專利名稱：：利用朊病毒特異性肽試劑的elisa試驗(yàn)的制作方法利用朊病毒特異性肽試劑的ELISA試驗(yàn)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及能與朊病毒蛋白相互作用的肽試劑(peptidereagent)、編碼這些肽試劑的多核苷酸、利用這種肽試劑和多核苷酸產(chǎn)生抗體的方法和采用這些方法產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明還涉及利用這些肽試劑檢測樣品中是否存在朊病毒的方法和將這些肽試劑用作治療性或預(yù)防性組合物組分的方法。祖旦冃豕蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病(proteinconformationaldisease)包括各種不相關(guān)的疾病，包括傳染性海綿樣月畝病(transmissiblespongiformencephalopathies),該疾病因蛋白質(zhì)構(gòu)象異常轉(zhuǎn)換所致，進(jìn)而造成異常形式蛋白質(zhì)自身結(jié)合隨后發(fā)生組織沉積和損傷。這些疾病在臨床表現(xiàn)上也驚人相似，通常經(jīng)歷時(shí)間長度不同的潛伏期后從診斷快速發(fā)展為死亡。一組構(gòu)象疾病稱為"朊病毒疾病"或"傳染性海綿樣腦病(TSE)"。在人中，這些疾病包括克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(CJD)、Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合征(GSS)、致命性家族性失眠癥和庫魯病(參見，例如Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine(《哈里森內(nèi)科學(xué)原理》)，Isselbacher等編，McGraw-Hill,Inc.,紐約，(1994);Medori等，(1992)，N,Engl.J.Med.，326:444-9)。在動物中，TSE包括綿羊搔癢癥、牛海綿樣腦病(BSE)、傳染性水貂腦病和捕獲的黑尾鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病(Gajdusek，(1990)，SubacuteSpongiformEncephal叩athies:TransmissibleCerebralAmyloidosesCausedbyUnconventionalViruses(亞急性海綿樣腦病非尋常病毒導(dǎo)致的傳染性大腦淀粉樣變性)，第2289-2324頁。刊于Virology(《病毒學(xué)》)，F(xiàn)ields編，紐約RavenPress，Ltd)。傳染性海綿樣腦病的特征是有相同的特點(diǎn)存在構(gòu)象異常的朊病毒蛋白(富含(3-折疊(beta-rich)，蛋白酶K耐受)，當(dāng)將其接種于實(shí)驗(yàn)動物(包括靈長類動物、嚙齒類動物和轉(zhuǎn)基因小鼠)中時(shí)能傳染疾病。近年來，牛海綿樣腦病的快速傳播及其與人海綿樣腦病發(fā)生率升高有關(guān)導(dǎo)致對檢測非人哺乳動物傳染性海綿樣腦病的興趣明顯上升。偶然傳染這些疾病的悲劇性后果(參見，例如Gajdusek，InfectiousAmyloids,andPrusinerPrions(傳染性淀粉樣變性和Prusiner朊病毒)，刊于FieldsVirology(菲爾茲病毒學(xué))，F(xiàn)ields等編，Lippi謹(jǐn)tt-Ravin，Pub.，費(fèi)城，(1996);Brown等，(1992)，Lancet,340:24-27)、消除污染困難(Asher等，(1986)，第59-71頁，刊于LaboratorySafety:PrinciplesandPractices(《實(shí)驗(yàn)室安全原理和規(guī)范》)，Miller編，Am.Soc.Microb.)和近來對牛海綿樣腦病的關(guān)注(BritishMed.J.(1995)311:1415-1421)迫切需要建立鑒定患傳染性海綿樣腦病的人和動物的診斷檢驗(yàn)及治療受感染對象。朊病毒是導(dǎo)致海綿樣腦病(朊病毒疾病)的傳染性病原體。朊病毒與細(xì)菌、病毒和類病毒差別顯著。主要的假說是它與所有其它傳染性病原體不同，朊病毒蛋白的異常構(gòu)象導(dǎo)致了感染，該蛋白起著模板作用并將正常朊病毒構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)楫惓?gòu)象。20世紀(jì)80年代早期首次特征鑒定到朊病毒蛋白(參見，例如Bolton，McKinley等，(1982)，Science,218:1309-1311;Pmsiner，Bolton等，(1982)，Biochemistry,21:6942-6950;McKinley，Bolton等，(1983)，Cell,35:57-62)。自那時(shí)起已克隆、測序并在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)了完整的朊病毒蛋白編碼基因。參見，例如Basler，Oesch等，(1986)，Cell,46:417-428。朊病毒疾病的關(guān)鍵特征是正常(細(xì)胞或非致病性)形式的朊病毒蛋白(Prpe)形成了形狀異常的蛋白(PrpSe)，也稱為搔癢癥蛋白。參見，例如Zhang等，(1997)，Biochem.，36(12):3543-3553;Cohen禾口Prusiner，(1998)，AnnRev.Biochem.，67:793-819;Pan等，(1993)，ProcNatlAcadSciUSA,90:10962-10966;Safar等，(1993)，JBiolChem，268:20276-20284。光譜學(xué)和晶體學(xué)研究表明與主要為a-螺旋折疊非疾病形式相比，朊病毒的疾病相關(guān)形式基本上均富含(3-片層結(jié)構(gòu)。參見，例如Wille等，(2001)，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,99:3563-3568;Peretz等，(1997)，J.Mol.Biol.，273:614-622;Cohen和Prusiner，第5章StructuralStudiesofPrionProteins(朊病毒蛋白的結(jié)構(gòu)研究)，刊于PRIONBIOLOGYANDDISEASES(《朊病毒生物學(xué)和疾病》)，S.Pmsiner編，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1999，第191-228頁)?？磥斫Y(jié)構(gòu)發(fā)生變化后生物化學(xué)特性也改變Prpe可溶于非變性洗滌劑，Prpse不可溶；蛋白酶易消化Prpe，而PrP&部分耐受，形成稱為"PrPres"(Baldwin等，(1995);Cohen和Prusiner，(1995);Safar等，(1998)，Nat.Med.4(10):1157-1165)、"PrP27-30"(27-30kDa)或"PK-耐受"(蛋白酶K耐受)形式的N-末端截短片段。此外，PrPSe可將Prpe轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒詷?gòu)象。參見，例如Kaneko等，(1995)，Proc.Nat'lAcad.SciUSA，92:11160-11164;Caughey，(2003)，BrMedBull.,66:109-20。已證實(shí)難于在活對象中和從活對象取得的樣品中檢測到構(gòu)象疾病蛋白的致病性同種型。因此，在對象死亡前對包含上述情況在內(nèi)的這些傳染性和淀粉樣變性的明確診斷和姑息療法基本上是仍未解決的難題。腦組織活檢的組織病理學(xué)檢驗(yàn)對于對象有風(fēng)險(xiǎn)，可能會因活組織檢査樣品的獲取部位而錯(cuò)失病損和淀粉樣沉積的檢測。然而，風(fēng)險(xiǎn)還涉及活組織檢查的動物、患者和衛(wèi)生保健人員。此外，除非動物已變?yōu)槭澄锕?yīng)，否則通常不能獲得動物腦檢驗(yàn)的結(jié)果。另外，產(chǎn)生的大多數(shù)抗朊病毒肽抗體能識別變性的PrpSe和Prpe，雖然報(bào)道有對天然PrpSe特異的抗體。(參見，例如Matsunaga等，(2001)，PROTEINS:Structure,FunctionandGenetics(蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和遺傳學(xué))，44:110-118;美國專禾lj5,846,533和6,765,088)。可用許多TSE檢驗(yàn)(參見，Soto，C.，(2004)，NatureReviewsMicrobiol.,2:809;Biffiger等，(2002)，J.Virol.Meth.，101:79;Safar等，(2002)，NatureBiotech.,20:1147;Schaller等，ActaNeuropathol.，(1999)，98:437;Lane等，(2003)，Clin.Chem.，49:1774)。然而，所有這些檢驗(yàn)利用腦組織樣品并只適用于死后檢驗(yàn)。大多數(shù)這些檢驗(yàn)也需要用蛋白酶K處理樣品，這樣做耗時(shí)，PrPe消化不完全可導(dǎo)致假陽性結(jié)果以及消化對蛋白酶敏感的PrPSe可導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，需要能檢測各種樣品，例如取自血液供給，農(nóng)用動物和其它人和動物食品供給的活對象的樣品中是否存在致病性朊病毒蛋白的組合物和方法。此外，需要能診斷和治療朊病毒相關(guān)疾病的方法和組合物。發(fā)明概述本發(fā)明人開發(fā)了一種檢測致病性朊病毒蛋白的靈敏方法。該方法足夠靈敏從而能檢測可能存在于患朊病毒相關(guān)疾病個(gè)體生物學(xué)液體中的低水平致病性朊病毒。因此，該方法可用作死前診斷檢驗(yàn)或用于篩檢獻(xiàn)血樣品等。本發(fā)明部分涉及能與朊病毒蛋白相互作用的肽試劑。更具體地說，這些肽試劑能優(yōu)先與朊病毒蛋白的致病性同種型相互作用。以下共有專利申請描述了這種肽試劑2004年8月13日提交的美國系列號10/917,646;2005年2月11日提交的美國系列號11/056,950;2004年8月13日提交的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/026363;所有這些申請納入本文作為參考。這些肽試劑用于濃縮和分離檢驗(yàn)樣品中的致病性朊病毒蛋白。與以前描述的Prpse試驗(yàn)不同，本發(fā)明方法不需要蛋白酶處理樣品來除去PrPe。在本發(fā)明方法中，可聯(lián)用肽試劑與靈敏的ELISA來檢測濃縮和分離的朊病毒蛋白。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測樣品中是否存在致病性朊病毒的方法，該方法包括(a)提供包含能優(yōu)先與朊病毒的病原形式相互作用的肽試劑的第一固體支持物；(b)在樣品中存在的致病性朊病毒蛋白能與肽試劑結(jié)合的條件下使所述第一固體支持物與樣品接觸；(c)除去未結(jié)合的樣品；(d)使致病性朊病毒蛋白與肽試劑解離；和(e)利用朊病毒-結(jié)合試劑檢測解離的致病性朊病毒。所述肽試劑最好衍生自具有選自SEQIDNO:12-260所示序列的肽，以下共有的專利申請?jiān)斒隽诉@些肽試劑:2004年8月13日提交的美國系列號10/917,646;2005年2月11日提交的美國系列號11/056,950;2004年8月13日提交的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/026363。除去任何未結(jié)合的樣品后，致病性朊病毒蛋白與肽試劑解離。致病性朊病毒蛋白通常在解離過程中變性。利用離液劑(例如，硫氰酸胍或鹽酸胍)或高鹽濃度或優(yōu)選通過改變pH來實(shí)現(xiàn)解離。低pH(例如，低于pH2)和高pH(高于pH12)均可用，雖然優(yōu)選高pH。利用抗朊病毒抗體，采用免疫測定，優(yōu)選ELISA，更優(yōu)選夾心ELISA檢測解離的和變性的朊病毒蛋白。本發(fā)明也提供實(shí)施該方法的試劑盒，這些試劑盒裝有一種或多種在固體支持物上提供的肽試劑和任選的一種或多種抗-朊病毒抗體?？蓸?biāo)記抗-朊病毒抗體和/或可在固體支持物上提供。如使用說明書(所述)，試劑盒中可任選裝有所述方法使用的緩沖液、洗滌溶液、變性劑和其它組分。這些肽試劑應(yīng)用廣泛，包括用作分離致病性朊病毒或檢測樣品中是否存在致病性朊病毒的工具，用作治療性或預(yù)防性組合物的組分和/或用于產(chǎn)生朊病毒特異性抗體。例如，與Prpe相比，能優(yōu)先與PrpSe相互作用的肽試劑可用于直接檢測從對象活體取得的樣品中的致病性形式，例如用于診斷疾病或篩檢獻(xiàn)血樣品或篩檢器官捐獻(xiàn)的器官。本文所述的肽試劑可以是部分或完全合成的，例如可包含一種或多種以下部分環(huán)狀殘基或肽、肽的多聚體、標(biāo)記物和/或其它化學(xué)部分。合適肽試劑的例子包括衍生自SEQIDNO:12-260所示肽的那些，例如，SEQIDNO:66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、122、123、124、125、126、127、14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、101、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、131、132、133、134、135、136、56、57、65、82或84所示的肽及其類似物和衍生物。本文所述的肽試劑可與任何構(gòu)象疾病蛋白，例如朊病毒蛋白(如，致病性蛋白Prpse和非致病性形式PrPe)相互作用。在某些實(shí)施方式中，與Prpe相比，該肽試劑能優(yōu)先與PrpSe相互作用。這些肽試劑通常對多種物種的Prpse具有特異性，但也可對一種物種的Prpse具有特異性。另一實(shí)施方式提供的肽試劑衍生自本文所述任何序列所示的肽。在某些實(shí)施方式中，這些肽試劑衍生自朊病毒蛋白質(zhì)的各區(qū)域，例如利用對應(yīng)于殘基23-43或85-156(如，按照SEQIDNO:2所示小鼠朊病毒序列編號的23-30、86-111、89-112、97-107、113-135和136-156)的那些區(qū)域。為方便起見，以上所示的氨基酸殘基編號對應(yīng)于SEQIDNO:2所示小鼠朊病毒蛋白序列的那些編號；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難根據(jù)本領(lǐng)域已知的序列和本文提供的指導(dǎo)鑒定其它物種朊病毒蛋白中的相應(yīng)區(qū)域。示范性肽試劑包括衍生自SEQIDNO:66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、122、123、124、125、126、127、134或135所示肽;或SEQIDNO:14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、101、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、129、130、131、132、133或128所示的肽；或SEQIDNO:56、57、65、82、84或136所示肽的那些試劑。一方面提供了檢測是否存在朊病毒蛋白的方法。該檢測方法可與診斷朊病毒相關(guān)疾病(例如，在人或非人動物對象中)，確保血液供給、血制品供給或食物供給中基本上無PrpSe，分析移植用器官和組織樣品，監(jiān)測外科工具和裝置消毒以及知道是否存在致病性朊病毒至關(guān)重要的任何其它情況的方法聯(lián)用。檢測方法依賴于該肽試劑與致病性朊病毒同種型優(yōu)先相互作用。某些實(shí)施方式提供了檢測生物學(xué)樣品中致病性朊病毒的方法。在一實(shí)施方式中，該方法包括在該肽試劑能與致病性朊病毒(如果存在的話)相互作用的條件下使懷疑含致病性朊病毒的樣品與本文所述一種或多種肽試劑接觸；通過致病性朊病毒與該肽試劑的結(jié)合檢測樣品中是否存在致病性朊病毒。肽試劑與致病性朊病毒的相互作用可以在溶液中進(jìn)行，或者可在固相上提供一種或多種反應(yīng)物?？衫迷撾脑噭┳鳛椴蹲皆噭z測試劑或二者進(jìn)行夾心型試驗(yàn)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在該方面可聯(lián)用其它朊病毒結(jié)合試劑(例如，能與變性的朊病毒蛋白結(jié)合的抗體和其它結(jié)合分子)與本發(fā)明肽試劑。在該實(shí)施方式的一個(gè)方面，在固體支持物上提供本發(fā)明一種或多種肽試劑，在致病性朊病毒(如果存在的話)能與該肽試劑結(jié)合的條件下使之與懷疑含致病性朊病毒的樣品接觸?？梢猿悠分形唇Y(jié)合的物質(zhì)，包括任何非致病性朊病毒，可檢測維持與該肽試劑結(jié)合或與該肽試劑解離后的致病性朊病毒。可利用含可檢測標(biāo)記的肽試劑(與本發(fā)明用來"捕捉"致病性朊病毒的同一肽試劑或第二種肽試劑)或含可檢測標(biāo)記的抗朊病毒抗體或其它朊病毒結(jié)合試劑檢測致病性朊病毒。該抗體或朊病毒結(jié)合試劑無需對朊病毒的致病性形式特異。在該實(shí)施方式的其它方面，致病性朊病毒與該肽試劑解離，變性并用抗朊病毒抗體以夾心型試驗(yàn)檢測。在另一實(shí)施方式中，該方法包括在該肽試劑能與致病性朊病毒(如果存在的話)結(jié)合的條件下使懷疑含致病性朊病毒的樣品與選自SEQIDNO:12-260所示肽及其類似物和衍生物的一種或多種肽試劑接觸;通過致病性朊病毒與該肽試劑的結(jié)合檢測樣品中是否存在致病性朊病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，樣品與選自具有SEQIDNO:66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、122、123、124、125、126、127、14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、101、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、131、132、133、134、135、56、57、65、82、136或84所示序列的肽及其類似物和衍生物的一種或多種肽試劑接觸。診斷朊病毒相關(guān)疾病的方法可用以上檢測致病性朊病毒的任一方法。在所有提供含一種或多種本發(fā)明肽試劑的固體支持物的上述實(shí)施方式中，考慮了先將該肽試劑與樣品接觸再與固體支持物結(jié)合的其它實(shí)施方式。在這些實(shí)施方式中，該肽試劑包含結(jié)合對的一個(gè)成員，而固體支持物含該結(jié)合對的第二成員。例如，本發(fā)明肽試劑可含有或經(jīng)修飾含有生物素。使生物素化的肽試劑在該肽試劑能與致病性朊病毒結(jié)合的條件下與懷疑含致病性朊病毒的樣品接觸。然后使含親和素或鏈霉親和素的固體支持物與該生物素化的肽試劑接觸。本文描述了其它合適的結(jié)合對物質(zhì)。在用本文所述固體支持物的任一方法中，固體支持物可以是，例如硝酸纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠、聚氟乙烯、重氮化紙、尼龍膜、活化珠和/或磁性反應(yīng)珠、聚氯乙烯；聚丙烯、聚苯乙烯乳膠、聚碳酸酯、尼龍、葡萄糖、甲殼質(zhì)、沙子、二氧化硅、浮石粉、瓊脂糖、纖維素、玻璃、金屬、聚丙烯酰胺、硅、橡膠、多糖、重氮化紙；活化珠和/或磁性反應(yīng)珠和常規(guī)用于固相合成、親和分離、純化、雜交反應(yīng)、免疫測定和其它這種應(yīng)用的任何物質(zhì)。支持物可以是粒子或者可以是連續(xù)表面的形式，包括膜、篩網(wǎng)、平板、小球、載玻片、圓碟、毛細(xì)管、中空纖維、針頭、大頭針、芯片、固體纖維、凝膠(例如硅膠)和珠或顆粒(例如，多孔玻璃珠、硅膠、任選與二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯珠、接枝共聚珠、聚丙烯酰胺珠、乳膠珠、任選與N-N'-二-丙烯?；叶方宦?lián)的二甲基丙烯酰胺珠、氧化鐵磁珠和用疏水性聚合物包被的玻璃顆粒)。術(shù)語"固體支持物"和"固體表面"可互換使用。此外，在本文所述的任一方法中，樣品可以是生物學(xué)樣品，即從活的或曾經(jīng)活的生物獲得或衍生的樣品，例如器官、全血、血液成分、血液組分、血漿、血小板、血清、腦脊液(CSF)、腦組織、神經(jīng)系統(tǒng)組織、肌肉組織、骨髓、尿、眼淚、非神經(jīng)系統(tǒng)組織、器官和/或活檢或尸檢。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，生物學(xué)樣品包括血液、血液成分或血液組分。所述樣品可以是非生物學(xué)樣品。在另一方面，本發(fā)明提供通過本文所述任一檢測方法檢測所述對象的生物學(xué)樣品中是否存在致病性朊病毒來診斷朊病毒相關(guān)疾病的方法。在另一方面，本發(fā)明包括制備基本上不含致病性朊病毒的血液供給的方法，該方法包括以下步驟通過本文所述任一方法篩檢所收集血液的等份血樣(例如，全血、血漿、血小板或血清)；排除檢測到致病性朊病毒的任何樣品；以及合并未檢測到致病性朊病毒的樣品來提供基本上不含致病性朊病毒的血液供給。在還有另一方面，本發(fā)明包括制備基本上不含致病性朊病毒的食品供給，特別是肉供給(例如，人用或動物消耗的牛肉、羔羊肉、羊肉或豬肉)的方法，該方法包括以下步驟采用本文所述任一方法篩檢從要進(jìn)入食品供給的食品收集的樣品；鑒定檢測到致病性朊病毒的樣品；和從食品供給中除去在其樣品中檢測到致病性朊病毒的任何活的或死的生物或要進(jìn)入食品供給的食品；從而提供基本上不含致病性朊病毒的食物。在另一方面，本發(fā)明包括檢測樣品中是否存在致病性朊病毒、從樣品中分離致病性朊病毒、從樣品中除去致病性朊病毒的各種試劑盒，所述試劑盒裝有本文所述的一種或多種肽試劑；和/或含一種或多種本文所述肽試劑的任何固體支持物；抗朊病毒抗體和其它所需試劑及任選的陽性和陰性對照和/或替代陽性對照。本發(fā)明也提供可用作本文所述試驗(yàn)陽性對照的替代分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒于本文內(nèi)容不難想到本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方式。附圖簡述圖1描述了人(SEQIDNO:l)和小鼠(SEQIDNO:2)朊病毒蛋白的氨基酸序列。圖2描述了以下物種的朊病毒蛋白質(zhì)的比對情況人(SEQIDNO:3)、金黃倉鼠(倉鼠)(SEQIDNO:4)、牛(SEQIDNO:5)、綿羊(SEQIDNO:6)、小鼠(SEQIDNO:7)、麋鹿(SEQIDNO:8)、扁角鹿(fallowdeer)(扁角鹿)(SEQIDNO:9)、黑尾鹿(黑尾鹿)(SEQIDNO:10)和白尾鹿(whitetaileddeer)(白尾鹿)(SEQIDNO:11)。麋鹿、扁角鹿、黑尾鹿和白尾鹿彼此只有兩個(gè)殘基(S/N128和Q/E226(以粗體字顯示))不同。圖3，A-F圖描述了用示范性擬肽取代來制備本文所述任何肽試劑。各圖中擬肽畫有圓圈，本文所述的示范性肽試劑(SEQIDNO:14，QWNKPSKPKTN)顯示，其中用N-取代的甘氨酸(擬肽)殘基替代了脯氨酸殘基(SEQIDNO:14的殘基8)。A圖顯示其中脯氨酸殘基被擬肽殘基N-(S)-(l-苯基乙基)甘氨酸取代的肽試劑；B圖顯示其中脯氨酸殘基被擬肽殘基N-(4-羥基苯基)甘氨酸取代的肽試劑；C圖顯示其中脯氨酸殘基被擬肽殘基N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸取代的肽試劑；D圖顯示其中脯氨酸殘基被擬肽殘基N-(異丙基)甘氨酸取代的肽試劑；E圖顯示其中脯氨酸殘基被擬肽殘基N-(3，5-二甲氧基芐基)甘氨酸取代的肽試劑；和F圖顯示其中脯氨酸殘基被擬肽殘基N-氨基丁基甘氨酸取代的肽試劑。圖4描述了實(shí)施例2所述的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。泳道1和2顯示正常小鼠腦勻漿液(泳道1，標(biāo)記為"C")和變性的受感染小鼠腦勻漿液(泳道，標(biāo)記為"Sc")中存在朊病毒蛋白。泳道3、4和5顯示了人血漿中存在本文所述肽試劑(SEQIDNO:68)與致病性朊病毒形式的特異性結(jié)合。具體地說，泳道3是人血漿對照，泳道4是正常小鼠腦勻漿液樣品。泳道5顯示了該肽試劑與受感染的小鼠腦勻漿液樣品中的PrpSe有強(qiáng)烈結(jié)合。圖5描述了本文所述示范性PEG-連接的肽試劑的結(jié)構(gòu)。圖6描述了(QWNKPSKPKTN)2K(SEQIDNO:133)的結(jié)構(gòu)。圖7，A-C圖描述了示范性的PrpSe檢測試驗(yàn)。圖7A顯示了用包被有本文所述PrpSe特異性肽試劑的磁珠捕捉PrpSe。用磁場吸下(pu11down)磁珠和結(jié)合的PrPSe并洗滌。圖7B顯示了PrPSe的洗脫、變性及將變性的Prpse包被到ELISA的板孔上。圖7C顯示了通過雙抗體ELISA檢測包被到各孔上的PrPSe。圖8描述了用正常小鼠腦勻漿液作不同稀釋的小鼠Prpse腦勻漿液的ELISA檢測。圖9，A和B圖描述了摻加入人血漿樣品中的小鼠Prpse的ELISA檢測。圖9A描述了用QWNKPSKPKTN-生物素(SEQIDNO:14)進(jìn)行的ELISA檢測。圖9B描述了用生物素-GGGKRPKPGG(SEQIDNO:68)進(jìn)行的ELISA檢測。圖10，A和B圖分別描述了ELISA和蛋白質(zhì)印跡檢測，其中圖10A描述了正常和感染搔癢癥的金黃倉鼠(SHa)中PrPSe的ELISA檢測。圖10A描述了用QWNKPSKPKTN-生物素(SEQIDNO:14)(黑柱)或生物素-GGGKRPKPGG(SEQIDNO:68)(白柱)對不用蛋白酶K消化的吸下PrPSe的ELISA檢測。圖10B描述了對PK消化樣品的蛋白質(zhì)印跡分析。"MW"指蛋白質(zhì)分子量。泳道1和2顯示對正常SHa腦勻漿液的兩份不同樣品的分析。泳道3和4顯示對PrPSeSHa腦勻漿液的兩份不同樣品的分析。泳道5顯示對正常小鼠腦勻漿液的分析。泳道6顯示對PrPs"j、鼠腦勻漿液的分析。圖11描述了從正常和受感染的鹿PrP基因轉(zhuǎn)基因小鼠獲得樣品的ELISA結(jié)果。利用QWNKPSKPKTN-生物素(SEQIDNO:14)(黑色和淺灰色矩形)、生物素-KKKAGAAAAGAVVGLGG-C0NH2(SEQIDNO:136)(淺灰色矩形)禾口GGGKRPKPGG(SEQIDNO:68)(灰色矩形)吸下PrPSe，通過ELISA檢測。圖12，A和B圖分別描述了蛋白質(zhì)印跡和ELISA檢測，其中圖12A描述了CJD(sCJD,vCJD，感染的SHa)的蛋白質(zhì)印跡分析檢測。圖12B描述了ELISA檢測用蛋白酶K消化的吸下的CJD。圖13描述了用本文所述各種肽試劑作ELISA檢測人vCJD腦勻漿液的PrPSe。朊病毒特異性試劑如下QWNKPSKPKTN-生物素(SEQIDNO:14);QWNKPSKTTKTNGGGQWNKPSKPKTN-生物素(SEQIDNO:51);生物素-QWNKPSKPKTN,其中P5用N-(3，5-二甲氧基節(jié)基)甘氨酸取代(SEQIDNO:117);生物素-QWNKPSKPKTN，其中P5用N-氨基丁基甘氨酸取代(SEQIDNO:118);生物素-QWNKPSKPKTN，其中P8用N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸取代(SEQIDNO:111);生物素-QWNKPSKPKTN，其中P8用N-氨基丁基甘氨酸取代(SEQIDNO:114);生物素-QWNKPSKPKTN，其中P5用N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸取代和P8用N-氨基丁基甘氨酸取代(SEQIDNO:131);生物素-QWNKPSKPKTN,其中P5用N-(異丙基)甘氨酸取代和P8用N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸取代(SEQIDNO:132);QWNKPSKPKTN2K-生物素(SEQIDNO:133);生物素-GGGKKRPKPGG(SEQJDNO:68);生物素-KKRPKPGG，其中P6用N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸取代(SEQIDNO:122);生物素-GGGKKRPKPGGGQWNKPSKPKTN(SEQIDNO:81);4-支鏈MAPS-GGGKKRPKPGGWNTGGG-生物素(SEQIDNO:134);8-支鏈MAPS-GGGKKRPKPGGWNTGGG-生物素(SEQIDNO:135);生物素-KKKAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM(SEQIDNO:57);生物素-KKKAGAAAAGAVVGGLGG-CONH2(SEQIDNO:136);禾n生物素-GGGKKKKKKKK(SEQIDNO:85)。圖14描述了將肽試劑與樣品培育后包被珠進(jìn)行檢測與先將肽試劑包被到珠上然后與懷疑含致病性朊病毒的樣品培育進(jìn)行的檢測作比較。先包被(黑圈)比培育后包被(白圈)的檢測效率高約100倍。詳述本發(fā)明提供能優(yōu)先與致病性朊病毒蛋白(與非致病性朊病毒蛋白相比)相互作用的肽試劑與改進(jìn)的ELISA方法聯(lián)用來檢測致病性朊病毒蛋白的方法。本發(fā)明涉及可用較小的肽(長度小于50-100個(gè)氨基酸，優(yōu)選長度小于50個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選長度小于約30個(gè)氨基酸)來區(qū)分非致病性和致病性朊病毒蛋白這一驚人和出乎意料的發(fā)現(xiàn)。因此，本
發(fā)明內(nèi)容涉及以下驚人的發(fā)現(xiàn)，即這些肽及其衍生物(統(tǒng)稱為"肽試劑")能以不同的特異性和/或親和力與致病性和非致病性的蛋白質(zhì)結(jié)合，因而其本身可用作診斷性/檢測試劑或治療性組合物的組分。在本發(fā)明之前，據(jù)信只有較大的分子(例如，抗體、PrP、cc-形式的rPrP和血纖蛋白溶酶原)可用于區(qū)分致病性和非致病性形式。同樣，可利用以前描述的抗原性肽產(chǎn)生抗體來評估它們區(qū)分致病性和非致病性形式的能力。然而，由于朊病毒蛋白的相對而言無免疫原性本質(zhì)，已證實(shí)難以產(chǎn)生對致病性形式特異的抗體。參見，例如R.A.Williamson等，"AntibodiesasToolstoProbePrionProteinBiology"(抗體可作為檢測朊病毒蛋白質(zhì)生物學(xué)性質(zhì)的工具)，刊于PRIONBIOLOGYANDDISEASES(《朊病毒生物學(xué)和疾病》)，S.Prusiner編，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1999，第717-741頁。發(fā)現(xiàn)本文所述的某些肽能優(yōu)先與致病性(PrpSe)朊病毒蛋白相互作用從而能開發(fā)用于診斷、檢測試驗(yàn)和治療等的新試劑。因此，本發(fā)明涉及肽試劑，此外，本發(fā)明涉及利用這些肽試劑的檢測試驗(yàn)和診斷試驗(yàn)，利用這些肽試劑的純化或分離方法和包含這些肽試劑的治療性組合物。也提供了編碼這些肽試劑的多核苷酸和利用這些肽試劑產(chǎn)生的抗體。本文所述的肽試劑、多核苷酸和/或抗體可用于檢測，例如生物學(xué)樣品中是否存在致病性朊病毒的組合物和方法。此外，本發(fā)明還涉及將這種肽試劑、抗體和/或多核苷酸用作治療性或預(yù)防性組合物組分的方法。與非致病性同種型相比，本發(fā)明所用的肽試劑包含能優(yōu)先與致病性同種型相互作用的肽。例如，在某些實(shí)施方式中，本文所述肽試劑與構(gòu)象疾病的致病性蛋白形式特異性結(jié)合，而不與非致病性形式結(jié)合(或結(jié)合程度較低)。例如，可利用本文所述肽試劑產(chǎn)生抗體。這些抗體可識別致病性形式、非致病性形式或二者。這些分子可單獨(dú)或以各種組合用于診斷性試驗(yàn)和/或預(yù)防性或治療性組合物中。除非另有指明，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥學(xué)常規(guī)方法實(shí)施本發(fā)明。參考文獻(xiàn)完整解釋了這種技術(shù)。參見，例如Remington'sPharmaceuticalSciences(《雷明頓藥物科學(xué)》)，第18版(Eastern,賓夕法尼亞MackPublishingCompany,1990);MethodsInEnzymology(《酶學(xué)方法》)(S.Colowick禾口N.Kaplan編，AcademicPress,Inc.);HandbookofExperimentalImmunology(《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊》)，第I-IV巻，(D.M.Weir和CC.Blackwell編，1986，BlackwellScientificPublications);Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryMa腿l(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》)(第二版，1989);HandbookofSurfaceandColloidalChemistry(《表面和膠體化學(xué)手冊》)(Birdi，K.S.編，CRCPress,1997);ShortProtocolsinMolecularBiology(《分子生物學(xué)簡單方法》)，第四版，(Ausubel等編，1999，JohnWiley&Sons);MolecularBiologyTechniques:AnIntensiveLaboratoryCourse(《分子生物學(xué)技術(shù)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)室課程》)，(Ream等編，1998，AcademicPress);PCR(IntroductiontoBiotechniquesSeries(生物技術(shù)叢書引言))，第二版，(Newton和Graham編，1997，SpringerVerlag);Peters和Dalrymple，F(xiàn)ieldsVirology(《菲爾茲病毒學(xué)》)(第二版)，F(xiàn)ields等編，B.N.RavenPress,紐約，NY。應(yīng)該知道本發(fā)明肽試劑、抗體和方法不限于具體試劑或方法參數(shù)，因?yàn)檫@些當(dāng)然可變。也應(yīng)知道本文所用術(shù)語的目的只是為描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式，而非限制性的。本文引用的所有出版物、專利和專利申請全文納入本文作為參考。I.定義為便于理解本發(fā)明，下文討論了本申請選用的術(shù)語。術(shù)語"朊病毒"、"朊病毒蛋白"、"PrP蛋白"和在本文可互換使用，指致病性蛋白形式(各稱為搔癢癥蛋白、致病性蛋白形式、致病性同種型、致病性朊病毒和PrP"和非致病性形式(各稱為細(xì)胞蛋白形式、細(xì)胞同種型、非致病性同種型、非致病性朊病毒蛋白和Prpe)以及可能不具有致病性構(gòu)象或正常細(xì)胞構(gòu)象的朊病毒蛋白的變性形式或各種重組形式。致病性蛋白形式與人和動物的疾病狀態(tài)有關(guān)(海綿樣腦病)，非致病性形式通常存在于動物細(xì)胞中，在合適的條件下可能轉(zhuǎn)化為致病性Prpse構(gòu)象。在各種哺乳動物種類，包括人、綿羊、牛和小鼠中會天然產(chǎn)生朊病毒。人朊病毒蛋白的代表性氨基酸序列見SEQIDNO:l。小鼠朊病毒蛋白的代表性氨基酸序列見SEQIDNO:2。其它代表性序列見圖2。本文所用的術(shù)語"致病性"可表示蛋白實(shí)際上導(dǎo)致了疾病或簡單地表示該蛋白與疾病有關(guān)，因此存在疾病時(shí)即存在該蛋白。因此，連同本文內(nèi)容所用的致病性蛋白不一定是疾病的特定致病因子。致病性形式可以是或不是傳染性的。更具體地說，術(shù)語"致病性朊病毒形式"指哺乳動物、禽類或重組朊病毒蛋白的特定構(gòu)象和/或富含卩-片層的構(gòu)象。富含P-片層的構(gòu)象通常能耐受蛋白酶K。對于構(gòu)象疾病蛋白形式，術(shù)語"非致病性"和"細(xì)胞的"二者可互換使用，指存在與疾病無關(guān)的該蛋白質(zhì)的正常同種型。此外，本文所用的"朊病毒蛋白"或"構(gòu)象疾病蛋白"不限于具有本文所述確切序列的多肽。不難明白這些術(shù)語包括任何已鑒定或未鑒定的物種或疾病(例如，阿耳茨海默病、帕金森病等)的構(gòu)象疾病蛋白。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過本文和本領(lǐng)域的指導(dǎo)能采用例如序列比較程序(例如，BLAST和本文所述的其它程序)或鑒定和比對結(jié)構(gòu)特征或基序來確定對應(yīng)于附圖所示任何其它朊病毒蛋白序列的區(qū)域。本文利用術(shù)語"PrP基因"描述表達(dá)朊病毒蛋白的任何遺傳物質(zhì)，包括已知的多態(tài)性和致病性突變。術(shù)語"PrP基因"通常指任何物種的編碼任何形式PrP蛋白的任何基因。Gabriel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:9097-9101(1992)和美國專利號5,565,186;5,763,740;5,792,901和WO97/04814描述了一些共知的PrP序列，這些納入本文作為參考的文獻(xiàn)公開和描述了這種序列。PrP基因可來自任何動物，包括本文所述的"宿主"和"測試"動物并包括其任何和所有多態(tài)性和突變，應(yīng)該知道這些術(shù)語包括尚未發(fā)現(xiàn)的其它這種PrP基因。這種基因表達(dá)的蛋白質(zhì)可采取PrPe(非疾病)或PrPSe(疾病)形式。本文所用的"朊病毒相關(guān)疾病"指完全或部分由致病性朊病毒蛋白CPrpS,導(dǎo)致的疾病。朊病毒相關(guān)疾病包括但不限于搔癢、牛海綿樣腦病(BSE)、瘋牛病、貓海綿樣腦病、庫魯病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(CJD)、新變體克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(iwCJD)、慢性消耗性疾病(CWD)、Gerstmann-Strassler-Scheinker病(GSS)和致命性家族性失眠癥(FPI)。本文所用的術(shù)語"肽試劑"通常指包含天然產(chǎn)生或合成的氨基酸聚合物或氨基酸樣分子的任何化合物，包括但不限于只含有氨基和/或亞氨基分子的化合物。本發(fā)明肽試劑優(yōu)先與致病性朊病毒蛋白相互作用，它們通常衍生自朊病毒蛋白的片段。術(shù)語"肽"可與"寡肽"或"多肽"互換使用，這些術(shù)語并未暗示具體大小。例如，該定義包括含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括，例如非天然氨基酸、擬肽等)的肽，具有天然和非天然產(chǎn)生的(例如，合成)取代鍵以及本領(lǐng)域己知其它修飾的肽。因此，該定義包括合成肽、二聚體、多聚體(例如，串聯(lián)重復(fù)、多抗原肽(MAP)形式、線性連接的肽)、環(huán)狀、支鏈分子等。這些術(shù)語也包括含有一個(gè)或多個(gè)N-取代甘氨酸殘基("擬肽")和其它合成氨基酸或肽的分子(可參見，例如美國專利號5,831,005;5,877,278和5,977,301;Nguyen等，(2000)ChemBiol.7(7):463-473;Simon等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci,USA89(20):9367-9371)。適用于本發(fā)明肽的非限制性長度包括長為3-5個(gè)殘基的肽、長為6-10個(gè)殘基(或其中的任何整數(shù))的肽、長為11-20個(gè)殘基(或其中的任何整數(shù))、長為21-75個(gè)殘基(或其中的任何整數(shù))、長為75-100個(gè)殘基(或其中的任何整數(shù))或長度大于100個(gè)殘基的肽。本發(fā)明所用的肽通?？删哂羞m用于所需應(yīng)用的最大長度。肽的長度最好介于約3-100個(gè)殘基之間。鑒于本文所述本領(lǐng)域技術(shù)人員通常不難選擇最大長度。此外，本文所述肽試劑(例如，合成肽)可包括其它分子，例如標(biāo)記物、接頭或其它化學(xué)部分(例如，生物素、淀粉狀蛋白特異性染料，如Control紅或硫磺素(Thioflavin))。這些部分能進(jìn)一步提高肽與朊病毒蛋白的相互作用和/或檢測朊病毒蛋白。肽試劑也包括具有一個(gè)或多個(gè)取代、添加和/或缺失(包括一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸)的本發(fā)明氨基酸序列衍生物。衍生物優(yōu)選顯示與任何野生型或參比序列有至少約50%相同性，優(yōu)選至少約70%相同性，更優(yōu)選與本文所述任何野生型或參比序列有至少約75%、80%、85%、90%,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相同性?？扇缦挛乃鰷y定序列(或百分比)相同性。這種衍生物可包含多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、?；?、磷酸化等。肽衍生物也可包含對天然序列的修飾，例如缺失、添加和取代(通常是保守性的)，只要該多肽保留所需活性。這些修飾可以是有意的，例如通過定點(diǎn)誘變，或者可以是意外的，例如通過產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主突變或PCR擴(kuò)增所致的錯(cuò)誤。此外，可作出修飾使之具有以下一種或多種效應(yīng)毒性降低；對朊病毒蛋白的親和力和/或特異性提高；促進(jìn)細(xì)胞加工(例如，分泌、抗原呈遞等)；和促進(jìn)呈遞至B-細(xì)胞和/或T-細(xì)胞?？芍亟M、合成、從天然來源或組織培養(yǎng)物中純化來制備本文所述多肽。本文所用的"片段"表示只由天然發(fā)現(xiàn)的完整全長蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)的一部分構(gòu)成的肽。例如，片段可包含蛋白的C-末端缺失和/或N-末端缺失。所述片段通常保留其所衍生的全長多肽序列的一個(gè)、一些或所有功能。片段通常含有天然蛋白的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；優(yōu)選至少約8個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；更優(yōu)選含天然蛋白的至少約IO、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。如本領(lǐng)域已知的，術(shù)語"多核苷酸"通常指核酸分子。"多核苷酸"可包括雙鏈和單鏈序列，其指(但不限于)原核序列、真核mRNA、病毒的cDNA、原核或真核mRNA、病毒(例如，RNA和DNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)的基因組RNA和DNA序列、原核DNA或真核(例如，哺乳動物)DNA，特別是合成的DNA序列。該術(shù)語也包括含有DNA和RNA的任何己知堿基類似物的序列，包括對天然序列的修飾，例如缺失、添加和取代(通常是保守性)。這些修飾可以是有意的，例如通過定點(diǎn)誘變，或者可以是意外的，例如通過含有朊病毒編碼多核苷酸的宿主突變。多核苷酸修飾可具有各種效果，包括例如促進(jìn)宿主細(xì)胞表達(dá)多肽產(chǎn)物。多核苷酸可編碼生物學(xué)活性(例如，免疫原性或治療性)蛋白或多肽。根據(jù)多核苷酸所編碼多肽的性質(zhì)，多核苷酸可包含最少10個(gè)核苷酸，例如多核苷酸編碼抗原或表位的情況下。所述多核苷酸通常編碼至少18、19、20、21、22、23、24、25、30個(gè)或甚至更多個(gè)氨基酸的肽。"多核苷酸編碼序列"或"編碼"所選擇多肽的序列是在置于合適的調(diào)節(jié)序列(或"調(diào)控元件")控制下時(shí)能在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄(以DNA為例)并翻譯(以mRNA為例)為多肽的核酸分子。位于5'(氨基)末端的起始密碼子和3'(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定了編碼序列的邊界。轉(zhuǎn)錄終止序列可以位于編碼序列的3'端。典型的"調(diào)控元件"包括但不限于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，例如啟動子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件、轉(zhuǎn)錄終止信號和聚腺苷酸序列；和翻譯調(diào)節(jié)子，例如優(yōu)化翻譯啟動的序列，如Shine-Dalgarno(核糖體結(jié)合位點(diǎn))序列、Kozak序列(即，優(yōu)化翻譯的序列，例如位于編碼序列的5'端)、前導(dǎo)序列(異源或天然的)、翻譯起始密碼子(例如，ATG)和翻譯終止序列。啟動子可包括可誘導(dǎo)啟動子(分析物、輔因子、調(diào)節(jié)蛋白等誘導(dǎo)與啟動子操作性連接的多核苷酸序列表達(dá))、可阻遏啟動子(分析物、輔因子、調(diào)節(jié)蛋白等誘導(dǎo)與啟動子操作性連接的多核苷酸序列表達(dá))和組成型啟動子。"操作性連接"指配置元件中的所述各組分能執(zhí)行其常規(guī)功能。因此，與編碼序列操作性連接的給定啟動子在存在合適酶時(shí)能實(shí)現(xiàn)該編碼序列表達(dá)。啟動子無需與編碼序列毗連，只要它能起到指導(dǎo)其表達(dá)的功能。因此，例如啟動子序列和編碼序列之間可以存在間插性不翻譯但可轉(zhuǎn)錄的序列，啟動子序列仍可認(rèn)為與編碼序列"操作性連接"。本文用于描述核酸分子的"皿"核酸分子表示基因組、cDNA、半合成或合成來源的多核苷酸，根據(jù)其來源或操作，這些核酸分子(1)不與其天然相連的全部或部分多核苷酸相連；和/或(2)與除其天然連接的多核苷酸以外的多核苷酸相連。關(guān)于蛋白質(zhì)或多肽所用的術(shù)語"重組"表示重組多核苷酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽。以單細(xì)胞實(shí)體培養(yǎng)的原核微生物或真核細(xì)胞系的"重組宿主細(xì)胞"、"宿主細(xì)胞"、"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"、"細(xì)胞培養(yǎng)物"和其它這種術(shù)語可互換使用，它們表示可用作或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)運(yùn)DNA受者的細(xì)胞，包括已轉(zhuǎn)染的原始細(xì)胞的后代。應(yīng)該知道由于意外的和有意的突變，一個(gè)親代細(xì)胞的后代在形態(tài)學(xué)或基因組或總DNA互補(bǔ)上不一定與原始親代完全一樣。該定義和上述術(shù)語要包括通過相對特性(例如存在編碼所需肽的核苷酸序列)的特征鑒定與親代細(xì)胞足夠相似的親代細(xì)胞后代。當(dāng)"分離的"指多核苷酸或多肽時(shí)，其表示所述分子已與天然發(fā)現(xiàn)該分子的完整生物相分離，或者當(dāng)多核苷酸或多肽在自然界中每發(fā)現(xiàn)時(shí)，其基本上不含其它生物大分子從而使得該多核苷酸或多肽可用于其所需目的。本領(lǐng)域已知的"抗體"包含能通過化學(xué)或物理方式與感興趣多肽的表位結(jié)合或締合的一種或多種生物學(xué)部分。例如，本發(fā)明抗體可優(yōu)先與致病性構(gòu)象朊病毒相互作用(例如，與之特異性結(jié)合)。術(shù)語"抗體"包括從多克隆和單克隆制品獲得的抗體以及以下抗體雜交(嵌合型)抗體分子(參見，例如Winter等，(1991)，Nature,349:293-299;和美國專利號4,816,567);F(ab')2和F(ab)片段；Fv分子(非共價(jià)異質(zhì)二聚體，參見例如Inbar等，(1972),ProcNatlAcadSciUSA,69:2659-2662;Ehrlich等，(1980)，Biochem，19:4091-4096);單鏈Fv分子(sFv)(參見，例如Huston等，(1988)，ProcNatlAcadSciUSA,85:5897-5883);二聚和三聚抗體片段構(gòu)建物；微小抗體(minibody)(參見，例如Pack等，(1992)，Biochem,31:1579-1584;Cumber等，(1992)，JImmunology,149B:120-126);人源化抗體分子(參見，例如Riechmann等，(1988)，Nature,332:323-327;Verhoeyan等，(1988)，Science,239:1534-1536;和1994年9月21日公布的英國專利公布號GB2,276,169);從這種分子獲得的任何功能片段，其中這種片段保留了親代抗體分子的免疫學(xué)結(jié)合特性。術(shù)語"抗體"還包括通過非常規(guī)方法，例如噬菌體展示獲得的抗體。本文所用的術(shù)語"單克隆抗體"指具有同源抗體群的抗體組合物。該術(shù)語不涉及抗體的種類或來源，也不限于其制備方式。因此，該術(shù)語包括小鼠雜交瘤獲得的抗體以及利用人雜交瘤而不是小鼠雜交瘤獲得的人單克隆抗體。參見，例如Cote等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy(《單克隆抗體和癌癥治療》)，AlanR.Liss，1985，第77頁。如果需要多克隆抗體，通常用免疫原性組合物(例如，本文所述的肽試劑)免疫選擇的哺乳動物(例如，小鼠、家兔、山羊、馬等)。收集免疫動物的血清，按照已知方法處理。如果含針對所選肽試劑的多克隆抗體的血清含有針對其它抗原的抗體，可通過免疫親和層析純化這些多克隆抗體。產(chǎn)生和加工多克隆抗血清的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見，例如Mayer和Walker編，(1987)，IMMUNOCHEMICALMETHODSINCELLANDMOLECULARBIOLOGY(《細(xì)胞和分子生物學(xué)的免疫化學(xué)方法》)，(AcademicPress,倫敦)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也不難制備抗本文所述肽試劑的單克隆抗體。利用雜交瘤制備單克隆抗體的通用方法是熟知的?？赏ㄟ^細(xì)胞融合，也可通過其它技術(shù)，例如用致癌性DNA直接轉(zhuǎn)化B-淋巴細(xì)胞或用E-B病毒轉(zhuǎn)染來制備無限增殖的產(chǎn)抗體細(xì)胞系。參見，例如M.Schreier等，(1980)，HYBRIDOMATECHNIQUES(雜交瘤技術(shù))；Hammerling等，(1981)，MONOCLONALANTIBODIESANDT-CELLHYBRIDOMAS(單克隆抗體和T-細(xì)胞雜交瘤)；Kennett等，(1980)，MONOCLONALANTIBODIES(《單克隆抗體》);也參見美國專利號4，341,761;4,399,121;4,427,783;4,444,887;4,466,917;4,472,500;4,491,632和4,493,890。本文所用的"單結(jié)構(gòu)域抗體"(dAb)是由能與指定的抗原特異性結(jié)合的VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的抗體。dAb不含VL結(jié)構(gòu)域，但含已知抗體中存在的其它抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如K和X結(jié)構(gòu)域。制備dAb的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如Ward等，Nature,341:544，(1989)?？贵w也可含有VH和VL結(jié)構(gòu)域以及其它已知的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些類型的抗體及其制備方法的例子是本領(lǐng)域己知的(參見，例如納入本文作為參考的美國專利號4,816,467)，包括以下方法。例如，"脊椎動物抗體"指抗體是四聚體或其聚集體，包含通常聚集成"Y"構(gòu)型的輕鏈和重鏈，各鏈之間可以具有或不具有共價(jià)鍵。無論在原位或體外(例如在雜交瘤中)產(chǎn)生，脊椎動物抗體中各鏈的氨基酸序列與脊椎動物所產(chǎn)生抗體中發(fā)現(xiàn)的那些序列同源。例如，脊椎動物抗體包括純化的多克隆抗體和單克隆抗體，制備方法如下文所述。"雜交抗體"是其中各鏈與哺乳動物抗體各鏈分別同源的抗體，"雜交抗體"代表了各鏈的新裝配物，從而能利用四聚體或聚集體沉淀兩種不同抗原。在雜交抗體中，一對重鏈和輕鏈與針對第一抗原產(chǎn)生的抗體中發(fā)現(xiàn)的那些(鏈)同源，而第二對鏈對針對第二抗原產(chǎn)生的抗體中發(fā)現(xiàn)的那些(鏈)同源。這造成"二價(jià)"性能，即同時(shí)與兩種抗原結(jié)合的能力。如下文所述，利用嵌合鏈也可形成這種雜交(抗體)。"嵌合抗體"指其中重鏈和輕鏈?zhǔn)侨诤系鞍椎目贵w。該鏈氨基酸序列的一部分通常與衍生自特定物種或特定類型抗體的相應(yīng)序列同源，而該鏈的其余區(qū)段與衍生自另一物種或類型的序列同源。重鏈和輕鏈的可變區(qū)通常模擬源自一種脊椎動物抗體的可變區(qū)，而恒定部分與源自另一種脊椎動物抗體的序列同源。然而，該定義不限于此具體實(shí)施例。也包括重鏈或輕鏈之一或二者由能模擬不同來源抗體序列的序列組合構(gòu)成的任何抗體，而不論這些來源是不同的類別來源或不同的物種來源，也不論融合點(diǎn)是位于可變區(qū)/恒定區(qū)邊界。因此，可產(chǎn)生恒定區(qū)或可變區(qū)均不模擬己知抗體序列的抗體。然后可能(例如)構(gòu)建可變區(qū)對特定抗原的特異性親和力較高，或恒定區(qū)能引發(fā)補(bǔ)體結(jié)合能力提高的抗體，或者可對具體恒定區(qū)所擁有的特性中作出其它改進(jìn)。另一例子是"改變的抗體"，指改變了其中脊椎動物抗體的天然氨基酸序列的抗體。采用重組DNA技術(shù)可重新設(shè)計(jì)抗體從而獲得所需特性?？捎性S多變化，從改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸到完全重新設(shè)計(jì)某區(qū)域，例如恒定區(qū)。恒定區(qū)的變化通常能獲得所需的細(xì)胞加工特性，例如改變補(bǔ)體結(jié)合、與膜相互作用和其它效應(yīng)器功能?？稍诳勺儏^(qū)中作出變化以改變其抗原結(jié)合特性。也可工程改造抗體以促進(jìn)將分子或物質(zhì)特異性遞送到特定細(xì)胞或組織部位。可通過已知的分子生物學(xué)技術(shù)，例如重組技術(shù)、定點(diǎn)誘變等作出所需變化。還有另一例子是"單價(jià)抗體"，它是由重鏈/輕鏈二聚體與第二重鏈的Fc區(qū)(即，莖)結(jié)合構(gòu)成的聚集體。該類型抗體逃避抗原性調(diào)節(jié)。參見，例如Glennie等，Nature295:712(1982)。此抗體定義也包括抗體的"Fab"片段。"Fab"區(qū)指重鏈和輕鏈中的部分，那些部分與含有重鏈和輕鏈的分支部分的序列大致相等或類似，其顯示在免疫學(xué)上能結(jié)合特定抗原但缺乏效應(yīng)器Fc部分。"Fab"包括能與指定抗原或抗原家族選擇性反應(yīng)的一條重鏈和一條輕鏈的聚集體(通常稱為Fab，)以及含有2H和2L鏈的四聚體(稱為F(ab)2)。Fab抗體可類似地分為上述那些的亞組，即"脊椎動物Fab"、"雜交Fab"、"嵌合型Fab"和"改變的Fab"。本領(lǐng)域己知產(chǎn)生抗體的Fab片段的方法，包括，例如蛋白水解和通過重組技術(shù)合成。"抗原-抗體復(fù)合物"指由抗原和能與抗原的表位特異性結(jié)合的抗體形成的復(fù)合物。如果肽(或肽試劑)與另一肽或蛋白質(zhì)特異性、非特異性地結(jié)合或(發(fā)生)特異性和非特異性結(jié)合的某種組合，則稱二者"相互作用"。如果肽(或肽試劑)與致病性形式結(jié)合的親和力和/或特異性高于非致病性同種型，則稱其與致病性朊病毒蛋白"優(yōu)先相互作用"。能優(yōu)先與致病性朊病毒蛋白相互作用的肽試劑在本文也稱為致病性朊病毒特異性肽試劑。應(yīng)該知道優(yōu)先相互作用無需在特定氨基酸殘基和/或各肽的基序之間相互作用。例如，在某些實(shí)施方式中，本文所述的肽試劑與致病性同種型優(yōu)先相互作用，而與非致病性同種型的結(jié)合水平弱但能檢測到(例如，顯示是感興趣多肽結(jié)合的10%或更低)。例如，利用合適的對照通常不難區(qū)分弱結(jié)合或背景結(jié)合與感興趣化合物或多肽的優(yōu)先相互作用。本發(fā)明肽一般能在有106-倍過量的非致病性形式存在下結(jié)合致病性朊病毒。術(shù)語"親和力"指結(jié)合強(qiáng)度，可以定量表示為解離常數(shù)(Kd)。能優(yōu)先與致病性同種型相互作用的肽(或肽試劑)與該致病性同種型相互作用的親和力優(yōu)選比與非致病性同種型相互作用的親和力至少高2倍，更優(yōu)選至少高10倍，甚至更優(yōu)選至少高IOO倍。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可測定結(jié)合親和力(即，Kd)。本領(lǐng)域熟知測定氨基酸序列"相似性"或"相同性百分比"的技術(shù)。"相似性"通常表示在合適位置對兩條或多條多肽進(jìn)行氨基酸與氨基酸的比較，在這些位置的氨基酸相同或具有相似的化學(xué)和/或物理特性，例如，電荷或疏水性。然后可測定所比較的多肽序列之間所謂的"相同性百分比"。本領(lǐng)域也熟知測定核酸和氨基酸序列相同性的技術(shù)，包括測定該基因的mRNA的核苷酸序列(一般通過cDNA中間體)和測定其所編碼的氨基酸序列，并將該序列與第二氨基酸序列比較。"相同性"通常分別指兩條多核苷酸或多肽序列的核苷酸與核苷酸或氨基酸與氨基酸的確切一致性。可通過測定兩條或多條氨基酸或多核苷酸序列的"相同性百分比"來比較這些序列。相同性百分比可通過以下步驟直接比較兩個(gè)分子(參比序列和與該參比序列的相同性％未知的序列)之間的序列信息來確定比對序列，記下兩條比對序列之間的確切匹配數(shù)目，除以參比序列的長度并將結(jié)果乘以100?？墒褂梅奖憧捎玫挠?jì)算機(jī)程序來幫助分析，例如Dayhoff，M.O.的AtlasofProteinSequenceandStructure(《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖集》)，(M.O.Dayhoff編.，5增刊2:353-358,NationalbiomedicalResearchFoundation,華盛頓，哥倫比亞特區(qū))中的ALIGN,該程序采用了Smith和Waterman(v4dvawcesz>Jpp/.Tl^A.2:482-489，1981)的局部同源性算法進(jìn)行肽分析。確定核苷酸序列相同性的程序可用WisconsinS叫uenceAnalysisPackage(威斯康星序列分析包)，第八版(得自GeneticsComputerGroup,Madison,WI)中，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，這些程序也依賴Smith和Waterman算法。這些程序可方便地使用生產(chǎn)商推薦的和以上威斯康星序列分析包中描述的默認(rèn)參數(shù)。例如，具體核苷酸序列與參比序列的相同性百分比可使用Smith和Waterman同源性算法確定，該算法采用默認(rèn)評分表和6個(gè)核苷酸位置的空位罰分。本
發(fā)明內(nèi)容中建立相同性百分比的另一方法是使用JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok開發(fā)，愛丁堡大學(xué)版權(quán)所有的MPSRCHTM程序包，該程序包可從多種來源獲得，例如因特網(wǎng)。這套程序包可使用Smith-Waterman算法，其中評分表使用默認(rèn)參數(shù)(例如，空位開放罰12分、空位延伸罰1分、一個(gè)空位罰6分)。產(chǎn)生"匹配"值的數(shù)據(jù)反映了"序列相同性"。計(jì)算序列之間相同性或類似性百分比的使用默認(rèn)參數(shù)的其它合適程序一般是本領(lǐng)域已知的，例如另一比對程序是BLAST。例如，BLASTN和BLASTP可以使用以下默認(rèn)參數(shù)遺傳密碼=標(biāo)準(zhǔn)；過濾器=無；鏈=兩條；截?cái)嘀?60;預(yù)期值=10;矩陣-BLOSUM62;描述=50條序列；分類標(biāo)準(zhǔn)=高評分；數(shù)據(jù)庫=非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS翻譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。這些程序的細(xì)節(jié)不難獲得。本文所用的"免疫原性組合物"指給予對象后能導(dǎo)致該對象產(chǎn)生體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的任何組合物(例如，肽、抗體和/或多核苷酸)。免疫原性組合物可通過，例如注射、吸入、口服、鼻內(nèi)或任何其它胃腸外或粘膜(如，直腸內(nèi)或陰道內(nèi))給藥途徑直接引入受者對象中。"表位"表示在抗原上能誘導(dǎo)特異性B細(xì)胞和/或T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)賦予該分子免疫原性的位點(diǎn)，包括能引發(fā)免疫學(xué)反應(yīng)或能與生物學(xué)樣品中存在的抗體反應(yīng)的表位。該術(shù)語也可與"抗原決定簇"或"抗原決定簇位點(diǎn)"互換使用。表位可含有3個(gè)或更多個(gè)氨基酸，這些氨基酸的空間構(gòu)象為該表位所特有。表位通常由至少5個(gè)氨基酸構(gòu)成，更常由至少8-10個(gè)氨基酸構(gòu)成。本領(lǐng)域己知測定氨基酸空間構(gòu)象的方法，包括，例如X-射線晶體學(xué)和二維核磁共振。此外，采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)不難鑒定給定蛋白質(zhì)的表位，例如采用疏水性研究和定點(diǎn)血清學(xué)。也參見，Geysen等，Proc,Natl.Acad.SciUSA(1984)81:3998-4002(快速合成肽來測定給定抗原中免疫原性表位位置的通用方法)；美國專利號4,708,871(鑒定和化學(xué)合成抗原的表位的方法)；禾nGeysen等，MolecularImmunology(1986)23:709-715(鑒定對給定抗體具有高親和力的肽的技術(shù))?？梢杂煤唵蔚娘@示一種抗體阻斷另一抗體與靶抗原結(jié)合能力的免疫測定鑒定能識別同一表位的抗體。本文所用的"免疫學(xué)應(yīng)答"或"免疫應(yīng)答"是當(dāng)本文所述某肽存在于疫苗組合物中時(shí)，對象對其產(chǎn)生體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。這些抗體也能中和感染和/或介導(dǎo)抗體-補(bǔ)體或依賴抗體的細(xì)胞毒性從而為受免疫宿主提供保護(hù)力。可采用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)免疫測定，例如競爭試驗(yàn)來測定免疫學(xué)反應(yīng)。"基因轉(zhuǎn)移"或"基因遞送"指可靠地將感興趣的DNA插入宿主細(xì)胞的方法或系統(tǒng)。這種方法可導(dǎo)致非整合性轉(zhuǎn)移的DNA瞬時(shí)表達(dá)，轉(zhuǎn)移復(fù)制子(例如，附加體)的染色體外復(fù)制和表達(dá)，或轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)整合入宿主細(xì)胞的基因組DNA中?；蜻f送表達(dá)載體包括但不限于源自甲病毒、痘病毒和牛痘病毒的載體。當(dāng)用于免疫時(shí)，這種基因遞送表達(dá)載體可稱為疫苗或疫苗載體。術(shù)語包括生物學(xué)和非生物學(xué)樣品。生物學(xué)樣品是從活的或曾經(jīng)活的生物獲得或衍生的樣品。非生物學(xué)樣品不是從活的或曾經(jīng)活的生物獲得。生物學(xué)樣品包括但不限于從動物(活的或死的)獲得的樣品，例如器官(如大腦、肝臟、腎臟等)、全血、血液成分、血漿、腦脊液(CSF)、尿、眼淚、組織、器官、活檢。非生物學(xué)樣品的例子包括藥物、食物、化妝品等。術(shù)語"標(biāo)記物"和"可檢測標(biāo)記"指能檢測的分子，包括但不限于放射性同位素、熒光劑、發(fā)光劑(luminescer)、化學(xué)發(fā)光劑、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑試劑、生色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬液膠、配體(例如，生物素或半抗原)等。術(shù)語"熒光劑"指能顯示可檢測范圍熒光的物質(zhì)或其一部分。本發(fā)明可用的標(biāo)記物具體例子包括但不限于熒光素、羅丹明、丹酰、傘形酮、德克薩斯紅、魯米諾、吖啶酯(acridiniumester)、NADPH、P-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶和脲酶。標(biāo)記物也可以是表位標(biāo)簽(例如，His-His標(biāo)簽)、抗體或可擴(kuò)增的或其它可檢測的寡核苷酸。II.概述本文描述了利用肽試劑檢測樣品中致病性朊病毒的方法，其中所述肽試劑能通過，例如優(yōu)先結(jié)合一種形式而不結(jié)合另一種來區(qū)分朊病毒蛋白的致病性和非致病性同種型。本發(fā)明人利用這些肽試劑開發(fā)了檢測樣品中是否存在致病性朊病毒的靈敏方法。本文與以下共有專利申請均描述了這些肽試劑2004年8月13日提交的美國系列號10/917,646;2005年2月11日提交的美國系列號11/056,950;2004年8月13日提交的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/026363。因?yàn)殡脑噭﹥?yōu)先與朊病毒的致病性形式相互作用，它們能從含有細(xì)胞(B卩，非致病性)朊病毒蛋白和致病性朊病毒蛋白的樣品中有效分離和濃縮致病性朊病毒。與以前描述的檢測PrP"的方法不同，無需用蛋白酶K或其它蛋白酶消化。通常在固體支持物(優(yōu)選磁力珠)上提供肽試劑，從而不難分離與肽試劑結(jié)合的致病性朊病毒蛋白與樣品的其它組分，特別是非致病性朊病毒蛋白。可任選洗滌結(jié)合的致病性朊病毒以除去任何痕量的未結(jié)合物質(zhì)。然后可通過加入離液劑或優(yōu)選通過改變pH使結(jié)合的致病性朊病毒與肽試劑解離。III.A.肽試劑本發(fā)明部分依賴于本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)朊病毒蛋白的較小片段能優(yōu)先與朊病毒的致病性形式相互作用。這些片段無需是較大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一部分或其它類型的支架分子，即能顯示與致病性朊病毒同種型的這種優(yōu)先相互作用。雖然不想遵循任何具體理論，看來這些肽片段可能是通過模擬非致病性同種型中存在的構(gòu)象而自發(fā)采取能與致病性朊病毒同種型而不是非致病性朊病毒同種型結(jié)合的構(gòu)象。不難將這種通用原理，即構(gòu)象疾病蛋白的某些片段能優(yōu)先與該構(gòu)象疾病蛋白(本文證明是朊病毒)的致病性形式相互作用應(yīng)用于其它構(gòu)象疾病蛋白，從而產(chǎn)生能優(yōu)先與致病性形式相互作用的肽試劑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)知道，雖然這些片段提供了起始點(diǎn)(例如，就大小或序列特征而言)，但可對這些片段作出許多修飾來產(chǎn)生具有更理想屬性(例如，親和力較高、穩(wěn)定性較高、溶解性較高、蛋白酶敏感性較低、特異性較高、易于合成等)的肽試劑。本文所述肽試劑通常能優(yōu)先與朊病毒蛋白的致病性形式相互作用。因此，用這些肽試劑不難檢測致病性朊病毒蛋白是否存在，進(jìn)而在實(shí)際上任何生物學(xué)或非生物學(xué)樣品中(包括活的或死的大腦、脊髓或其它神經(jīng)系統(tǒng)組織以及血液)診斷朊病毒相關(guān)疾病。此外，可利用任何合適的信號放大系統(tǒng)來進(jìn)一步促進(jìn)檢測，包括但不限于利用支鏈DNA擴(kuò)增信號(參見，例如美國專利號5,681,697;5,424,413;5,451,503;5,4547,025;禾口6,235,483);應(yīng)用耙擴(kuò)增技術(shù)，例如PCR、滾環(huán)擴(kuò)增、ThirdWave的侵入物(invader)(Armda等，2002Expert.Rev.Mol.Diagn.2:487;美國專利號6090606、5843669、5985557、6090543、5846717)、NASBA、TMA等(美國專利號6,511,809;EP0544212A1);和/或免疫-PCR技術(shù)(參見，例如美國專利號5,665,539;國際公布WO98/23962;WO00/75663和WO01/31056)。本文描述的肽試劑能與構(gòu)象疾病蛋白的致病性形式相互作用。本文中構(gòu)象疾病蛋白的例子是朊病毒蛋白。以下是與假定有兩種或多種不同構(gòu)象蛋白相關(guān)的疾病的非限制性列表。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>此外，以上列出的構(gòu)象疾病蛋白各包含許多變體或突變體，從而導(dǎo)致不同的蛋白品系(strain),這些蛋白品系均屬于本發(fā)明。下文給出了小鼠朊病毒蛋白的各種區(qū)域和序列的功能分析。也參見Priola(2001)Adv.ProteinChem.57:1-27。按照標(biāo)準(zhǔn)方法和本文的指導(dǎo)不難測定對應(yīng)于下文所述小鼠(Mo)、倉鼠(Ha)、人(Hu)、鳥(A)和綿羊(Sh)的其它物種的區(qū)域和殘基。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>MoQ172推定的蛋白質(zhì)X結(jié)合位點(diǎn)；當(dāng)其突變時(shí)能保護(hù)抵御朊病毒疾病176二硫鍵連接的半胱氨酸Hal73-194螺旋B178疾病相關(guān)突變180疾病相關(guān)突變；糖基化位點(diǎn)196糖基化位點(diǎn)198疾病相關(guān)突變Ha200陽228螺旋cHuE200與Lybian猶太人家族性CJD相關(guān)的突變?yōu)镵(組合M129多態(tài)性也增加了患病的機(jī)會)208疾病相關(guān)突變210疾病相關(guān)突變MoQ219推定的蛋白質(zhì)X結(jié)合位點(diǎn)；當(dāng)其突變時(shí)能保護(hù)抵御朊病毒疾病232疾病相關(guān)突變232GPI錨約233推定的GPI錨切割位點(diǎn)233-254從突變蛋白質(zhì)中除去的部分也應(yīng)注意具有相同氨基酸序列的朊病毒蛋白(和其它構(gòu)象疾病蛋白)具有兩種不同的三維構(gòu)象。一種構(gòu)象與疾病特征相關(guān)，通常不可溶；而另一構(gòu)象與疾病特征無關(guān)，是可溶的。參見，例如Wille等，"StructuralStudiesoftheScrapiePrionProteinbyElectronCrystallography"(通過電子晶體學(xué)研究搔癢癥朊病毒蛋白的結(jié)構(gòu))，Proc.Natl.Acad.SciUSA，99(6):3563-3568(2002)。雖然用朊病毒蛋白作了示范，但本發(fā)明不限于所列的疾病、蛋白質(zhì)和蛋白品系。因此，在某些方面，本文描述的肽試劑包含衍生自天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列，例如構(gòu)象疾病蛋白(如朊病毒蛋白)或含有顯示與朊病毒蛋白同源的基序或序列的蛋白。具體地說，本發(fā)明肽試劑通常衍生自天然的朊病毒蛋白。肽試劑最好衍生自朊病毒蛋白某些區(qū)域的氨基酸序列。這些優(yōu)選區(qū)域的例子是小鼠朊病毒序列(SEQIDNO:2)，氨基酸殘基23-43和85-156的區(qū)域及其亞區(qū)域。本發(fā)明不限于衍生自小鼠序列的肽試劑，也包括以本文所述的類似方式衍生自任何物種(包括人、牛、綿羊、鹿、麋鹿、倉鼠)的朊病毒序列的肽試劑。當(dāng)本文所述的肽試劑衍生自朊病毒蛋白時(shí)，其可包含聚脯氨酸II型螺旋基序。該基序含有通用序列PxxP(例如，SEQIDNO:1的殘基102-105)，雖然有人提出其它序列，特別是丙氨酸四肽也能形成聚脯氨酸II型螺旋(參見，例如Nguyen等，ChemBiol.20007:463;Nguyen等，Science1998282:2088;Schweitzer陽Stenner等，J.Am.ChemSoc.2004126:2768)。在PxxP序列中，"X"可以是任何氨基酸，"P"在天然產(chǎn)生的序列中是脯氨酸，但在本發(fā)明肽試劑中可用脯氨酸替代品取代。這種脯氨酸替代品包括通常稱為擬肽的N-取代甘氨酸。因此，在包含基于PxxP序列的聚脯氨酸II型螺旋的本發(fā)明肽試劑中，"P"代表脯氨酸或N-取代甘氨酸殘基，"x"代表任何氨基酸或氨基酸類似物。特別優(yōu)選的N-取代甘氨酸是本文所述的。此外，已知許多不同物種，包括人、小鼠、綿羊和牛產(chǎn)生的朊病毒蛋白的多核苷酸序列和氨基酸序列。各物種中也存在這些序列的變體。因此，本發(fā)明所用的肽試劑包含任何物種的氨基酸序列或變體的片段或衍生物。例如，在某些實(shí)施方式中，本文所述的肽試劑衍生自圖2所示的任一序列(SEQIDNo:3-11)。本文專門公開的肽試劑的序列通常以小鼠朊病毒序列為基礎(chǔ)，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候不難取代其它物種的相應(yīng)序列。例如，如果需要診斷或治療人，可方便地用相應(yīng)的人序列替代小鼠序列。在一具體例子中，在衍生自約殘基85-約殘基112區(qū)域的肽試劑中(例如，SEQIDNO:35、36、37、40)，可用甲硫氨酸替代對應(yīng)于殘基109位的亮氨酸，用甲硫氨酸替代對應(yīng)于殘基112位的纈氨酸，用絲氨酸替代對應(yīng)于殘基97位的天冬酰胺。類似地，如果需要診斷牛，可在公開的表位序列中作出合適取代以反映牛朊病毒序列。因此，接著上文衍生自約殘基85-約殘基112區(qū)域的肽試劑的例子，可用甲硫氨酸替代對應(yīng)于殘基109位的亮氨酸，用甘氨酸替代對應(yīng)于殘基97位的天冬酰胺。也可用這些序列含氨基酸取代、缺失、添加和其它突變的朊病毒蛋白衍生物。與朊病毒蛋白序列相比，任何氨基酸取代、添加和缺失最好不會影響該肽試劑與致病性形式相互作用的能力。應(yīng)該知道無論本文所述肽試劑是何種來源，這些肽試劑不一定與已知的朊病毒蛋白序列相同。因此，與天然產(chǎn)生的朊病毒蛋白或本文公開的序列相比，本文所述肽試劑可包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加和缺失，只要它們保留了優(yōu)先與構(gòu)象疾病蛋白的致病性形式相互作用的能力。某些實(shí)施方式優(yōu)選保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代是在側(cè)鏈相似的氨基酸家族內(nèi)的取代。遺傳編碼的氨基酸通常分為4個(gè)家族(1)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性=賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)無電荷極性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、色氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)一起分類為芳族氨基酸。例如，可以合理地估計(jì)分別用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸，用谷氨酰胺取代天冬酰胺，用絲氨酸取代蘇氨酸，或用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸類似地保守性取代某氨基酸對生物學(xué)活性不會產(chǎn)生大的影響。也應(yīng)明白可利用天然氨基酸和非天然氨基酸的任何組合來制備本文所述肽試劑。經(jīng)常遇到的非基因編碼的氨基酸類似物包括但不限于鳥氨酸(Orn);氨基異丁酸(Aib);苯并硫代苯丙氨酸(benzothi叩henylalanine)(BtPhe);合歡氨酸(Abz);叔丁基甘氨酸(Tie);苯基甘氨酸(PhG);環(huán)己基丙氨酸(Cha);正亮氨酸(NIe);2-萘基丙氨酸(2-Nal);1-萘基丙氨酸(l-Nal);2-噻吩丙氨酸(2-Thi);1，2,3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic);N-甲基異亮氨酸(N-Melle);高精氨酸(Har);Na-甲基精氨酸(N-MeArg);磷酸酪氨酸(pTyr或pY);六氫吡啶羧酸(Pip);4-氯苯丙氨酸(4-ClPhe);4-氟苯丙氨酸(4-FPhe);1-氨基環(huán)丙垸羧酸(l-NCPC);和肌氨酸(Sar)。本發(fā)明肽試劑中所用的任何氨基酸可以是D-同種型，或更典型是L-同種型?？捎糜谛纬杀疚乃鲭脑噭┑钠渌翘烊划a(chǎn)生的氨基酸類似物包括擬肽和/或肽模擬化合物，例如生物學(xué)功能相同氨基酸的磺酸和硼酸類似物也可用于本發(fā)明化合物中，包括具有可任選用等構(gòu)物取代的一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵的化合物。例如，在本
發(fā)明內(nèi)容中，-CONH—可由--CH2NH-、-NHCO-、-S02NH-、-CH20-、-CH2CH2-、-CH2S-、-CH2SO-、-CH-CH陽(順式或反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2,1,5陽二取代的四唑取代，從而使得由這些等構(gòu)物連接的鍵可維持與-CONH-連接鍵相似的取向。本文所述肽試劑中一個(gè)或多個(gè)殘基可包含擬肽。因此，肽試劑也可包含一個(gè)或多個(gè)N-取代的甘氨酸殘基(具有一個(gè)或多個(gè)N-取代的甘氨酸殘基的肽可稱為"擬肽")。例如，在某些實(shí)施方式中，N-取代的甘氨酸殘基可替代本文所述任何肽試劑中一個(gè)或多個(gè)脯氨酸殘基。在這點(diǎn)上。合適的特定N-取代甘氨酸包括但不限于N-(S)-(l-苯基乙基)甘氨酸；N-(4-羥基苯基)甘氨酸；N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸；N-(異丙基)甘氨酸；N-(3,5-二甲氧基節(jié)基)甘氨酸；和N-氨基丁基甘氨酸(例如，圖3)。其它N-取代的甘氨酸也適合于替代本文所述肽試劑序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些和其它氨基酸類似物和肽模擬物的綜述可參見Nguyen等，(2000)ChemBiol.7(7):463-473;Spatola，A,F.，千U于ChemistryandBiochemistryofAminoAcids,PeptidesandProteins(《氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué)》)，B.Weinstein編，MarcelDekker，紐約，第267頁，(1983)。也可參見Spatola，A.F.，PeptideBackboneModifications(《肽骨架修飾》)(綜述)，VegaData,第1巻，第3版，(1983年3月)；Morley，TrendsPharmSci(綜述)，第463-468頁，(1980);Hudson,D.等，IntJPeptProtRes，14:177-185(1979)(-CH2NH-，CH2CH2-);Spatola等，LifeSci，38:1243-1249(1986)(-CH2-S);HarmJ.，Chem.Soc.PerkinTrans.I，307-314(1982)(-CH—CH-，順式和反式)；Almquist等，JMedChem，23:1392-1398(1980)(-COCHr);Jennings-White等，TetrahedronLett,23:2533(1982)(—COCH2-);Szelke等，歐洲申請EP45665CA:97:39405(1982)(-CH(OH)CH2-);Holladay等，TetrahedronLett,24:4401-4404(1983)(-C(OH)CH2-);禾卩Hruby，LifeSci，31:189-199(1982)(-CH2-S-);各篇文獻(xiàn)納入本文作為參考。可用硼酸-;8(0印2或硼酸酯^(011)20或納入本文作為參考的美國專利號5,288,707公開的其它硼酸衍生物替代C-末端羧酸。本文所述肽試劑可包含單體、多聚體、環(huán)化分子、支鏈分子、接頭等。也考慮了本文所述任何序列的多聚體(即，二聚體、三聚體等)或其生物學(xué)功能等價(jià)物。多聚體可以是均多聚體，即由相同的單體構(gòu)成，例如各單體的肽序列相同。或者，多聚體可以是雜多聚體，表示所有構(gòu)成多聚體的單體不都相同?？赏ㄟ^將單體直接彼此連接或與基質(zhì)連接來形成多聚體，包括例如多抗原肽(MAPS)(如，對稱的MAPS)，與聚合物支架，如PEG支架相連的肽和/或含或不含間隔臂單元的串聯(lián)連接肽?；蛘?，可將連接基團(tuán)加入單體序列從而將各單體連接在一起進(jìn)而形成多聚體。利用連接基團(tuán)的多聚體的非限制性例子包括利用甘氨酸接頭的串聯(lián)重復(fù)；通過接頭與基質(zhì)連接的MAPS和/或通過接頭與支架相連的線性連接肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知連接基團(tuán)可包含雙功能間隔臂單元(同雙功能或異雙功能)。例如(不限于)利用諸如琥珀酰亞胺基-4-(對馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己垸-l-羧酸酯(SMCC)、琥珀酰亞胺基-4-(對馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯等試劑摻入這種間隔臂單元將肽連接在一起的許多方法描述于PierceImmunotechnologyHandbook(《皮爾斯免疫技術(shù)手冊》)(PierceChemicalCo.,Rockville，lll.)并可利用SigmaChemicalCo.(St.Louis,Mo.)禾口AldrichChemicalCo.(Milwaukee,Wis.)及"ComprehensiveOrganicTransformations"(《綜合有機(jī)化學(xué)轉(zhuǎn)化》)，VCK-Verlagsgesellschaft,Weinheim/德國(1989)描述的方法?？捎糜趯误w序列連接在一起的連接基團(tuán)的例子是—Yl—F—Y2，其中Y〗和Y2相同或不同，它們是0-20個(gè)，優(yōu)選0-8個(gè)，更優(yōu)選0-3個(gè)碳原子的亞烷基，F(xiàn)是一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)，例如—O—、—S—、—S—S—、-陽C(O)-國O--、—NR—、--C(O)--NR—、—NR—C(O)--O--、--NR--C(O)—NR—、—NR—C(S)—NR—、—NR—C(S)—0—。Y,和Y2可任選用羥基、烷氧基、羥基烷基、烷氧基垸基、氨基、羧基、羧基垸基等取代。應(yīng)該知道單體的任何合適原子可與連接基團(tuán)相連。此外，本發(fā)明肽試劑可以是線性、支鏈或環(huán)狀。可環(huán)化單體單元或?qū)⑵溥B接在一起以提供線形或支鏈形式、環(huán)形(例如，大環(huán))、星形(樹狀體)或球形(例如，富勒烯)。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難知道可從本文公開的單體序列形成多種聚合物。在某些實(shí)施方式中，多聚體是環(huán)狀二聚體。使用上述相同的術(shù)語，二聚體是均二聚體或雜二聚體?？赏ㄟ^上述任一鍵制成環(huán)狀形式(無論單體或多聚體)，例如但不限于(1)通過在氮和C-末端羰基之間直接形成酰胺鍵或通過中介性間隔基團(tuán)(例如通過與含s氨基的羧酸縮合)使C-末端羧酸與N-末端胺環(huán)化；(2)通過在兩個(gè)殘基的側(cè)鏈之間形成鍵，例如在天冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈與賴氨酸側(cè)鏈之間形成酰胺鍵，或在兩個(gè)半胱氨酸側(cè)鏈之間或在青霉胺與半胱氨酸側(cè)鏈之間或在兩個(gè)青霉胺側(cè)鏈之間形成二硫鍵來環(huán)化；(3)通過分別在側(cè)鏈(例如，天冬氨酸或賴氨酸)與N-末端胺或C-末端羧基之間形成酰胺鍵來環(huán)化；和/或(4)通過中介性短碳間隔臂基團(tuán)連接兩個(gè)側(cè)鏈。本文所述肽試劑最好沒有致病性和/或傳染性。本發(fā)明肽試劑可以長3-約100個(gè)殘基(或其中的任何值)或者甚至更長，優(yōu)選約4-75個(gè)殘基(或其中的任何值)，優(yōu)選約5-約63個(gè)殘基(或其中的任何值)，甚至更優(yōu)選約8-約30個(gè)殘基(或其中的任何值)，最優(yōu)選肽試劑長10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)殘基。本文所述組合物和方法所用的肽試劑的非限制性例子衍生自表1和表4所示序列。表中的肽試劑以常規(guī)的單字母氨基酸密碼表示，N-末端在左C-末端在右描述。方括號中的氨基酸表示不同肽試劑中可用于該位置的替代殘基。圓括號表明肽3試劑中這些殘基可存在或缺失?？捎肗-取代的甘氨酸殘基取代任何脯氨酸殘基以形成擬肽。表中的任何序列在N-和/或C-末端可任選包含Gly接頭(Gn，其中n=l、2、3或4)。表l肽序歹1JSEQIDNOKKRPK12MANLGCWMLVLFVATWSDLGLC13(GGG)QWNKESKPKTN14QWNKPSKPKTNMKHV15NQNN[N/T]FVHDC雨T[I/V]K[Q/E]HTVTTTTKGEN16TTKGENFTETD17GENFIETD18GENFTETD,K[麗]MERVVEQMC〖I/V]TQY[E/Q]ESQAYY[Q/D](G)(R)R[G/S][S/A]S19NQNN[N/T]FVHDCVNIT,K[Q/E]HTVTTTTKGENFTETD同K[M/I]MERVVEQMC[I/V]TQY[E/Q]ESQAYY[Q/D](G)(R)R[G/S][S/A]S20[A/V/T/M][V/I]LFSSPPVILLISEUFL[I/M〗VG21G[N/S]D[W/Y]EDRYYRENM[H/Y]RYPNQVYYRP[M/V]D[Q/E/R]Y[S/N]NQ,/TJFVH22N[N/T]FVHDCVNTT[I/V]K[Q/E]HTVTTTTK23VYYR24RYPNQVYYRP[M/V]D[Q腿]25KKRPKPGG(G)WTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGG26WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGG(G)27WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGG(G)[G/T]WGQPHGG28GGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTN29GGTHSQWNKPSKPKTN30WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGG(G)[G/T]WGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGG31GQPHGGGW32RPnHFGSDYEDRYYRENMHR33RPMIHFGNDWEDRYYRENMYR34(GGGG)C(GG)GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHV(GGGG)C35(GGGG)GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHV36GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHV(GGGG)37[M/L]KH[磨]38KPKTN[M/L]KH〖M/V]39C(GG)GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHV(GGGG)C40SRPHHFGSDYEDRYYRENMHRYPN41PMIHFGNDWEDRYYRENMYRPVD42AGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM43RPMfflFGNDWEDRYYRE薩YR(GGG)44GGGRPMfflPGNDWEDRYYRENMYRGG45(GG)C(GGG)RPMIHFGMDWEDRYYRENMYR(GGG)C46AGAAAAGAVVGGLGG47GGLGG48LGS49QWNKPSKPKTN(GGG)50<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>(GGG)KKRAKAGG98(GGG)QWNKASKPKTN99(GGG)QWAKPSKPKTN100(GGG)QWNKPAKPKTN101(GGG)QWNKPSKPKAN102(GGG)QWNKPSKPKTA103(GGG)AKRPKPGG104(GGG)KARPKPGG105(GGG)KKAPKPGG106(GGG)KKRPAPGG107(GGG)KKAPKAGG108(GGG)KKRPKEGGGWNTGG127QWNKPSKPKTNGGGQWNKPSKPKTNGGGQWNKPSKPKTN128((QWNKPSKPKTN))2K1334-支鏈MAPS-GGGKKRPKPGGWNTGGG1348-支鏈MAPS-GGGKKRPKPGGWNTGGG135KKKAGAAAAGAVVGGLGG-CONH2136DLGLCKKRPKPGGXWNTGG137DLGLCKKRPKPGGXWNTG138DLGLCKKRPKPGGXWNT139DLGLCKKRPKPGGXWN140DLGLCKKRPKPGGXW141DLGLCKKRPKPGGX142LGLCKKRPKPGGXWNTG143LGLCKKRPKPGGXWNT'144LGLCKKRPKPGGXWN145LGLCKKRPKPGGXW146LGLCKKRPKPGGX147GLCKKRPKPGGXWNTGG148GLTKKRPKPGGXWNTG149GLCKKRPKPGGXWNT150GLCKKRPKPGGXWNmGLCKKRPKPGGXW152GLCKKRPKPGGX153LCKKRPKPGGXWNTGG154LCKKRPKPGGXWNTG155LCKKRPKPGGXWNT156LCKKRPKPGGXWN157LCKKRPKPGGXW158LCKKRPKPGGX159CKKRPKPGGXWNTGG160CKKRPKPGGXWNTG161CKKRPKPGGXWNT162CKKRPKPGGX額163CKKRPKPGGXW164CKKRPKPGGX165KKRPKPGGXWNTGG166KKRPKPGGXWNTG167<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>GQWNKPSKPKTNMKHM216GQWNKPSKPKTNMKH217GQWNKPSKPKTNMK218GQWNKPSKPKT醒219GQWNEPSKPKTN220THGQWNKPSKPKTNMKHV221HGQWNKPSKPKTNMKHV222GQWNKPSKPKTNMKHV223THNQWNKPSKPKTNMKHM224THNQWNKPSKPKTNMKH225THNQWNKPSKPKTNMK226THNQWNKPSKPKT畫227THNQWNKPSKPKTN228HNQWNKPSKPKTNMKHM229HNQWNKPSKPKTNMKH230HNQWNKPSKPKTNMK231HNQWNKPSKPKT薩232HNQWNKPSKPKTN233NQWKKPSKPKTNMKHM234NQWNKPSKPKTNMKH235NQWNKPSKPKTNMK236NQWNKPSKPKTNM237NQWNKPSKPKTN238THNQWNKPSKPKTNMKHV239HNQWNKPSKPKTNMKHV240NQWNKPSKPKTNMKHV241PHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQ242GGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHM243QWNKPSKPKTNMKHMGGGQWNKPSKPKTNMKHM.244GGWGQGGGTH[N/S]QWNKPSKPKTN[L7M]KH[V/M](GGGG)245PHGGGWGQHG[G/S]SWGQPHGG[G/S]WGQ246QWNKPSKPKTN[L/M]KH[V/M](GGG)2474-支鏈MAPS-(GGG)QWNKPSKPKTN(GGG)2598-支鏈MAPS-(GGG)KKRPKPGGWNT(GGG)260一方面，本發(fā)明方法所用的肽試劑包括本文公開的各種肽及其衍生物(如本文所述)。因此，本發(fā)明包括衍生自以下所示任一序列的肽及其類似物(例如，用N-取代甘氨酸取代一個(gè)或多個(gè)脯氨酸)和衍生物的肽試劑SEQIDNO:12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259或260。本發(fā)明方法優(yōu)選利用衍生自以下所示肽及其類似物(例如，用N-取代甘氨酸取代一個(gè)或多個(gè)脯氨酸)和衍生物的肽試劑:SEQIDNO:12、13、14、15、16、17、18、19、,20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、,37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、,55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、72、74、76、77、78、81、82、84、89、'96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、纖、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259或260。在某些實(shí)施方式中，這些方法所用的肽試劑能與致病性朊病毒特異性結(jié)合，例如衍生自以下所示肽及其類似物(例如，用N-取代甘氨酸取代一個(gè)或多個(gè)脯氨酸)和衍生物的肽試劑SEQIDNO:66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、122、123、,124、,125、126、127、14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、101、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、13K132、56、57、65、82、84、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259或260。如上所述，本文所述肽試劑可包含一個(gè)或多個(gè)取代、添加和/或突變。例如，可用其它殘基(如丙氨酸殘基)或用氨基酸類似物或N-取代的甘氨酸殘基取代肽試劑中一個(gè)或多個(gè)殘基來制備擬肽(參見，例如Nguyen等，(2000)ChemBiol.7(7):463-473)。此外，本文所述肽試劑也可包含其它肽或非肽組分。其它肽組分的非限制性例子包括間隔殘基，例如位于一端或兩端的兩個(gè)或多個(gè)甘氨酸(天然或衍生的)殘基或氨基己酸接頭或有助于肽試劑溶解的殘基，例如酸性殘基，如以SEQIDNO:83、86為例描述的天冬氨酸(Asp或D)。例如，在某些實(shí)施方式中，將肽試劑合成為多抗原肽(MAP)。通常直接在MAP載體上(例如支鏈賴氨酸或其它MAP載體核心)合成肽試劑的多份拷貝(例如，2-10份拷貝)。參見，例如Wu等，(2001)JAmChemSoc.2001123(28):6778-84;Spetzler等，(1995)IntJPeptProteinRes.45(1):78隱85和SEQIDNO:134禾B135。本文所述肽試劑中包含的非肽組分(例如，化學(xué)部分)的非限制性例子包括位于該肽試劑兩末端之一或內(nèi)部的一種或多種可檢測標(biāo)記、標(biāo)簽(例如，生物素、His-標(biāo)簽、寡核苷酸)、染料、結(jié)合對成員等。非肽組分也可直接或通過間隔臂基團(tuán)(例如酰胺基團(tuán))與化合物上通過定量結(jié)構(gòu)-活性數(shù)據(jù)和/或分子建模預(yù)計(jì)無干擾的位置相連(例如，通過與一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記共價(jià)連接)。本文所述肽試劑也可包含對朊病毒特異的化學(xué)部分，例如淀粉狀蛋白特異性染料(例如，剛果紅、硫磺素等)。化合物的衍生化(例如，標(biāo)記，環(huán)化、與化學(xué)部分相連等)不應(yīng)實(shí)質(zhì)性干擾(甚至可能提高)肽試劑的結(jié)合特性、生物學(xué)功能和/或藥理學(xué)活性。這些肽試劑通常與朊病毒片段或本文所述肽序列有至少約50%的序列相同性。這些肽試劑優(yōu)選與朊病毒片段或本文所述肽序列有至少約70%的序列相同性。更優(yōu)選有至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列相同性。本文所述肽試劑優(yōu)先與致病性形式相互作用，因此可用于各種分離、純化、檢測、診斷和治療應(yīng)用。例如，在肽試劑優(yōu)先與致病性形式相互作用的實(shí)施方式中，可利用所述肽試劑本身來檢測樣品，例如血液、神經(jīng)系統(tǒng)組織(大腦、脊髓、CSF等)或其它組織或器官樣品中的致病性形式。肽試劑也可用于診斷是否存在致病性形式相關(guān)疾病、分離致病性形式和通過除去致病性形式來凈化樣n叩o可采用任何已知的結(jié)合試驗(yàn)，例如免疫測定，如ELISA、蛋白質(zhì)印跡等(參見實(shí)施例)來檢驗(yàn)肽試劑與朊病毒蛋白的相互作用。檢驗(yàn)本發(fā)明肽試劑的特異性的一種常規(guī)方法是選擇含致病性和非致病性朊病毒的樣品。這種樣品通常包括患病動物的大腦或脊髓組織。將能與致病性形式特異性結(jié)合的本文所述肽試劑連接于固體支持物(采用本領(lǐng)域熟知和下文描述的方法)，利用其分離("吸下")致病性朊病毒與其它樣品組分并獲得固體支持物上肽-朊病毒結(jié)合相互作用數(shù)目直接相關(guān)的定量值。也可采用本領(lǐng)域己知的改進(jìn)形式和其它試驗(yàn)來證明本發(fā)明肽試劑的特異性。參見，例如實(shí)施例。雖然利用本文所述肽試劑的本發(fā)明方法不要求，但其它朊病毒試驗(yàn)可利用具有致病性構(gòu)象的朊病毒通常耐受某些蛋白酶，例如蛋白酶K這一事實(shí)。同一蛋白酶能降解非致病性構(gòu)象的朊病毒。因此，當(dāng)利用蛋白酶時(shí)，可將樣品分為兩份等體積。將蛋白酶加入第二份樣品并進(jìn)行相同檢驗(yàn)。由于第二份樣品中的蛋白酶會降解任何非致病性朊病毒，可將第二份樣品中的任何肽-朊病毒結(jié)合相互作用歸因于致病性朊病毒。因此，評估本文所述肽試劑的結(jié)合特異性和/或親和力的非限制性例子包括標(biāo)準(zhǔn)Western和Far-Western印跡法；標(biāo)記肽；ELISA樣試驗(yàn)；和/或細(xì)胞試驗(yàn)。例如，Western印跡通常利用含標(biāo)簽的第一抗體檢測"吸下"試驗(yàn)(如本文所述)獲得的樣品中經(jīng)SDS-PAGE凝膠(電泳)的變性朊病毒蛋白，該蛋白電印跡到硝酸纖維素或PVDF膜上。能識別變性朊病毒蛋白的抗體已有描述(描述于Peretz等，1997J.Mol.Biol.273:614;Peretz等，2001Nature412:739;Williamson等，1998J.Virol.72:9413;美國專利號6,765,088;美國專利號6,537548等)，一些可商品化購得。其它朊病毒結(jié)合分子己有描述，例如嫁接了基序的雜交多肽(參見WO03/085086)、某些陽離子或陰離子聚合物(參見WO03/073106)、作為"增殖催化劑"的某些肽(參見WO02/0974444)和血纖蛋白溶酶原。然后用標(biāo)簽的探針(例如，鏈霉親和素偶聯(lián)的堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、ECL試劑和/或可擴(kuò)增的寡核苷酸)檢測(和/或放大)第一抗體。也可用檢測試劑，例如含親和力標(biāo)簽(例如，生物素)的肽評估結(jié)合情況，所述肽可用親和力標(biāo)簽的探針(例如，鏈霉親和素偶聯(lián)的堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、ECL試劑或可擴(kuò)增的寡核苷酸)作標(biāo)記和檢測。此外，可采用類似于夾心ELISA的微量滴定板方法，例如用本文所述朊病毒特異性肽試劑和其它檢測試劑，包括但不限于具有親和力和/或檢測標(biāo)記的另一種朊病毒特異性肽試劑(如鏈霉親和素偶聯(lián)的堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、ECL試劑或可擴(kuò)增的寡核苷酸)將朊病毒蛋白固定在固體支持物上(例如，微量滴定板孔、珠等)。參見實(shí)施例。也可采用細(xì)胞試驗(yàn)，例如直接檢測單個(gè)細(xì)胞的朊病毒蛋白(如利用能根據(jù)熒光分揀細(xì)胞、計(jì)數(shù)或檢測特異性標(biāo)記細(xì)胞的熒光標(biāo)記朊病毒特異性肽試劑)。III.B.肽試劑的產(chǎn)生可采用本領(lǐng)域熟知的任何方法產(chǎn)生本發(fā)明肽試劑。在所述肽試劑完全或部分是遺傳編碼肽的一實(shí)施方式中，可采用本領(lǐng)域熟知的重組技術(shù)產(chǎn)生此肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用標(biāo)準(zhǔn)方法和本文的指導(dǎo)不難測定編碼所需肽的核苷酸序列。一旦分離，可任選修飾重組肽以包含本文所述和本領(lǐng)域熟知的非遺傳編碼的組分(例如，可檢測標(biāo)記、結(jié)合對成員等)，從而產(chǎn)生肽試劑?？筛鶕?jù)已知序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，用于檢測基因組文庫或CDNA文庫。然后可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和利用能在全長序列的所需部分截短該基因的(例如)限制性內(nèi)切酶進(jìn)一步分離這些序列。類似地，可采用已知技術(shù)(例如苯酚抽提)從細(xì)胞和含細(xì)胞的組織直接分離感興趣的序列，對序列進(jìn)行進(jìn)一步操作產(chǎn)生所需的截短物。用于獲得和分離DNA的技術(shù)說明可參見，例如Sambrook等，同上。也可合成產(chǎn)生(例如，根據(jù)已知的序列)編碼肽的序列?？稍O(shè)計(jì)含所需特定氨基酸序列的合適密碼子的核苷酸序列。一般從通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備并裝配成完整編碼序列的重疊寡核苷酸來裝配完整序列。參見，例如Edge(1981)Nature292:756;Nambair等，(1984)Science223:1299;Jay等，(1984)J.Biol.Chem.259:6311;Stemmer等，(1995)Gene164:49-53。不難采用重組技術(shù)克隆所述肽試劑所用多肽的編碼序列，然后通過合適的堿基對取代進(jìn)行體外誘變，從而得到所需氨基酸的密碼子。這種變化可包括只改變一個(gè)堿基對以實(shí)現(xiàn)一個(gè)氨基酸變化，或可包括幾個(gè)堿基對變化?；蛘撸衫媚茉诘陀阱e(cuò)配雙螺旋解鏈溫度的溫度下與親代核苷酸序列(通常是對應(yīng)于RNA序列的cDNA)雜交的錯(cuò)配引物制作突變。通過使引物的長度和堿基組成維持在較狹窄的限度內(nèi)并使突變堿基位于中心來制備特異性引物。參見，例如Innis等，(1990)PCRApplications:ProtocolsforFunctionalGenomics(《PCR應(yīng)用功能基因組學(xué)方法》)；Zoller和Sm他，MethodsEnzymol.(1983)100:468。利用DNA聚合酶、克隆的產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)引物延伸，選擇通過分離引物延伸鏈衍生的含突變DNA的克隆。可利用突變型引物作為雜交探針實(shí)現(xiàn)選擇。該技術(shù)也適用于產(chǎn)生多點(diǎn)突變。參見，例如Dalbie-McFarland等，Proc.Nat1.Acad.SciUSA(1982)79:6409。一旦分離和/或合成了編碼序列，可將它們克隆入任何合適的載體或復(fù)制子中進(jìn)行表達(dá)，(也參見實(shí)施例)。從本文的指導(dǎo)可以明白，可通過制備表達(dá)構(gòu)建物產(chǎn)生編碼修飾多肽的各種載體，所述構(gòu)建物可以各種組合與其中含有缺失或突變的多肽的編碼多核苷酸操作性連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多克隆載體，選擇合適的克隆載體只是選擇問題。用于克隆的重組DNA載體及其可轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的例子包括噬菌體X(大腸桿菌(五.Co/Z))、pBR322(大腸細(xì)菌)、pGV1106(革蘭陰性細(xì)菌)、pLAFRl(革蘭陰性細(xì)菌)、pME290(非大腸桿菌革蘭陰性細(xì)菌)、pHV14(大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(5ac///1^w6W&))，pBD9(芽孢桿菌CBac"/w力)、pLF61(鏈霉菌C^印fom;;ce力)、pUC6(鏈霉菌)、YIp5(酵母OSacc/u^omj;cM))、YCpl9(酵母)和牛乳頭瘤病毒(哺乳動物細(xì)胞)。通常參見DNACloning(《DNA克隆》)第I和II巻，同上；Sambrook等，同上；B.Perbal，同上。也可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，例如桿狀病毒系統(tǒng)，其描述于例如Summers禾口Smith，TexasAgriculturalExperimentStationBulletin(德克薩斯農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站公報(bào))，第1555號，(1987)。桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法可以是從Imdtrogen(加利福尼亞，圣迭哥)等商品化購得的試劑盒形式("MaxBac"試劑盒)。也可利用植物表達(dá)系統(tǒng)制備本文所述肽試劑。這種系統(tǒng)通常利用病毒載體以異源基因轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞。這種系統(tǒng)的說明可參見，例如Porta等，Mol.Biotech.(1996)5:209-221;Hackland等，Arch.Virol.(1994)139:1-22。發(fā)現(xiàn)病毒系統(tǒng)，例如牛痘(病毒)感染/轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Tomei等，J.Virol.(1993)67:4017-4026和Selby等，JGen.Virol.(1993)74:1103-1113所述)也可用于本發(fā)明。此系統(tǒng)中，首先在體外用編碼噬菌體T7RNA聚合酶的牛痘病毒重組體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。該聚合酶顯示有精密的特異性，即它只轉(zhuǎn)錄攜帶T7啟動子的模板。感染后，用由T7啟動子驅(qū)動的感興趣DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。重組牛痘病毒在胞質(zhì)中表達(dá)的聚合酶將轉(zhuǎn)染的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，然后利用宿主翻譯機(jī)制翻譯成蛋白質(zhì)。該方法能高水平、瞬時(shí)地在胞質(zhì)中產(chǎn)生大量RNA及其翻譯產(chǎn)物?；蚩梢灾糜趩幼?、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(對于細(xì)菌表達(dá))和任選的操縱子(本文統(tǒng)稱為"調(diào)控"元件)控制下，從而能在含該表達(dá)構(gòu)建物的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中將編碼所需多肽的DNA序列轉(zhuǎn)錄成RNA。編碼序列可含有或不含有信號肽或前導(dǎo)序列。對于本發(fā)明，可利用天然產(chǎn)生的信號肽或異源序列。通過宿主的翻譯后加工可除去前導(dǎo)序列。參見，例如美國專利號4,431,739;4,425,437;4,338,397。這種序列包括但不限于TPA前導(dǎo)序列以及蜜蜂二甲雙胍信號序列。相對于宿主細(xì)胞的生長，也可能需要能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)序列表達(dá)的其它調(diào)控序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這種調(diào)控序列，其例子包括對化學(xué)或物理刺激(包括存在調(diào)節(jié)化合物)起反應(yīng)而打開或關(guān)閉基因表達(dá)的那些序列。載體中也可存在其它類型的調(diào)節(jié)序列，例如增強(qiáng)子序列。可先連接控制序列和其它調(diào)節(jié)序列與編碼序列，再插入載體?；蛘撸蓪⒕幋a序列直接克隆入已含有調(diào)控序列和合適的限制性位點(diǎn)的表達(dá)載體中。在一些情況中，可能需要修飾編碼序列使之以合適的取向與調(diào)控序列相連；即維持在正確的讀框內(nèi)。可通過刪除蛋白質(zhì)編碼序列的一部分、插入某序列和/或取代序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)核苷酸來制備突變體或類似物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知修飾核苷酸序列的技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變。參見，例如Sambrook等，同上；DNACloning(《DNA克隆》)，第I和II巻，同上；NucleicAcidHybridization(《核酸雜交》)，同上。然后用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域已知的許多哺乳動物細(xì)胞系包括可從美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)獲得的無限增殖細(xì)胞系，例如但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如H印G2)、Vero293細(xì)胞以及其它細(xì)胞。類似地，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌宿主，例如大腸桿菌、枯草芽胞桿菌和鏈球菌屬(^^;^ococc^^p.)可用于本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建物?？捎糜诒景l(fā)明的酵母宿主包括釀酒酵母(Sacc/zor函戸scerev/sz'ae)、白色念珠菌(Camf/ctoa/6〖ccms)、麥芽糖假絲酵母(Ca"cfc/awa"cwa)、多形漢森酵母(i/a"w肌/apo(ymo^/za)、脆壁克魯維酵母(A7甲er纖戸s/rag他)、孚L酸克魯維酵母(腸戸rom戸s/ac叫、季也蒙畢赤酵母(P/c/z/agw〃/e"'mo;^〃)、巴斯德畢赤酵母(尸〖c/n'apaWo"';y)、裂殖酵母(Sc/n'zc^acc/zaromyces/om6e)禾口角早月旨耳P氏酵母(FarcrvWa//po/y"ca)等?？捎糜跅U狀病毒表達(dá)載體的昆蟲細(xì)胞包括埃及伊蚊04e&saeg;;^/)、苜蓿銀紋夜蛾04^ograp/7Gfca/^bm/ca)、家香(5om6_yxmon')、黑腹果蟲黽(Drc^op/n'/a置/a"og"j^)、草地貪夜蛾(印oco//era/rwg—rt/a)禾口粉蚊夜蛾(7V/c/2op/認(rèn)'am')等。取決于選擇的表達(dá)系統(tǒng)和宿主，在表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生本發(fā)明蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何選擇合適的培養(yǎng)條件。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞將多肽產(chǎn)物分泌入周圍培養(yǎng)基中。載體中可包含某些調(diào)節(jié)序列來提高蛋白產(chǎn)物的分泌，例如組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)前導(dǎo)序列、干擾素(Y或a)信號序列或已知分泌型蛋白的其它信號肽序列。然后可通過本文所述的各種技術(shù)分離分泌的多肽產(chǎn)物，例如采用標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)，例如但不限于羥基磷灰石樹脂、柱層析、離子交換層析、分子大小排阻層析、電泳、HPLC、免疫吸附技術(shù)、親和層析、免疫沉淀等?；蛘?，可采用化學(xué)、物理或機(jī)械方法破碎轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，這些方法能裂解細(xì)胞但能維持重組多肽基本完整。也可通過(例如利用洗滌劑或有機(jī)溶劑)除去細(xì)胞壁或細(xì)胞膜組分使多肽漏出而獲得胞內(nèi)蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這種方法，其描述于例如ProteinPurificationApplications:APracticalApproach(《蛋白質(zhì)純化應(yīng)用實(shí)用方法》)，(E丄.V.Harris和S.Angal編，1990)。例如，本發(fā)明用于破碎細(xì)胞的方法包括但不限于聲裂法或超聲處理；攪拌；液體或固體擠壓；熱處理；凍融法；干燥法；爆發(fā)性減壓；滲透休克；用裂解酶處理，包括蛋白酶，例如胰蛋白酶、神經(jīng)氨酸酶和溶菌酶；堿處理；和利用洗滌劑和溶劑，例如膽汁鹽、十二烷基硫酸鈉、Triton、NP40和CHAPS。用于破碎細(xì)胞的具體技術(shù)主要是選擇問題，取決于表達(dá)多肽的細(xì)胞類型、所用的培養(yǎng)條件和預(yù)處理。細(xì)胞破碎后，通常采用離心除去細(xì)胞碎片，采用標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)，例如但不限于柱層析、離子交換層析、分子大小排阻層析、電泳、HPLC、免疫吸附技術(shù)、親和層析、免疫沉淀等來進(jìn)一步純化胞內(nèi)產(chǎn)生的多肽。例如，獲得本發(fā)明胞內(nèi)多肽的方法之一包括親和純化，例如利用抗體(如以前產(chǎn)生的抗體)的免疫親和層析或凝集素親和層析。特別優(yōu)選的凝集素樹脂是能識別甘露糖部分的樹脂，例如但不限于衍生自雪花蓮?fù)庠茨?Galanthusnivalisagglutinin)(GNA)、小扁豆凝集素(LCA或小扁豆凝集素)、豌豆凝集素(PSA或豌豆凝集素)、Narcissuspseudonarcissusagglutinin(NPA)禾口Alliumursinumagglutinin(AUA)的樹脂。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何選擇合適的親和樹脂。親和純化后，可采用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)一步純化多肽，例如采用上述任何技術(shù)?？刹捎没瘜W(xué)方法常規(guī)合成肽試劑，例如釆用肽領(lǐng)域技術(shù)人員己知的幾種技術(shù)。這些方法通常采用將一個(gè)或多個(gè)氨基酸依次加入延伸中的肽鏈。通常用合適的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)第一個(gè)氨基酸的氨基或羧基。然后將受保護(hù)或衍生的氨基酸與惰性固體支持物相連，或在允許形成酰胺鍵的條件下通過加入序列中互補(bǔ)基團(tuán)(氨基或羧基)得到適當(dāng)保護(hù)的下一個(gè)氨基酸而在溶液中使用。然后除去新加入氨基酸殘基的保護(hù)基團(tuán)，再加入下一個(gè)氨基酸(適當(dāng)保護(hù)的)，依此類推。所需氨基酸以正確順序連接后，依次或同時(shí)除去其余的保護(hù)基團(tuán)(和任何固體支持物，如果采用固相合成技術(shù))得到最終多肽。通過簡單改進(jìn)該通用方法即可一次將多個(gè)氨基酸加入延伸的鏈，例如通過脫保護(hù)后偶聯(lián)(在不產(chǎn)生外消旋手性中心的條件下)受保護(hù)的三肽與適當(dāng)保護(hù)的二肽而形成五肽。例如，固相肽合成技術(shù)可參見J.M.Stewart和J.D.Young，SolidPhasePeptideSynthesis(《固相肽合成》)(PierceChemicalCo.，Rockford,EL1984)及G.Barany和R.B.Merrifield，ThePeptides:Analysis,Synthesis,Biology(《肽分析、合成、生物學(xué)》)，E.Gross和J.Meienhofer編，第2巻，(AcademicPress,紐約，1980)，第3-254頁;經(jīng)典溶液合成可參見M.Bodansky，PrinciplesofPeptideSynthesis(《肽合成原理》)，(Springer-Verlag，伯林，1984)及E.Gross禾口J.Meienhofer編,ThePeptides:Analysis,Synthesis,Biology(《肽分析、合成、生物學(xué)》)，第1巻。這些方法用于較小的多肽，即最多長約50-100個(gè)氨基酸，但也適用于較大的多肽。典型的保護(hù)基團(tuán)包括叔丁氧基羰基(Boc);9-笏甲氧基羰基(Fmoc);芐氧基羰基(Cbz);對甲苯磺酰基(TX);2,4-二硝基苯基；芐基(Bzl);聯(lián)苯基異丙氧基羧基-羰基;叔戊氧基羰基；異龍腦氧基羰基(isobomyloxycarbonyl);鄰-溴芐氧基羰基；環(huán)己基；異丙基；乙?；秽?硝基苯基磺?；取５湫偷墓腆w支持物是交聯(lián)的多聚支持物。這些支持物包括二乙烯基苯交聯(lián)的苯乙烯聚合物，例如二乙烯基苯-羥甲基苯乙烯共聚物、二乙烯基苯-氯甲基苯乙烯共聚物和二乙烯基苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物。可按照例如，美國專利號5,877,278;6,033,631;Simon等，(1992)Proc.NatlAcad.SciUSA89:9367合成含多聚物的擬肽。也可通過例如同時(shí)進(jìn)行多個(gè)肽合成的其它方法來化學(xué)制備本發(fā)明的肽試劑。參見，例如Houghten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:5131-5135;美國專利號4,631,211。IV.試驗(yàn)本發(fā)明人開發(fā)了用于檢測樣品中致病性朊病毒的靈敏試驗(yàn)。該試驗(yàn)聯(lián)合了肽試劑區(qū)分致病性和非致病性朊病毒蛋白的能力與改進(jìn)的ELISA技術(shù)。由于肽試劑優(yōu)先與致病性朊病毒蛋白相互作用，可利用這些試劑分離和濃縮樣品中的任何致病性朊病毒。與利用蛋白酶K消化常導(dǎo)致致病性同種型有一定程度N-末端消化來區(qū)分致病性和非致病性同種型的方法不同，本發(fā)明方法利用肽試劑可分離全長致病性朊病毒蛋白。因此，可利用能識別朊病毒蛋白N-末端表位的抗朊病毒抗體以及能識別朊病毒蛋白其它區(qū)域表位的抗朊病毒抗體來檢測。一旦利用肽試劑分離了致病性朊病毒蛋白和非致病性同種型(存在于大多數(shù)樣品中)，可使致病性朊病毒蛋白與肽試劑解離并用本文所述的許多ELISA形式檢測。致病性朊病毒在與肽試劑解離過程中通常發(fā)生變性。ELISA中優(yōu)選利用變性的朊病毒蛋白，因?yàn)橐阎S多能與變性PrP結(jié)合的抗-朊病毒抗體可商品化購得。利用高濃度離液劑，例如3M-6M的胍鹽，如硫氰酸胍或鹽酸胍可實(shí)現(xiàn)致病性朊病毒的解離和變性。必須先除去或稀釋離液劑，再進(jìn)行ELISA，因?yàn)殡x液劑會干擾ELISA中抗-朊病毒抗體的結(jié)合。這增加了洗滌步驟或產(chǎn)生的樣品體積大，兩種情況均對快速高通量試驗(yàn)不利。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用離液劑使致病性朊病毒蛋白與肽試劑解離/變性的優(yōu)選替代方法是利用高或低pH。通過加入能將pH升高至12以上的組分(例如，NaOH)或降低至2以下的組分(例如，H3P04)不難使致病性朊病毒蛋白與肽試劑解離和變性。此外，通過加入小體積的合適酸或堿不難將pH再調(diào)節(jié)至中性，從而能直接用于ELISA而不要任何額外洗滌且不明顯增加樣品體積。因此，本發(fā)明提供檢測樣品中是否存在致病性朊病毒的方法，包括在肽試劑能與致病性朊病毒(如果存在的話)結(jié)合的條件下使懷疑含有致病性朊病毒的樣品與能優(yōu)先與致病性形式的朊病毒蛋白結(jié)合的肽試劑接觸而形成第一復(fù)合物；除去未結(jié)合的樣品物質(zhì)；使致病性形式與肽試劑解離；和利用朊病毒結(jié)合試劑檢測存在的解離致病性朊病毒。"朊病毒結(jié)合試劑"是能與任何構(gòu)象的朊病毒蛋白結(jié)合的試劑，朊病毒結(jié)合試劑通常與變性形式的朊病毒蛋白結(jié)合。這種試劑已見描述，包括例如抗朊病毒抗體(描述于Peretz等，1997J.Mol.Biol.273:614;Peretz等，2001Nature412:739;Williamson等，1998J.Virol.72:9413;美國專利號6,765,088;美國專利號6,537548等)、基序嫁接的雜交多肽(參見WO03/085086)、某些陽離子或陰離子多聚物(參見WO03/073106)、作為"繁殖催化劑"的某些肽(參見WO02/0974444)和血纖蛋白溶酶原。應(yīng)該明白如果所用的具體朊病毒結(jié)合試劑與變性形式的朊病毒結(jié)合，則應(yīng)先使"捕捉"的致病性朊病毒蛋白變性再用朊病毒結(jié)合試劑檢測。朊病毒結(jié)合試劑優(yōu)選抗朊病毒抗體。某些實(shí)施方式用抗-PrP抗體檢測朊病毒蛋白。能與朊病毒，特別是PrPe或變性的PrP結(jié)合的抗體、修飾的抗體和其它試劑己見描述，一些可商品化購得(參見，例如抗-朊病毒抗體描述于Peretz等，1997J.Mol.Biol.273:614;Peretz等，2001Nature412:739;Williamson等，1998J.Virol.72:9413;美國專利號6,765,088。一些這種物質(zhì)和其它物質(zhì)可商品化購自InProBiotechnology,SouthSanFrancisco,力Q禾幅尼亞，CaymanChemicals,AnnArborMI等；PrionicsAG，Zurich;修飾的抗體也可參見WO03/085086)。該方法所用的合適抗體包括但不限于3F4、D18、D13、6H4、MAB5242、7D9、BDI115、SAF32、SAF53、SAF83、SAF84、19B10、7VC、12F10、PRI308、34C9、FabHuM-P、FabHuM-Rl和FabHuM-R72。解離的致病性朊病毒蛋白優(yōu)選是變性的。術(shù)語"變性"或"變性的"具有應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的常規(guī)意義，表示蛋白質(zhì)喪失其天然二級和三級結(jié)構(gòu)。對于致病性朊病毒蛋白，"變性"的致病性朊病毒蛋白不再保留天然致病性構(gòu)象，因此該蛋白不再有"致病性"。變性的致病性朊病毒蛋白的構(gòu)象類似于變性的非致病性朊病毒蛋白或與之相同。然而，本文為簡明起見，術(shù)語"變性的致病性朊病毒蛋白"可用于指作為致病性同種型由肽試劑捕獲隨后變性的致病性朊病毒蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在固體支持物上提供肽試劑?？上仍诠腆w支持物上提供肽試劑，再與樣品接觸，或者肽試劑適合與樣品接觸并與其中任何致病性朊病毒結(jié)合后再與固體支持物結(jié)合(例如，通過使用生物素化的肽試劑與含有親和素或鏈霉親和素的固體支持物)。因此，本發(fā)明還提供檢測樣品中是否存在致病性朊病毒的方法，包括(a)提供包含肽試劑的第一固體支持物；(b)在樣品中存在的致病性朊病毒蛋白能與肽試劑結(jié)合形成第一復(fù)合物的條件下使該第一固體支持物與樣品接觸；(C)除去未結(jié)合的樣品物質(zhì)；(d)使致病性朊病毒蛋白與第一復(fù)合物解離；和(e)利用朊病毒結(jié)合試劑檢測解離的致病性朊病毒。肽試劑優(yōu)選衍生自序列選自SEQIDNO:12-260的肽。本文描述了制備包含肽試劑的固體支持物的本領(lǐng)域常規(guī)方法，包括將蛋白質(zhì)和肽與各種固體表面相連的熟知方法。在樣品中的任何致病性朊病毒蛋白能與肽試劑結(jié)合的條件下使樣品與包含肽試劑的固體支持物接觸，從而形成第一復(fù)合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難確定本文進(jìn)一步描述的這種結(jié)合條件。通?？稍谖⒘康味ò宓目字谢蛟谛◇w積的塑料試管中進(jìn)行該方法，但任何方便的容器都適用。樣品通常是液體樣品或混懸液，可在(加入)肽試劑之前或之后加入反應(yīng)容器。一旦產(chǎn)生了第一復(fù)合物，可通過分離固體支持物與反應(yīng)溶液(含有未結(jié)合的樣品物質(zhì))，例如通過離心、沉淀、過濾、磁力等除去未結(jié)合的樣品物質(zhì)(即，未與肽試劑結(jié)合的任何樣品組分，包括任何未結(jié)合的致病性朊病毒蛋白)?？扇芜x對含第一復(fù)合物的固體支持物進(jìn)行一次或多次洗滌步驟以除去任何殘留樣品物質(zhì)，再進(jìn)行本發(fā)明的下一步驟。除去未結(jié)合的樣品物質(zhì)以及任何任選的洗滌步驟后，使結(jié)合的致病性朊病毒蛋白與第一復(fù)合物解離。可以許多方式實(shí)現(xiàn)這種解離。在一個(gè)實(shí)施方式中，加入離液劑，優(yōu)選胍鹽化合物，例如硫氰酸胍或鹽酸胍至濃度3M-6M之間。加入離液劑導(dǎo)致致病性朊病毒蛋白與肽試劑解離，亦造成致病性朊病毒蛋白變性。另一實(shí)施方式通過將pH提升至12或更高("高pH")或?qū)H降低至2或更低("低pH")來實(shí)現(xiàn)解離。第一復(fù)合物與高或低pH接觸導(dǎo)致致病性朊病毒蛋白與肽試劑解離并造成致病性蛋白變性。在此實(shí)施方式中，優(yōu)選使第一復(fù)合物與高pH接觸。pH在12.0-13.0之間通常足夠；優(yōu)選采用pH在12.5-13.0之間；更優(yōu)選采用pH在12.7-12.9之間；最優(yōu)選采用pH為12.9?；蛘?，可使第一復(fù)合物與低pH接觸來解離致病性朊病毒蛋白與肽試劑。對于該替代方法，pH在1.0-2.0之間足夠。第一復(fù)合物與高pH或低pH接觸只需短時(shí)間，例如60分鐘，優(yōu)選不超過15分鐘，更優(yōu)選不超過10分鐘。接觸時(shí)間過長會導(dǎo)致致病性朊病毒蛋白的結(jié)構(gòu)明顯變化，從而破壞檢測步驟所用抗朊病毒抗體識別的表位。接觸足夠時(shí)間以解離致病性朊病毒蛋白后，通過加入酸性試劑(如果采用高pH解離條件)或堿性試劑(如果采用低pH解離條件)不難將pH調(diào)節(jié)至中性(即pH在約7.0-7.5之間)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難確定合適的方案，本文描述了實(shí)施例。為實(shí)現(xiàn)高pH解離條件，通常加入NaOH至約0.05N-約0.2N濃度足夠。優(yōu)選加入NaOH至濃度在0.05N-0.15N之間；更優(yōu)選使用0.1N的NaOH。一旦致病性朊病毒與肽試劑解離，可加入合適量的酸溶液，例如磷酸、磷酸二氫鈉將pH調(diào)節(jié)至中性(即，約7.0-7.5之間)。為實(shí)現(xiàn)低pH解離條件，通常加入H3P04至約0.2M-約0.7M的濃度足夠。優(yōu)選加入H3P04至濃度在0.3M-0.6M之間；更優(yōu)選使用0.5M的H3P04。一旦致病性朊病毒與肽試劑解離，可加入合適量的堿溶液，例如NaOH或KOH將pH調(diào)節(jié)至中性(即，約7.0-7.5之間)。然后分離解離的致病性朊病毒蛋白與含有肽試劑的固體支持物。"分離的"表示解離的朊病毒與固體支持物(含結(jié)合的肽試劑)不一起存在于同一容器中?？梢韵嗨品绞綄?shí)現(xiàn)這種分離以除去上述未結(jié)合的物質(zhì)?？衫秒貌《窘Y(jié)合試劑檢測解離的致病性朊病毒蛋白。本文它處描述了已知的許多這種試劑。用于檢測解離的致病性朊病毒蛋白的優(yōu)選朊病毒結(jié)合試劑是抗朊病毒抗體。許多抗朊病毒抗體已有描述，許多可商品化購得，例如FabD18(Peretz等，(2001)Nature412:739-743)、3F4(購自SigmaChemicalStLouisMO;也參見美國專利號4,806,627)、SAF-32(CaymanChemical，AnnArborMI)、6H4(PrionicAG，瑞士；也參見美國專利號6,765,088)?？捎肊LISA型試驗(yàn)，例如直接ELISA或抗體夾心ELISA型試驗(yàn)檢測解離的致病性朊病毒蛋白，下文更全面地描述了這些試驗(yàn)。雖然用術(shù)語"ELISA"描述用抗-朊病毒抗體進(jìn)行的檢測，但所述試驗(yàn)不限于其中的抗體是"酶聯(lián)"的試驗(yàn)。可用本文所述和免疫測定領(lǐng)域熟知的任何可檢測標(biāo)記標(biāo)記檢測抗體。在該方法的一實(shí)施方式中，解離的致病性朊病毒蛋白被動包被在第二固體支持物表面上。熟知這種被動包被的方法，通常在37"用pH8的100mMNaHC03包被數(shù)小時(shí)或在4'C包被過夜。熟知其它包被緩沖液(例如，50mM碳酸鹽pH9.6;10mMTrispH8，或10mMPBSpH7.2)。第二固體支持物可以是本文所述或本領(lǐng)域熟知的任何固體支持物；第二固體支持物優(yōu)選微量滴定板，例如96-孔聚苯乙烯板。當(dāng)用高濃度離液劑解離時(shí)，先將離液劑的濃度稀釋約2倍，再包被到第二固體支持物上。當(dāng)采用高或低pH解離時(shí)，中和后，可用解離的致病性朊病毒蛋白包被而無需進(jìn)一步稀釋。一旦解離的致病性朊病毒蛋白包被于第二固體支持物上，洗滌該支持物以除去未于該固體支持物附著的任何組分。在抗體能與包被于該第二固體支持物上的朊病毒蛋白結(jié)合的條件下加入抗-朊病毒抗體。如果先使解離的致病性朊病毒蛋白變性再包被到第二固體支持物上，所用的抗體應(yīng)是能與變性形式的朊病毒蛋白結(jié)合的抗體。這種抗體包括熟知的抗體(例如上述的)以及通過熟知方法，例如用rPrP、Prpe或其片段在小鼠、家兔、大鼠等中引發(fā)免疫反應(yīng)而產(chǎn)生的抗體。(參見，美國專利號4,806,627;6,165,784;6,528,269;6,379,905;6,261,790;6，765，088;5,846,533;EP891552B1和EP909388Bl)。特別優(yōu)選能識別朊病毒蛋白N-末端表位的抗-朊病毒抗體，例如能識別殘基23-90區(qū)域內(nèi)表位的抗體。因此，在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測樣品中致病性朊病毒是否存在的方法，包括(a)提供包含肽試劑的第一固體支持物；(b)在致病性朊病毒蛋白(樣品中存在的話)能與肽試劑結(jié)合的條件下使第一固體支持物與樣品接觸形成第一復(fù)合物；(C)除去未結(jié)合的樣品物質(zhì)；(d)使致病性朊病毒蛋白與第一復(fù)合物解離；(e)分離解離的致病性朊病毒蛋白與第一固體支持物；(f)在解離的朊病毒蛋白能與第二固體支持物附著的條件下使解離的朊病毒蛋白與第二固體支持物接觸；和(g)用試劑檢測附著在第二固體支持物上的致病性朊病毒。肽試劑優(yōu)選衍生自具有選自SEQIDNO:12-260所示序列的肽。在該實(shí)施方式中，第一固體支持物優(yōu)選磁珠；第二固體支持物優(yōu)選微量滴定板；朊病毒結(jié)合試劑優(yōu)選抗-朊病毒抗體，特別是3F4、6H4、SAF32。可檢測地標(biāo)記朊病毒結(jié)合試劑。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，采用抗體夾心型ELISA檢測解離的致病性朊病毒蛋白。在此實(shí)施方式中，在包含抗-朊病毒第一抗體的第二固體支持物上"重捕獲"解離的朊病毒蛋白。任選洗滌含重捕獲朊病毒蛋白的第二固體支持物以除去任何未結(jié)合的物質(zhì)，然后在抗-朊病毒第二抗體能與重捕獲朊病毒蛋白結(jié)合的條件下與抗-朊病毒第二抗體接觸?？?朊病毒第一和第二抗體通常是不同的抗體，優(yōu)選能識別朊病毒蛋白上的不同表位。例如，抗-朊病毒第一抗體能識別朊病毒蛋白N-末端的表位，抗-朊病毒第二抗體能識別除N-末端以外的表位，或反之亦然。第一抗體可以是，例如能識別八重復(fù)區(qū)(octarepeatregion)(殘基23-90)中表位的SAF32,第二抗體可以是能識別位于殘基109-112處表位的3F4;或者，第一抗體可以是3F4而第二抗體可以是SAF32。不難選擇第一和第二抗體的其它組合。在此實(shí)施方式中，可檢測地標(biāo)記抗-朊病毒第二抗體，但不是抗-朊病毒第一抗體。當(dāng)利用促溶劑解離致病性朊病毒蛋白與肽試劑時(shí)，必須先除去促溶劑或至少稀釋15倍，再進(jìn)行檢測試驗(yàn)。當(dāng)采用高或低pH解離和中和時(shí)，可使用解離的朊病毒而無需進(jìn)一步稀釋。當(dāng)解離的致病性朊病毒先變性再進(jìn)行檢測時(shí)，第一和第二抗體均與變性的朊病毒蛋白結(jié)合。因此，本發(fā)明提供檢測樣品中致病性朊病毒是否存在的方法，包括(a)提供包含肽試劑的第一固體支持物；(b)在致病性朊病毒蛋白(樣品中存在的話)能與肽試劑結(jié)合的條件下使第一固體支持物與樣品接觸形成第一復(fù)合物；(c)除去未結(jié)合的樣品物質(zhì)；(d)使致病性朊病毒蛋白與第一復(fù)合物解離，藉此使致病性朊病毒蛋白變性；(e)分離解離變性的致病性朊病毒蛋白與該第一固體支持物；(f)在解離的朊病毒蛋白能與抗-朊病毒第一抗體結(jié)合的條件下使解離變性的致病性朊病毒蛋白與第二固體支持物接觸；和(g)利用抗-朊病毒第二抗體檢測結(jié)合在第二固體支持物上的朊病毒蛋白。肽試劑優(yōu)選衍生自具有選自SEQIDNO:12-260所示序列的肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一固體支持物優(yōu)選磁珠；第二固體支持物優(yōu)選微量滴定板或磁珠；抗-朊病毒第一和第二抗體優(yōu)選不同的抗體；第一和第二抗體能與變性的朊病毒蛋白結(jié)合；優(yōu)選抗-朊病毒第一或第二抗體中至少一種能識別位于朊病毒蛋白N-末端區(qū)域的表位。為用于本發(fā)明方法，樣品可以是已知或懷疑含有致病性朊病毒蛋白的任何物質(zhì)。樣品可以是生物學(xué)樣品(即，從活的或曾經(jīng)活的生物制備樣品)或非生物學(xué)樣品。合適的生物學(xué)樣品包括但不限于器官、全血、血液成分、血液組分、血漿、血小板、血清、腦脊液(CSF)、腦組織、神經(jīng)系統(tǒng)組織、肌肉組織、骨髓、尿、眼淚、非神經(jīng)系統(tǒng)組織、器官和/或活檢或尸檢樣品。優(yōu)選的生物學(xué)樣品包括血液、血液成分或血液組分、血漿、血小板和血清。在肽試劑能與致病性朊病毒蛋白(如果樣品中存在的話)結(jié)合的條件下使樣品與一種或多種本發(fā)明肽試劑接觸。根據(jù)本文內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全能確定這些具體條件。通常，在合適溫度(例如，約4'C)下用約中性pH的合適緩沖液(例如，pH7.5的TBS緩沖液)一起培育樣品和肽試劑合適的時(shí)間(例如，約1小時(shí)到過夜)使之結(jié)合。上述捕捉和檢測步驟可以在溶液中進(jìn)行，或者可在固體支持物上或以固相和液相的某種組合進(jìn)行。本文描述了合適的固相試驗(yàn)方式。對于固相方式，捕捉試劑(可以是一種或多種本發(fā)明肽試劑，或一種或多種朊病毒結(jié)合試劑)一般與固體支持物相連，或適合與固體支持物相連。捕捉試劑可適合于通過本領(lǐng)域已知的任何方法與固體支持物相連，例如捕捉試劑和固體支持物可以各自含有結(jié)合對的一個(gè)成員，當(dāng)捕捉試劑與固體支持物接觸時(shí)，捕捉試劑可通過該結(jié)合對成員間的結(jié)合而與固體支持物相連。例如，捕捉試劑可以包含生物素，固體支持物可包含親和素或鏈霉親和素。除生物素-親和素和生物素-鏈霉親和素以外，該實(shí)施方式的其它合適的結(jié)合對包括例如抗原-抗體、半抗原-抗體、模擬表位(mimetope)-抗體、受體-激素、受體-配體、激動劑-拮抗劑、凝集素-碳水化合物、A蛋白-抗體Fc。這種結(jié)合對是熟知的(參見，例如，美國專利號6,551,843和6,586,193)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全能選擇合適的結(jié)合對并使其適用于本發(fā)明。當(dāng)捕捉試劑適合與上述支持物相連時(shí)，可使樣品在捕捉試劑與支持物相連之前或之后與捕捉試劑接觸?；蛘?，可采用本領(lǐng)域熟知的偶聯(lián)化學(xué)方法使肽試劑和抗-朊病毒抗體與固體支持物共價(jià)相連。采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法將含巰基的肽試劑直接與固體支持物，例如磁珠相連(參見，例如Chrisey，L.A.，Lee,G.U.禾口O'Ferrall，CE.，(1996)，CovalentattachmentofsyntheticDNAtoself-assembledmonolayerfilms(合成DNA與自身裝配的單層膜共價(jià)連接)，NucleicAcidsResearch,24(15)，3031-3039;Kitagawa，T.，Shimozono，T.，Aikawa，T.，Yoshida，T.禾口Nishimura，H.，(1980)，Preparationandcharacterizationofhetero-bifunctionalcross-linkingreagentsforproteinmodifications(制備禾卩牛寺征鑒定用于蛋白質(zhì)修飾的異雙功能交聯(lián)劑)，Chem.Pharm.Bull.，29(4)，1130-1135)。首先采用碳二亞胺化學(xué)方法將羧酸化磁珠與含馬來酰亞胺官能團(tuán)的異雙功能交聯(lián)劑(購自PierceBiotechnologyInc.的BMPH)偶聯(lián)。然后將巰基化的肽或擬肽與BMPH包被珠的馬來酰亞胺官能團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)。本文和以下共有專利申請描述了本發(fā)明方法所用的肽試劑2004年8月13日提交的美國系列號10/917,646;2005年2月11日提交的美國系列號11/056,950;2004年8月13日提交的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/026363。肽試劑可衍生自朊病毒蛋白的肽片段。肽試劑優(yōu)選衍生自具有SEQIDNO:12-260所示序列的肽，即該肽試劑衍生自具有以下SEQIDNO所示序列的肽12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259或260。該方法所用的肽試劑更優(yōu)選衍生自具有SEQIDNO:66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、122、123、124、125、126、127、129、130、131、132、134或135之一所示序列的肽；或衍生自SEQIDNO:14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、101、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128或133所示的肽；或衍生自SEQIDNO:56、57、65、82、84或136所示的肽；肽試劑最優(yōu)選衍生自具有SEQIDNO:68、50或14所示序列的肽?？缮锼鼗脑噭?。可將肽試劑與固體支持物相連。在一些實(shí)施方式中，可檢測地標(biāo)記肽試劑。通常利用本文所述肽試劑與樣品中的朊病毒蛋白結(jié)合(例如，作為捕捉物質(zhì))和/或檢測是否存在朊病毒蛋白(例如，作為檢測物質(zhì))。捕捉試劑和檢測試劑可以是不同的分子，或者一種分子可同時(shí)擁有捕捉和檢測功能。在某些實(shí)施方式中，捕捉和/或檢測試劑是是能優(yōu)先與致病性朊病毒相互作用(即，對致病性朊病毒特異)的本文所述肽試劑。在其它實(shí)施方式中，捕捉試劑對致病性朊病毒特異，而檢測試劑能與致病性和非致病性形式結(jié)合，例如能與朊病毒蛋白結(jié)合的抗體。上文描述了這種朊病毒結(jié)合試劑?；蛘撸谄渌鼘?shí)施方式中，捕捉試劑對致病性朊病毒無特異性，而檢測試劑對致病性朊病毒特異。然后可采用任何合適的檢測方法來鑒定本文所述肽試劑與朊病毒蛋白間的結(jié)合。例如，本文所述的試驗(yàn)可包括利用標(biāo)記的肽試劑或抗體。適用于本發(fā)明的可檢測標(biāo)記包括能檢測的任何分子，包括但不限于放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、生色團(tuán)、熒光半導(dǎo)體納米晶體(nanocrystal)、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑試劑、生色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬液膠、配體(例如，生物素或半抗原)等。其它標(biāo)記物包括但不限于利用熒光的那些標(biāo)記物，包括能發(fā)出可檢測范圍熒光的那些物質(zhì)或其各部分。本發(fā)明可用的標(biāo)記物具體例子包括但不限于堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)、熒光素、FITC、羅丹明、丹酰、傘形酮、二甲基吖啶酯(DMAE)、德克薩斯紅、魯米諾、NADPH和卩-半乳糖苷酶。此外，可檢測標(biāo)記物可包括寡核苷酸標(biāo)簽，該標(biāo)簽可通過任何已知的核酸檢測方法，包括PCR、TMA、b-DNA、NASBA等檢測?？稍谌芤褐?例如，液體培養(yǎng)基)或固體支持物上進(jìn)行本文所述試驗(yàn)的一個(gè)或多個(gè)步驟。為本發(fā)明的目的，固體支持物可以是任何物質(zhì)(即不可溶基質(zhì))，具有感興趣分子(例如，本文肽試劑、朊病毒蛋白、抗體等)能連接或附著的剛性或半剛性表面。示范性固體支持物包括但不限于基質(zhì)，例如硝酸纖維素、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、乳膠、聚碳酸酯、尼龍、葡聚糖、幾丁質(zhì)、沙子、二氧化硅、浮石粉、瓊脂糖、纖維素、玻璃、金屬、聚丙烯酰胺、硅、橡膠、多糖、聚氟乙烯、重氮化紙；活化珠、磁性反應(yīng)珠和常規(guī)用于固相合成、親和分離、純化、雜交反應(yīng)、免疫測定和其它這類應(yīng)用的任何物質(zhì)。支持物可以是顆?；蛘呖梢圆扇∵B續(xù)表面形式，包括膜、篩網(wǎng)、平板、小球、載玻片、圓碟、毛細(xì)管、中空纖維、針頭、大頭針、芯片、固體纖維、凝膠(例如硅膠)和珠，例如，多孔玻璃珠、硅膠、任選與二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯珠、接枝共聚珠、聚丙烯酰胺珠、乳膠珠、任選與N-N'-二-丙烯?；叶方宦?lián)的二甲基丙烯酰胺珠、氧化鐵磁珠和用疏水性聚合物包被的玻璃顆粒。特別優(yōu)選的固體支持物是聚苯乙烯微量滴定板和/或聚苯乙烯磁性顆粒，例如DynabeadsM-270(DynalBiotech)。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)不難偶聯(lián)本文所述肽試劑與固體支持物。先偶聯(lián)肽試劑與蛋白(例如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)具有更好的固相結(jié)合特性時(shí))可促進(jìn)其在支持物上固定。合適的偶聯(lián)蛋白包括但不限于大分子，例如血清白蛋白，包括牛血清白蛋白(BSA)、匙孔槭血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它蛋白?？捎糜诮Y(jié)合分子與支持物的其它物質(zhì)包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知這類分子和偶聯(lián)這些分子與蛋白的方法。參見，例如Brinkley,M.A.,(1992)S/oco"乂wgafeC7zem.,2:2-13;Hashida等，(1984),J///,5/oc/zem.,6:56-63;Anjaneyulu禾口Staros(1987)/"/er"a〃owa//,o/尸ejpf/de/Vc^e/w30:117-124。如果需要，不難功能化要加入固體支持物的分子以產(chǎn)生苯乙烯或丙烯酸部分，從而能將這些分子摻入聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或其它聚合物中，例如聚酰亞胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯(polyethylene)、聚乙烯(polyvinyl)、聚二乙炔、聚亞苯基亞乙烯基(polyphenylene-vinylene)、多肽、多糖、聚砜、聚吡咯、聚咪唑、聚噻吩、聚醚、環(huán)氧化物、石英玻璃、硅膠、硅氧垸、多磷酸鹽、水凝膠、瓊脂糖、纖維素等。肽試劑可以通過結(jié)合對分子間的相互作用連接于固體支持物。這種結(jié)合對是熟知的，本文它處描述了例子。通過上述技術(shù)將結(jié)合對物的一個(gè)成員偶聯(lián)于固體支持物，結(jié)合對物的另一成員與肽試劑相連(合成之前、期間或之后)。如此修飾的肽試劑與樣品接觸后，可與溶液中的致病性朊病毒(如果存在的話)相互作用，然后使固體支持物與肽試劑(或肽-朊病毒復(fù)合物)接觸。對于該實(shí)施方式，優(yōu)選的結(jié)合對包括生物素和親和素及生物素和鏈霉親和素。本發(fā)明試驗(yàn)也可用合適的對照。例如，這些試驗(yàn)中可用Prpe的陰性對照。這些試驗(yàn)也可用PrpSe(或PrPres)的陽性對照。下述替代對照也可用于本發(fā)明。為進(jìn)行上述檢測試驗(yàn)，可用試劑盒提供上述試驗(yàn)試劑(包括本文所述肽試劑)，試劑盒中裝有合適的使用說明書和其它必需的試劑。在肽試劑偶聯(lián)于固體支持物時(shí)，所述試劑盒還可裝有偶聯(lián)于一種或多種固體支持物上的這種肽試劑。試劑盒還可裝有一種或多種抗-朊病毒抗體?？蓹z測地標(biāo)記或者可在固體支持物上提供這種抗-朊病毒抗體。所述試劑盒還可裝有上述合適的陽性和陰性對照。根據(jù)所用的具體檢測試驗(yàn)，所述試劑盒也可裝有合適的標(biāo)記物和其它包裝的試劑和材料(即，洗滌緩沖液、培育緩沖液)。V.替代對照本文所述的替代對照分子可用于朊病毒檢測試驗(yàn)。也提供了包含替代對照的組合物和利用這些替代對照的方法。雖然以前描述了用于免疫測定的人工對照(參見，例如美國專利號5,846,738;5,491,218;6,015,662;6,281,004和國際專利公布號WO99/33965)，但這些分子不適用于朊病毒試驗(yàn)。不能用作對照。在某些方面，替代對照能和優(yōu)先與病原性朊病毒蛋白相互作用的肽試劑相結(jié)合。因此，在這些方面，本發(fā)明(替代對照物及其用法)部分依賴于以下申請2004年8月13日提交的美國系列號10/917,646;2005年2月11日提交的美國系列號11/056,950;2004年8月13日提交的PCT申請?zhí)朠CT/US2004/026363所述的發(fā)現(xiàn)，即朊病毒蛋白的較小片段能優(yōu)先與朊病毒的致病性形式相互作用。顯示能與致病性朊病毒同種型優(yōu)先相互作用的這些片段無需是較大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或其它類型的支架分子的一部分。雖然不想遵循任何具體理論，看來這些肽片段自發(fā)采取的構(gòu)象可能是模擬了非致病性同種型的構(gòu)象而能與致病性朊病毒同種型而不與非致病性朊病毒同種型結(jié)合。不難將構(gòu)象疾病蛋白的某些片段能優(yōu)先與該構(gòu)象疾病蛋白(本文為朊病毒)的致病性形式相互作用的這種通用原理應(yīng)用于其它構(gòu)象疾病蛋白來產(chǎn)生能優(yōu)先與致病性形式相互作用的肽試劑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)知道，雖然這些片段提供了起始點(diǎn)(例如，就大小或序列特征而言)，但可對這些片段作出許多修飾來產(chǎn)生具有更理想屬性(例如，親和力較高、穩(wěn)定性較高、溶解性較高、蛋白酶敏感性較低、特異性較高、易于合成等)的肽試劑。因此，本文所述替代對照能與朊病毒結(jié)合試劑結(jié)合，包括2004年8月13日提交的國際申請?zhí)朠CT/US2004/026363所述肽試劑以及這些肽試劑的抗體(或其片段)和/或其它朊病毒抗體。因此，對于朊病毒試驗(yàn)，這些替代對照提供了簡單而有效的無感染性陽性對照和/或用作質(zhì)量控制，可用于確認(rèn)實(shí)際上任何生物學(xué)或非生物學(xué)樣品中(包括活的或死的大腦、脊髓或其它神經(jīng)系統(tǒng)組織以及血液)朊病毒相關(guān)疾病的診斷結(jié)果。此外，可利用任何合適的信號放大系統(tǒng)來進(jìn)一步檢測試驗(yàn)中的替代對照，包括但不限于利用多個(gè)識別位點(diǎn)、支鏈DNA來放大信號(參見，例如美國專利號5,681,697;5,424,413;5,451,503;5,4547,025;和6,235,483);應(yīng)用耙擴(kuò)增技術(shù)，例如PCR、滾環(huán)擴(kuò)增、ThirdWave的侵入物(Armda等，2002Expert.Rev.Mol.Diagn.2:487;美國專利號6090606、5843669、5985557、6090543、5846717)、NASBA、TMA等(美國專利號6,511,809;EP0544212A1);和/或免疫-PCR技術(shù)(參見，例如美國專利號5,665,539;國際公布WO98/23962;WO00/75663和WO01/31056)。本文所述的無感染性分子可用作朊病毒檢測試驗(yàn)，特別是檢測樣品中致病性朊病毒試驗(yàn)的替代對照。本文所述的替代對照可用作陽性對照來確認(rèn)朊病毒檢測/分離方法的精確性和/或作為質(zhì)量控制以確保試驗(yàn)試劑和方法符合合格試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。所述替代對照最有用的試驗(yàn)通常用朊病毒結(jié)合試劑來"捕捉"待檢測的朊病毒，所述朊病毒結(jié)合試劑可以是能優(yōu)先與致病性朊病毒蛋白相互作用的肽試劑。"捕捉"表示利用肽試劑來固定或局限朊病毒。朊病毒結(jié)合試劑和"捕捉"的朊病毒蛋白通常形成的復(fù)合物可由本文進(jìn)一步描述的方法檢測。常用檢測試劑來檢測該復(fù)合物。檢測試劑通常是朊病毒結(jié)合試劑，一般經(jīng)可檢測標(biāo)記(或可標(biāo)記的，例如以第一檢測抗體和標(biāo)記的第二抗體為例)。本發(fā)明的替代對照包含能與朊病毒試驗(yàn)的朊病毒結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的第一結(jié)構(gòu)域。例如，在一方面，該第一結(jié)構(gòu)域能結(jié)合優(yōu)先與PrpSe相互作用的肽試劑。替代對照也可包含一種或多種可檢測標(biāo)記物，從而能方便地檢測替代對照與朊病毒結(jié)合試劑(例如，肽試劑)的結(jié)合。在一方面，替代對照具有雙功能(或者，在一些情況中具有三功能)，即它們包含試劑第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，該第二結(jié)構(gòu)域包含能與朊病毒試驗(yàn)中檢測試劑結(jié)合的分子。例如，如果檢測試劑包含抗體，則第二結(jié)構(gòu)域可包含該抗體可識別的表位(或模擬表位)?；蛘?，該第二結(jié)構(gòu)域和檢測試劑各自可包含結(jié)合對分子(例如，生物素和鏈霉親和素等)的一個(gè)成員。因此，第一和第二結(jié)構(gòu)域通常是彼此不同的分子，但在一些情況中可以是相同的分子。雙功能替代物的第二結(jié)構(gòu)域可直接結(jié)合可檢測標(biāo)記的檢測試劑?；蛘撸诙Y(jié)構(gòu)域可識別檢測系統(tǒng)的某組分。例如，在某些免疫測定中(例如，ELISA)，通過與第一抗體結(jié)合來檢測分析物(例如，朊病毒或替代對照)，該第一抗體進(jìn)而與可檢測標(biāo)記的第二抗體結(jié)合。因此，在某些實(shí)施方式中，第二結(jié)構(gòu)域可識別雙抗體檢測試劑系統(tǒng)中的第一抗體。本發(fā)明的雙功能(或三功能)替代對照可以是一種分子(例如，包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的融合或嵌合蛋白質(zhì))或分別合成然后彼此共價(jià)或非共價(jià)相連的兩種(或多種)分子。這些分子可以本領(lǐng)域己知的任何方式相連，只要能保留這些結(jié)構(gòu)域的結(jié)合功能。含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的雙功能替代對照在所述兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間也可包含一個(gè)或多個(gè)接頭。本文所述的雙功能替代對照優(yōu)選用于朊病毒檢測試驗(yàn)，所述試驗(yàn)利用能優(yōu)先與Prpse相互作用的一種或多種肽試劑作為朊病毒結(jié)合試劑。許多抗-PrP抗體及其所識別的PrP表位是己知的，例如表A所示。表A:PrP抗體和表位<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>110-118,20015)Leclerc等，J.Mol.Biol"326:475-483,2003FabHuM-R72倉鼠朊病毒蛋白的152-163EN顧RYPNQVYY(SEQIDNO:275)InPro1)Williamson等，J.Virol.,72:9413-9418,1998.2)Peretz等，J.Mol.Biol"273:614-622,1997.3)Mats麗ga等，Proteins,44:10-118,2001.小鼠抗-朊病毒蛋白識別綿羊、牛、黑尾鹿、麋鹿和白尾鹿組織中反芻類動物朊病毒蛋白上的保守表位(QYQRES)(SEQIDNO:276)。VMRD,Inc.Spraker等，J.Vet.Diagn.Invest.14(l):3-7(2002)除了以上列出的抗體和表位，用本文所述肽試劑產(chǎn)生的抗體，這些抗體的片段，這些抗體的表位或模擬表位也可用于本發(fā)明替代對照中。如上所述，根據(jù)該試驗(yàn)所用的朊病毒結(jié)合試劑和檢測試劑選擇替代對照的第一和第二結(jié)構(gòu)域。表B、C和D提供了示范性替代對照的非限制性例子。具體地說，表B顯示了當(dāng)該試驗(yàn)的朊病毒結(jié)合試劑是本文所述肽試劑和第一結(jié)構(gòu)域能識別該肽試劑時(shí)的示范性替代對照。表B:肽試劑免疫測定所用的雙功能替代對照<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>表c顯示了當(dāng)該試驗(yàn)的朊病毒結(jié)合試劑包含本文所述肽試劑和第一結(jié)構(gòu)域識別該肽的輔助基序時(shí)的示范性替代對照。該輔助基序可以是，例如可檢測標(biāo)記物、結(jié)合對的一個(gè)成員(例如，生物素、His-6)、不依賴于PrP吸下肽序列而可被識別的肽。替代物的第一結(jié)構(gòu)域包含能識別該肽試劑的輔助基序的分子，例如抗體(或其片段)、適體、蛋白質(zhì)等。表C:肽試劑-輔助基序免疫測定所用的雙功能替代對照<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>表D描述了其第一結(jié)構(gòu)域包含該試驗(yàn)中用作朊病毒結(jié)合試劑的抗體所識別表位的示范性替代對照。進(jìn)而第二替代結(jié)構(gòu)域包含該檢測試劑(識別PrP的抗體)所識別的表位。表D:朊病毒免疫測定所用的雙功能替代對照<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>在本文所述的任一替代對照中，一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域可包含多個(gè)識別位點(diǎn)。當(dāng)檢測方法采用雙抗體夾心型ELISA時(shí)，替代對照可包含能與"重捕獲"抗體結(jié)合的第三結(jié)構(gòu)域。例如，如果用SAF32抗體來重捕獲解離的致病性朊病毒蛋白，而3F4抗體用作檢測抗體，除能與"吸下"步驟所用的肽試劑結(jié)合的結(jié)構(gòu)域外，替代對照還可包含SAF32和3F4抗體識別的表位。VI.其它應(yīng)用A.檢測如上所述，可用本文所述檢測致病性朊病毒蛋白的方法來診斷對象的朊病毒疾病。此外，也可用上述方法檢測血液和/或食物供應(yīng)中的致病性朊病毒污染。因此，可用本文所述檢測方法篩檢各收集樣品或合并樣品的等份試樣來制備基本上不含致病性朊病毒的血液供應(yīng)品。可在合并前除去污染了致病性朊病毒的樣品或要合并樣品。以此方法可提供基本上不含致病性朊病毒污染的血液供應(yīng)品。"基本上不含致病性朊病毒"表示采用本文所述任何試驗(yàn)未檢測到有致病性朊病毒存在。重要的是，已顯示能檢測用正常組織稀釋106倍的腦組織中致病性蛋白形式的本文所述肽試劑是唯一經(jīng)證實(shí)能檢測血液中致病性朊病毒的試劑。因此，本發(fā)明提供制備基本上不含致病性朊病毒的血液供應(yīng)品的方法，所67述血液供應(yīng)品包括全血、紅細(xì)胞、血漿、血小板或血清，所述方法包括(a)用本文提供的任何檢測方法篩檢收集血液樣品的全血、紅細(xì)胞、血漿、血小板或血清的等份試樣；和(b)只合并未檢測到致病性朊病毒的樣品以提供基本上不含致病性朊病毒的血液供應(yīng)品。類似地，可篩檢食物供應(yīng)品中是否存在致病性朊病毒來提供基本上不含致病性朊病毒的食物。因此，可釆用本文所述任何方法篩檢用作人或動物消耗食物的活動物樣品中是否存在致病性朊病毒。也可篩檢取自要進(jìn)入食物供應(yīng)的食物產(chǎn)品的樣品。鑒定或檢測樣品中是否有致病性朊病毒，除去欲進(jìn)入食物供應(yīng)的其樣品檢測出致病性朊病毒的活動物或食物。以此方式可提供基本上不含致病性朊病毒的食物供應(yīng)品。因此，本發(fā)明提供制備基本上不含致病性朊病毒的食物供應(yīng)品的方法，所述方法包括(a)用本文提供的檢測致病性朊病毒的任何方法篩檢從要進(jìn)入食物供應(yīng)的活動物收集的樣品或從要進(jìn)入食物供應(yīng)的食物收集的樣品；和(b)只合并未檢測到致病性朊病毒的樣品以提供基本上不含致病性朊病毒的食物供應(yīng)品。實(shí)施例下文是實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施方式的實(shí)施例。提供這些實(shí)施例只是為說明目的，不應(yīng)理解為以任何方式限制了本發(fā)明的范圍。已努力確保所用數(shù)字(例如，用量、溫度等)的精確性，但當(dāng)然應(yīng)該考慮到一定的實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。實(shí)施例1:制備肽試劑基本上按照Merrifield(1969)Advan.Enzymol.32:221;Holm和Medal(1989),Multiplecolumnpeptidesynthesis(《多柱肽合成》)，第208E頁;Bayer和G.Jung編，Peptides(《肽》)，1988，WalterdeGruyter&Co.Berlin-N.Y所述采用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成朊病毒蛋白的肽片段。用HPLC純化各肽，質(zhì)譜驗(yàn)證序列。與野生型序列相比，在某些情況中，合成的肽在N或C末端包含其它殘基，例如GGG殘基和/或包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。A.擬肽取代也在SEQIDNO:14(QWNKPSKPKTN，對應(yīng)于SEQIDNO:2的殘基97-107)、SEQIDNO:67(KKRPKPGGWNTGG，對應(yīng)于SEQIDNO:2的殘基23-36)和SEQIDNO:68(KKRPKPGG，對應(yīng)于SEQIDNO:2的殘基23-30)所示肽中作出擬肽取代。具體地說，用各種N-取代的擬肽取代這些肽中一個(gè)或多個(gè)脯氨酸殘基?？捎萌我桓彼崛〈臄M肽可參見圖3。如全文納入本文作為參考的美國專利號5,877,278禾P6,033,631;Simon等(1992)/Voc.淑/.爿c^/.Sc/.89:9367所述制備和合成擬肽。B.多聚化也可將某些肽試劑制備為多聚物，例如通過制備串聯(lián)重復(fù)(通過接頭，如GGG連接肽的多份拷貝)、多抗原肽(MAPS)和/或線形連接的肽。具體地說，基本上如Wu等(2001)C&mSoc.2001123(28):6778-84;Spetzler等(1995)/尸e;^/Vofe/"i^.45(1):78-85所述采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備MAPS。也采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用聚乙二醇(PEG)接頭制備線形和支鏈肽(例如，PEG接頭多聚化)。具體地說，制備具有以下結(jié)構(gòu)的支鏈多個(gè)肽PEG支架(branchedmultipeptidePEGscaffold):生物素-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys(非肽對照)和生物素陽PEG-Lys(肽)-PEG-Lys(肽)-PEG-Lys(肽)-PEG-Lys(肽)-PEG-Lys(肽)。此外，制備與Lys相連的肽Lys-s-NH-CO-(CH2)3-Mal-S-Cys-肽。參見圖5。C.生物素化合成和純化后按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生物素化各肽。將生物素加入各肽的N-或C-末端。實(shí)施例2:結(jié)合試驗(yàn)A.吸下用磁珠吸下試驗(yàn)檢驗(yàn)本文所述肽試劑特異性結(jié)合朊病毒蛋白的能力。對于該試驗(yàn)，用生物素標(biāo)記肽試劑(使其與鏈霉親和素包被的磁珠相連)或與磁珠共價(jià)連接。制備RMLPrpSe+和PrPc+Balb-c小鼠的腦勻漿液。簡言之，將含1%TW20和1%triton100的5mLTBS緩沖液(50mMTris-HClpH7.5和37.5mMNaCl)加入重約0.5g大腦以產(chǎn)生10%勻漿液。勻漿(dounce)腦漿液直至大顆粒消失。將用緩沖液作1:l稀釋的200pl等份試樣加入預(yù)冷的微量離心管中，超聲處理樣品數(shù)次，每次數(shù)秒。500X離心樣品10-15分鐘，取出上清液。為檢驗(yàn)蛋白酶K的消化作用，將某些上清液分成兩份樣品，向一份樣品中加入4pl蛋白酶K，37"C搖動l小時(shí)。向蛋白酶K試管中加入8微升PMSF以終止消化，試管在4'C培育最少1小時(shí)。此外，也檢驗(yàn)了用生物素化肽和鏈霉親和素磁珠的不同形式吸下效果。在第一組實(shí)驗(yàn)中，將傳染性腦勻漿液與生物素化肽混合，然后加入鏈霉親和素珠。在第二組實(shí)驗(yàn)中，用生物素化肽包被磁性鏈霉親和素珠，然后與傳染性腦勻槳液混合。在兩組實(shí)驗(yàn)中，所有三種組分(珠、肽和腦勻漿液)一起培育后，洗滌混合物，室溫下用3MGdnSCN處理15分鐘，如下所述進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。如圖14所示，第二種形式(先用生物素化肽包被，再與腦勻漿液混合)分離(吸下)PrP"的效果比第一種形式(生物素化肽與腦勻漿液混合后加入珠)高約100倍。根據(jù)這些結(jié)果，按照第二種形式進(jìn)行其它檢測實(shí)驗(yàn)。將勻漿液保存于4'C直至進(jìn)一步使用，如果需要再次進(jìn)行上述超聲波處理。如下所述，4'C下將腦勻漿液的10%w/vPrP"或PrpSe+制品與生物素標(biāo)記肽試劑培育過夜。準(zhǔn)備含有400lal緩沖液、50pl提取物和5pl生物素標(biāo)記肽試劑(10mM儲備液)的試管。室溫下用臺式搖床(platformrocker)培育這些試管至少2小時(shí)，或4。C培育過夜。培育后，加入50plSA-珠(DynalM280鏈霉親和素112.06)，旋振混合試管。室溫?fù)u動(VWR，搖動平臺，IOO型)培育試管1小時(shí)，或在4'C培育過夜。從搖床中取出樣品，置于磁場中以收集連有肽試劑和朊病毒的磁珠，用1ml試驗(yàn)緩沖液洗滌5-6次。立即使用樣品或在-2(TC保存直至進(jìn)行下述蛋白質(zhì)印跡或ELISA。B.蛋白質(zhì)印跡如下所述進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。將25-30^SDS緩沖液(NovexTris-甘氨酸SDS-樣品緩沖液2X)加入各試管作最后一次洗滌后使上述沉淀的珠-肽-朊病毒復(fù)合物變性。旋振混合各試管直至所有珠懸浮。煮沸各試管直至蓋子開始打開，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至固體膜進(jìn)行WB分析。室溫下用5。/。牛奶/TBS-T[50ml1MTrispH7.5;37.5ml4MNaCl，1-10mL吐溫，用牛奶將體積調(diào)節(jié)至1L]封閉膜30分鐘。如2003年9月30號提交的名為"PrionChimerasandUsesThereof"(朊病毒嵌合體及其應(yīng)用)的國際申請?zhí)朠CT/US03/31057所述(該份申請納入本文作為參考)，將10-15ml的抗-朊病毒多克隆抗體的1:50倍稀釋液加入膜，室溫培育1小時(shí)。用TBS-T洗滌膜多次。洗滌后，加入以1:1000稀釋(用TBS-T)的偶聯(lián)有堿性磷酸酶(AP)的第二抗體(山羊抗-家兔lgG(H+L)抗體)(Pierce),室溫下培育20分鐘。用TBS-T洗滌膜多次。加入堿性磷酸酶沉淀試劑(1-步NBT/BCIP)(Pierce)并顯色直至看見背景或信號明顯。C.ELISA如下所述進(jìn)行間接ELISA。(圖7)。(間接ELISA用抗原包被平板，在此情況中，用吸下步驟得到的PrP包被各平板，未標(biāo)記第一抗體對抗原特異，標(biāo)記第二抗體能結(jié)合第一抗體)。如上所述吸下得到各樣品中的PrP"。簡言之，用一種或多種本文所述肽試劑包被磁珠，等份加入96-孔板。將小鼠腦勻漿液、摻加了Prpse的人血漿、正常和搔癢癥大腦的金黃倉鼠(SHa)腦勻漿液、人vCJD腦和正常與患病(CWDPrpSe)的鹿PrP基因轉(zhuǎn)基因小鼠的腦勻漿液的樣品和肽試劑包被珠室溫培育4小時(shí)以使樣品中的任何Prpse與肽試劑包被珠結(jié)合。用肽試劑珠捕獲Prpse后，使各板暴露于磁場和除去上清液，洗滌各孔除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后使結(jié)合肽的PrpSe與肽珠解離。由于仍沒有能識別天然(未變性)PrpSe的抗體，故在變性條件下解離PrPSe，即用3M或6M硫氰酸胍(GdnSCN)培育。參見，例如Peretz等，(1997)Mo/.腸/.273(3):614-622;Ryou等，(2003)/"my/.83(6):837-43。通過與0.1MNaHCO3，pH8.9(110pi/孔)培育將解離的Prpse包被到各平板上，采用抽吸和洗滌(3X含0.05%TW20的200piTBS)除去各孔中的珠。洗滌后，在37'C用TBS配制的200^3%BSA封閉各孔(用樣品中的任何PrP&包被)1小時(shí)。然后抽去各孔的封閉液，將TBS配制含1。/。BSA的100pi0.5嗎/ml第一FabD18溶液(Peretz等，(2001)胸訓(xùn)412(6848):739-743)加入各孔，37°〇培育2小時(shí)。然后用含0.05%TW2的300[UTBC洗滌各孔9次。將偶聯(lián)有堿性磷酸酶(AP)的山羊抗-人抗體(100pl的1:5000稀釋液)加入各孔，平板在37。C培育1小時(shí)。洗滌后(9X含0.05%TW2的300plTBC)，將100plAP底物加入各孔，平板在37。C培育0.5小時(shí)，讀取各板孔的光密度(OD)。表2和圖7-12顯示了間接ELISA的結(jié)果。表2顯示了各種肽試劑的O.D.值。超過空白對照的O.D.值(范圍是0.172-0.259)判為陽性。圖8顯示了摻加了各種稀釋度的傳染性朊病毒顆粒的小鼠腦勻漿液中PrpSe的ELISA檢測結(jié)果。如上所述進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。LD5。定義為殺死50%動物的PrpSe致死劑量，已測定了包括小鼠在內(nèi)的許多嚙齒類模型。參見，例如Klohn等，(2003)PracA^/v4caafSc〖t/S爿100(20):11666-11671。ELISA試驗(yàn)檢測到的血漿和暗黃覆蓋層中朊病毒傳染性低于100LD5o單位，這是檢測血液樣品中朊病毒的所需靈敏度。圖9顯示了用Q額KPSKPKTN-生物素(SEQIDNO:14)(圖9A)和生物素-GGGKRPKPGG(SEQIDNO:68)(圖9B)作為捕捉(吸下)試劑，檢測摻入人血漿中的小鼠Prpse的ELISA結(jié)果。圖10A顯示了用QWNKPSKPKTN-生物素(SEQIDNO:14)和生物素-GGGKRPKPGG(SEQIDNO:68)吸下而不用蛋白酶K(PK)消化的正常和PrPSe感染的金黃倉鼠(SHa)l^10%腦勻槳液(購自VAMedicalCenter,巴爾的摩，馬里蘭州)的ELISA檢測結(jié)果。圖IOB描述經(jīng)PK消化樣品的蛋白質(zhì)印跡分析。圖ll顯示了攜帶鹿PrP基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(得自Gle皿Telling,肯塔基州立大學(xué)，參見Browning等，(2004)Wro/.78(23):13345-13350)中PrPSe的ELISA檢測結(jié)果。如上所述，用QWNKPSKPKTN-生物素(SEQIDNO:14)、生物素-KKKAGAAAAGAVVGLGG-CONH2(SEQIDNO:136)和GGGKRPKPGG(SEQIDNO:68)吸下PrPSe，通過ELISA檢測。圖12顯示了通過蛋白質(zhì)印跡(12A)和ELISA(圖12B)檢測各種CJD樣品中的PrPSc。圖13顯示了用本文所述以下各種肽來檢測vCJD腦勻漿液中的PrPSe:QWNKPSKPKTN-生物素(SEQIDNO:14);QWNKPSKTTKTNGGGQWNKPSKPKTN-生物素(SEQIDNO:51);生物素-QWNKPSKPKTN，其中P5用N-(3,5-二甲氧基芐基)甘氨酸取代(SEQIDNO:117);生物素-QWNKPSKPKTN，其中P5用N-氨基丁基甘氨酸取代(SEQIDNO:118);生物素-QWNKPSKPKTN，其中P8用N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸取代(SEQIDNO:111);生物素-QWNKPSKPKTN，其中P8用N-氨基丁基甘氨酸取代(SEQIDNO:114);生物素-QWNKPSKPKTN，其中P5用N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸取代和P8用N-氨基丁基甘氨酸取代(SEQIDNO:131);生物素-QWNKPSKPKTN，其中P5用N-(異丙基)甘氨酸取代和P8用N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸取代(SEQIDNO:132);Q額KPSKPKTN2K-生物素(SEQIDNO:133;圖6);生物素-GGGKKRPKPGG(SEQJDNO:68);生物素-KKRPKPGG，其中P6用N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸取代(SEQIDNO:122);生物素-GGGKKRPKPGGGQWNKPSKPKTN(SEQIDNO:81);4隱支鏈MAPS-GGGKKRPKPGGWNTGGG-生物素(SEQIDNO:134);8-支鏈MAPS-GGGKKRPKPGGWNTGGG-生物素(SEQIDNO:135);生物素-KKKAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM(SEQIDNO:57);生物素-KKKAGAAAAGAVVGGLGG-CONH2(SEQIDNO:136);和生物素-GGGKKKKKKKK(SEQIDNO:85)。D.結(jié)果表2和圖8-14總結(jié)了蛋白質(zhì)印跡和間接ELISA結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果。簡言之，不必用蛋白酶K消化腦勻漿液來檢測本文所述肽試劑與PrPSt:的特異性結(jié)合。如圖4所示，無一例觀察到與野生型腦勻漿液有結(jié)合，表明肽試劑與PrpSe特異性結(jié)合。圖8-14顯示了不同物種的靈敏度和特異性。此外，上述蛋白質(zhì)印跡分析可檢測低于4個(gè)log稀釋度的PrPSe，而ELISA比蛋白質(zhì)印跡靈敏至少10倍。因此，本文所述肽試劑能進(jìn)行簡單的單孔高通量試驗(yàn)來有效檢測生物學(xué)樣品中是否存在各種物種的PrpSe，檢測靈敏度達(dá)到100LD5o以下并且無需蛋白酶K消化。表2肽試劑(在N-或C-末端用生物素標(biāo)記)序列編號蛋白質(zhì)印跡ELISAA405nm3CGG5WGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHVjC35+0.687jGGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHV36+NDGGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHV337+NDC^GGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHV'C40+ND<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>1:目測觀察評估相對信號強(qiáng)度2:環(huán)化的3:加入/插入所示位置的GGGG殘基4:加入/插入所示位置的GGG殘基5:加入/插入所示位置的GG殘基6:加入/插入所示位置的KKK殘基ND=未檢測也進(jìn)行了丙氨酸掃描來鑒定參與結(jié)合的殘基。表3顯示了結(jié)果。表3肽試劑(在N-或C-末端用生物SE(JIDNO蛋白質(zhì)印跡ELISA素標(biāo)記)A405nmQ西KPSKPKTN14+++0.775QANKPSKPKTN89+++0.245QWNAPSKPKTN92+0.283Q畫KPSAPKTN93+0.256Q，KPSKPATN94+0.230QWNKASKPKTN99+/-0.250Q，KPSKAKTN91+0.260QWNKASKAKTN95-0.241QWAKPSKPKTN100ND0.376QWNKPAKPKTN101ND0.356QWNKPSKPKAN102ND0.234QWNKPSKPKTA103ND0.262KKRPKPGG68+++0.765AKRPKPGG104+0.273KARPKPGG105+0.256KKAPKPGG106+0.268KKRPAPGG107+0.578KKRAKPGG96++2.19KKRPKAGG97++1.24KKAPKAGG賜+1.46此外，如表4所示，用許多N-取代的甘氨酸(擬肽)取代脯氮酸殘基進(jìn)一步提高了含SEQIDNO:14、SEQIDNO:67和SEQIDNO:68的肽試劑與PrPSc的結(jié)合。也參見圖13。表4蛋白質(zhì)印跡ELISAA405nma在(GGGQWNKPSK^KTN中(SEQIDNO:14)脯氨酸+++0.775N-(S)-(l-苯基乙基)甘氨酸(圖3A中以圓圈表示的擬肽)(SEQIDNO:109)++0.865N-(4-羥基苯基)甘氨酸(圖3B中以圓圈表示的擬肽)(SEQIDNO:110)-0.934N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸(圖3C中以圓圈表示的擬肽)(SEQIDNO:111)++1.141N-(異丙基)甘氨酸(圖3D中以圓圈表示的擬肽)(SEQIDNO:112)ND0.974N-(3,5-二甲氧基芐基)甘氨酸(圖3E中以圓圈+++2.045<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>a在(GGG)iKKITKPGGWNTGG中(SEQIDNO:67)N-氨基丁基甘氨酸(SEQIDNO:249)NDNDN-(3，5-二甲氧基芐基)甘氨酸(SEQIDNO:250)NDNDN-(異丙基)甘氨酸(SEQIDNO:251)NDNDN-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸(SEQIDNO:252)NDND嗜(GGG)^KR頭KPGG中(SEQIDNO:68)N-氨基丁基甘氨酸(SEQIDNO:253)NDNDN-(3，5-二甲氧基芐基)甘氨酸(SEQIDNO:254)NDNDN-(異丙基)甘氨酸(SEQIDNO:255)NDNDN-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸(SEQIDNO:256)NDND1該表格所示實(shí)驗(yàn)用的肽試劑中不存在任選的GGG接頭此外，結(jié)合PrpSe的肽試劑多聚化也提高了對PrpSe的親和力。具體地說，串聯(lián)重復(fù)比單拷貝產(chǎn)生更強(qiáng)烈的信號(蛋白質(zhì)印跡檢測)。在某些情況中，珠上預(yù)先衍生的MAP形式使結(jié)合提高了兩倍。然而，MAP形式導(dǎo)致溶液中的肽沉淀。也檢測到線形連接的肽能提高結(jié)合而不導(dǎo)致沉淀。實(shí)施例3-夾心ELISA和pH解離如實(shí)施例2所示，離液劑，例如胍鹽能有效地使吸下步驟中捕獲的PrPse解離并變性。然而，必須除去或大量稀釋胍鹽以使變性的朊病毒蛋白與抗-朊病毒抗體(用于，例如檢測PrP)接觸。對于直接或間接ELISA(其中相當(dāng)大量的PrP直接包被在微量滴定板上)，這不是問題，但對于夾心ELISA是個(gè)問題。我們開發(fā)了替代方法來使肽試劑捕獲的Prpse變性，該方法不用Gdn且無需額外洗滌或加入大量稀釋液。該方法采用pH處理(高pH或低pH)使Prpse變性。變性的PrP可與肽試劑解離。通過中和溶液不難除去變性條件。與肽試劑解離后，利用2種不同的抗-朊病毒抗體(一種用于"捕捉"，一種用于檢測)進(jìn)行夾心ELISA來檢測PrPse。利用3MGdnSCN或者高或低pH的pH處理使朊病毒蛋白解離和變性來進(jìn)行這些測定。下文概述了這些實(shí)驗(yàn)的方案。將鏈霉親和素磁珠(M-280Dynabeads)與含SEQIDNO:68的生物素化肽試劑混合，洗滌以除去未結(jié)合的肽試劑。用肽包被的珠吸下?lián)饺牒?0%人血漿的100pl溶液中的0.025nl人vCJD10%腦勻漿液。37。C混合l小時(shí)后，洗滌珠，用不同pH的溶液處理。室溫下培育10分鐘后，將溶液調(diào)節(jié)至約7的中性pH。將含解離和變性的朊病毒蛋白的上清液加入已用抗-朊病毒抗體SAF32包被的微量滴定板，然后在37'C培育平板2小時(shí)。洗滌各平板，加入AP-標(biāo)記的3F4抗體作為檢測抗體。37'C培育各平板2小時(shí)，再次洗滌，加入化學(xué)發(fā)光AP底物(LumiphosPlus)，37。C培育30分鐘，用LuminoskanAscent(ThermoLabsytems)讀取A4。5。結(jié)果示于表5。該實(shí)驗(yàn)中pH解離和變性的最佳條件是0.1NNaOH(pH約13)或0.5M磷酸(pH約1)，IO分鐘。與用Gdn相比，我們用pH13或pH1處理將摻有4倍BH(即，含有100nlvCJDBH或正常BH)的人血漿樣品重復(fù)上述夾心ELISA。表6顯示了這些結(jié)果類似于以前的結(jié)果。表5.吸下的pH和Gdn變性PrP的夾心ELISA數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>表6.含100nlBH的夾心ELISA<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>類似于上述進(jìn)行夾心ELISA，但用不同的抗-朊病毒抗體作為捕捉抗體。如上所述用AP-3F4檢測。用6H4(商品化購自PrionicsAG)捕捉。也用兩種其它抗-朊病毒抗體，C2和C17作為捕捉抗體。C2能識別朊病毒蛋白N-末端八重復(fù)(區(qū)域)中的表位。C17能識別C-末端區(qū)域中殘基121-231之間的表位。該實(shí)驗(yàn)只采用高pH處理60分鐘，然后如上所述中和至pH7。為比較，用GdnSCN3M處理10分鐘。表7顯示了結(jié)果。表7.用3種不同捕捉抗體的夾心ELISA數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>實(shí)施例4:制備替代對照A.替代對照識別的肽試劑如下所示制備能識別肽試劑QWNKPSKPKTNMKHMGGG(SEQIDNO:19S，含C-末端GGG接頭)的替代對照采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備含末端半胱氨酸(DWEDRYYREC，SEQIDNO:265或CDWEDRYYRE,SEQIDNO:266)的6H4表位肽序列(DWEDRYYRE，SEQIDNO:264)，用交聯(lián)劑，例如磺基-SMCC(琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來酰亞胺基甲基]-環(huán)己烷-l-羧酸酯)將其偶聯(lián)于3F4。進(jìn)行充分透析以除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑和游離肽。在用含序列"MKHM"(SEQIDNO:261)的肽試劑(例如SEQIDNO:183、188、193、198、206、211、216、224、229、234、243或244中任一序列或從中衍生的肽試劑)的朊病毒檢測試驗(yàn)中可用如此制備的替代對照。B.替代對照識別的肽試劑的輔助基序如下所示制備能結(jié)合肽試劑GGGKKRPKPGG(SEQIDNO:14，含N-末端GGG接頭)的替代對照，其中該肽試劑還包含生物素。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備含末端半胱氨酸(DWEDRYYREC，SEQIDNO:265或CDWEDRYYRE,SEQIDNO:266)的6H4表位肽序列(DWEDRYYRE，SEQIDNO:264)，用交聯(lián)劑，例如磺基-SMCC(琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來酰亞胺基甲基]-環(huán)己垸-l-羧酸酯)將其偶聯(lián)于鏈霉親和素。充分透析以除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑和游離肽。C.夾心試驗(yàn)的雙肽結(jié)構(gòu)域替代對照如下所示制備能識別朊病毒結(jié)合試劑3F4和第一抗體6H4的雙功能替代對照。采用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成技術(shù)制備包含3F4表位、6H4表位和接頭的肽。具體地說，合成MKHMGGGGGDWEDRYYRE(SEQIDNO:267)，其中MKHM(SEQIDNO:261)是3F4所識別的表位，GGGGG(SEQIDNO:268)是接頭，DWEDRYYRE(SEQIDNO:264)是6H4所識別的表位。雖然已相當(dāng)詳細(xì)地描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但應(yīng)知道可以作出明顯的改變而不脫離本文限定的本發(fā)明構(gòu)思和范圍。權(quán)利要求1.一種檢測樣品中是否存在致病性朊病毒的方法，包括(a)提供包含肽試劑的第一固體支持物，所述肽試劑衍生自具有選自SEQIDNO12-260所示序列的肽；(b)在樣品中存在的致病性朊病毒蛋白與所述肽試劑結(jié)合的條件下使所述第一固體支持物與樣品接觸以形成第一復(fù)合物；(c)除去未結(jié)合的樣品材料；(d)使致病性朊病毒蛋白與所述第一復(fù)合物解離；和(e)利用朊病毒-結(jié)合試劑檢測解離的致病性朊病毒。2.—種檢測樣品中是否存在致病性朊病毒的方法，包括(a)提供包含肽試劑的第一固體支持物，所述肽試劑衍生自具有選自SEQIDNO:12-260所示序列的肽；(b)在樣品中存在的致病性朊病毒蛋白與所述肽試劑結(jié)合的條件下使所述第一固體支持物與樣品接觸以形成第一復(fù)合物；(C)除去未結(jié)合的樣品材料；(d)使致病性朊病毒蛋白與所述第一復(fù)合物解離；(e)分離解離的致病性朊病毒蛋白與所述第一固體支持物；(f)在解離的朊病毒蛋白與第二固體支持物附著的條件下使解離的朊病毒蛋白與第二固體支持物接觸；和(g)利用朊病毒結(jié)合試劑檢測附著在所述第二固體支持物上的致病性朊病毒。3.—種檢測樣品中是否存在致病性朊病毒的方法，包括(a)提供包含肽試劑的第一固體支持物，所述肽試劑衍生自具有選自SEQIDNO:12-260所示序列的肽；(b)在樣品中存在的致病性朊病毒蛋白與所述肽試劑結(jié)合的條件下使所述第一固體支持物與樣品接觸以形成第一復(fù)合物；(C)除去未結(jié)合的樣品材料；(d)使致病性朊病毒蛋白與所述第一復(fù)合物解離，藉此使致病性朊病毒蛋白變性；(e)分離解離變性的致病性朊病毒蛋白與所述第一固體支持物；(f)在解離的朊病毒蛋白能與抗-朊病毒第一抗體結(jié)合的條件下使解離變性的致病性朊病毒蛋白與第二固體支持物接觸；和(g)利用抗-朊病毒第二抗體檢測結(jié)合在所述第二固體支持物上的朊病毒蛋白。4.如權(quán)利要求l、2或3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述解離步驟包括使結(jié)合的致病性朊病毒蛋白與鹽或離液劑接觸。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述離液劑包括硫氰酸胍(GdnSCN)或鹽酸胍(GdnHCl)。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述GdnSCN或GdnHCl的濃度在約3M-約6M之間。7.如權(quán)利要求l、2或3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述解離步驟包括使結(jié)合的致病性朊病毒蛋白接觸高或低pH，藉此使解離的致病性朊病毒蛋白變性。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述pH高于12或低于2。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述pH在12.5-13.0之間。10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，通過加入NaOH至濃度0.05N-0.15N使結(jié)合的致病性朊病毒蛋白接觸高pH。11.如權(quán)利要求7、8、9或10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述接觸步驟進(jìn)行不超過15分鐘。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述接觸步驟進(jìn)行不超過10分鐘。13.如權(quán)利要求7、8、9或10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括將變性并解離的致病性朊病毒蛋白的pH中和至7.0-7.5之間。14.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，通過加入磷酸或其鈉鹽來中和pH。15.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一固體支持物包括磁珠。16.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述朊病毒結(jié)合試劑是抗-朊病毒抗體。17.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一或第二固體支持物包括微量滴定板或磁珠。18.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一或第二抗-朊病毒抗體與變性形式的朊病毒蛋白結(jié)合。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述抗-朊病毒第一或第二抗體識別朊病毒蛋白氨基末端中的表位。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述抗-朊病毒第一或第二抗體識別朊病毒蛋白殘基23-90內(nèi)的表位。21.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述抗-朊病毒抗體選自FabD18、3F4、SAF-32、6H4。22.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述肽試劑衍生自具有選自SEQIDNO:66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、122、123、124、125、126、127、14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、101、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、131、132、133、134、135、136、56、57、65、82和84中一條或多條序列的肽。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述肽試劑衍生自具有選自SEQIDNO:66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、122、123、124、125、126、127、134和135中一條或多條序列的肽。24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述肽試劑衍生自具有選自SEQIDNO:14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、101、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、129、130、131、132、133或128中一條或多條序列的肽。25.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述肽試劑衍生自具有選自SEQIDNO:56、57、65、82、84和136中一條或多條序列的肽。26.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述肽試劑衍生自具有選自SEQIDNO:14、51、117、118、111、114、131、132、133、68、122、81、134、135、57、136和85中一條或多條序列的肽。27.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述肽試劑包含SEQIDNO:14。28.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述肽試劑包含SEQIDNO:51。29.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述肽試劑包含SEQIDNO:68。30.—種用于朊病毒檢測試驗(yàn)的替代對照，所述替代對照包含與肽試劑結(jié)合的第一替代結(jié)構(gòu)域，所述肽試劑衍生自具有選自SEQIDNO:12-260序列的肽；和結(jié)合朊病毒試驗(yàn)所用檢測試劑的第二替代結(jié)構(gòu)域，其中所述朊病毒檢測試驗(yàn)利用肽試劑和檢測試劑來檢測樣品中是否存在致病性朊病毒蛋白。31.—種檢測樣品中是否存在致病性朊病毒的方法，包括(a)在允許第一肽試劑與假使存在的致病性朊病毒蛋白結(jié)合的條件下使懷疑含有致病性朊病毒的樣品在檢驗(yàn)容器中與優(yōu)先和致病性朊病毒蛋白相互作用的第一肽試劑接觸以形成第一復(fù)合物；(b)在允許替代對照與所述第一肽試劑結(jié)合的條件下使所述第一肽試劑在對照容器中與權(quán)利要求30所述的替代對照接觸；(c)通過致病性朊病毒與所述第一肽試劑的結(jié)合檢測樣品中可能存在的致病性朊病毒；和(d)通過檢測存在與所述第一肽試劑結(jié)合的替代對照來確認(rèn)存在所檢測的致病性朊病毒。全文摘要本發(fā)明描述了能優(yōu)先與PrP^sc形式的朊病毒蛋白相互作用的肽制劑可用于檢測生物學(xué)樣品中的PrP^sc。具體地說，描述了ELISA試驗(yàn)。文檔編號G01N33/53GK101166976SQ200680006225公開日2008年4月23日申請日期2006年1月13日優(yōu)先權(quán)日2005年1月13日發(fā)明者C·胡,D·佩列茲,M·科諾利,M·米切利特謝,M·高,R·楚克曼,T·霍恩,X·王申請人:諾華疫苗和診斷公司