專利名稱：：樣品中脂質(zhì)氧化抗體酶的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及血液或血清樣品中脂質(zhì)氧化抗體酶的檢測。例如，這在評估個體心血管病癥中有用。
背景技術(shù)：
：脂質(zhì)氧化是導致循環(huán)的脂蛋白轉(zhuǎn)化成高致動脈粥樣硬化因子的主要過程之一[GotoY.(1982)supra,HalliwellB.,andJ.M.C.Gutteridge,(1989)supra,SchultzD.,andHarrisonD.G.(2000)supra。脂質(zhì)氧^1的主要原因是稱為"抗體酶"的催化抗體(參見WO03/017992、WO03/019196和WO03/019198)?？贵w酶是發(fā)生動脈粥樣硬化的關(guān)鍵致病因素和動脈粥樣硬化相關(guān)病癥的重要診斷標志物，還是治療干預的目標。目前的抗體酶化驗是基于抗體酶對脂質(zhì)氧化的測量。例如，脂質(zhì)氧化的量由脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的水平來測定。MDA的水平可以方便地通過分光光度法測量，因為MDA和硫代巴比妥酸反應時生成有色產(chǎn)物[Draper,H.H.etalFreeRadic.Biol.Med.(1993)15,353。但是，基于脂質(zhì)氧化的抗體酶化驗很慢，因為脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的顯色一般需要8~12小時。脂質(zhì)氧化化驗還需要使用如三氯乙酸之類的有毒試劑，以及大量的患者血清(通常23ml)。本發(fā)明人已經(jīng)i^i只到抗體酶破壞衣原體抗原，而且這種破壞可以被用于測量樣品中的抗體酶活性以及使用常規(guī)的免疫測定法進行快速測定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個方面提供一種測量樣品中抗體酶水平的方法，包括消除樣品中抗體酶介導的脂質(zhì)氧化活性，和測定樣品中的抗體與衣原體抗原的結(jié)合。相對于未處理的對照，樣品中結(jié)合的增加指示樣品中存在抗體酶。增加的量指示樣品中抗體酶的水平。相對于未處理的對照，樣品中的結(jié)合沒有任何增加指示所述樣品中不存在抗體酶。經(jīng)過消除抗體酶介導的脂質(zhì)氧化活性處理的樣品和對照(即未處理樣品)中抗體的結(jié)合可以同時或依次測定。一些實施方案中，從個體采集的初始樣品可以分成或等分成兩個或多個單獨樣品，至少其中之一經(jīng)處理以消除抗體酶介導的脂質(zhì)氧化，并且至少其中之一作為對照保持不被處理。其它的實施方案中，可以從個體獲得兩個或多個相同的樣品，至少其中之一經(jīng)處理以消除抗體酶介導的脂質(zhì)氧化，并且至少其中之一作為對照保持不被處理。個體血清中抗體酶的存在可以指示所述個體具有或患有動脈粥樣硬化病癥，或者可以指示所述個體將來惟患這種病癥的易感性或風險。抗體酶的量、水平或活性可以指示這種病癥的嚴重性或風險水平，即抗體的量和/活性增加指示病癥的嚴重性或風險的增加。一種評價個體動脈粥樣硬化病癥的方法可以包括消除從個體取得的樣品中抗體酶介導的脂質(zhì)氧化活性；和測定樣品中的抗體與衣原體抗原的結(jié)合。經(jīng)處理樣品相對于未處理樣品的結(jié)合增加指示樣品中抗體酶的水平。個體對動脈粥樣硬化病癥的存在、嚴重性或易感性可以由樣品中抗體酶的水平來評估。例如，這些方法可以用于確定個體的最佳治療方法。例如，具有指示動脈粥樣硬化病癥的抗脂質(zhì)抗體酶的個體可以接受治療以減輕病情或其癥狀?？怪|(zhì)抗體酶的水平或量可以指示病情的嚴重性，并且可以用于確定特定療程是否合適。樣品優(yōu)選是包括來自個體的血漿或血清的樣品，例如血液、血清或血漿樣品。從個體獲取、保存和制備合適樣品的方法是醫(yī)療實踐中眾所周知的。例如，可以通過從個體提取血液并從所提取的血液中分離血清來獲得血清的測試樣品。合適的提取方法包括離心分離，以從細胞材料中分離血清和血漿。衣原體抗原可以是衣原體細胞中的任何免疫原或免疫原性成分，即激發(fā)或能夠激發(fā)哺乳動物體內(nèi)對于衣原體細胞的免疫應答的來自衣原體的分子，例如衣原體細胞表面分子，或該成分的模擬或功能類似物。換言之，衣原體抗原是能夠與對抗衣原體細胞而產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合的衣原體細胞的成分。本發(fā)明方法所用的合適的衣原體抗原包括分離、純化、克隆或合成的衣原體抗原；這些抗原的片段或表位；這些抗原的集合；衣原體細胞的勻漿級分；完整的衣原體細胞；及其任意組合。模擬活性衣原體表位的抗獨特型抗體或這些抗獨特型抗體的片段也可以適用作本發(fā)明方法中的衣原體抗原。制備衣原體抗原的合適方法是現(xiàn)有技術(shù)中/>知的。例如，衣原體抗原可以通過如HPLC凈支術(shù)進行分離和/或純化。在一些優(yōu)選實施方案中，衣原體抗原可以位于衣原體細胞的表面上，本文所描述的方法可以包括測定在經(jīng)處理和未處理的樣品中抗體與衣原體細胞的結(jié)合。衣原體細胞可以是來自屬于鷚鵡熱衣原體組的物種的細胞。鷚鵠熱衣原體組包括鷚鵠熱衣原體和肺炎衣原體。一些實施方案中，衣原體細胞可以是綿羊的鷚鵠熱衣原體細胞?；铙w綿羊的鸚鷸熱衣原體的凍干制品可以商購(Intervet)。樣品中的抗體和衣原體抗原的結(jié)合可以通過任何合適的方法或化驗程序來測定。用單個探針分子標記是一種可能的方法。例如，可以用探針分子標記與樣品中的抗體或衣原體細胞或抗原結(jié)合的第二抗體。所述探針分子可以直接或間接產(chǎn)生可檢測的優(yōu)選可測量的信號。需要時，探針分子的鍵合可以是直接或間接的、共價(例如通過肽鍵)或非共價的。通過肽鍵的鍵合可以是編碼結(jié)合分子(例如抗體)和探針分子的基因融合物重組表達的結(jié)果。探針包括例如熒光素、羅丹明、藻紅素和得克薩斯紅的熒光色素、例如二氨基聯(lián)苯胺的生色染料、大分子膠體顆粒或微粒材料例如具有顏色、磁性或順磁性的乳膠珠、和能夠直接或間接產(chǎn)生可以視覺觀察、電子檢測或其它方式記錄的可檢測信號的生物或化學活性試劑。生物或化學活性試劑包括對顯色或改變顏色或引起電性質(zhì)變化的反應進行催化的酶。試劑可以被分子激發(fā)，使得電子在能態(tài)之間躍遷產(chǎn)生特征光譜吸收或發(fā)射。他們可以包括與生物傳感器協(xié)同使用的化學實體。可以使用生物素/抗生物素蛋白或生物素/鏈霉抗生物素蛋白和堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)。更多的例子包括辣根過氧物酶和化學發(fā)光法?？梢岳萌我獾倪@些方法來測定抗體和衣原體抗原的結(jié)合。由單個抗體-探針綴合物產(chǎn)生的信號可以用來獲得樣品(正常和測試)中相關(guān)抗體結(jié)合的可定量的絕對或相對數(shù)據(jù)。本發(fā)明的方法可采用任意方便的形式進行。免疫學分析是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，許多合適的方法有效并可用于實施本發(fā)明的方法，例如ELISA、蛋白質(zhì)印跡法(Westernblotting)、微免疫熒光法(MIF)、Biacore(Biacore，Upsala，Sweden)、免疫沉淀或免疫-比濁法、凝集法(例如基于紅血球、膠乳或其他聚合物的凝集)、免疫組織化學、免疫電泳、基于抗體的親和色鐠法和IDEIA(Boots-Celltech)、以及其它氧化還原放大診斷系統(tǒng)。一些優(yōu)選的實施方案中，可以采用夾心分析法。例如，夾心分析可以使用結(jié)合樣品中抗衣原體抗體的捕捉抗體和檢測抗衣原體抗體與捕捉抗體存在結(jié)合的標記衣原體抗原或細胞。作為選擇，夾心分析可以釆標記抗體。捕捉抗體，衣原體抗原或衣原體細胞可以,皮固定，例如固定至不溶性支持物或固體表面。支持物可以是顆?；蚬腆w形式，并且可以包括板、試管、珠、球、過濾器或膜。將抗體固定至不溶性支持物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。分析中的未固定組分(即溶液中的游離組分)例如抗體、衣原體抗原或衣原體細胞可以包括上述可檢測的標記物。例如，抗體可以用熒光團例如FITC或羅丹明、放射性同位素、或非同位素標記試劑例如生物素或洋地黃毒苷進行標記；含有生物素的組分可以使用與任意期望的標記物如熒光染料綴合的"檢測試劑"如抗生物素蛋白來檢測。測定結(jié)合的方式不是本發(fā)明的特征，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)自己的偏好和常識選擇合適的方式。樣品可以通過任何方便的物理或化學處理方法進行處理以消除抗體酶介導的脂質(zhì)氧化，所述物理或化學處理方法消除或顯著降低抗體酶的活性，但不影響或基本不影響抗體酶和衣原體抗原的結(jié)合。一些實施方案中，樣品可以物理處理以使抗體酶介導脂質(zhì)氧化滅活。例如，樣品可以被加熱。所述樣品可以根據(jù)使脂質(zhì)氧化活性滅活但不影響特異抗體結(jié)合性質(zhì)的任意溫度方案來加熱。合適的溫度方案可以包括將樣品加熱到至少37。C、至少56'C或至少70'C。所述樣品可以被加熱足夠長的時間以使抗體酶介導的脂質(zhì)氧化滅活或基本滅活而不影響抗體酶和抗原的結(jié)合。例如樣品可以被加熱至少l分鐘、至少5分鐘、至少15分鐘、至少45分鐘、至少60分鐘、至少8小時、至少12小時或至少24小時。一些實施方案中，所述樣品可以被加熱至70。C并保持至少1分鐘、至少2分鐘、至少3分鐘、至少5分鐘或至少IO分鐘；加熱至56。C并保持至少15分鐘、至少20分鐘、至少30分鐘、至少45分鐘或至少60分鐘；或加熱至37'C并保持至少8小時、至少12小時、至少24小時或至少48小時。其它物理處理方法可用于使脂質(zhì)氧化活性滅活而不影響特異抗體的結(jié)合性質(zhì)。樣品可以經(jīng)歷反復的凍融循環(huán)，例如兩個或多個先凍后融的循環(huán)。樣品可以長期保存，例如在04。C下保存至少4天、在-10。C下保存至少2個或3個月、或在-20'C下保存至少4個或至少6個月。樣品可以經(jīng)歷高能超聲、微波、UV、Y-輻射或任意其它的電磁波。本發(fā)明方法所用的處理方法或方案的適合性可以通過測量樣品經(jīng)處理后的脂質(zhì)氧化和衣原體結(jié)合活性來確定，如本文所述。本發(fā)明方法所用的合適的處理方法或方案使抗體酶介導氧化滅活但不影響抗衣原體抗體的結(jié)合特性。其它的實施方案中，樣品可以被化學處理以使抗體酶介導的脂質(zhì)氧化滅活。例如，樣品可以用一種或多種抗體酶滅活劑處理。滅活劑可以包括低pH抗氧化劑(即在pH5.5下抑制氧化反應)、羥基自由基清除劑、"電子捕捉劑，，如冠醚和類固醇、"電子墊"如聚乙烯基聚合物、"電子穴"如泛醌和Q8、銅螯合劑和鈞螯合劑。合適的滅活劑可以包括抗壞血酸、乙酰水楊酸、疊氮化鈉、兒茶素包括兒茶素沒食子酸酯、DMSO(二甲基亞砜)、阿齊霉素、血紅蛋白、泰利霉素ketek、或其中任意一種的衍生物、類似物和鹽。其它的實施方案中，滅活劑可以是細菌細胞，例如是來自如乳酸菌的益生菌的細胞，或這種細胞的產(chǎn)物?？贵w酶滅活處理的有效性可以通過測定抗體酶樣品(例如治療前和治療后從患者的動脈粥樣硬化斑中獲得的IgG)的脂質(zhì)氧化活性來確定?？梢允褂萌魏畏奖銣y定脂質(zhì)氧化的方法。用于測定脂質(zhì)氧化的許多方法在本領(lǐng)域公知，并且可以用來測定樣品中脂質(zhì)氧化的降低或消除。例如在CRCHandbookofMethodsforOxygenRadicalResearch,CRCPress,BocaRaton,Florida(1985),OxygenRadicalsinBiologicalSystems.MethodsinEnzymology,v.186,AcademicPress,London(1990);OxygenRadicalsinBiologicalSystems.MethodsinEnzymology,v.234,AcademicPress,SanDiego,NewYork,Boston,London(1994);和FreeRadicals.Apracticalapproach.IRLPress,Oxford,NewYork,Tokyo(1996)中描述了合適的方法。優(yōu)選實施方案中，通過測定脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的生成(即存在或量)來測定氧化，所述脂質(zhì)氧化產(chǎn)物可包括醛例如丙二醛(MDA)、(脂質(zhì))過氧化物、二烯共輒物或烴氣體。從個體獲得的樣品可以被處理以限制或降低補體活性。一些實施方案中，樣品可以用補體抑制劑處理。補體活性的抑制劑是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，包括例如Ca"螯合劑例如EGTA或EDTA;胸普激酶抑制劑包括兒茶素例如表焙兒茶素沒食子酸酯(EGCG);多糖例如酵母聚糖；肽酰分子例如CD46、CD55、CD59、培克珠單抗(pexelizumab)、依庫珠單抗eculizumab)、compstatin、目艮鏡蛇毒，抗Clq和補體級聯(lián)的其它組分或中間體的抗體、和這些抗體的片段；和模擬補體級聯(lián)的功能與性質(zhì)的化合物。其它的實施方案中，樣品可以用抑制補體活性的程序或方案來處理。合適的程序包括加熱樣品，例如加熱至56'C持續(xù)30分鐘，或70'C持續(xù)2~5分鐘，或者使補體滅活的其它溫度方案。其它物理程序，例如超聲沖擊、輻射和/或激光處理也可以使用。本文描述的測定酶活性的方法也可以用于篩選抑制抗體酶活性的化合物。這些化合物可以用于治療動脈粥樣硬化。本發(fā)明的另一個方面提供一種篩選抗體酶抑制劑的方法，包括測定樣品中的抗體與衣原體抗原的結(jié)合；用測試化合物處理所述樣品，和；測定處理后的樣品中的抗體與衣原體抗原的結(jié)合。所述處理后與衣原體抗原結(jié)合的增加指示該化合物是抗體酶抑制劑。樣品優(yōu)選是包含抗體酶的樣品。合適的樣品可以從患有動脈粥樣硬化疾病的個體獲得，例如可以是血清樣品，或來自動脈粥樣硬化斑或動脈粥樣硬化病變的樣品。所述樣品可以通過例如與A蛋白結(jié)合來富集IgG,如下文所述。樣品中抗體酶的存在可以>使用現(xiàn)有技術(shù)中>^知的脂質(zhì)氧化分析來證實。用這些方法識別的抗體酶抑制劑可以用于治療動脈粥樣硬化病癥，包括心血管疾病例如動脈粥樣硬化、缺血性(冠狀動脈)心臟病、心肌缺血(絞痛)、心肌梗塞、動脈瘤疾病、動脈粥樣外圍血管疾病、腹主動脈與骼動脈疾病、慢性和危重性下肢局部缺血、內(nèi)臟局部缺血、腎動脈疾病、腦血管疾病、中風、動脈粥樣硬化視網(wǎng)膜病、血栓、異常血凝固和高血壓。這些病癥可以是醫(yī)學或獸醫(yī)學病癥。合適的測試化合物可以是小的化學體、肽、抗體分子或其它需要確定對抗體酶活性的影響的分子。合適的測試化合物可以選自化合物集合和例如使用下文所述的組合化學所設(shè)計的化合物。特別適合的測試化合物包括金屬螯合劑，例如銅或鉀的螯合劑、抗氧化劑尤其是低pH值抗氧化劑(即在pH5.5時抑制氧化反應的化合物)、羥基自由基清除劑、"電子捕捉劑，，如冠醚和類固醇、"電子墊"如聚乙烯基聚合物、和"電子穴"如泛醌和Q8。合適的測試化合物可以包括已使用本發(fā)明方法確定為抗體酶抑制劑的疊氮化鈉，兒茶素包括兒茶素沒食子酸酯、DMSO、阿齊霉素、血紅蛋白、泰利霉素的衍生物、類似物和鹽、細菌細胞的級分、提取物和衍生物，尤其是益生菌如乳酸菌的培養(yǎng)物。組合庫技術(shù)(Schultz，JS(1996)Biotechnol.Prog.12:729-743)提供了一種測定大量潛在的具有改變抗體酶活性能力的不同物質(zhì)的有效方式。進行上述篩選之前或篩選時，可以根據(jù)與抗體酶的結(jié)合能力來篩選測試化合物。這可以用作在測試化合物調(diào)節(jié)抗體酶活性的實際能力之前的粗篩。可以加入到本發(fā)明分析的測試化合物的量通常會根據(jù)所用化合物的類型用試湊法來確定。典型地，大約0.01-100nM的假定抑制劑化合物的濃度可以使用，例如0.110nM?？梢允褂玫幕衔锟梢允怯糜谒幬锖Y選程序的天然或合成的化合物?？梢允褂煤袛?shù)種特征或非特征組分的植物提取物或乳酸菌等益生菌的提取物、級分或組分。其他的候選抑制劑化合物可以基于模擬抗體酶和/或與其結(jié)合的脂質(zhì)抗原的三維結(jié)構(gòu)并使用合理的藥物設(shè)計來提供具有特定分子形狀、尺寸和電荷特征的潛在抑制劑化合物。本文描述的篩選方法還可以包括測定存在測試化合物時抗體酶的脂質(zhì)氧化活性。脂質(zhì)氧化活性包括脂質(zhì)過氧化活性可以通過測定宿主脂質(zhì)(即來自樣品的脂質(zhì))、來自衣原體細胞等外源抗原的脂質(zhì)或其它來源的脂質(zhì)(例如可以是作為測定方法的一部分被加入的脂質(zhì))的氧化作用來測定。可以測量例如共氧化偶聯(lián)探針分子的氧化產(chǎn)物或副產(chǎn)物的積累或者底物如未改變的脂質(zhì)或輔助底物如氧的消失或消耗。許多用于測定脂質(zhì)過氧化的方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的，適合根據(jù)本發(fā)明來使用。例如，在CRCHandbookofMethodsforOxygenRadicalResearch,CRCPress,BocaRaton,Florida(1985),OxygenRadicalsinBiologicalSystems.MethodsinEnzymology,v.186，AcademicPress,London(1990》OxygenRadicalsinBiologicalSystems.MethodsinEnzymology,v.234,AcademicPress,SanDiego，NewYork,Boston,London(1994);and,FreeRadicals.Apracticalapproach.IRLPress,Oxford,NewYork,Tokyo(1996)等文—描述了合適的方法。優(yōu)選的實施方案中，通過測定脂質(zhì)氧化產(chǎn)物-包括丙二醛(MDA)等醛類、(脂質(zhì))過氧化物、二烯共軛物或烴氣體的生成(即存在或量)來測定。脂質(zhì)氧化產(chǎn)物可以通過任何適合的方法來測定。例如，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可以通過HPLC(Brown，R.K.，andKelly,F.JIn:FreeRadicals.Apracticalapproach.IRLPress,Oxford,NewYork,Tokyo(1996)，119-131)、紫夕F光i普法(Kinter，M.Quantitativeanalysisof4-hydroxy-2國nonenal.Ibid.,133-145)或氣相色譜-質(zhì)鐠法(Morrow,J.D.,andRoberts,L.J.F2-Isoprostanes:prostaglandin-likeproductsoflipidperoxidation.Ibid.147-157沐測定。例如，丙二醛(MDA)的生成可以在和2-硫代巴比妥酸(通常為ImM)反應之后通過測量適當波長例如525nm處的吸光度來測定。利用一種或多種初分篩(例如在無細胞系統(tǒng)中)確定為具有抑制抗體酶活性能力的試劑還可以使用一種或多種次級篩進行評估。次級篩可以涉及血管系統(tǒng)中抗體酶活性的測試或抗體酶生物學功能的測試，例如在動物模型中?？梢栽诖渭壓Y中評估的合適的生物學功能包括動脈硬化病變的尺寸降低和數(shù)量的減少，或者是動脈粥樣硬化病癥的其它癥狀或效果的減輕，例如血壓的下降。使用本發(fā)明方法確定為抗體酶抑制劑的化合物的例子包括抗壞血酸、乙酰水楊酸、疊氮化鈉、(+)兒茶素沒食子酸酯、DMS、血紅蛋白、泰利霉素-ketek，乳酸菌細胞和表3列出的其它試劑。識別的化合物可以被分離或純化和/或被合成或生產(chǎn)出來。任選地，本文所述的被識別為抗體酶的化合物可以被修飾，以優(yōu)化活性或提供其它有益特征，例如提高半衰期或減少對個體給藥時的副作用。前導化合物的修飾技術(shù)和策略是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的。本文所述的被識別的抗體抑制劑可以被配制成具有下述藥學可接受的賦形劑的組合物，例如藥劑、藥物組合物或藥物。這些組合物可以對個體給藥。本發(fā)明包括用上述分析方法識別為抗體酶抑制劑的化合物、藥學或獸醫(yī)學組合物、藥劑、藥物或其它包括該化合物的組合物；包括將這種組合物施用于患者的方法，例如用于治療(可包括預防性治療)動脈粥樣硬化；這種化合物在生產(chǎn)如用于治療動脈粥樣硬化病癥的給藥組合物中的應用；和制備藥學或獸醫(yī)學組合物的方法，該方法包括將該化合物和藥學上可接受的賦形劑、支持物和其它可選成分混合。無論提供給個體的是多肽、肽、核酸分子、小分子或其它藥學上可用的化合物，優(yōu)選以"預防有效量"或"治療有效量"(視情況而定，盡管預防可以被視為治療)進行給藥，這足以顯示給個體帶來的益處。實際給藥量和給藥的頻率和時程將取決于所治療病癥的性質(zhì)和嚴重程度。治療的處方，例如劑量等的確定是全科醫(yī)師和其他醫(yī)生的職責。根據(jù)所治療的病癥，組合物可以單獨給藥或與其它治療同時或依次聯(lián)合使用。根據(jù)本發(fā)明及根據(jù)本發(fā)明使用的藥學組合物除活性成分外還可以包括藥學可接受的賦形劑、支持物、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它材料，這些材料應該沒有毒性且不干擾活性成分的效用。支持物或其它材料的準確性質(zhì)將取決于給藥的途徑，其可以是口服或注射，例如皮膚、皮下或靜脈注射。用于口服的藥學組合物可以是片劑、膠嚢、粉劑或液體形式。片劑可以包括固體支持物，例如明膠或佐劑。液體藥學組合物一般包括液體支持物，例如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。生理鹽水溶液、葡萄糖、其它糖溶液或如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的多元醇可以包括在內(nèi)。對于靜脈、皮膚或皮下注射、或病痛部位注射，所述活性成分將是無熱原且具有合適的pH、等電點和穩(wěn)定性的藥學可接受的水溶液形式。本領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)人員完全能夠使用如氯化鈉針劑、林格注射液(Ringer'sInjection)或乳酸林格注射液的等滲支持物制備合適的溶液。防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加劑可以根據(jù)需要包括在內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用常規(guī)技能和常識來改變本發(fā)明分析方法的確切形式。根據(jù)本公開內(nèi)容，本發(fā)明的各種進一步的方面和實施方案對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。本說明書中提及的所有文獻在此通過引用全部并入本文。本發(fā)明包括上述特征的每一種組合和次級組合?，F(xiàn)在將以實施例的方式并參照以下附圖和附表對本發(fā)明的某些方面和實施方案進行i兌明。圖1示出脂質(zhì)氧化和測量抗衣原體抗體酶活性的衣原體抗原破壞分才斤之間的比較。表1通過其氧化血清脂質(zhì)的能力或通過其破壞衣原體抗原的能力來示出抗衣原體抗體酶活性測量的比較，ELISA分析。表2通過其氧化血清脂質(zhì)的能力或通過其破壞衣原體抗原的能力來示出抗衣原體抗體酶活性測量的比較，MIF分析。表3示出不同因素對抗體酶產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用和破壞衣原體肺炎抗原能力的影響。實施例材料和方法樣品的制備抗體是在俄羅斯聯(lián)邦頓河畔羅斯托夫(Rostov-na-Donu)醫(yī)科大學心血管外科中心的腹部動脈狹窄的旁路手術(shù)期間，從53和64歲的兩位男性患者取回的發(fā)生動脈粥樣硬化病變的人體動脈中提取的。取回之后，這些樣品被立即放入0~4。C下的30%w/v氯化鈉溶液中一個月，然后進行實驗。對照實驗顯示，在此期間胰蛋白酶、過氧化氫酶、過氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、肌酸激酶和乳酸脫氫酶等酶的活性，以及免疫球蛋白(IgG)斷裂的水平和脂質(zhì)過氧化作用的程度沒有顯著變化。將動脈片(濕重約為200~400mg)切成每片重約10mg的小片，置于含有l(wèi)%非離子型洗滌劑IgepalCA-630的5.0mlPBS溶液中，用帶有15mm探針的機械勻裝器(Ultra-Turrax)以全輸出功率勻裝3次持續(xù)3秒，每次冷卻間隔20秒。勻漿之后，不溶成分通過5000g離心10分鐘進行分離，上清液用于分析。所述上清液在37'C下用附著于交聯(lián)的4%珠狀瓊脂上的A蛋白處理30分鐘。然后，將附著于所述珠粒的免疫球蛋白片段在5000g時沉降10分鐘，倒出上清液。為了除去附著于沉降的免疫球蛋白上的任何脂蛋白，將所述樣品用10%IgepalCA-630再次懸浮。然后，在5000g下離心10分鐘，倒出上清液。為了除去洗滌劑，在同樣方案中用過量磷酸緩沖液通過離心分離進行連續(xù)3次洗滌。脂蛋白從免疫球蛋白片段上的去除通過該級分中缺少膽固醇來確i^?？贵w酶滅活對于物理滅活，將同樣的抗體酶樣品分為兩等份。一份在水浴中56。C下加熱30分鐘，另一份未處理。在第一份處理完之后，將兩份樣品用同樣的方式進行測試。對于化學滅活，將稀釋溶液分為兩部分。一部分中加入抗體酶抑制劑。使用下述抗體酶抑制劑DMSO，0.1~10%;疊氮化鈉，l(T5~1(T3M;兒茶素，106~103M;ketek，106~1(T3M;乳酸菌培養(yǎng)物，lnMlmM;抗壞血酸，1(T4~10-3M;乙酰水楊酸10-410-3M。將血清樣品分為兩等份，一份用含有抗體酶抑制劑的溶液進行稀釋，第二份用對照溶液進行稀釋。然后兩份樣品以同樣的方式進行測試?；贓LISA的抗體酶分析ELISA分析通過依據(jù)廠商說明書使用的Medac材料和試劑來進行。筒言之，對來自患者的血清樣品進行上述處理。50nl樣品稀釋劑用移液管移至微量測試孔Al中作為空白，50jil陰性對照、陽性對照和稀釋后的患者樣品被移至其它的微量測試孔中。所述微量測試孔盤在37。C(±rC)下濕室中孵育60分鐘(土5分鐘)，然后將每個孔用200fil沖洗緩沖液洗三次。然后向每個孔中加入50jil綴合物，在37。C(土1。C)下濕室中孵育60分鐘(±5分鐘)并洗滌。將50nlTMB-底物加入到每個孔中，在37。C(±rC)下濕室中孵育30分鐘(土2分鐘)。所述反應通過向每個孔中加入100fd停止液而終止。加入停止液之后15分鐘內(nèi)，在450nm處(基準620~650nm)讀取光測讀數(shù)。為了計算結(jié)果，將空白(孔Al)的OD值從所有其它的OD值中減去。優(yōu)選地，空白的OD值〈0.150，陰性對照的平均OD值〈0.100，陽性對照的OD值>0.800。截止值=陰性對照的平均OD值+0.380。灰色區(qū)域=截止值±10%。裂解衣原體的微量免疫熒光測試(MIF)帶有沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體的玻片通過涂抹這些細菌的原生小體來制備。血清在PBS中被稀釋到效價為1:1024，并在37。C下加熱30分鐘。在PBS中洗滌之后，將抗人體IgG、IgA和IgM綴合物加入樣品中。在37。C下加熱30分鐘并在PBS中洗滌之后，用帶有封固介質(zhì)(mountingmedium)的蓋片覆蓋所述玻片。將熒光顯微鏡用于玻片讀數(shù)。出現(xiàn)"星空，，現(xiàn)象即淺紅背景上出現(xiàn)綠色熒光點所代表的是陽性反應。兩位獨立的專家對所有的樣品進行評估。ELISA和MIF結(jié)果的分沖斤如果經(jīng)處理樣品和未處理樣品之間的信號差異低于10%(或者MIF中的效價沒有增加)，則結(jié)論是抗體酶活性為陰性。如果經(jīng)處理樣品和未處理樣品之間的信號差異在10%到15%之間(或者MIF中的一個效價增加)，則結(jié)論是抗體酶活性不清楚，或者處于"灰色"區(qū)域。如果經(jīng)處理樣品和未處理樣品之間的信號差異大于15%(或者MIF中的兩個或更多效價增加)，則結(jié)論是抗體酶活性為陽性。裂解衣原體的電子顯微檢查將細菌細胞在在2.5%的戊二醛溶液中固定1小時后，再在鉻-鋨溶液中固定1小時，所述戊二醛溶液由0.2M的pH為7.2的四甲二砷緩沖液中制備。此后，樣品通過乙醇和純丙酮的梯度增加來脫水，并包埋在Eponate12T14-Araldite502中。超薄玻片利用UltracutReichert-Jung制備并用1%的乙酸鈾酰和檸檬酸鉛的水溶液染色。利用電子顯微鏡JEM100Cx(放大倍率)x5300~53000倍對玻片進行檢查并拍照。SDS-PAGE根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，利用各種可商購的系統(tǒng)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。例如，4吏用以下試劑進行DPO033/02;Issue1.0"ProteinelectrophoresisusingNOVEXTMsystem(SDS-PAGE)"中描述的方法NuPAGETMBis國Tris4~12%預制凝膠(InvitrogenNP0321批號#2063076)(15孑L);NuPAGETMBis-Tris4~12。/o預制凝膠(InvitrogenNP0321批號#2072272)(10孔)；NuPAGETMLDS樣品緩沖液4x(InvitrogenNP0007批號#300277);NuPAGETM樣品還原劑xlO(InvitrogenNP0004批號#300505)NuPAGETMMOPSSDS電泳緩沖液x20(InvitrogenNP0001批號#300704);SeeBlueTM預染色標記物(InvitrogenLC5625批號弁seel1214).脂質(zhì)過氧化作用的測定脂質(zhì)過氧化作用以MDA濃度的水平進行評估，并通過分光光度法進行測量[Draper,H.H.etalFreeRadic.Biol.Med.(1993)15,353。簡言之，樣品中抗體酶的水平按如下測定血清樣品用pH4.0的0.05M醋酸緩沖液按1:1稀釋至樣品最終pH值為5.6~5.8之間。9卯jd稀釋后的血清和lOjil商用活體綿羊衣原體疫苗(Intervet)相混合。樣品在37。C下孵育過夜(12~16小時)。將250^140%三氯乙酸和250jilImM硫代巴比妥酸加入到每個樣品中。所有的樣品置于水浴中煮沸30分鐘。樣品被冷卻，并在3000g離心10分鐘。收集上清液并在X525nm處測量吸光度以測定丙二醛(MDA)的濃度，所述MDA為脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物。結(jié)果抗體酶對衣原體的作用動脈硬化粥樣斑IgG的抗體酶富集級分按上述方法制備。所述動脈硬化粥樣斑IgG的抗體酶富集級分對肺炎衣原體的原生小體和網(wǎng)織紅細胞體的作用通過MIF和電子顯微鏡進行測定。在微免疫熒光測定(MIF)觀察抗體酶富集級分的肺炎衣原體細胞裂解。電子顯微檢查表明抗體酶富集級分同時溶解肺炎衣原體的原生小體和網(wǎng)織紅細胞體。動脈硬化粥樣斑IgG的抗體酶富集級分的分析動脈硬化粥樣斑IgG的抗體酶富集級分和從血清中純化的IgG級分一起用SDS-PAGE進行分析。電泳分析表明抗體酶富集級分只含有IgG，不含任何其它可檢測的蛋白質(zhì)。抗體酶分析上述用于衣原體抗原破壞的ELISA和MIF測試被用于測量患者血清樣品中抗衣原體抗體酶的活性，并與脂質(zhì)氧化測試進行比較。其結(jié)果分別見表1和表2，并概括于圖1。ELISA(E45()nmxl，OOO)和MIF(Ab效價)測試的結(jié)果被發(fā)現(xiàn)與脂質(zhì)過氧化測試的結(jié)果相關(guān)?？贵w酶抑制滅活抗體酶能力的一組處理通過上述ELISA法進行測試，而抑制抗體酶活性的能力用脂質(zhì)氧化測試進行測定。其結(jié)果列于表3?？箟难?、乙酰水楊酸、疊氮化鈉、EDTA、EGTA、兒茶素沒食子酸酯、DMSO、血紅蛋白、泰利霉素ketek和乳酸菌均被發(fā)現(xiàn)抑制抗體酶的活性。滅活抗體酶的化合物可以用于測定抗體酶水平的方法，或可被用于治療例如治療動脈粥樣硬化或心血管疾病。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>患者在破壞肺炎衣原體抗原的抗體能力喪失方面的抗體酶活性抗原酶滅活之前MIF效價抗原酶滅活之后MIF效價抗原酶(+)血清，通過脂質(zhì)氧化MDA分析來測試<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>物理過程反復凍融56'C下陽性陽性加熱30分鐘陽性陽性藥物，試劑或食品1-乙酰水楊酸陽性陽性2.抗壞血^_陽性陽性3.EDTA陽性陽性4.EGTAn/a陽性5.氰化鈉陰性陰性S.疊氮化鈉陽性陽性7,(+)兒茶素沒食子酸酯陽性陽性8.fi-胡蘿卜素陰性陰性9.(+)a-生育酚陰性陰性10.(+)y-生育粉陰性陰性11.苯曱酸陰性陰性12.DMSO陽性陽性13.D-甘露醇陰性陰性14.PMS陰性陰性15.血紅蛋白陽性陽性is.泰利霉素，Ketek陽性陽性17.四環(huán)素陰性陰性18.乳酸菌培養(yǎng)體陽性陽性19.番茄紅素陰性陰性抗體-抗原反應在加入這些酸化合物后被阻斷.權(quán)利要求1.一種測量樣品中抗體酶水平的方法，包括消除所述樣品中抗體酶介導的脂質(zhì)氧化，和測定樣品中的抗體與衣原體抗原的結(jié)合，其中，相對于對照，經(jīng)處理樣品中的結(jié)合增加指示所述樣品中抗體酶的存在或水平。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品是從個體獲得的血液、血清或血漿樣品。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述樣品中抗體酶的存在指示動脈粥樣硬化病癥。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中物理處理所述樣品以消除抗體酶介導的脂質(zhì)氧化。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法6.才艮據(jù)權(quán)利要求5的方法5分鐘。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法30分鐘。8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法9.才艮據(jù)權(quán)利要求4的方法10.根據(jù)權(quán)利要求l-3中任抗體酶介導的脂質(zhì)氧化。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述樣品用一種或多種滅活劑處理。12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述滅活劑是羥基自由基清除劑、低pH抗氧化劑、電子捕捉劑、電子墊或電子穴。13.根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中所述滅活劑是羥基自由基清除劑。14.根據(jù)權(quán)利要求11~13中任一項的方法，其中所述滅活劑選自乙酰水楊酸、抗壞血酸、EDTA、EGTA、(+)兒茶素沒食子酸酯、疊氮化鈉、DMSO、血紅蛋白、泰利霉素ketek及其類似物或衍生物。15.根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中所述滅活劑為細菌細胞。,其中所述樣品被加熱。,其中所述樣品被加熱到至少37°。持續(xù)至少，其中所述樣品被加熱到至少56'C持續(xù)至少，其中所述樣品經(jīng)歷兩個或多個凍融循環(huán)。，其中所述樣品在0-4。C下保持至少4天。一項的方法，其中化學處理所述樣品以消除16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述滅活劑為乳酸菌細胞。17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述樣品中抗體酶介導的脂質(zhì)氧化的量在進行所述處理后測定。18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述衣原體抗原在衣原體細胞的表面上。19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述抗體與所述衣原體抗原的結(jié)合利用第二抗體來測定。20.才艮據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述第二抗體結(jié)合至IgG。21.才艮據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中由所述第二抗體和所述衣原體抗原或細胞構(gòu)成的組中的第一成員被標記。22.才艮據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中由所述第二抗體和所述衣原體抗原或細胞構(gòu)成的組中的第二成員被固定化。23.—種篩選抗體酶抑制劑的方法，包括測定樣品中的抗體與衣原體抗原的結(jié)合，用測試化合物處理所述樣品，和；測定經(jīng)處理的樣品中的抗體與衣原體抗原的結(jié)合，相對于未處理樣品，經(jīng)處理樣品的結(jié)合增加指示所述化合物是抗體酶抑制劑。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述抗體酶抑制劑用于治療動脈粥樣硬化疾病。25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，其中所述樣品包括脂質(zhì)氧化抗衣原體抗體酶。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述樣品來自患有動脈粥樣硬化疾病的個體。27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述樣品為血清或動脈粥樣石更化斑樣28.根據(jù)權(quán)利要求23~27中任一項的方法，其中所述樣品為富IgG的樣品。29.根據(jù)權(quán)利要求2328中任一項的方法，其中所述滅活劑為低pH抗氧化劑。30.根據(jù)權(quán)利要求2328中任一項的方法，其中所述滅活劑為羥基自由基清除劑。31.根據(jù)權(quán)利要求23~30中任一項的方法，包括測定在測試化合物存在時抗體酶的脂質(zhì)氧化活性。32.根據(jù)權(quán)利要求23~31中任一項的方法，包括將所述化合物識別為抗體酶抑制劑。全文摘要本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)樣品中脂質(zhì)氧化抗體酶破壞衣原體抗原并且破壞的程度提供樣品中抗體酶的水平或活性的測量。脂質(zhì)氧化抗體酶可以通過例如消除或破壞樣品中抗體酶介導的脂質(zhì)氧化活性和測定樣品中相對于對照的抗體和衣原體抗原的結(jié)合來測量或檢測。這些方法可以用于評估心血管病癥。文檔編號G01N33/68GK101147064SQ200680009817公開日2008年3月19日申請日期2006年2月24日優(yōu)先權(quán)日2005年2月25日發(fā)明者伊萬·派特亞耶夫申請人:劍橋治療診斷科技有限公司