專利名稱：用于分離微生物的方法和裝置的制作方法
用于分離孩吏生物的方法和裝置本發(fā)明涉及微生物的分離。4艮多孩i生物在生長的同時(shí)合成生物膜(biofilm)。除了細(xì)菌之 外，真菌、藻類、原生動物同樣形成生物膜。因此，在很多領(lǐng)域生物膜是普遍存在的，由于生物膜，而存在 衛(wèi)生危害，它們有時(shí)會引起相對大的損害。當(dāng)生物膜生長時(shí)，首先是細(xì)菌附著到載體上然后在載體上群集 化(或拓殖)。細(xì)菌繁殖從而快速形成由細(xì)胞體的細(xì)胞層構(gòu)成的膜， 該細(xì)胞層分泌胞外多糖厚層，其起到免受環(huán)境介質(zhì)侵入的保護(hù)作用 (COSTERTON 5We"ce， vol. 284(5418)， p :1318-22, 1999 )。生物膜形成的動力學(xué)可以分成5個步驟(

圖1):上，從而形成"調(diào)節(jié)膜(film conditionnant)"。-黏附或可逆附著:存在的孩t生物通過重力作用、布朗運(yùn)動或 者通過趨化性(如果具有鞭毛)而靠近表面。在該連4妾(或固定) 的第一步驟，僅僅涉及純粹的物理現(xiàn)象以及發(fā)生微弱的物理化學(xué)相 互作用，孩i生物仍能4艮容易地脫離出來。-附著:這個更慢的步驟涉及與更強(qiáng)能量的相互作用以及微生 物代謝和微生物的細(xì)胞附屬物(鞭毛、纖毛，...)。附著是一個活 躍且特異的現(xiàn)象。特別是由于胞外多糖(EPS)的合成，第一批移 生菌(colonisateurs )將不可逆地連接到表面上。這個過程相對緩'f曼， 并依賴于環(huán)境因素和所存在的微生物。生物膜的成熟(生長和表面掛膜):附著到表面之后，細(xì)菌繁 殖并且重新集聚以形成被聚合物圍繞的微菌落。該聚合物基質(zhì)(或 多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物)將起如同膠合劑的作用，并加強(qiáng)細(xì)菌彼此間 的耳關(guān)系以及與表面的耳關(guān)系以最終形成生物膜，并達(dá)到平4軒狀態(tài)。該 生物膜通常以構(gòu)成限制點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)生長。該孩史環(huán)境將是浮游生物 生長方式相關(guān)的多種生理》務(wù)飾和分子》務(wù)飾的場所。如果條件允許， 以這種方式形成的生物膜將占據(jù)提供給它的所有表面。盡管某些種 類的孩i生物不合成EPS或者只有4艮少的聚合物同樣能夠在表面上 附著并形成生物膜，生物力莫的成熟一^:均與EPS的生成相關(guān)。脫落:生物膜是永久動態(tài)平衡的結(jié)構(gòu)并根據(jù)載體、微生物和環(huán) 境而變化。前述變化可以表現(xiàn)為細(xì)胞或者聚集體的脫落。根據(jù)本發(fā)明，利用微生物的附著和固定性能來分離微生物。本發(fā)明的原理包括在或多或少液態(tài)的培養(yǎng)基的粗提取物中加 入粒子，尤其是磁性的或者可磁化小珠，使得這些小珠與培養(yǎng)基接 觸足夠長的一革殳時(shí)間而〗吏樣吏生物附著到粒子表面，以j更通過任^可適 當(dāng)?shù)姆椒?，尤其是通過^l鐵將粒子從培養(yǎng)基中分離出來，并且將所 述粒子在合適的固體培養(yǎng)基上鋪開，以便實(shí)現(xiàn)用粒子捕獲的微生物 的生長。因此，本發(fā)明的目的在于從含有樣么生物的培養(yǎng)基中分離至少一 種樣t生物的方法，包纟舌以下步-驟a)在所述培養(yǎng)基的4是取物中加入給定凄t量的^茲性或可》茲化粒 ， b) 孵育粒子和培養(yǎng)基一,殳足夠長的時(shí)間侵J啟生物附著到所述 粒子的表面上；c) 從培養(yǎng)基中分離所述粒子；d) 在與樣i生物的生長相容的載體上鋪開所述粒子；e) 在載體上醉育所述#立子一 #史足夠長的時(shí)間以4吏7于應(yīng)于所分 離微生物的菌落生長。才艮據(jù)本發(fā)明的一個具體實(shí)施方式
，該方法可以包括預(yù)培養(yǎng)含有 待分離微生物的培養(yǎng)基提取物的預(yù)先步驟。為此，將提取物置于與 樣吏生物的成活力相容的溫度中。我們非常清楚，除了通常溫度下生 存的生物外，還存在著在溫度、氣體分壓(氧氣、氮?dú)?、二氧化?氣體等)、衛(wèi)生、pH (酸、堿)的極端條件、氧化還原條件和/或需 氧或厭氧條件下生活的微生物。因此，本領(lǐng)域一支術(shù)人員能夠使生長 溫度適合于所培養(yǎng)的微生物的需要。最常用的生長溫度可以是在20 至50才聶氏溫度之間，優(yōu)選在30至40。C之間。這一預(yù)培養(yǎng)步驟的目 的是使培養(yǎng)基富含微生物，在根據(jù)(不同)微生物可變化的一段時(shí) 間內(nèi)實(shí)現(xiàn)該步驟，該時(shí)間可以是20分鐘至7到10天，優(yōu)選在1至 48小時(shí)之間，可選地在攪拌條件下進(jìn)行。才艮據(jù)本發(fā)明的另 一個具體實(shí)施例，本發(fā)明的方法包括在本發(fā)明 方法的步驟c)和步驟d)之間增加的補(bǔ)充步驟，包括將步驟c)獲 得的小珠任意浸入沖洗溶液(有利地含水沖洗溶液)中，能夠除去 先前的培養(yǎng)基并除去(存在于浸潤小珠的液體中的)未附著的,鼓生 物。這一步驟允許選4奪粘附最強(qiáng)的由此最不可逆附著的纟效生物。這 一步驟還可以是用于4企驗(yàn)孩吏生物附著性能的快速處理或延長處理 的時(shí)才幾(在沖洗;容液中的預(yù)防性或治療性處理)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很容易確定加入培養(yǎng)基的小珠的數(shù)量。根據(jù)本發(fā)明，步驟b)的孵育進(jìn)行一段時(shí)間，根據(jù)(不同)微生 物，該時(shí)間可以是幾秒至幾小時(shí)，優(yōu)選在15秒至45分鐘。在孵育時(shí)間之后，微生物能夠附著到粒子(小珠)上。根據(jù)本發(fā)明，粒子和培養(yǎng)基在步驟c)的分離可以根據(jù)本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的任何方法來實(shí)現(xiàn)。例如，通過離心并除去培養(yǎng)基，或 者進(jìn)一步地，優(yōu)選^4居本發(fā)明，利用產(chǎn)生能夠吸引粒子的》茲場或電 場的系統(tǒng)，尤其是磁鐵來提取粒子。根據(jù)這一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
， 粒子通過石茲4失^是耳又，f茲《失有利地浸入^是取物中。根據(jù)有利的具體實(shí)施方式
，產(chǎn)生能夠吸引粒子的磁場或電場的 系統(tǒng)，尤其是》茲孝失，可以用任何系統(tǒng)尤其是可移動的保護(hù)層或者罩 (capot)來保護(hù)，該保護(hù)層或者罩可以由任何材料例如塑料制成， 其不千擾》茲波或電波。更優(yōu)選地，所述罩是用后即丟棄的。于是可 以重新利用該》茲4失。根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實(shí)施方式
，本發(fā)明方法包括清洗產(chǎn)生 》茲場或電場的系統(tǒng)的補(bǔ)充步驟以^更除去存在于浸濕液體中的未附 著的微生物或者粘附性較弱的微生物。在這個補(bǔ)充步驟的過程中， 將系統(tǒng)浸入清洗溶液，該清洗溶液可以是例如無菌培養(yǎng)基。本領(lǐng)域:汰術(shù)人員明了，該步驟基本上不超過幾秒鐘，至多幾分鐘，這是除 去系統(tǒng)表面上的未附著微生物所需的時(shí)間。根據(jù)本發(fā)明，通過在微生物培養(yǎng)裝置(例如含有適合于微生物生長的培養(yǎng)基的皮式(P6tri)培養(yǎng)皿)的表面上》文置所述粒子，可 沖艮據(jù)一個具體實(shí)施方式
，通過從塑料罩中取出磁鐵同時(shí)使塑料 罩靠近孩i生物培養(yǎng)裝置的表面，可以實(shí)現(xiàn)前述方欠置。根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方式，使用放置在培養(yǎng)裝置的表面下方的另一塊磁體，可以放置小珠(bille,鋼珠)。為了鋪開并分散小珠，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何系 統(tǒng)，例如手動分布才幾。#4居一個具體實(shí)施方式
，4吏用力丈置在孩i生物 培養(yǎng)裝置表面下方的旋轉(zhuǎn)磁鐵。通過由旋轉(zhuǎn)樣i生物培養(yǎng)裝置產(chǎn)生的液體渦流可以完成小^朱的分散。一旦粒子(小珠)被分散，培養(yǎng)裝置放置在孵育箱中一段足夠 長的時(shí)間來4吏孩i生物在裝置表面上生長。這里，本領(lǐng)域4支術(shù)人員使 孵育時(shí)間和溫度適合于期望分離的樣t生物。這個時(shí)間可以包括幾個 小時(shí)至幾天，優(yōu)選在4小時(shí)至48小時(shí)之間。孵育溫度可以是在30 至40°C。本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)在附圖中表現(xiàn)出來，附圖中圖1示出樣i生物l是耳又的傳統(tǒng)方法(A)與本發(fā)明方法(B)的 比較；圖2示出提取步驟和粒子的沖洗步驟；圖3示出粒子在皮式培養(yǎng)亞表面上的力欠置；圖4示出借助于旋轉(zhuǎn)》茲4失粒子在皮式培養(yǎng)亞表面上的分散。
權(quán)利要求
1.從含有微生物的培養(yǎng)基中分離至少一種微生物的方法，包括以下步驟a)在所述培養(yǎng)基的提取物中加入給定數(shù)量的磁性或者可磁化粒子；b)孵育所述粒子和所述培養(yǎng)基一段足夠長的時(shí)間以使所述微生物生長并附著到所述粒子的表面上，c)從所述培養(yǎng)基中分離所述粒子；d)在與所述微生物生長相容的一種載體上鋪開所述粒子；e)在一種載體上孵育所述粒子一段足夠長的時(shí)間使對應(yīng)于所分離的微生物的菌落生長。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括使含有期望 分離的所述孩t生物的所述培養(yǎng)基的提取物預(yù)培養(yǎng)的預(yù)先步驟， 可選地在攪拌下進(jìn)行。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將所述一是取物置于 與所述微生物的成活力相容的溫度，尤其在20至50攝氏溫度， 優(yōu)選在30至40才聶氏溫度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述預(yù)培養(yǎng)步驟的 持續(xù)時(shí)間在20分鐘至10天之間，優(yōu)選在1小時(shí)至48小時(shí)之間。
5. 才艮據(jù)4又利要求1至4中4壬一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包 括在步驟c)和d)之間的補(bǔ)充步驟，所述補(bǔ)充步驟包括將所 述步驟c )獲得的小珠隨意浸入優(yōu)選含水的沖洗溶液中。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，進(jìn)行 步驟b)孵育一段時(shí)間，取決于微生物，所述時(shí)間為幾秒至幾 小時(shí)，優(yōu)選在15秒至45分鐘。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在所 述步驟c)粒子和培養(yǎng)基的分離通過離心并除去培養(yǎng)基，或者 進(jìn) 一 步通過使用產(chǎn)生能夠吸收粒子的磁場或電場的系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在所 述步驟c)粒子和培養(yǎng)基的分離通過磁4失來實(shí)現(xiàn)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述磁鐵被浸入提 取物中。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述 產(chǎn)生能夠吸引所述粒子的；茲場或電場的系統(tǒng)尤其通過可移動 保護(hù)層或者罩來保護(hù)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述可移動保護(hù) 層或者罩是一次性使用的。
12. 根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，包 括清洗所述產(chǎn)生石茲場或電場的系統(tǒng)的補(bǔ)充步驟。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于一種基于微生物附著到粒子表面的能力將所述微生物分離的方法。
文檔編號G01N33/543GK101156070SQ200680008409
公開日2008年4月2日 申請日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月15日
發(fā)明者尼古拉·巴拉, 蒂埃里·貝爾納迪 申請人:生物膜控制公司