廣泛解釋為涵蓋任何時間相關(guān)的事件。通常視Cox成比例危險模型比許多其他回歸模型更一般，因為Cox模型并不基于任何關(guān)于基本生存分布的性質(zhì)或形態(tài)的假設(shè)。Cox模型假設(shè)基本危險率隨獨立協(xié)變量或預(yù)測因子而變化，且不對危險函數(shù)的性質(zhì)或形態(tài)進行假設(shè)。
Cox成比例危險模型的非限定性實例通過以下等式描述 其中i是個體的下標，且Hi(t)為時間t時的危險且代表時間t時的終點(例如，死亡、疾病進展或另一時間相關(guān)的事件)的概率，假定個體生存直到時間t。Xj表示預(yù)測因子或協(xié)變量，其可為連續(xù)(continuous)、二分(dichotomous)或其他有序分類(orderedcategorical)變量。Cox成比例回歸模型假設(shè)預(yù)測因子的效應(yīng)隨時間為恒定的。在許多實施例中，Xj代表抗癌治療開始后實體腫瘤患者的外周血細胞(例如，PBMC)中基因j表達水平的變化。其中Xj具有高度偏斜分布，可執(zhí)行對數(shù)轉(zhuǎn)換來降低極值效應(yīng)。H0(t)為時間t時的基線危險，且表明當(dāng)所有獨立協(xié)變量都等于0時，各個體的危險。在Cox模型中，未指定基線危險函數(shù)。即使缺乏特定的基線危險函數(shù)，但仍可(例如)通過部分似然法(method of parial likeihood)估計Cox模型。
等式(1)所描繪的Cox模型為半?yún)?shù)的，因為當(dāng)基線危險可采用任何形式時，均可估計協(xié)變量的系數(shù)?？紤]x值隨相應(yīng)線性預(yù)測因子而不同的兩個觀察結(jié)果i和i′ 和 Hi(t)與Hi′(t)的比率 Hi(t)/Hi′(t)＝[H0(t)exp(PI)]/[H0(t)exp(PI′)]＝exp(PI)/exp(PI′)(4) 與時間t無關(guān)。因此，等式(1)中的Cox模型為成比例危險模型。
等式(5)描述單變量Cox模型，其中僅單個預(yù)測因子通過Cox回歸加以評定 Hi(t)＝H0(t)exp(βxi)(5) 危險比率(RR)定義為exp(β)，其代表預(yù)測因子一個單位變化的事件(例如，死亡或疾病進展)的相對風(fēng)險。在許多應(yīng)用中，PBMC表達值表現(xiàn)為以2為底的對數(shù)，且一個單位變化對應(yīng)于雙重表達。危險比率的自然對數(shù)產(chǎn)生系數(shù)β。當(dāng)使用S-Plus或R程序包時，危險比率RR可使用程序包中的“coxph()”函數(shù)產(chǎn)生。
在單變量Cox分析中，小于1的危險比率指示系數(shù)β為負。結(jié)果，預(yù)測因子的值的增加產(chǎn)生降低的事件(例如，死亡或疾病進展)瞬時風(fēng)險。相反地，預(yù)測因子的值的減小產(chǎn)生較高的事件瞬時風(fēng)險。同樣地，大于1的危險比率暗示系數(shù)β為正。因此，預(yù)測因子的值的增加(或減小)產(chǎn)生較高(或較低)的事件瞬時風(fēng)險。
作為非限定性實例，當(dāng)系數(shù)β為負時，與預(yù)測因子χi′相比預(yù)測因子xi的增加產(chǎn)生較低的PI，因此，產(chǎn)生與Hi′(t)相比較低的Hi(t)。參見等式(2)、(3)及(4)，其中k＝1。相反地，xi的減小產(chǎn)生與Hi′(t)相比較高的Hi(t)。當(dāng)系數(shù)β為正時，xi的增加(或減小)產(chǎn)生與Hi′(t)相比較高(或較低)的Hi(t)。因此，可使用Cox成比例危險模型評估不同個體之間的時間相關(guān)事件的相對風(fēng)險。
一旦擬合Cox模型時，就可使用至少三個假設(shè)檢驗評定協(xié)變量的統(tǒng)計顯著性。這些檢驗為似然比檢驗(likelihood ratio test)、Wald檢驗和計分檢驗(score test)。在許多實施例中，通過一種或一種以上用于基因表達從基線的變化與患者結(jié)果之間的相關(guān)性的這些檢驗所確定的p值為至多0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001或更低。本發(fā)明的預(yù)后性基因的危險比率可小于1，諸如至多0.5、0.33、0.25、0.2、0.1或更低。基因的危險比率也可大于1，諸如至少2、3、4、5、10或更大。小于1的危險比率指示實體腫瘤患者的外周血細胞中基因表達水平的增加暗示患者的良好預(yù)后，而大于1的危險比率暗示患者的外周血細胞中基因表達水平的增加指示患者的不良預(yù)后。
本發(fā)明也涵蓋使用多變量Cox模型使實體腫瘤患者的外周血基因表達變化與臨床結(jié)果相關(guān)。各多變量Cox模型包括兩個或兩個以上協(xié)變量或預(yù)測因子，且各協(xié)變量代表抗癌治療期間實體腫瘤患者的外周血細胞(例如，PBMC)中預(yù)測因子基因表達水平的變化。在許多實施例中，表達水平的變化從基線起度量。也可將不同協(xié)變量間的相互作用引入模型中。
可在多變量模型中檢驗對單變量分析為顯著(例如，具有至多0.05、0.01、0.005、0.001或更低的p值)的預(yù)測因子。在一實例中，使用正向逐步選擇法(forward stepwiseselection)選擇用于多變量分析的預(yù)測因子。舉例來說，可首先將對單變量分析為單一最顯著的預(yù)測因子輸入多變量模型中，接著輸入次最顯著的預(yù)測因子等等。在一些情況下，在不損害模型的預(yù)測性能的情況下，使用降維法(dimension reduction method)(諸如主成分分析(principal component analysis)或分片逆回歸(sliced inverse regression))潛在減少多變量模型中的預(yù)測因子的數(shù)目。
可利用多種計算機程序進行Cox回歸分析。這些程序的實例包括(但不限于)S-Plus、SAS或SPSS程序包。參見，例如Allison，Survival Analysis Using the SAS SystemAPractical Guide(Gary NCSAS Institute，1995)；和Therneau，A Package for SurvivalAnalysis in S(Technical Report，www.mayo.edu/hsr/people/therneau/survival.ps，MayoFoundation，1999)。
也可使用修改的Cox模型。舉例來說，可將分層因子引入Cox模型中以允許變量各級之間存在非成比例的危險?？墒褂脷埐畎l(fā)現(xiàn)預(yù)測因子的修正函數(shù)形式，鑒別通過模型不良預(yù)測的個體或評定成比例危險假設(shè)。另外，可通過修改的Cox模型分析隨時間變化的協(xié)變量、時間依賴性系數(shù)、多個/相關(guān)觀察結(jié)果或多個時標。也可使用處罰Cox模型(Penalized Cox model)或脆弱模型(frailty model)。
本發(fā)明的特征也在于使用其他相關(guān)法或統(tǒng)計法鑒別外周血基因表達變化與患者結(jié)果之間的相關(guān)性。這些方法包括(但不限于)加權(quán)投票(weighted voting)(Golub，等人，Science，286531-537(1999))、支持向量機((Su，等人，CANCER Research，617388-93(2001))、K-最鄰近法(K-nearest neighbor)(Ramaswamy，等人，Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the USA，9815149-15154(2001))、相關(guān)系數(shù)(van′tVeer，等人，NATURE，415530-536(2002))或其他合適模式識別程序。
可根據(jù)本發(fā)明加以評估的實體腫瘤治療的實例包括(但不限于)藥物療法(例如，CCI-779療法)、化學(xué)療法、激素療法、放射療法、免疫療法、手術(shù)、基因療法、抗血管生成療法、姑息療法或其他常規(guī)或非常規(guī)療法或其任何組合。符合本發(fā)明的實體腫瘤包括(不限于)RCC、前列腺癌、頭/頸癌、卵巢癌、睪丸癌、腦腫瘤、乳癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮頸癌、子宮癌、肝癌或其他不具有血液或淋巴細胞起源的腫瘤?？墒褂弥苯踊蜷g接觀測進程評估實體腫瘤的狀況或進展。合適觀測法包括(但不限于)掃描(諸如X射線(X-ray)、計算機化軸向?qū)用鎄射線攝影法(computerized axial tomography)(CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging)(MRI)、電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomography)(PET)或超聲波掃描術(shù)(ultrasonography)(U/S))、活檢、觸診、內(nèi)窺鏡檢查、腹腔鏡檢查或所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員了解的其他合適方法。
可通過大量標準評定實體腫瘤的臨床結(jié)果。在許多實施例中，基于患者對治療性治療的反應(yīng)度量臨床結(jié)果。時間相關(guān)的臨床結(jié)果量度的實例包括(但不限于)疾病進展時間(TTP)、死亡時間(TTD或生存)、完全反應(yīng)時間、部分反應(yīng)時間、微小反應(yīng)時間、疾病穩(wěn)定時間或其組合。
TTP是指治療開始的日期到度量疾病進展的第一天之間的間隔。TTD是指治療開始的日期到死亡時間之間的間隔。完全反應(yīng)、部分反應(yīng)、微小反應(yīng)、疾病穩(wěn)定或疾病進展可使用(不限于)WHO報導(dǎo)標準(WHO Reporting Criteria)，諸如WHO公開案第48號(World Health Organization，Geneva，Switzerland，1979)所述的標準加以評估。以此標準，在每次評定中度量一維或二維可度量的病變。當(dāng)多個病變存在于任一器官中時，那么可選擇多達6個(如果可用)代表性病變。
在許多情況下，“完全反應(yīng)”(CR)定義為通過兩次相隔不少于4周的觀察判定所有可度量且可評估的疾病完全消失。不存在新的病變且不存在疾病相關(guān)癥狀?！安糠址磻?yīng)”(PR)在提及二維可度量疾病時意謂通過2次相隔不少于4周的觀察判定所有可度量的病變的最大垂直直徑的乘積的和減少至少約50％?！安糠址磻?yīng)”在提及一維可度量疾病時意謂通過2次相隔不少于4周的觀察判定所有病變的最大直徑的和減少至少約50％。就部分反應(yīng)來說，不必所有病變均退回至合格狀態(tài)，但任何病變均不應(yīng)進展且不應(yīng)出現(xiàn)任何新的病變。評定應(yīng)為客觀的。“微小反應(yīng)”在提及二維可度量疾病時意謂所有可度量的病變的最大垂直直徑的乘積的和減少約25％或更多但減少小于約50％?！拔⑿》磻?yīng)”在提及一維可度量疾病時意謂所有病變的最大直徑的和減少至少約25％但小于約50％。
“疾病穩(wěn)定”(SD)在提及二維可度量疾病時意謂所有可度量的病變的最大垂直直徑的乘積的和減少小于約25％或增加小于約25％?！凹膊》€(wěn)定”在提及一維可度量疾病時意謂所有病變的直徑的和減少小于約25％或增加小于約25％。不應(yīng)出現(xiàn)任何新的病變。“疾病進展”(PD)是指至少一個二維(最大垂直直徑的乘積)或一維可度量病變的尺寸增加大于或等于約25％或出現(xiàn)新的病變。如果通過陽性細胞學(xué)證實出現(xiàn)胸膜積液或腹水，那么也視為疾病進展。病理性骨折或骨骼斷裂不一定證明疾病進展。
在一非限定性實例中，根據(jù)表1判定一維和二維可度量疾病的總體個體腫瘤反應(yīng)。
表1總體個體腫瘤反應(yīng) 舉例來說，在以下情形中可評定非可度量疾病的總體個體腫瘤反應(yīng) a)總體完全反應(yīng)如果存在非可度量疾病，那么其應(yīng)完全消失。否則，個體不能視為“總體完全反應(yīng)者”。
b)總體進展在非可度量疾病的尺寸顯著增加或出現(xiàn)新的病變的情況下，總體反應(yīng)將進展。
就相關(guān)性研究來說，實體腫瘤患者可基于其各自的臨床結(jié)果分等級。其也可使用傳統(tǒng)的臨床風(fēng)險評定法分等級。在許多情況下，這些風(fēng)險評定法使用若干將實體腫瘤患者分為不同預(yù)后或風(fēng)險群組的預(yù)后性因子。這些方法的一個實例為用于RCC的Motzer風(fēng)險評定，描述于Motzer，等人，J Clin Oncol，172530-2540(1999)中。不同風(fēng)險群組中的患者對療法可具有不同反應(yīng)。
可使用多種類型的外周血樣鑒別外周血基因表達變化與患者結(jié)果之間的相關(guān)性。適于此目的的外周血樣包括(但不限于)全血樣或包含高濃度PBMC的樣品?！案邼舛取币庵^樣品中PBMC的百分率比全血中的高。在許多情況下，高濃度樣品中的PBMC百分率比全血中的高至少1、2、3、4、5或更多倍。在許多其他情況下，高濃度樣品中的PBMC百分率為至少90％、95％、98％、99％、99.5％或更高。含高濃度PBMC之血樣可通過使用諸如菲科爾梯度離心(Ficoll gradients centrifugation)或CPT(細胞純化管(cellpurification tube))的所屬領(lǐng)域中已知的任何方法加以制備。
本發(fā)明中所使用的外周血樣可在抗癌治療之前、期間或之后的任何時候加以分離。舉例來說，外周血樣可在治療性治療之前分離。這些樣品在本文中稱為“基線”或“預(yù)處理”樣品。這些樣品中的基因表達分布在本文中稱為“基線”或“預(yù)處理”分布。另一實例，外周血樣可在抗癌治療開始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16周從實體腫瘤患者中分離。也可使用其他時間間隔來制備血樣。
在許多實施例中，基因表達變化通過度量抗癌治療開始后特定時間的基因表達分布與基線表達分布之間的改變來確定。也可使用不為基線的參考時間點。
外周血基因表達變化可使用全基因表達分析加以評估。適于此目的的方法包括(但不限于)核酸陣列(諸如cDNA或寡核苷酸陣列)、蛋白質(zhì)陣列、雙向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳/質(zhì)譜及其他高通量核苷酸或多肽檢測技術(shù)。
核酸陣列允許一次定量檢測大量基因的表達水平。核酸陣列的實例包括(但不限于)來自Affymetrix(Santa Clara，CA)的Genechip微陣列、來自Agilent Technologies(PaloAlto，CA)的cDNA微陣列及美國專利第6,288,220號和第6,391,562號中所述的微珠陣列。
待與核酸陣列雜交的聚核苷酸可用一或多個標記部分加以標記以允許檢測雜交的聚核苷酸復(fù)合體。標記部分可包括通過光譜法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、生物電子法、免疫化學(xué)法、電法、光學(xué)法或化學(xué)法可檢測的組合物。例示性標記部分包括放射性同位素、化學(xué)發(fā)光化合物、經(jīng)標記的結(jié)合蛋白、重金屬原子、諸如熒光標記以及染料的光譜標記、磁標記、聯(lián)結(jié)酶、質(zhì)譜標記、自旋標記、電子轉(zhuǎn)移供體和受體等。也可使用未經(jīng)標記的聚核苷酸。聚核苷酸可為DNA、RNA或其經(jīng)修飾形式。
雜交反應(yīng)可以完美雜交或差異雜交格式執(zhí)行。在完美雜交格式中，使由一個諸如抗癌治療期間的特定時間自實體腫瘤患者分離的外周血樣的樣品制備的聚核苷酸與核酸陣列雜交。形成雜交復(fù)合體后所檢測到的信號指示樣品中的聚核苷酸水平。在差異雜交格式中，用不同標記部分標記由兩個生物樣品(諸如一個來自所關(guān)注的患者和另一來自參考患者)制備的聚核苷酸。將這些經(jīng)不同標記的聚核苷酸的混合物添加到核酸陣列中。然后，在來自不同標記的發(fā)射可個別檢測的條件下檢查核酸陣列。在一個實施例中，使用熒光團Cy3和Cy5(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway N.J.)作為差異雜交格式的標記部分。
可使用諸如由Affymetrix或Agilent Technologies提供的軟件的市售軟件分析從核酸陣列收集的信號。雜交實驗中可包括諸如掃描靈敏性、探針標記及cDNA/cRNA定量的對照。在許多實施例中，在核酸陣列表達信號經(jīng)受進一步的分析之前，使其按比例調(diào)整或歸一化。舉例來說，當(dāng)在相似檢驗條件下使用一個以上陣列時，可使各基因的表達信號歸一化以考慮雜交強度的改變。也可使用源自各陣列上所包含的內(nèi)標歸一化對照的強度使個別聚核苷酸復(fù)合體雜交的信號歸一化。另外，可使用在所有樣品中具有相對一致的表達水平的基因使其他基因的表達水平歸一化。在一個實施例中，使基因的表達水平在所有樣品中歸一化以致平均值為0且標準偏差為1。在另一實施例中，使通過核酸陣列所檢測到的表達資料經(jīng)受排除展示所有樣品中最小或可忽略改變的基因的改變過濾器。
II.鑒別RCC預(yù)后性基因 RCC包含所有腎癌病例中的大部分且在工業(yè)化國家中為十大最常見癌癥之一。晚期RCC的5年生存率小于5％。RCC通常通過成像方法檢測，30％明顯非轉(zhuǎn)移性患者經(jīng)受手術(shù)后復(fù)發(fā)且最終死于疾病。新近表達分布研究已證明原發(fā)性惡性腫瘤的轉(zhuǎn)錄分布根本地由相應(yīng)正常組織的轉(zhuǎn)錄分布改變而來(請參見Slonim，Pharmacogenomics，2123-136(2001))。詳細檢查RCC腫瘤轉(zhuǎn)錄分布的特異性微陣列研究(Young，等人，Am.J.Pathol.，1581639-1651(2001))已鑒別許多等級的在正常腎組織與原發(fā)性RCC腫瘤之間變化的基因。
已為診斷有RCC的患者開發(fā)出數(shù)個預(yù)后性因子和計分指數(shù)，典型例子為數(shù)個關(guān)鍵指標的多變量評定。一個實例為Motzer風(fēng)險評定計分，其使用5個由Motzer，等人，J ClinOncol，172530-2540(1999)提出的預(yù)后性因子，即Karnofsky身體狀況評分、血清乳酸脫氫酶、血紅蛋白、血清鈣及先前存在/不存在腎切除?？苫诟髯缘腗otzer風(fēng)險評定計分將RCC患者分為良好、中等或不良預(yù)后等級。
本發(fā)明的特征在于用于RCC的預(yù)后的替代基因標志。RCC患者的外周血細胞中這些基因的表達水平在CCI-779療法期間發(fā)生變化，且這些與基線表達水平的變化的量值與諸如TTP或TTD的臨床結(jié)果的連續(xù)量度相關(guān)。
CCI-779為mTOR通路的小分子抑制劑，其當(dāng)前在腫瘤學(xué)領(lǐng)域中的多種適應(yīng)癥中及諸如多發(fā)性硬化癥之適應(yīng)癥中作為細胞生長抑制劑經(jīng)受評估。CCI-779為免疫抑制雷帕霉素(rapamycin)的酯類似物且其本身為雷帕霉素的哺乳動物標靶的有效的選擇性抑制劑。雷帕霉素的哺乳動物標靶(mTOR)會激活包括p70s6激酶的磷酸化的多個信號傳輸通路，此導(dǎo)致編碼涉及翻譯和進入細胞周期G1期的蛋白質(zhì)的5′TOP mRNA的翻譯的增加。歸因于CCI-779對mTOR及細胞周期控制的抑制效應(yīng)，其充當(dāng)細胞生長抑制劑和免疫抑制劑。
用25mg、75mg或250mg CCI-779靜脈內(nèi)(IV)輸液每周一次地治療111位晚期RCC患者(34位女性和77位男性)直到證明疾病進展。進一步分析一45位患者(18女性和27位男性)子組的基因表達結(jié)果。將這45位患者的RCC腫瘤在臨床場所分類為常規(guī)(透明細胞)癌(24)、顆粒狀(1)、乳頭狀(3)或混合亞型(7)。10個腫瘤分類為未知的。RCC患者主要是高加索人血統(tǒng)(Caucasian descent)(44位高加索人、1位美裔非洲人)且平均年齡為58歲(在40-78歲范圍內(nèi))。納入標準包括先前已接受晚期疾病的療法或先前尚未接受晚期疾病的療法但不是接受高劑量IL-2療法的適當(dāng)候選者的組織學(xué)上確認為晚期腎癌的患者。其他納入標準包括具有以下特征的患者(1)疾病的二維可度量的證據(jù)；(2)進入研究之前證明疾病進展；(3)年齡在18歲或更大；(4)ANC＞1500/μL，血小板＞100,000/μl且血紅蛋白＞8.5g/dL；(5)由血清肌酸酐＜1.5×正常值上限證明腎功能足夠；(6)由膽紅素＜1.5×正常值上限和AST＜3×正常值上限(或如果存在肝轉(zhuǎn)移，那么AST＜5×正常值上限)證明肝功能足夠；(7)血清膽固醇＜350mg/dL，三酸甘油酯＜300mg/dL；(8)ECOG身體狀況評分0-1；以及(9)至少12周的預(yù)期壽命。排除標準包括具有以下特征的患者(1)存在已知CNS轉(zhuǎn)移；(2)給藥開始3周內(nèi)進行手術(shù)或放射療法；(3)給藥開始4周內(nèi)進行RCC化學(xué)療法或生物療法；(4)給藥開始4周內(nèi)用先前研究劑治療；(5)免疫受損的狀況，包括那些已知HIV為陽性或接受包括皮質(zhì)類固醇的免疫抑制劑的同時使用的患者；(6)主動感染；(7)需要抗痙攣療法治療；(8)危急生命的心律失常治療6個月內(nèi)/或正在進行過程中存在不穩(wěn)定的絞痛/心肌梗塞；(9)在過去3年里有先前惡性腫瘤病史；(10)對大環(huán)內(nèi)脂類抗菌素過敏；以及(11)懷孕或任何其他大體上將增加與參與研究相關(guān)的風(fēng)險的疾病。試驗整段時間內(nèi)以每周一次30分鐘的靜脈內(nèi)輸液所投與的三種劑量(25mg、75mg或250mg)中的一種的CCI-779治療所選擇的RCC患者。
治療之前及CCI-779療法開始后每8周記錄殘余、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性疾病的臨床病期及尺寸。腫瘤尺寸以厘米度量且報導(dǎo)為最長直徑與其垂直直徑的乘積。可度量疾病定義為通過CT掃描、X射線或觸診這兩個直徑均大于1.0cm的任何二維可度量病變。腫瘤反應(yīng)通過所有可度量病變的乘積的和加以判定。指定臨床反應(yīng)的類別由臨床方案定義給出(亦即，疾病進展、疾病穩(wěn)定、微小反應(yīng)、部分反應(yīng)及完全反應(yīng))。也使用以Motzer風(fēng)險評定指定的預(yù)后的類別(良好對中等對不良)。在45位RCC患者中，6位指定為良好風(fēng)險評定，17位患者擁有中等風(fēng)險計分且22位患者收到不良預(yù)后等級。除分類等級外，也監(jiān)測總生存及疾病進展時間作為臨床終點。
在CCI-779療法之前及治療開始后每8周從RCC患者的外周血分離PBMC。由所分離的PBMC制備核酸樣品且根據(jù)制造商指南使其與HG-U95A基因芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)雜交。參見GeneChipExpression Analysis-Technical Manual(第701021部分，第1修訂本，Affymetrix，Inc.1999-2001)，其整體內(nèi)容以引用的方式併入本文中。通過MAS 4算法由探針強度計算信號，且使用如實例中所述的尺度頻率歸一化法(scalefrequency normalization method)將信號強度轉(zhuǎn)化為頻率。
為鑒別與患者結(jié)果相關(guān)的PBMC中轉(zhuǎn)錄水平的特異性改變，使用考慮臨床結(jié)果量度的檢查效應(yīng)的Cox成比例危險回歸以將結(jié)果建立為Log2轉(zhuǎn)換的表達水平的函數(shù)(以ppm為單位)的模型。對已通過最初過濾標準的5,469個合格者中的每一個均執(zhí)行兩個臨床結(jié)果量度TTP和TTD的Cox回歸分析(整個資料集至少1個“存在”呼叫，及至少一個＞10ppm頻率的轉(zhuǎn)錄物；參見實例3)。在Cox成比例危險分析中，與各轉(zhuǎn)錄物相關(guān)的危險比率指示良好或非良好結(jié)果的似然性，其中小于1的危險比率指示增加協(xié)變量的水平的風(fēng)險較低且大于1的危險比率指示風(fēng)險較高。
對各轉(zhuǎn)錄物和結(jié)果量度來說，計算危險比率且計算假設(shè)危險比率等于1(亦即，無風(fēng)險)的Wald p值。就5個I型(亦即，假陽性)誤差水平，計算對各結(jié)果量度所執(zhí)行的5,469個檢驗中名義上顯著的檢驗的數(shù)目。為調(diào)整5,469個檢驗不獨立的事實，然后使用基于排列的方法評估所觀察到的顯著性檢驗的數(shù)目將在無風(fēng)險的零假設(shè)下出現(xiàn)的頻率。
Cox成比例危險回歸模型適于評定通過HG-U95AAffymetrix微陣列度量的基因表達水平與臨床結(jié)果之間的聯(lián)系。使用來自在基線、8周及16周樣品中通過最初過濾標準的5,469個合格者中的每一個的表達水平擬合模型(所有樣品至少1個“存在”呼叫及至少一個＞10ppm頻率的轉(zhuǎn)錄物)。就其與從基線成比例頻率之變化的聯(lián)系，檢驗兩個臨床量度TTD和TTP?；贚og2轉(zhuǎn)換的成比例頻率值計算從基線的變化，且計算基線后8周和16周的變化。
臨床結(jié)果與從基線表達水平的變化的比較結(jié)果，8周的變化概述于表2A和2B中，且16周的變化概述于表3A和3B中。臨床結(jié)果與從基線基因表達的變化之間的聯(lián)系的證據(jù)對16周的兩個結(jié)果變量來說更有力。
表2A.8周從基線Log2轉(zhuǎn)換的頻率變化的TTD臨床結(jié)果的Cox成比例危險回歸的排列結(jié)果(n＝30位患者) *就5,469個基因來說(通過“至少一個存在呼叫及至少一個頻率＞10ppm”過濾) 表2B.8周從基線Log2轉(zhuǎn)換的頻率變化的TTP臨床結(jié)果的Cox成比例危險回歸的排列結(jié)果(n＝30位患者) *就5,469個基因來說(通過“至少一個存在呼叫及至少一個頻率＞10ppm”過濾) 表3A.16周從基線Log2轉(zhuǎn)換的頻率變化的TTD臨床結(jié)果的Cox成比例危險回歸的排列結(jié)果(n＝22位患者) *就5,469個基因來說(通過“至少一個存在呼叫及至少一個頻率＞10ppm”過濾) 表3B.16周從基線Log2轉(zhuǎn)換的頻率變化的TTP臨床結(jié)果的Cox成比例危險回歸的排列結(jié)果(n＝22位患者) *就5,469個基因來說(通過“至少一個存在呼叫及至少一個頻率＞10ppm”過濾) 表4A和4B提供PBMC中的20個例示性基因，其具有就TTP來說各自與低風(fēng)險(危險比率＜1.0)或高風(fēng)險(危險比率＞1.0)相關(guān)的16周轉(zhuǎn)錄水平變化。表5A和5B列出PBMC中的20個例示性基因，其具有就TTD來說各自與低風(fēng)險(危險比率＜1.0)或高風(fēng)險(危險比率＞1.0)相關(guān)的16周轉(zhuǎn)錄水平變化。表6提供這些基因的注解。
表4A.展示與TTP顯著相關(guān)的16周變化的經(jīng)CCI-779治療的患者的RCCPBMC中的20個例示件基因 (16周時表達增加暗示進展的良好預(yù)后) 表4B.展示與TTP顯著相關(guān)的16周變化的經(jīng)CCI-779治療的患者的RCC PBMC中的20個例示性基因 (16周時表達增加暗示進展的不良預(yù)后) 表5A.展示與TTD顯著相關(guān)的16周變化的經(jīng)CCI-779治療的患者的RCC PBMC中的20個例示性基因 (16周時表達增加暗示生存的良好預(yù)后) 表5B.展示與TTD顯著相關(guān)的16周變化的經(jīng)CCI-779治療的患者的RCC PBMC中的20個例示性基因 (16周時表達增加暗示生存的不良預(yù)后) 表6.RCC預(yù)后性基因的注解 表4A、4B、5A和5B中的各合格者代表HG-U95A基因芯片上的寡核苷酸探針組合。通過合格者鑒別的基因的RNA轉(zhuǎn)錄物可在核酸陣列雜交條件下與合格者的至少一個寡核苷酸探針(PM或完美匹配探針)雜交。較佳地，基因的RNA轉(zhuǎn)錄物在核酸陣列雜交條件下不與PM探針的錯配探針(MM)雜交。除錯配探針中心處或附近的單一同數(shù)取代外，MM探針與相應(yīng)PM探針相同。對25-基體的PM探針來說，MM探針在第13個位置處具有同數(shù)堿基變化。
在許多情況下，通過合格者鑒別的基因的RNA轉(zhuǎn)錄物可在核酸陣列雜交條件下與這一合格者的PM探針的至少50％、60％、70％、80％、90％或100％雜交，但不與其相應(yīng)MM探針雜交。在許多其他情況下，如由相應(yīng)探針對的雜交強度差(亦即，PM-MM)與總雜交強度(亦即，PM+MM)的比率所度量，這些PM探針的每一個的差別計分(R)為至少0.015、0.02、0.05、、0.2、0.3、0.4、0.5或更高。又在許多其他情況下，通過合格者鑒別的基因的RNA轉(zhuǎn)錄物可在例如臨界值Tau為0.015且顯著性水平α1為0.4的基因芯片的默認設(shè)置值下產(chǎn)生“存在”呼叫。參見GeneChipExpression Analysis-DataAnalysis Fundamentals(第701190部分，第2修訂本，Affymetrix，Inc.2002)，其整體內(nèi)容以引用的方式併入本文中。
HG-U95A基因芯片上各PM探針的序列和從其得到PM探針的相應(yīng)靶序列可獲自Affymetrix序列資料庫。參見，例如www.affymetrix.com/support/technical/byproduct.affx？product＝hgu133。所有這些PM探針序列和其相應(yīng)靶序列均以引用的方式併入本文中。
表4A、4B、5A及5B中所列的各基因和相應(yīng)單一基因ID以及Entrez入藏登記號根據(jù)HG-U95A基因芯片注解確定。單一基因包含非冗余集合的定向基因簇。認為各單一基因簇包括代表單一基因的序列。表4A、4B、5A及5B中所列的基因的其他信息可基于相應(yīng)單一基因ID或Entrez入藏登記號獲自美國國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(NCBI)(Bethesda，MD)的Entrez資料庫。
由HG-U95A合格者鑒別的基因也可通過對人類基因組序列資料庫BLAST檢索合格者的靶序列來判定。適于此目的的人類基因組序列資料庫包括(但不限于)NCBI人類基因組資料庫。NCBI提供諸如“blastn”的BLAST程序用于檢索其序列資料庫。在一個實施例中，通過使用合格者的靶序列的明確片段(例如，最長明確片段)進行NCBI人類基因組資料庫的BLAST檢索。將由合格者代表的基因鑒別為那些與明確片段具有顯著序列一致性的基因。在許多情況下，所鑒別的基因與明確片段的序列一致性至少為95％、96％、97％、98％、99％或更高。
如本文所使用，表4A、4B、5A及5B中由合格者代表的基因不僅包括那些其中明確描述的基因，而且包括那些表格中未列出但能夠與表格中的合格者的PM探針雜交的基因。所有這些基因均可用作用于RCC或其他實體腫瘤的預(yù)后的生物標志。
上述分析使用Cox成比例危險回歸鑒別與臨床結(jié)果TTP和TTD的連續(xù)量度相關(guān)的RCC患者的PBMC中(從基線水平)8或16周的轉(zhuǎn)錄水平的變化。排列分析指示16周變化與臨床結(jié)果TTP和TTD之間存在顯著聯(lián)系，但8周PBMC轉(zhuǎn)錄變化與這些臨床結(jié)果之間存在不太顯著的聯(lián)系。
PBMC中的轉(zhuǎn)錄變化似乎“滯后”CCI-779暴露的發(fā)現(xiàn)受到極大關(guān)注，因為其支持以下理論CCI-779療法后PBMC中的轉(zhuǎn)錄改變反映外周血的循環(huán)細胞對腫瘤變化的反應(yīng)而非通過血液中的CCI-779指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄改變。這一理論解釋16周PBMC轉(zhuǎn)錄水平的變化與臨床結(jié)果更顯著地相關(guān)的觀察結(jié)果，因為實現(xiàn)血液中CCI-779的穩(wěn)態(tài)水平與PBMC對腫瘤變化的反應(yīng)之間會存在滯后。因此，可使用根據(jù)本發(fā)明鑒別的轉(zhuǎn)錄物作為藥物功效的早期藥物基因組學(xué)指標。應(yīng)注意，在大部分轉(zhuǎn)錄物中，其與16周的臨床結(jié)果的顯著聯(lián)系的方向與8周的一致，但顯著性低，此暗示8周PBMC中的轉(zhuǎn)錄模式與16周的顯示類似趨勢，但與所關(guān)注的臨床結(jié)果的顯著聯(lián)系與16周不同。
在顯示與疾病進展顯著負面相關(guān)的增加的轉(zhuǎn)錄物中(亦即，當(dāng)16周表達的增加值升高時，PBMC轉(zhuǎn)錄物與RCC患者中的越發(fā)更短的TTP相關(guān))，存在數(shù)個所關(guān)注的觀察結(jié)果。與跳躍易位斷點編碼的轉(zhuǎn)錄物同源的兩個獨立序列在具有更短TTP的患者的PBMC中增加。另外，20個與疾病進展負面相關(guān)的例示性轉(zhuǎn)錄物(表4B)中的三個編碼涉及真核翻譯開始和延伸的因子。這些真核翻譯相關(guān)因子的鑒別受到關(guān)注，因為歸因于CCI-779抑制mTOR通路，其最終抑制哺乳動物翻譯。
跳躍易位斷點蛋白JTB在具有快速進展時間的患者的PBMC分布中16周時急劇增加。正常蛋白編碼高度保守的膜轉(zhuǎn)運體蛋白，跳躍易位現(xiàn)象后，此產(chǎn)生缺乏跨膜域的截斷蛋白(Hatakeyama，等人，Oncogene，182085-2090(1999))。在20個16周時增加與快速疾病進展顯著相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物中，鑒別對應(yīng)于這一轉(zhuǎn)錄的兩個獨立合格者(表4B中的41833_at和41834_g_at)。這一發(fā)現(xiàn)暗示這些患者中的總?cè)旧w組不穩(wěn)定性可出現(xiàn)于PBMC的替代組織中，因為RCC患者的PBMC中所度量的表達水平未必反映源自在血液中循環(huán)的轉(zhuǎn)移性腎癌細胞的任何轉(zhuǎn)錄(Twine，等人，CANCER Res.，636069-6075(2003))。
就生存來說，在具有更短死亡時間的患者中，大量編碼核糖體蛋白的轉(zhuǎn)錄物增加。展示編碼核糖體蛋白的轉(zhuǎn)錄物的表達水平與數(shù)個研究中的淋巴細胞含量強烈相關(guān)(數(shù)據(jù)未展示)。因為淋巴細胞在具有較短TTP與較長TTP的患者之間無差異分布(數(shù)據(jù)未展示)，所以隱含療法約4個月后，循環(huán)淋巴細胞中的轉(zhuǎn)錄激活可能不良預(yù)示RCC患者的總生存。因此，可使用循環(huán)淋巴細胞反應(yīng)指示RCC患者中的不良預(yù)后。
預(yù)示其他時間相關(guān)臨床事件的基因也可使用與Cox成比例危險模型組合的探針陣列加以鑒別?？拱┲委熎陂g實體腫瘤患者的外周血細胞中的這些基因的表達水平的變化統(tǒng)計上與患者結(jié)果顯著相關(guān)。
III.RCC或其他實體腫瘤的預(yù)后 本發(fā)明的特征在于PBMC中的表達分布變化與實體腫瘤患者的臨床結(jié)果相關(guān)的預(yù)后性基因。這些預(yù)后性基因可用作RCC或其他實體腫瘤的預(yù)后的替代標志。其也可用作CCI-779或其他抗癌藥物的功效的藥物基因組學(xué)指標。
可通過本發(fā)明評定的臨床終點的實例包括(但不限于)死亡、疾病進展或其他時間相關(guān)事件。這些臨床終點的合適量度包括TTP、TTD或其他時間依賴性臨床量度。任何實體腫瘤或抗癌治療均可根據(jù)本發(fā)明加以評估。
一方面，所關(guān)注的患者的預(yù)后涉及以下步驟 檢測抗癌治療開始后所關(guān)注的患者的外周血細胞(例如，PBMC)中的一個或一個以上預(yù)后性基因的表達水平的變化；和 比較所檢測的變化與參考變化。
抗癌治療開始后，預(yù)后性基因各具有改變的表達水平，且罹患相同實體腫瘤且接受與所關(guān)注的患者相同的治療的患者的PBMC中的這一改變的量值與這些患者的臨床結(jié)果相關(guān)。因此，在所關(guān)注的患者中檢測到的變化預(yù)示患者的臨床結(jié)果。
所關(guān)注的患者的基因表達變化可從任何參考點起度量，且在適當(dāng)相關(guān)模型(例如，Cox模型或諸如最近鄰體分析的基于等級的相關(guān)性量度)下，罹患相同實體腫瘤的患者中從某點起度量的表達水平的變化與這些患者的臨床結(jié)果相關(guān)。在許多實施例中，所關(guān)注的患者的預(yù)后性基因的表達水平的變化通過度量抗癌治療開始后特定時間所關(guān)注的患者的外周血中基因表達水平與預(yù)后性基因的基線表達水平之間的改變來判定。
可選擇確定所關(guān)注的患者的基因表達變化所使用的特定時間以使此段時間所度量的變化與患者結(jié)果之間在排列分析下存在顯著相關(guān)性。排列分析評估所觀察到的顯著性檢驗的數(shù)目將在無風(fēng)險的零假設(shè)下出現(xiàn)的頻率。在一實例中，選擇特定時間以使預(yù)定α置信水平(例如，0.05、0.01、0.005或更低)下名義上顯著相關(guān)的數(shù)目等于或超過所觀察到數(shù)目的排列百分率低于10％、5％、1％、0.5％或更低。在一非限定性實例中，特定時間為抗癌治療開始后至少16周。也可使用抗癌治療開始后小于16周的時間，諸如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周。
在許多實施例中，所關(guān)注的患者的預(yù)后所使用的參考變化為參考患者的基因表達變化。參考患者罹患相同實體腫瘤且接受與所關(guān)注的患者相同的抗癌治療。參考患者也可為Cox成比例危險模型或另一相關(guān)模型所使用的“虛擬”患者。參考變化可使用與所關(guān)注的患者的相同或相當(dāng)?shù)姆椒▉泶_定。所關(guān)注的患者的變化與參考變化之間的差值暗示所關(guān)注的患者與參考患者相比的相對預(yù)后。參考變化和所關(guān)注的患者的變化可同時或相繼確定。
在一個實施例中，所關(guān)注的患者與參考患者均罹患RCC且這兩種患者接受相同抗癌治療(例如，CCI-779療法)。所關(guān)注的患者和參考患者的基因表達的變化通過度量治療開始后特定時間(例如，16周)各患者的外周血細胞中的一個或一個以上預(yù)后性基因的表達水平與預(yù)后性基因的基線表達水平之間的改變來確定。在Cox成比例危險模型下，接受相同抗癌治療的RCC患者的PBMC中的這些改變的量值與這些患者的臨床結(jié)果相關(guān)。
當(dāng)預(yù)后性基因具有大于1的危險比率時，與參考患者相比所關(guān)注的患者的外周血細胞中較高的基因表達水平變化指示與參考患者相比所關(guān)注的患者的較差預(yù)后。相反地，與參考患者相比，所關(guān)注的患者的較小變化指示所關(guān)注的患者的較佳預(yù)后。
當(dāng)預(yù)后性基因具有小于1的危險比率時，與參考患者相比所關(guān)注的患者的外周血細胞中較高的基因表達水平變化指示所關(guān)注的患者的較佳預(yù)后。相反地，所關(guān)注的患者的較小變化指示所關(guān)注的患者的較差預(yù)后。
適于此目的的預(yù)后性基因包括(但不限于)表4A、4B、5A及5B中所描繪的那些基因。選自表4A和4B中的基因可用于評定所關(guān)注的患者的相對TTP，而選自表5A和5B中的基因可用于評估所關(guān)注的患者的相對TTD。
也可使用其他預(yù)后性基因。在許多實施例中，本發(fā)明中所使用的各預(yù)后性基因展示抗癌治療(例如，CCI-779療法)開始后RCC患者的PBMC中表達水平的變化與這些患者的臨床結(jié)果之間的統(tǒng)計上顯著的相關(guān)性。在許多情況下，這一相關(guān)性的p值為至多0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001或更低。預(yù)后性基因的危險比率可為至多0.5、0.33、0.25、0.2、0.1或更低。危險比率也可為至少2、3、4、5、10或更高。
在許多實施例中，所關(guān)注的患者的預(yù)后所使用的參考變化具有經(jīng)驗上或?qū)嶒炆洗_定的值。如果所關(guān)注的患者的表達水平變化大于或小于經(jīng)驗上或?qū)嶒炆洗_定的值，那么視所關(guān)注的患者具有不良或良好預(yù)后。舉例來說，當(dāng)預(yù)后性基因具有小于1(或大于1)的危險比率時，所關(guān)注的患者的外周血細胞中基因的表達水平從基線的變化超過經(jīng)驗上確定的值的觀察結(jié)果預(yù)示所關(guān)注的患者的良好(或不良)預(yù)后。
在一個實施例中，經(jīng)驗上或?qū)嶒炆洗_定的值代表抗癌治療開始后特定時間參考患者的外周血細胞(例如，PBMC)中預(yù)后性基因的表達水平與基線表達水平之間的平均變化。用于此目的的合適平均法包括(但不限于)算術(shù)平均、調(diào)和平均、絕對值平均、log轉(zhuǎn)換值平均或加權(quán)平均。參考患者罹患相同實體腫瘤且接受與所關(guān)注的患者相同的治療。在許多情況下，參考患者包含具有類似預(yù)后(例如，良好、中等或不良預(yù)后)的患者。
本發(fā)明的特征在于使用單變量或多變量Cox模型以用于所關(guān)注的患者的預(yù)后。單變量Cox分析(例如，等式(5))提供一個預(yù)測因子一個單位變化的時間相關(guān)事件(例如，死亡或疾病進展)的相對風(fēng)險。在許多實施例中，預(yù)測因子代表抗癌治療開始后實體腫瘤患者的外周血細胞中預(yù)后性基因的表達水平的變化。如上所述，可選擇將所關(guān)注的患者劃分到處于臨界值的不同預(yù)后群組中，其中具有臨界值以上的表達水平變化的患者具有較高風(fēng)險，且具有臨界值以下的表達水平變化的患者具有較低風(fēng)險，或反之亦然，視基因是不良(RR＞1)還是良好(RR＜1)預(yù)后的指標而定。另外，模型擬合可提供基線危險H0(t)或系數(shù)β的估計，從而能夠更定量地評定所關(guān)注的患者的臨床結(jié)果。由單變量Cox分析鑒別的預(yù)后性基因可個別或組合用于所關(guān)注的患者的預(yù)后。
在多變量Cox模型(例如，等式(1))中，可使用線性預(yù)測因子PI作為所關(guān)注的患者預(yù)后的風(fēng)險指數(shù)。在許多情況下，多變量Cox模型可通過將各個別基因逐步輸入模型中來建立，其中所輸入的第一基因係預(yù)選自那些具有顯著單變量p值的基因，且選擇用于在各隨后步驟輸入模型中的基因為最佳改進模型對資料的擬合的基因。
可用訓(xùn)練集(training set)計算風(fēng)險指數(shù)值的分布從而確定適當(dāng)?shù)母铧c來區(qū)分高風(fēng)險和低風(fēng)險。可檢查割點的連續(xù)統(tǒng)。使用風(fēng)險指數(shù)函數(shù)和訓(xùn)練集中所估計的高/低風(fēng)險割點，可計算各檢驗實例的風(fēng)險指數(shù)值且用于將所關(guān)注的患者指定為高或低風(fēng)險群組。
在許多實施例中，預(yù)測所關(guān)注的患者的臨床結(jié)果的精度(亦即，正確呼叫與正確和不正確呼叫的總和的比率)為至少50％、60％、70％、80％、90％或更高。臨床結(jié)果預(yù)測的效力也可通過靈敏性和特異性度量。在許多實施例中，本發(fā)明中所使用的預(yù)后性基因的靈敏性和特異性為至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。此外，基于外周血的預(yù)后可與其他臨床證據(jù)組合以提高最終臨床結(jié)果預(yù)測的精度。
可使用多種血樣類型確定所關(guān)注的患者或參考患者的基因表達變化。適于此目的血樣的實例包括(但不限于)全血樣品或包含高濃度PBMC的樣品。也可使用其他血樣，且患者結(jié)果與這些血樣的基因表達變化之間存在統(tǒng)計上顯著的相關(guān)性。
大量方法可用于檢測所關(guān)注的血樣中的基因表達水平。舉例來說，基因的表達水平可通過度量基因的RNA轉(zhuǎn)錄的水平來確定。出于此目的的合適方法包括(但不限于)定量RT-PCT、RNA印跡法(Northern Blot)、原位雜交、狹縫印跡(slot-blotting)、核酸酶保護分析或核酸陣列(包括微珠陣列)。基因的表達水平也可通過度量基因所編碼的多肽的水平來確定。出于此目的的合適方法包括(但不限于)免疫分析(諸如ELISA、RIA、FACS或蛋白印跡(Western Blot))、雙向凝膠電泳(2-dimensional gelelectrophoresis)、質(zhì)譜或蛋白質(zhì)陣列。
一方面，通過度量外周血樣中基因的RNA轉(zhuǎn)錄水平來確定預(yù)后性基因的表達水平?？墒褂枚喾N方法將RNA從外周血樣中分離。例示性方法包括異硫氰酸胍/酸酚法、TRIZOLReagent(Invitrogen)或Micro-FastTrackTM 2.0或FastTrackTM 2.0mRNAIsolation Kits(Invitrogen)。所分離的RNA可為總RNA或mRNA。所分離的RNA可擴增到cDNA或cRNA，隨后檢測或定量。擴增可為特異性的或非特異性的。合適的擴增方法包括(但不限于)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)、等溫擴增、連接酶鏈反應(yīng)及Qβ復(fù)制酶。
在一個實施例中，擴增方案使用逆轉(zhuǎn)錄酶?？墒褂媚孓D(zhuǎn)錄酶及由寡聚d(T)和編碼噬菌體T7啟動子的序列組成的引物將所分離的mRNA逆向轉(zhuǎn)錄為cDNA。所產(chǎn)生之cDNA為單鏈。使用與分解DNA/RNA雜合體的核糖核酸酶(RNase)組合的DNA聚合酶合成cDNA的第二條鏈。雙鏈cDNA合成后，添加T7RNA聚合酶且然后從雙鏈cDNA的第二條鏈轉(zhuǎn)錄cRNA?？赏ㄟ^與經(jīng)標記的探針雜交檢測或定量擴增的cDNA或cRNA。擴增過程期間也可標記cDNA或cRNA且然后檢測或定量。
在另一實施例中，可使用定量RT-PCR(諸如TaqMan，ABI)檢測或比較所關(guān)注的預(yù)后性基因的RNA轉(zhuǎn)錄水平。定量RT-PCR涉及將RNA逆轉(zhuǎn)錄(RT)為cDNA，接著相對定量PCR(RT-PCR)。
在PCR中，擴增的靶DNA的分子數(shù)目每個反應(yīng)周期增加近兩倍直到某試劑變得有限。此后，擴增速率變得逐漸減弱直到周期之間不存在擴增靶的增加。如果以周期數(shù)為X軸且擴增靶DNA的濃度log為Y軸作曲線圖，那么通過連接作圖點可形成具有特征形態(tài)的曲線。從第一周期起，線的斜率為正且為恒定的。此稱為曲線的線性部分。某試劑變得有限后，線的斜率開始減小且最終變?yōu)?。此時，擴增靶DNA的濃度變得漸近某一固定值。此稱為曲線的平坦部分。
PCR的線性部分中靶DNA的濃度與PCR開始之前靶的起始濃度成比例。通過測定已完成相同周期數(shù)且處于線性范圍內(nèi)的PCR反應(yīng)中的靶DNA的PCR產(chǎn)物的濃度，有可能確定原始DNA混合物中特異性靶序列的相對濃度。如果DNA混合物為由從不同組織或細胞分離RNA所合成的cDNA，那么可測定各組織或細胞的從其得到靶序列的特異性mRNA的相對豐度。在PCR反應(yīng)的線性范圍部分，PCR產(chǎn)物的濃度與相對mRNA豐度之間確實成正比例關(guān)系。
曲線平坦部分中靶DNA的最終濃度通過反應(yīng)混合物中可用的試劑來確定且與靶DNA的原始濃度無關(guān)。因此，在一個實施例中，當(dāng)PCR反應(yīng)處于其曲線的線性部分時，進行擴增PCR產(chǎn)物的取樣及定量。另外，可使可擴增的cDNA的相對濃度歸一化為某可基于內(nèi)部存在的RNA物質(zhì)或外部引入的RNA物質(zhì)的獨立標準物。特定mRNA物質(zhì)的豐度亦可相對于樣品中所有mRNA物質(zhì)的平均豐度確定。
在一個實施例中，PCR擴增利用大致與靶一樣豐富的PCR內(nèi)標物。如果在PCR擴增的線性階段期間取樣其產(chǎn)物，那么這一策略有效。如果當(dāng)反應(yīng)接近平坦階段時，取樣產(chǎn)物，那么不太豐富的產(chǎn)物可能變得相對過量。許多不同RNA樣品的相對豐度的比較以使所呈現(xiàn)的RNA的相對豐度的差值小于實際上的差值的方式變得不正常，當(dāng)就差異表達檢查RNA樣品時通常就是這樣。如果內(nèi)標物比靶豐富得多，那么此可改進。如果內(nèi)標物比靶豐富，那么可進行RNA樣品之間的直接線性比較。
臨床樣品的固有問題在于其具有可變的數(shù)量或質(zhì)量。如果用內(nèi)標物執(zhí)行相對定量RT-PCR，那么這一問題可得以克服，其中內(nèi)標物為比靶cDNA片段大的可擴增的cDNA片段且其中編碼內(nèi)標物的mRNA的豐度比編碼靶的mRNA高約5-100部。這一分析度量相對豐度，而不是各自mRNA物質(zhì)的絕對豐度。
在另一實施例中，相對定量RT-PCR使用外標物方案。在這一方案中，在PCR產(chǎn)物擴增曲線的線性部分取樣PCR產(chǎn)物。各靶cDNA片段的取樣最佳PCR周期數(shù)可憑經(jīng)驗確定。另外，從各種樣品分離的各RNA群的逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)物可歸一化為等濃度的可擴增cDNA。雖然經(jīng)驗確定cDNA制劑的擴增曲線和歸一化的線性范圍是冗長且耗時的過程，但在某些情況下，所得RT-PCR分析可能優(yōu)于那些源自用內(nèi)標物相對定量RT-PCR的分析。
在又一實施例中，可使用核酸陣列(包括微珠陣列)檢測或比較所關(guān)注的預(yù)后性基因的表達分布。核酸陣列可為商業(yè)寡核苷酸或cDNA陣列。其也可為包含用于本發(fā)明的預(yù)后性基因的濃探針的定制陣列。在許多實例中，本發(fā)明的定制陣列上至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的總探針為用于RCC或其他實體腫瘤預(yù)后性基因的探針。這些探針可在嚴格或核酸陣列雜交條件下與相應(yīng)預(yù)后性基因的RNA轉(zhuǎn)錄物或其補體雜交。
如本文所使用，“嚴格條件”至少與(例如)表6中所展示的條件G-L一樣嚴格?！案叨葒栏駰l件”至少與表6中所展示的條件A-F一樣嚴格。雜交在雜交條件(雜交溫度和緩沖液)下進行約4小時，接著在相應(yīng)洗滌條件(洗滌溫度和緩沖液)下進行兩次20分鐘的洗滌。
表6.嚴格條件 1雜合體長度為雜交聚核苷酸的雜交區(qū)所預(yù)期的長度。當(dāng)將聚核苷酸與未知序列的靶聚核苷酸雜交時，假定雜合體長度為雜交聚核苷酸的長度。當(dāng)雜交已知序列的聚核苷酸時，雜合體長度可通過比對聚核苷酸的序列且鑒別具有最佳序列互補性的區(qū)加以確定。
H雜交和洗滌緩沖液中，可用SSPE(1×SSPE為0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA(pH 7.4))代替SSC(1×SSC為0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)。
TB*-TR*預(yù)期長度小于50個堿基對的雜交的雜交溫度應(yīng)小于雜合體的熔融溫度(Tm)5-10℃，其中Tm根據(jù)以下等式確定。對長度小于18個堿基對的雜合體來說，Tm(℃)＝2(A+T堿基的#)+4(G+C堿基的#)。對長度在18個與49個堿基對之間的雜合體來說，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+]+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N為雜合體中堿基的數(shù)目，且[Na+]為雜交緩沖液中鈉離子的摩爾濃度(1×SSC的[Na+]＝0.165M)。
在一實例中，本發(fā)明的核酸陣列包括至少2、5、10或更多個不同探針。這些探針中的每一個均能夠在嚴格或核酸陣列雜交條件下與本發(fā)明的各個不同預(yù)后性基因(例如，選自表4A、4B、5A和5B的基因)雜交?？墒褂孟嗤A(yù)后性基因的多個探針。核酸陣列的探針密度可在任何范圍內(nèi)。
本發(fā)明的預(yù)后性基因的探針可為DNA、RNA、PNA或其經(jīng)修飾形式。各探針中的核苷酸殘基可為天然存在的殘基(諸如脫氧腺苷酸、脫氧胞苷酸、脫氧鳥苷酸、脫氧胸苷酸、腺苷酸、胞苷酸、鳥苷酸及尿苷酸)或能夠形成想要的堿基對關(guān)系的合成產(chǎn)生的類似物。這些類似物的實例包括(但不限于)氮和去氮嘧啶類似物、氮和去氮嘌呤類似物和其他雜環(huán)堿基類似物，其中嘌呤和嘧啶環(huán)的一個或一個以上碳和氮原子經(jīng)諸如氧、硫、硒及磷的雜原子取代。類似地，探針的聚核苷酸主鏈可為天然存在的(諸如通過5′到3′的鍵)或經(jīng)修飾的。舉例來說，核苷酸單元可經(jīng)由諸如5′到2′的鍵的非典型鍵連接，只要鍵不干擾雜交。另一實例，可使用肽核酸，其中構(gòu)成堿基通過肽鍵而非磷酸二酯鍵結(jié)合。
預(yù)后性基因的探針可與核酸陣列上的離散區(qū)穩(wěn)定連接?！胺€(wěn)定連接”意謂雜交和信號檢測期間探針相對于所連接的離散區(qū)保持其位置。核酸陣列上各離散區(qū)的位置可為已知的或可測定的?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域中已知的任何方法制造本發(fā)明的核酸陣列。
在另一實施例中，可使用核酸酶保護分析定量外周血樣中的RNA轉(zhuǎn)錄水平。存在許多不同版本的核酸酶保護分析。這些核酸酶保護分析的共同特征在于其涉及使反義核酸與待定量的RNA雜交。然后用分解單鏈核酸比分解雙鏈分子更有效的核酸酶分解所得的雜交雙鏈分子。分解生存的反義核酸的量為待定量的靶RNA物質(zhì)的量的量度。合適核酸酶保護分析的實例包括由Ambion，Inc.(Austin，Texas)提供的核糖核酸酶保護分析。
本發(fā)明的預(yù)后性基因的雜交探針或擴增引物可通過使用所屬領(lǐng)域中已知的任何方法制備。對染色體組位置尚未確定或一致性僅基于EST或mRNA資料的預(yù)后性基因來說，這些基因的探針/引物可源自相應(yīng)合格者的靶序列或相應(yīng)EST或mRNA序列。
在一個實施例中，預(yù)后性基因的探針/引物顯著偏離其他預(yù)后性基因的序列。此可通過對照諸如NCBI的Entrez資料庫的人類基因組序列資料庫檢查潛在探針/引物序列來實現(xiàn)。適于此目的的一種算法為BLAST算法。這一算法涉及首先通過在詢問序列中鑒別長度W的短字來確定高計分序列對(HSP)，當(dāng)短字與資料庫序列中的相同長度的字比對時，匹配或符合某個正值臨界值計分T。T稱作鄰近字計分臨界值。最初鄰近字匹配充當(dāng)引發(fā)尋找含有其的更長HSP的檢索的開端。然后沿各序列雙向延伸字匹配以增加累積比對計分。對核苷酸序列使用參數(shù)M(一對匹配殘基獲得計分；總＞0)和N(錯配殘基處罰計分；總＜0)計算累積計分。BLAST算法參數(shù)W、T及X確定比對的靈敏性和速度。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解，這些參數(shù)可隨不同目的而調(diào)整。
另一方面，通過度量預(yù)后性基因所編碼的多肽的水平確定本發(fā)明的預(yù)后性基因的表達水平。適于此目的的方法包括(但不限適于)免疫分析(諸如ELISA、RIA、FACS、點印跡、蛋白印跡)、免疫組織化學(xué)及基于抗體的放射成像。另外，可使用高產(chǎn)量蛋白定序、雙向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、質(zhì)譜或蛋白陣列。
在一個實施例中，使用ELISA檢測靶蛋白的水平。在例示性ELISA中，將能夠與靶蛋白結(jié)合的抗體固定在所選擇的展示蛋白親和性的表面上，諸如聚苯乙烯或聚氯乙烯微量滴定板的孔。然后，將待測試的樣品添加到孔中。結(jié)合且洗滌以移除非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合體后，可檢測所結(jié)合的抗原。檢測可通過添加對靶蛋白具有特異性且與可檢測標記聯(lián)結(jié)的第二抗體實現(xiàn)。檢測也可通過添加第二抗體，接著添加對第二抗體具有結(jié)合親和性的第三抗體實現(xiàn)，其中第三抗體與可檢測標記聯(lián)結(jié)。在樣品中的細胞添加到微量滴定板之前，可將其溶解或萃取以從潛在性干擾物質(zhì)中分離靶蛋白。
在另一例示性ELISA中，將懷疑含有靶蛋白的樣品固定于孔表面上且然后與抗體接觸。結(jié)合且洗滌以移除非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合體后，檢測所結(jié)合的抗原。當(dāng)最初抗體與可檢測標記聯(lián)結(jié)時，可直接檢測免疫復(fù)合體。也可使用對第一抗體具有結(jié)合親和性的第二抗體檢測免疫復(fù)合體，其中第二抗體與可檢測標記聯(lián)結(jié)。
另一例示性ELISA涉及在檢測中使用抗體競爭。在這一ELISA中，將靶蛋白固定在孔表面。將經(jīng)標記的抗體添加到孔中，使其與靶蛋白結(jié)合且借助于其標記檢測。然后，通過在與涂布孔一起培養(yǎng)之前或期間將樣品與標記抗體混合測定未知樣品中靶蛋白的量。未知樣品中的靶蛋白的存在作用于減少可與孔結(jié)合獲得的抗體的量，且從而降低最終信號。
不同ELISA格式可具有某些共同特征，諸如涂布、培養(yǎng)或結(jié)合、洗滌以移除非特異性結(jié)合的物質(zhì)和檢測所結(jié)合的免疫復(fù)合體。舉例來說，在用抗原或抗體涂布板期間，可將板的孔與抗原或抗體溶液一起培養(yǎng)整夜或數(shù)小時的特定時間。然后，洗滌板的孔以移除不完全吸附的物質(zhì)。然后，用對測試樣品來說為抗原性中性的非特異性蛋白“涂布”孔的任何剩余可用表面。這些非特異性蛋白的實例包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白及奶粉溶液。涂布可阻斷固定表面上的非特異性吸附部位且因此降低由表面上抗血清的非特異性結(jié)合引起的本底(background)。
在ELISA中，可使用第二或第三檢測方法。在蛋白或抗體與孔結(jié)合，用非反應(yīng)性物質(zhì)涂布以降低本底，以及洗滌以移除未結(jié)合的物質(zhì)后，使固定表面與待測試的對照或臨床或生物樣品在有效允許免疫復(fù)合體(抗原/抗體)形成的條件下接觸。這些條件可包括(例如)用諸如BSA、牛γ球蛋自(BGG)及磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)/Tween的溶液稀釋抗原和抗體，以及在室溫下將抗體和抗原培養(yǎng)約1到4小時或在4℃培養(yǎng)整夜。通過使用經(jīng)標記的第二結(jié)合配位體或抗體或第二結(jié)合配位體或抗體與經(jīng)標記的第三抗體或第三結(jié)合配位體的組合使得免疫復(fù)合體的檢測變得方便。
緊跟著ELISA中所有培養(yǎng)步驟，可洗滌接觸表面以移除非復(fù)合的物質(zhì)。舉例來說，可用諸如PBS/Tween或硼酸酯緩沖液的溶液洗滌表面。測試樣品與最初結(jié)合的物質(zhì)之間形成特異性免疫復(fù)合體且隨后洗滌后，可測定存在的免疫復(fù)合體的量。
為提供檢測方法，第二或第三抗體可具有相關(guān)標記以允許檢測。在一個實施例中，標記為與適當(dāng)發(fā)色底物一起培養(yǎng)后產(chǎn)生顯色的酶。因此，例如，使第一或第二免疫復(fù)合體與尿素酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶或過氧化氫酶結(jié)合的抗體接觸且將兩者可在有利于進一步形成免疫復(fù)合體的條件下一起培養(yǎng)一段時間(例如，在室溫下在諸如PBS-Tween的含PBS的溶液中培養(yǎng)2小時)。
在與經(jīng)標記的抗體一起培養(yǎng)且隨后洗滌以移除未結(jié)合的物質(zhì)后，可(例如)通過與諸如尿素和溴甲酚紫或2，2′-疊氮基-二-(3-乙基)-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和H2O2(在過氧化酶的情況下，作為酶標記)的發(fā)色底物一起培養(yǎng)來定量標記的量?？赏ㄟ^(例如)使用分光光度計度量所產(chǎn)生的色度實現(xiàn)定量。
適于檢測多肽水平的另一方法為RIA(放射免疫分析)。例示性RIA基于經(jīng)放射性標記的多肽與未標記的多肽之間與有限數(shù)量的抗體結(jié)合的競爭。合適的放射性標記包括(但不限于)I125。在一個實施例中，將固定濃度的經(jīng)I125標記的多肽與一系列對多肽具有特異性的抗體的稀釋液一起培養(yǎng)。當(dāng)將未標記的多肽添加到系統(tǒng)中時，與抗體結(jié)合的I125多肽的量減少。因此，可構(gòu)造標準曲線以代表隨未標記的多肽的濃度變化的抗體結(jié)合的I125多肽的量。由這一標準曲線，可確定未知樣品中多肽的濃度。執(zhí)行RIA的方案在所屬領(lǐng)域中為熟知的。
本發(fā)明的合適抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人化抗體、單鏈抗體、Fab片段或通過Fab表達庫產(chǎn)生的片段。也可使用中和抗體(亦即，那些抑制二聚體形成的抗體)。制備這些抗體的方法在所屬領(lǐng)域中為熟知的。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體可與相應(yīng)預(yù)后性基因產(chǎn)物或其他想要的抗原以至少104M-1、105M-1、106M-1、107M-1或更高的結(jié)合親和性結(jié)合。
本發(fā)明的抗體可用一個或一個以上可檢測部分標記以允許檢測抗體-抗原復(fù)合體?？蓹z測部分可包括可通過光譜法、酶法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、生物電子法、免疫化學(xué)法、電法、光學(xué)法或化學(xué)法檢測的組合物。可檢測部分包括(但不限于)放射性同位素、化學(xué)發(fā)光化合物、經(jīng)標記的結(jié)合蛋白、重金屬原子、諸如熒光標記以及染料的光譜標記、磁標記、聯(lián)結(jié)酶、質(zhì)譜標記、自旋標記、電子轉(zhuǎn)移供體和受體等等。
本發(fā)明的抗體可用作構(gòu)造檢測預(yù)后性基因的表達分布的蛋白陣列的探針。制造蛋白陣列或生物芯片的方法在所屬領(lǐng)域中為熟知的。在許多實施例中，本發(fā)明的蛋白陣列上的探針的本質(zhì)部分為對預(yù)后性基因產(chǎn)物具有特異性的抗體。舉例來說，蛋白陣列上的至少10％、20％、30％、40％、50％或更多探針可為對預(yù)后性基因產(chǎn)物具有特異性的抗體。
又一方面，通過度量這些基因的生物功能或活性來確定預(yù)后性基因的表達水平。當(dāng)已知預(yù)后性基因的生物功能或活性時，可開展合適的活體外或活體內(nèi)分析來評估這一功能或活性。接著，可使用這些分析來評定預(yù)后性基因的表達水平。
本發(fā)明中所使用的基因表達水平可為絕對水平、歸一化水平或相對水平。合適的歸一化進程包括(但不限于)那些常規(guī)核酸陣列分析中所使用的進程或那些由Hill等人在Genome Biol，2research0055.1-0055.13(2001)中所述的進程。在一實例中，使表達水平歸一化以致平均值為0且標準偏差為1。在另一實例中，使表達水平基于內(nèi)部或外部對照歸一化。在又一實例中，使表達水平相對于一個或一個以上在血樣中具有已知豐度的對照轉(zhuǎn)錄物歸一化。在許多實施例中，使用相同或相當(dāng)?shù)姆椒▽W(xué)確定用于評定所關(guān)注的患者和參考患者的基因表達變化的表達水平。
本發(fā)明的特征也在于適用于RCC或其他實體腫瘤的預(yù)后的電子系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包括用于接收或計算所關(guān)注的實體腫瘤患者的基因表達變化和參考表達變化的輸入或計算裝置。參考表達變化也可存儲在資料庫或另一媒體中，且可通過本發(fā)明的電子系統(tǒng)取回。所關(guān)注的患者的基因表達變化與參考表達變化之間的比較可諸如通過處理器或計算機來電子化執(zhí)行。在許多實施例中，系統(tǒng)也包括或能夠從另一資源(例如，互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器)下載的一個或一個以上程序，諸如Cox模型、k-最近鄰體分析或加權(quán)投票算法。這些程序可用于比較所關(guān)注的患者的基因表達變化與參考變化，或用于使實體腫瘤患者的基因表達變化與這些患者的臨床結(jié)果相關(guān)。在一實例中，本發(fā)明的電子系統(tǒng)耦連于核酸陣列以接收或處理由陣列所產(chǎn)生的表達資料。
又一方面，本發(fā)明提供適用于RCC或其他實體腫瘤的預(yù)后的試劑盒。各試劑盒包括至少一個用于RCC或?qū)嶓w腫瘤預(yù)后性基因(例如，選自表4A、4B、5A或5B的基因)的探針或大體上由其組成。也可包括有助于試劑盒使用的試劑或緩沖液。本發(fā)明中可使用任何類型的探針，諸如雜交探針、擴增引物、抗體或其他高親和性結(jié)合劑。
在一個實施例中，本發(fā)明的試劑盒包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個聚核苷酸探針或引物或大體上由其組成?？墒垢魈结?引物在嚴格或核酸陣列雜交條件下與不同實體腫瘤預(yù)后性基因(諸如選自表4A、4B、5A或5B的那些基因)雜交。如本文所使用，如果聚核苷酸可與基因的RNA轉(zhuǎn)錄物或其補體雜交，那么聚核苷酸可與基因雜交。
在另一實施例中，本發(fā)明的試劑盒包括一個或一個以上抗體或大體上由其組成，其中各抗體均能夠與由不同實體腫瘤預(yù)后性基因(諸如，那些選自表4A、4B、5A或5B的基因)編碼的多肽結(jié)合。
本發(fā)明中所使用的探針可經(jīng)標記或未標記。經(jīng)標記的探針可通過光譜法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、生物電子法、免疫化學(xué)法、電法、光學(xué)法、化學(xué)法或其他合適方法檢測。用于探針的例示性標記部分包括放射性同位素、化學(xué)發(fā)光化合物、經(jīng)標記的結(jié)合蛋白、重金屬原子、諸如熒光標記以及染料的光譜標記、磁標記、聯(lián)結(jié)酶、質(zhì)譜標記、自旋標記、電子轉(zhuǎn)移供體和受體等。
本發(fā)明的試劑盒也可具有含有緩沖液或報導(dǎo)基因構(gòu)件的容器。另外，試劑盒可包括執(zhí)行陽性或陰性對照的試劑。在一個實施例中，本發(fā)明中所使用的探針穩(wěn)定地與一個或一個以上底物支撐物連接。核酸雜交或免疫分析可直接在底物支撐物上進行。出于此目的的合適底物支撐物包括(但不限于)玻璃、二氧化硅、陶瓷、尼龍、石英晶片、凝膠、金屬、紙、微珠、管、纖維、膠片、膜、管柱基質(zhì)或微量滴定板孔。在許多實施例中，本發(fā)明的試劑盒中至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多的總探針為用于實體腫瘤預(yù)后性基因的探針。
另一方面，本發(fā)明的特征在于使用羅吉斯回歸、ANOVA(方差分析)、ANCOVA(協(xié)方差分析)、MANOVA(方差多重分析)或其他用于所關(guān)注的患者的實體腫瘤的預(yù)后的相關(guān)法或統(tǒng)計法。這些方法包含 檢測抗癌治療期間特定時間所關(guān)注的患者的外周血細胞中至少一個實體腫瘤預(yù)后性基因的表達水平；和 將表達水平輸入相關(guān)模型或統(tǒng)計模型中以確定所關(guān)注的患者的預(yù)后。
相關(guān)模型或統(tǒng)計模型定義罹患相同實體腫瘤且接受與所關(guān)注的患者相同的治療的患者的PBMC中實體腫瘤預(yù)后性基因的表達水平與這些患者的臨床結(jié)果之間的統(tǒng)計上顯著的相關(guān)性。在許多實例中，相關(guān)模型或統(tǒng)計模型能夠產(chǎn)生所關(guān)注的患者的臨床結(jié)果的定性預(yù)測(例如，良好或不良預(yù)后)。適合此目的的統(tǒng)計模型或分析包括(但不限于)羅吉斯回歸或基于等級的相關(guān)性量度。在許多其他實例中，相關(guān)模型或統(tǒng)計模型能夠產(chǎn)生所關(guān)注的患者的臨床結(jié)果的定量預(yù)測(例如，估計TTD或TTP)。適于這一目的的統(tǒng)計模型或分析包括(但不限于)多種回歸、ANOVA或ANCOVA模型。
用于建立相關(guān)模型/統(tǒng)計模型或預(yù)測所關(guān)注的患者的表達水平可為從基線或從相應(yīng)患者治療開始后另一特定參考時間點起度量的相對表達水平。也可使用絕對表達水平建立相關(guān)模型/統(tǒng)計模型或預(yù)測所關(guān)注的患者。在后一種情況中，可使用基線或另一特定參考時間的表達水平作為預(yù)測模型中的協(xié)變量。
IV.抗癌治療功效的評估 本發(fā)明允許個性化治療RCC或其他實體腫瘤。可在抗癌治療期間預(yù)測所關(guān)注的患者。良好的預(yù)后指示治療可繼續(xù)，而不良預(yù)后暗示治療可停止且應(yīng)使用不同方法治療患者。這一分析幫助患者避免不必要的不利反應(yīng)。此也提供改進的安全性和增加的治療效益/風(fēng)險比。
在一個實施例中，在CCI-779療法期間預(yù)測所關(guān)注的RCC患者。適于此目的的預(yù)后性基因包括(但不限于)表4A、4B、5A及5B中所描繪的那些基因。所關(guān)注的患者的外周血細胞中這些預(yù)后性基因的表達水平的變化可通過使用RT-PCR、ELISA、核酸陣列、蛋白陣列、蛋白質(zhì)功能分析或其他合適方法確定。將這些變化與參考變化比較以確定所關(guān)注的患者的預(yù)后。良好預(yù)后指示CCI-779治療適用于所關(guān)注的RCC患者。
任何類型的抗癌治療均可由本發(fā)明評估。在一個非限定性實例中，抗癌治療為藥物療法?？拱┧幬锏膶嵗?但不限于)細胞激素，諸如干擾素或介白素2；和化學(xué)療法藥物，諸如CCI-779、AN-238、長春堿(vinblastine)、氟尿苷(floxuridine)、5-氟尿嘧啶或他莫昔芬(tamoxifen)。AN238為具有與生長抑素(SST)載劑八肽連接的2-吡咯啉并阿霉素(2-pyrrolinodoxorubicin)的細胞毒素劑。AN238可標靶RCC腫瘤細胞表面上的SST受體?；瘜W(xué)療法藥物可個別使用或與其他藥物、細胞激素或療法組合使用。另外，也可使用單克隆抗體、抗血管生成藥物或抗生長因子藥物治療RCC或其他實體腫瘤。
抗癌治療也可為手術(shù)。適用于RCC的手術(shù)選擇包括(但不限于)根治性腎切除術(shù)(radical nephrectomy)、部分腎切除(partial nephrectomy)、轉(zhuǎn)移的移除(removal ofmetastases)、動脈栓塞術(shù)(arterial embolization)、腹腔鏡腎切除術(shù)(laparoscopicnephrectomy)、刀冷凍術(shù)(cryoablation)和保留腎單位手術(shù)(nephron-sparing surgery)。此外，可使用放射、基因療法、免疫療法、過繼性免疫療法或其他常規(guī)或?qū)嶒灟煼ㄖ委煂嶓w腫瘤。
應(yīng)了解上述實施例及其后實例以說明的方式而非限定性方式給出。由本發(fā)明說明書，本發(fā)明的范疇內(nèi)的多種變化和修改對所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將變得顯而易見。
V.實例 實例1.PBMC和RNA的純化 在CCI-779療法開始之前及療法8或16周后從RCC患者收集全血。將血樣抽取到CPT Vacutainer細胞制備管(Cell Preparation Vacutainer Tube)(Becton Dickinson)中。對各樣品來說，目標體積為8ml。根據(jù)制造商的方案(Becton Dickinson)經(jīng)菲科爾梯度(Ficoll gradient)分離PBMC。將PBMC小球存儲在-80℃下直到加工樣品用于RNA。
使用QIA切碎機和Qiagen Rneasy迷你試劑盒執(zhí)行RNA純化。將樣品采集在含0.1％β-巰基乙醇的RLT溶解緩沖液(Qiagen，Valencia，CA，USA)中且使用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)加工用于總RNA分離。使用96孔板UV讀數(shù)器在A260/280下監(jiān)測來定量洗脫的RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳以2％瓊脂糖凝膠核對RNA的質(zhì)量(波段為18S和28S)。將剩余RNA存儲在-80℃下直到加工用于Affymetrix基因芯片雜交。
實例2.RNA擴增和基因芯片雜交探針的產(chǎn)生 使用Lockhart等人在NATURE Biotechnology，141675-1680(1996)中所述的程序的修正制備寡核苷酸陣列的經(jīng)標記的靶。使用在5′末端含有T7DNA聚合酶啟動子的寡聚-d(T)24引物使2微克總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。將cDNA用作模板用于使用T7DNA聚合酶試劑盒(Ambion，Woodlands，TX，USA)和經(jīng)生物素標記的CTP和UTP(Enzo，F(xiàn)armingdale，NY，USA)活體外轉(zhuǎn)錄。使經(jīng)標記的cRNA在94℃下在40mM Tris-乙酸鹽(pH 8.0)、100mM KOAc、30mM MgOAc中以40mL的最終體積成為碎片歷時35分鐘。將10微克經(jīng)標記的靶以具有100mg/mL鯡魚精DNA和50mg/mL乙?；疊SA的IX MES緩沖液稀釋。為相對彼此歸一化陣列且估計寡核苷酸陣列的靈敏性，如Hill等人在Genome Biol.，2research0055.1-0055.13(2001)中所述，在各雜交反應(yīng)中包括11個細菌基因的活體外合成轉(zhuǎn)錄物。這些轉(zhuǎn)錄物的豐度以每總轉(zhuǎn)錄物的對照轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目為單位陳述在1∶300000(3ppm)到1∶1000(1000ppm)范圍內(nèi)。如這些對照轉(zhuǎn)錄物的信號反應(yīng)所判定，陣列的檢測靈敏性介于每百萬份2.33與4.5復(fù)本之間的范圍內(nèi)。
使經(jīng)標記的序列在99℃下變性5分鐘且然后在45℃下變性5分鐘且與由大量人類基因組成的寡核苷酸陣列(HG-U95A或HG-U133A，Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)雜交。在以60rpm旋轉(zhuǎn)下，使陣列在45℃下雜交16小時。雜交后，移出且存儲雜交混合物，洗滌陣列且使用GeneChip Fluidics Station 400用抗生蛋白鏈菌素R-藻紅素(分子探針(Molecular Probe))染色且按照制造商的說明書用Hewlett Packard GeneArrayScanner掃描。這些雜交及洗滌條件共同稱為“核酸陣列雜交條件”。
實例3.基因表達頻率的測定和表達資料的處理 使用Affymetrix MicroArray Suite軟件(MAS)處理陣列圖像以使用MAS的桌面版本將通過陣列掃描機產(chǎn)生的原始陣列圖像資料(.dat)文件變?yōu)樘结樚卣魉降膹姸雀攀?.eel文件)。使用基因表達資料系統(tǒng)(GEDS)作為圖形用戶界面，用戶提供表達分布信息和知識系統(tǒng)(EPIKS)奧雷克爾資料庫(Oracle database)的樣品描述且使修正.eel文件與描述相關(guān)聯(lián)。資料庫處理然后調(diào)用MAS軟件產(chǎn)生探針集概述值；對各探針集使用Affymetrix Average Difference算法和Affymetrix Absolute Detection量度(不存在、存在或臨界)概述每次信息的探針強度。也使用MAS通過將截尾均值調(diào)整為值100首過歸一化。資料庫處理也會計算一系列芯片質(zhì)量控制量度且將所有原始資料和質(zhì)量控制計算值存儲于資料庫中。
使用MAS軟件(Affymetrix)以原始熒光強度值執(zhí)行數(shù)據(jù)分析和不存在/存在呼叫測定。通過基于與本底相比的基因信號的強度估計樣品中是否檢測到轉(zhuǎn)錄物由MAS軟件計算“存在”呼叫。使用成比例頻率歸一化法(Hill，等人，Genome Biol，2research0055.1-0055.13(2001))使各轉(zhuǎn)錄物的“平均差”值歸一化為“頻率”值，其中使用示蹤于各雜交溶液中的具有已知豐度的11個對照cKNA的平均差值產(chǎn)生總校正曲線。然后，使用這一校正將所有轉(zhuǎn)錄物的平均差值轉(zhuǎn)化為在1∶300,000(約百萬分之3(ppm))到1∶1000(1000ppm)范圍內(nèi)的以百萬分之幾為單位陳述的頻率估計值。歸一化將各芯片的平均差值歸為由示蹤于各雜交溶液中的具有已知豐度的11個對照轉(zhuǎn)錄的平均差值所構(gòu)造的校正曲線。在許多情況中，歸一化法利用截尾均值歸一化，接著擬合遍及所有芯片的匯集標準曲線，這一曲線用于計算“頻率”值和每芯片的靈敏性估計。所得量度稱為成比例頻率且在所有陣列之間歸一化。
由資料比較排除并不具有任何相關(guān)信息的基因。在無疾病PBMC與RCC PBMC的比較中，此使用兩個資料簡化過濾器實現(xiàn)1)從資料集中移除所有GeneChip中呼叫為不存在(如由MAS中的Affymetrix Absolute Detection量度所判定)的任何基因；2)從資料集中移除所有GeneChip中以＜10ppm的歸一化頻率表達的任何基因以確保分析集中所保留的任何基因以至少10ppm的頻率檢測至少一次。執(zhí)行這些過濾步驟后，分析中的探針集的總數(shù)目為5,469。對一些多變量預(yù)測分析來說，使用更嚴格的資料簡化過濾器(P為25％且平均頻率＞5ppm)以減小鑒別低水平或不經(jīng)常檢測到的轉(zhuǎn)錄物的似然性。
實例4.異常樣品的基于皮爾遜評定(Pearson′s-Based Assessment) 為鑒別異常樣品，使用Splus(5.1版本)計算所有樣品對中的成對皮爾遜相關(guān)系數(shù)的平方(r2)。具體來說，由表達值的G×S矩陣開始計算，其中G為探針集的總數(shù)目且S為樣品的總數(shù)目。計算這一矩陣中樣品間的r2值。結(jié)果為r2值的對稱S×S矩陣。這一矩陣度量各樣品與分析中的所有其他樣品之間的類似性。因為所有這些樣品均來自根據(jù)共同方案采集的人類PBMC，所以通常期望相關(guān)系數(shù)揭示高度的類似性(亦即，大部分轉(zhuǎn)錄序列的表達水平在所分析的所有樣品中類似)。為概述樣品的類似性，計算研究中各樣品與其他樣品的所有MAS信號之間的r2值的平均值且在熱圖中作曲線圖以有助于快速觀測。平均值r2的值越接近于1，樣品與分析中的其他樣品越類似。低平均r2值指示樣品的基因表達分布對總基因表達模式來說為“異常值”。異常狀況可指示樣品具有顯著偏離分析中的其他樣品的基因表達分布或樣品的技術(shù)質(zhì)量為低質(zhì)量。
實例5.臨床研究方案概述 從參與II期研究的20位無疾病志愿者(12位女性和8位男性)和45位腎細胞癌瘤患者(18位女性和27位男性)的外周血中分離PBMC。收到臨床研究的藥物基因組學(xué)部分的同意書且項目得到參與臨床場所的地方倫理審查委員會(Institutional ReviewBoard)批準。將RCC腫瘤在各場所分類為常規(guī)(透明細胞)癌(24)、顆粒狀(1)、乳頭狀(3)或混合亞型(7)。10個腫瘤的分類不能確定。也通過多變量Motzer評定法計分簽署基線PBMC表達分布的藥物基因組學(xué)分析的書面同意書的45位患者。加入這一研究的同意的患者中，在這一研究中，6位指定為良好風(fēng)險評定，17位患者擁有中等風(fēng)險計分且22位患者收到不良預(yù)后分類。
用CCI-779的三種劑量(25mg、75mg或250mg)中的一種治療罹患晚期RCC病例的患者，試驗整段時間內(nèi)每周一次投與30分鐘的CCI-779靜脈內(nèi)輸液。治療之前及CCI-779療法開始后每8周記錄殘余、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性疾病的臨床病期及尺寸。腫瘤尺寸以厘米度量且報導(dǎo)為最長直徑與其垂直直徑的乘積。可度量疾病定義為通過CT掃描、X射線或觸診這兩個直徑均大于1.0cm的任何二維可度量病變。腫瘤反應(yīng)(完全反應(yīng)、部分反應(yīng)、微小反應(yīng)、疾病穩(wěn)定或疾病進展)通過所有可度量病變的垂直直徑的乘積的和判定。本發(fā)明藥物基因組學(xué)研究中所使用的兩個主要臨床結(jié)果量度為進展時間(TTP)和生存或死亡時間(TTD)。TTP定義為最初CCI-779治療日期到度量疾病進展的第一天或經(jīng)檢查稱為無進展的最后日期之間的間隔。生存或TTD定義為最初CCI-779治療的日期到死亡時間或經(jīng)檢查為已知活著的最后日期之間的間隔。
實例6.統(tǒng)計分析 使用Eisen等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，9514863-14868(1998)的進程執(zhí)行基于表達分布類似性的基因和/或陣列的無監(jiān)督分級聚類。在這些分析中，僅使用那些經(jīng)過非嚴格資料簡化過濾器的轉(zhuǎn)錄物(至少1個存在呼叫，整個資料集中至少1個大于或等于10ppm的頻率)。使表達資料進行l(wèi)og轉(zhuǎn)換且標準化以使平均值為0且方差為1，且使用具有非中心相關(guān)類似性量度的平均聯(lián)接聚類法(average linkage clustering)產(chǎn)生分級聚類結(jié)果。
為用完全時程鑒別所有CCI-779治療患者中隨時間變化的轉(zhuǎn)錄物(n＝21)，使用標準ANOVA且計算各時間點(基線、8周、16周)之間的平均倍數(shù)變化。
為鑒別展示與臨床結(jié)果相關(guān)的變化的轉(zhuǎn)錄物，使用Spearman秩相關(guān)性計算各轉(zhuǎn)錄物的臨床結(jié)果的連續(xù)量度(TTP和TTD)與從基線到8到16周的基因表達的變化之間的相關(guān)性。也使用Cox成比例危險回歸模型用臨床結(jié)果的檢查量度(TTP、TTD)評定基線和8或16周之間的基因表達資料的改變。
通過卡普蘭-邁耶分析(Kaplan Meier analysis)評定各組患者的生存資料，且使用Wilcoxon檢驗建立顯著性。
本發(fā)明的上述描述提供對本發(fā)明的說明和描述，但不希望詳盡本發(fā)明或?qū)⒈景l(fā)明局限于所揭示的精確實例中。修改和改變可能與以上教示一致或可從本發(fā)明的實踐中獲得。因此，應(yīng)注意本發(fā)明的范疇由權(quán)利要求書和其等價物界定。
權(quán)利要求
1.一種用于所關(guān)注的患者的實體腫瘤的預(yù)后或評估所關(guān)注的患者的實體腫瘤的治療效力的方法，所述方法包含
檢測所關(guān)注的患者治療期間所述患者的外周血細胞中至少一個基因的表達水平變化，其中在相關(guān)模型下，罹患相同實體腫瘤且接受與所關(guān)注的患者相同的治療的患者的所述變化與所述患者的臨床結(jié)果相關(guān)；和
將所關(guān)注的患者的所述變化與參考變化加以比較，
其中所關(guān)注的患者的所述變化與所述參考變化之間的差值指示所關(guān)注的患者的所述實體腫瘤的預(yù)后或治療效力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述相關(guān)模型為Cox成比例危險模型(Coxproportional hazards model)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述實體腫瘤為RCC且所述治療包含CCI-779療法。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所關(guān)注的患者的所述變化為所關(guān)注的患者的治療開始后特定時間所述患者的外周血細胞中所述至少一個基因的表達水平與所關(guān)注的患者的外周血細胞中所述至少一個基因的基線表達水平之間的變化，且其中所述參考變化為參考患者的治療開始后所述特定時間時所述參考患者的外周血細胞中所述至少一個基因的表達水平與所述參考患者的外周血細胞中所述至少一個基因的基線表達水平之間的變化，所述參考患者罹患所述實體腫瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述特定時間為所述治療開始后約16周。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述外周血細胞包含全血細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述外周血細胞包含高濃度(enriched)PBMC。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述至少一個基因具有小于1的危險比率，且與所述參考變化相比所關(guān)注的患者的所述變化的較大值暗示所關(guān)注的患者具有比所述參考患者好的預(yù)后，且與所述參考變化相比所關(guān)注的患者的所述變化的較小值暗示所關(guān)注的患者具有比所述參考患者差的預(yù)后。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述至少一個基因具有大于1的危險比率，且與所述參考變化相比所關(guān)注的患者的所述變化的較大值暗示所關(guān)注的患者具有比所述參考患者差的預(yù)后，且與所述參考變化相比所關(guān)注的患者的所述變化的較小值暗示所關(guān)注的患者具有比所述參考患者好的預(yù)后。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述至少一個基因各選自表4A、4B、5A或5B。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述參考變化具有憑經(jīng)驗或憑實驗確定的值。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述實體腫瘤為RCC，且所述治療包含CCI-779療法，且其中所關(guān)注的患者的所述變化為所關(guān)注的患者治療開始后特定時間時所述患者的外周血細胞中所述至少一個基因的表達水平與所述患者的外周血細胞中所述至少一個基因的基線表達水平之間的變化。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述特定時間為所述治療開始后約16周。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述至少一個基因各選自表4A、4B、5A或5B，且所述外周血細胞包含全血細胞或高濃度PBMC。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述至少一個基因具有小于1的危險比率，且與所述參考變化相比所關(guān)注的患者的所述變化的較大值暗示所關(guān)注的患者的良好預(yù)后，且與所述參考變化相比所關(guān)注的患者的所述變化的較小值暗示所關(guān)注的患者的不良預(yù)后。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述至少一個基因具有大于1的危險比率，且與所述參考變化相比所關(guān)注的患者的所述變化的較大值暗示所關(guān)注的患者的不良預(yù)后，且與所述參考變化相比所關(guān)注的患者的所述變化的較小值暗示所關(guān)注的患者的良好預(yù)后。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述參考變化為所述參考患者的治療開始后所述特定時間時參考患者的外周血細胞中所述至少一個基因的表達水平與所述參考患者的外周血細胞中所述至少一個基因的相應(yīng)基線表達水平之間的變化，所述參考患者各罹患所述實體腫瘤。
18.一種用于所關(guān)注的患者的實體腫瘤的預(yù)后或評估所關(guān)注的患者的實體腫瘤的治療效力的方法，所述方法包含
檢測所關(guān)注的患者治療期間所述患者的外周血細胞中兩個或兩個以上基因的表達分布變化，其中在相關(guān)模型下，罹患相同實體腫瘤且接受與所關(guān)注的患者相同的治療的患者的所述變化與所述患者的臨床結(jié)果相關(guān)；和
將所關(guān)注的患者的所述變化與參考變化加以比較，
其中所關(guān)注的患者的所述變化與所述參考變化之間的差值指示所關(guān)注的患者的所述實體腫瘤的預(yù)后或治療效力。
19.一種用于所關(guān)注的患者的實體腫瘤的預(yù)后或評估所關(guān)注的患者的實體腫瘤的治療效力的試劑盒，所述試劑盒包含一個或一個以上用于選自表4A、4B、5A或5B的基因的表達產(chǎn)物的探針。
20.一種鑒別實體腫瘤預(yù)后標志的方法，其包含
在患者抗癌治療期間，檢測所述患者的外周血細胞中基因表達分布的變化，所述患者各罹患所述實體腫瘤；和
在相關(guān)模型下，鑒別所述患者的基因的所述變化與所述患者的臨床結(jié)果相關(guān)。
全文摘要
本發(fā)明提供用于實體腫瘤的預(yù)后或評估實體腫瘤治療的方法、系統(tǒng)和儀器。實體腫瘤的預(yù)后的基因標志可根據(jù)本發(fā)明鑒別。抗癌治療開始后，實體腫瘤患者的PBMC中，各基因標志均具有改變的表達模式，且所述改變的量值與所述患者的臨床結(jié)果相關(guān)。在一個實施例中，使用Cox成比例危險模型(Cox proportional hazards model)判定CCI-779治療期間RCC患者的臨床結(jié)果與所述患者的PBMC中基因表達變化之間的相關(guān)性。Cox模型所鑒別的基因的非限定性實例描繪于表4A、4B、5A及5B中。所述基因可用作RCC預(yù)后的替代標志。其也可用作CCI-779或其他抗癌藥物的功效的藥物基因組學(xué)指標。
文檔編號G01N33/574GK101120255SQ200680005306
公開日2008年2月6日 申請日期2006年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月18日
發(fā)明者邁克爾·E·布爾奇斯基, 弗雷德里克·伊默曼, 安德魯·施特拉斯, 納塔莉·C·特溫, 唐娜·斯洛尼姆, 威廉·L·特雷皮奇奧, 安德魯·J·多爾納 申請人:惠氏公司