專利名稱：評價煙霧對細(xì)支氣管的影響的方法
評價煙霧對細(xì)支氣管的影響的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及評價從煙霧獲得的脂溶性部分對細(xì)支氣管的影響以及 鑒定生物活性劑的方法，該生物活性劑能夠降低煙霧對血管或細(xì)支氣 管中的平滑肌細(xì)胞的影響。發(fā)明背景長期以來認(rèn)為吸煙是與動脈粥樣硬化的高發(fā)病率相關(guān)的強(qiáng)危險因 素，與高血脂和高血壓協(xié)同起作用。中風(fēng)，心肌梗塞和跛行在吸煙者中是常見的(Wyngaarden & & Smith. Ce"7 7^由oi of歸/c/./7e, 1-2404 (W. B. Sauders company, Philadelphia, 1988 )。在西方 國家心血管疾病的直接醫(yī)療花費(fèi)是巨大的并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)吸煙導(dǎo)致全世 界每年5百萬的過早死亡，令人感興趣地，這些中的大部分是由于心血管事件引起的 (Lightwood. The economics of smoking and cardiovascular disease,戶rc^ Csrd/op^c Z /s 46， 39-78 ( 2003 )。 認(rèn)為煙霧顆粒引起對動脈壁的損傷，引起內(nèi)皮的局部化功能障礙和增 強(qiáng)的斑塊形成(Holden等，Endothelium-dependent effects of cigarette smoke components on tone of porcine intrapulmonary bronchioles in vitro( 7bi/co/ j卯/ 力sr則co/ 104， 191-9( 1990 ))。 然而，解釋吸煙如何參與并惡化動脈粥樣硬化過程的分子機(jī)理沒有得到充分了解。因此，存在研發(fā)一種方法的需要，在該方法中可以在支 氣管水平評價煙草煙霧的影響。通過發(fā)展這樣的方法，可評價現(xiàn)有的 煙草以及新的煙草產(chǎn)品的影響，所述新的煙草產(chǎn)品可能對動脈壁和氣 道具有較低的影響或根本沒有影響并有希望降低對煙草消費(fèi)者的危 害。該方法還可以用于篩選可以防止煙草產(chǎn)品在血管或氣道的平滑肌 細(xì)胞中誘導(dǎo)的改變的物質(zhì)，以及使用該方法來測定受體調(diào)控的表達(dá)，其可能由于吸煙而改變，即，可將該方法用作診斷方法。 發(fā)明概述本發(fā)明涉及評價從煙霧獲得的脂溶性部分對解剖的(dissected) 細(xì)支氣管如動脈或氣道平滑肌細(xì)胞的影響以及鑒定生物活性劑的方 法，該生物活性劑能夠降低煙霧對血管或細(xì)支氣管的影響。因此，這 是第一次可以相互比較不同的煙霧，如來自不同的煙草或煙草產(chǎn)品的 不同煙霧，并鑒定哪種煙草對使用所述煙草的人具有較少的危害，以及在發(fā)現(xiàn)新煙草中使用該方法，該新的煙草不影響或低程度地影響所 有受到煙霧影響并存在于血管或細(xì)支氣管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的受體的表 達(dá)，例如動脈壁或氣道中的內(nèi)皮縮血管肽受體，并因此降低血管或細(xì) 支氣管中平滑肌細(xì)胞的收縮。根據(jù)第一個方面，本發(fā)明涉及評價脂溶性煙草煙霧顆粒對血管或 細(xì)支氣管中的平滑肌細(xì)胞的影響的方法，包括步驟提供來自動物的 解剖的細(xì)支氣管或血管，將所述解剖的細(xì)支氣管或血管暴露于脂溶性 煙霧顆粒，在解剖所述細(xì)支氣管或血管之前誘導(dǎo)一種或多種介導(dǎo)緊張 性的受體的上調(diào)，將所述解剖的細(xì)支氣管或血管浸入介質(zhì)中并對所述 細(xì)支氣管或血管施加張力，測定所述解剖的細(xì)支氣管或血管的收縮應(yīng) 答和評價煙霧對血管或細(xì)支氣管中的平滑肌細(xì)胞的影響。在第二個方面中，本發(fā)明涉及評價煙草煙霧對血管或細(xì)支氣管中的平滑肌細(xì)胞的影響的方法，包括步驟提供來自動物的解剖的細(xì)支 氣管或血管，將所迷解剖的細(xì)支氣管或血管暴露于脂溶性煙霧顆粒， 在解剖所述細(xì)支氣管或血管之前誘導(dǎo)一種或多種介導(dǎo)緊張性的受體的 上調(diào)，將所述解剖的細(xì)支氣管或血管浸入介質(zhì)中并對所述細(xì)支氣管或 血管施加張力，加入生物活性劑，測定所述解剖的細(xì)支氣管或血管的 收縮應(yīng)答，和評價煙霧對血管或細(xì)支氣管中的平滑肌細(xì)胞的影響和獲 得生物活性劑。在第三個方面中，本發(fā)明涉及已經(jīng)通過上述方法獲得的生物活性 劑，以及所述生物活性劑的用途，用于治療涉及血管或細(xì)支氣管收縮的病癥，例如在慢性阻塞性肺病或細(xì)支氣管哞喘之后。 附圖簡述圖l.煙堿與DSP相比較對ACh-誘導(dǎo)的血管舒張的影響。使用 0. llmg/L的煙堿濃度，這是DSP中的煙堿濃度。因為煙堿和煙霧顆粒 溶解于DMS0中，將相同體積的DMSO加入培養(yǎng)基中作為對照。用煙堿 或DSP處理動脈6小時(A)和12小時(B)。數(shù)據(jù)顯示為平均值土S. E.M. n=8。 *p<0. 05和"p〈0. 01 vs.對照。發(fā)明詳述 定義在本申請和本發(fā)明的上下文中，適用以下定義術(shù)語"脂溶性煙霧顆粒"用來表示實施例1中獲得的部分。術(shù)語"生物活性劑，，用來表示能夠作為蛋白激酶抑制劑起作用的 物質(zhì)，該抑制劑能夠通過降低血管收縮或提高血管舒張來使血管緊張 性正?；?，如在缺血性腦損傷后的動脈中。術(shù)語"介質(zhì)"用來表示溶液，在其中可以上調(diào)解剖的動脈或細(xì)支 氣管的受體。受體的實例是內(nèi)皮縮血管肽，如A,和A"血管緊張素， 如AT和AT" 5-羥色胺，如5HT1B,和緩激肽，如B!和B2。生理溶液 的實例是本領(lǐng)域^支術(shù)人員顯而易見的。實例是改良的KREB， s, DMEM, 生理NaCl，磷酸鹽緩沖液等。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語"治療"意思是通過抑制導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和翻譯的信 號，受體上調(diào)將得到阻止，因此，例如，導(dǎo)致半影區(qū)損傷和神經(jīng)元喪 失的后遺癥將得到消除。術(shù)語"上調(diào)"用來表示血管和氣道中的受體在表型上改變和/或在 數(shù)目上增加，這將導(dǎo)致對循環(huán)和肺功能的有害影響。術(shù)語"細(xì)支氣管"用來表示氣管后的氣道。本發(fā)明的方法本發(fā)明涉及評價煙霧對血管或細(xì)支氣管中平滑肌細(xì)胞的影響的領(lǐng) 域，并因此獲得關(guān)于煙霧中哪種顆粒引起特定影響的知識。脂溶性煙 霧顆?？梢詠碜圆煌臒煵莓a(chǎn)品，如常規(guī)的香煙或雪茄。然后可從煙 草中去除顆粒并因此可以獲得更健康的煙草，其對煙草消費(fèi)者具有較 少的負(fù)面影響。已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)煙草煙霧至少上調(diào)動脈和細(xì)支氣管平滑肌細(xì)胞(SMC)中的內(nèi)皮縮血管肽受體。該方法還可以用于鑒定 新的生物活性劑，該活性劑可以用來治療涉及細(xì)支氣管或血管的病癥 以及用來測定受到脂溶性煙霧顆粒上調(diào)的受體的表達(dá)，并因此使用該 方法來測定由脂溶性煙霧顆粒引起的病癥或疾病的程度。為了能夠鑒定這樣的煙草脂溶性煙霧顆粒，我們已經(jīng)研發(fā)了 一種 方法，其中可以與一種或多種受體如內(nèi)皮縮血管肽受體的上調(diào)平行或 順次地誘導(dǎo)收縮和/或舒張。發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)體內(nèi)或體外遭 受缺血的組織的血管，如基底動脈和大腦中動脈，經(jīng)歷表型改變，使 得血管收縮受體群得到上調(diào)，其導(dǎo)致過度的動脈收縮，變得上調(diào)的受 體中有例如內(nèi)皮縮血管肽，5-羥色胺和血管緊張素受體。使用煙草脂 溶性煙霧顆粒看到相同的效果，雖然強(qiáng)烈得多。該方法可以用于理解 涉及例如內(nèi)皮縮血管肽受體上調(diào)的分子機(jī)理；該過程參與血管和肺疾 病。從這點，然后可以鑒定出生物活性劑，其可以用來治療煙霧誘導(dǎo) 的疾病。生物活性劑可以擔(dān)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)激酶抑制劑?？梢詮膭游锶绱笫螅∈?，豚鼠，狗，貓，馬或其合成形式獲得 動脈或氣道SMC。通過使用Adner等^>開的技術(shù)，Plasticity of contractile endothelin-B receptors in human arteries after organ culture. Br J Pharmacol 119， 1159-66 ( 1996 )和氣道如 Granstr6m等，Up-regulation of endothelin receptor function of mRNA expression in airway smooth muscle cells following sephadex-induced airway inflammation. Basic & Clinical Pharmacol Toxicol. 2004; 95: 43-48，來獲得SMC。然后將分離的 動脈或支氣管暴露于煙草煙霧或煙草脂溶性煙霧顆粒，后者已經(jīng)從所 述煙霧中提取出來，如水溶性顆粒或脂溶性顆粒。 一種提取所述脂溶性煙霧顆粒的方法是實施例1?？梢栽诒┞队跓煵葜苄詿熿F顆粒之前或之后，將細(xì)支氣管解剖 成更小的節(jié)段或圓片。細(xì)支氣管將在暴露于脂溶性煙霧顆粒的過程中上調(diào)內(nèi)皮縮血管肽 受體或內(nèi)皮縮血管肽受體可以保持或多或少的活性。然而，迄今為止 已經(jīng)評價的所有煙草都激活內(nèi)皮縮血管肽受體，并且結(jié)論是如果從煙 草去除上調(diào)內(nèi)皮縮血管肽受體的顆粒，可以獲得更健康的煙草或組織 將不易于患病。因此，本發(fā)明的方法是重要的且應(yīng)當(dāng)是研發(fā)新煙草中 有用的工具。該方法還可以用于篩選可以防止煙草產(chǎn)品在氣道中血管 平滑肌細(xì)胞中誘導(dǎo)的改變的物質(zhì)，以及使用該方法來測定可由于吸煙 而改變的受體調(diào)節(jié)的表達(dá)，即，可將該方法用作診斷方法。包括以下實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，且本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)限于此。實施例1Z 577 #炎承通過水抽吸器來"抽，，三支煙(每支煙0. 8mg煙堿)并且使煙霧 通過原棉過濾器。將過濾器中截留的煙霧顆粒溶解于lmlDMS0中。通 過氣相色鐠-火焰電離檢測(GC-FID， Agilent 6890N， USA)來分析 DMS0可溶性煙霧顆粒(DSP )制劑，使用0. 23mm x 15mm x 0. 25m DB-5MS 毛細(xì)管柱(Agilent, USA )。將GC-FID溫度編程，從50t:以51C/min 升高至280X:，并保持3分鐘。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)煙堿峰值和面積來計算DSP 中煙堿的濃度。通過氣相色鐠分析DSP制劑后，用DMSO將它們稀釋至 標(biāo)準(zhǔn)煙堿含量(0. llmg/L)并用于器官培養(yǎng)實驗。實施例2 遂歡刺備用C02將Sprague-Dawley大鼠(250 ~ 300g，雄性或雌性)安樂 死，將頭部切下并放血。溫和地取出腸系膜上動脈，浸入冷的充氧緩 沖溶液(以mM計NaCl 119， NaHC03 15， KC1 4. 6， MgC12 1. 2， NaH2P041.2， CaC12 1.5，葡萄糖5.5， pH7.4)，并在光學(xué)顯微鏡下解剖成 無粘附組織。從Department of Forensic Medicine of Xian Jiaotong University (China)(西安交通大學(xué)法醫(yī)系(中國))的3名對象獲 得人大腦中動脈(MCA)。在由于交通事故死亡后4至6小時，從三名 男性收集動脈并用于器官培養(yǎng)。使用大鼠和人動脈的實驗方案獲得當(dāng) 地Ethic， s Committee of Shaanxi province (China)(映西省倫 理委員會(中國))的批準(zhǔn)。實施例3我們已經(jīng)研發(fā)了誘導(dǎo)血管細(xì)胞中GPCR表型改變的體外方法，通過 將動l^片段培養(yǎng)一段時間(Ander等，Plasticity of contractile endothelin-B receptors in human bronchioles after organ culture./戶力"鵬co/ 119， 1159-66 ( 1996 ))。在無血清的DMEM中在37 'C在富含5°化02的潮濕空氣中培養(yǎng)1mm長的環(huán)狀片段(除去了內(nèi)皮和 外膜)24小時，含或不含0. 2 ju 1/ml的DSP。實施例4 沐斧秀理夢對于收縮實驗，將細(xì)支氣管安置在淹沒在以下組成的控溫緩沖溶 液(37"C )中的兩個金屬絲上(Myograph, J. P. Trading, Denmark): (mM)NaC1119， NaHC03 15， KC1 4. 6， MgCl2 1. 2， NaH具l. 2, CaCl2 1.5和葡萄糖5.5。將緩沖劑用富含5%0)2的氧氣連續(xù)充氣，使得pH 為7.4。通過用于個人電腦連續(xù)記錄的PowerLab裝置(AD Instruments, Hastings, England )記錄觀'J量值，并用軟件程序Chart 分析(Ander等，Plasticity of contractile endothelin-B receptors in human bronchioles after organ culture. /尸/ arzi7sco7 119， 1159—66 ( 1996 ))。實施例4將血管片段，每組三個樣品，置于Tissue TEK (Gibco)上，冷 凍并隨后切成8pM厚的切片。所用的一抗是兔子抗人ETb(IBL， 16207 )， 1: 400稀釋，山羊抗人ETA ( Santa Cruz Biotechnologis， sc-2 1194 ) , 1: 100稀釋，小鼠抗大鼠平滑肌肌動蛋白(Serotec， MCA 1 905T) ， 1: 100稀釋，和小鼠抗大鼠CD3 l( Serotec， MCA 1746 ), 1: 200稀釋。所有稀釋在含有10%胎牛血清的PBS中進(jìn)行。所用的二 抗是綴合的驢-抗-小鼠CyTM5( Jackson ImmunoResearch， 715-175-150 ) 1:100,綴合的驢-抗-兔Cy 3( Jackson ImmunoResearch, 711-165-152 ) 1: 100,在含有10%胎牛血清的PBS中。然后在共焦顯微鏡(Zeiss, USA )合適波長下檢測抗體。作為對照，只使用二抗。用Image J (http: 〃rsb. inf. nih. gov/i j )研究絕對熒光并減去背景熒光。在存 在平滑肌肌動蛋白陽性染色的地方，即因此在血管的肌肉部分中，進(jìn) 行測量。獲得的值是選定區(qū)域中的平均熒光。實施例5應(yīng)沖^矛掙,砑充器官培養(yǎng)后，收集血管并置于水上，在含有蛋白酶-和磷酸酶抑制 劑的裂解緩沖劑(10mMTris pH7. 4, 50mM P-甘油磷酸，100 ju M Na3V04, 0. 5°/。脫氧膽酸，lmMEGTA， 1mMEDTA, lmMNaF， 20mM Na4P20" 1% Triton X-IOO， lmM DTT， 20jaM抑胃酶肽，20juM亮抑酶肽，0. lU/ml抑酶 肽，InM花萼海綿誘癌素(Calyculin)和lmM PMSF)中均漿。使用 BioRad DC試劑盒(Hercules, CA， USA)和Genesys 6分光光度計 (Thermo, Waltham， MA， U.S.A.)測定總蛋白濃度。在10% SDS-PAGE 凝膠上的每個泳道中上樣45 jug總蛋白并以1.5mA/cm'印跡到Hybond PVDF膜上，持續(xù)30分鐘。隨后用5%脫脂奶將膜在室溫(RT)封閉1 小時并用 一抗在4X:孵育過夜，用二抗(Pierce, Rockf ord, IL， U. S. A.) 在RT賻育1小時。用Supersignal Dura試劑盒(Pierce, Rockford,IL， U.S.A.)將膜顯影并用Fujifilm LAS-1000 Luminiscent圖象分 析儀(Stamford, CT， U.S.A.)觀察。使用1: 1000的pAkts,， pJNK，磷酸-p38， ( Cell Signaling Technology, Beverly, MA， U.S.A.)， pELKl， pPKC5 SBR645 5 pPKC ￡ SER729 (Biosource, Camari 1 lo， CA， U. S. A，)， ETA和ET"Chemicon， Temecula， CA， U.S.A.)。使用1: 2500的pERK (P謂ega， Madison, WI， U.S.A.)。實施例6 體外藥理學(xué)從氣管和支氣管切下包括兩個軟骨節(jié)段的圓環(huán)片段。用1mm直徑 的金屬線剝除每個片段的上皮，并且表面作為finegraded file來避 免混淆擴(kuò)張效果(Hadj-Kaddour等，1996 )。然后將它們安置在兩個L-型的金屬叉上。 一個叉連接力位移傳感 器，該傳感器連接用于等容張力連續(xù)記錄的計算機(jī)，另一個叉連接位 移裝置。然后將片段浸入小的(2. 5ffll )含有相同緩沖溶液的控溫(37 °C )組織浴中。用02中5°化02平衡溶液，使得pH為7. 4。最初，將lmN 的張力施加至每個片段，然后使其穩(wěn)定在該張力水平60分鐘。首先通 過暴露于富鉀(60mM)緩沖溶液(對于組成，參見以下)來檢查每個 片段的收縮能力。只有已經(jīng)引發(fā)兩次強(qiáng)烈(>lmN)的可重復(fù)收縮(變 異<10%)后，將各個片段用于進(jìn)一步的研究。將通過r-溶液(60mM) 誘導(dǎo)的收縮用作收縮參照。剝除上皮和上皮完整片段之間的比較實驗 證明了收縮能力不受剝除影響或損害。以三個部分來進(jìn)行濃度應(yīng)答實驗首先，氣管中的內(nèi)皮縮血管肽 受體，在內(nèi)皮縮血管肽ETr拮抗劑FR 139317 ( 10|iM)，內(nèi)皮縮血管 肽ETB-拮抗劑BQ 788 ( 10|liM)不存在或存在下，或在兩種拮抗劑的 組合或混合的ET受體拮抗劑波生坦(10pM)存在下，使用內(nèi)皮縮血 管肽-l和S6c表征。其次，在已經(jīng)建立嗜酸性粒細(xì)胞炎癥后(24h)， 在大鼠氣道的兩個水平-氣管和支氣管研究內(nèi)皮縮血管肽-l和S6的效 果。通過內(nèi)皮縮血管肽激動劑達(dá)到最大收縮時，加入乙酰膽堿(lmM)。在該研究中可以使用所有片段，即，沒有片段通過除去上皮或由Sephadex誘導(dǎo)的炎癥而受到損害。通過木棒機(jī)械除去氣道上皮細(xì)胞， 并在實驗后通過組織學(xué)研究來控制結(jié)果(蘇木精-曙紅染色)。緩沖溶液和藥物標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液(mM): NaCl 119, NaHC03 15， KC1 4. 6, MgCl21.2， NaH2P041.2， CaCl21.5,葡萄糖5.5。使用分析級化學(xué)物質(zhì)和雙蒸餾 水制備所有的溶液。將S6c和ET-l (Auspeptide, Aus)溶解于含有 牛血清白蛋白(Kabi, Sweden)的水中(0.1% w/v )。將所有MAPK 抑制劑溶解于DMSO中并稀釋于水中。PD98059, SB239063, SB408039, SB386023b和SB203580購自Sigma， St.Louis， USA。計算和統(tǒng)計將數(shù)據(jù)表示為平均值士S.E.M.將每個片段的收縮應(yīng)答表示為r 誘導(dǎo)的收縮的百分比。Emax表示激動劑誘導(dǎo)的最大收縮，對于每個血管片段，以絕對值給出或表示為r誘導(dǎo)的應(yīng)答的百分比。從濃度-應(yīng)答曲線中點以上和以下的濃度之間的線計算出pECs。值。將Dunn， s post-hoc檢驗的Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗用于所有的統(tǒng)計分析。 在P<0. 05認(rèn)為差異是顯著的。實施例7 實時PCR將肺樣品在獲得后立即在液氮中快速冷凍并使用TRIzol試劑 (GibcoBRL)按照供應(yīng)商的說明提取總細(xì)胞RNA。將所得到的RNA沉淀最后用70%冰冷乙醇洗滌，風(fēng)千并再溶解于10 pi焦碳酸二乙酯 (DEPC)-處理的水中。使用分光光度法(DU64分光光度計；Beckman，F(xiàn)ullerton， CA, USA )觀'J定RNA的量，i人為OD260: 280 > 1. 6的t匕侈'J為純的。4吏用GeneAmp RNA PCR試劑盒(Perkin—Elmer， Foster City,CA， USA)在DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer)上進(jìn)行RT-PCR。如下設(shè) 計用于大鼠內(nèi)皮縮血管肽ETA(產(chǎn)生264個堿基對產(chǎn)物)和內(nèi)皮縮血管 肽ETs受體(產(chǎn)生560個堿基對產(chǎn)物)的特異性引物內(nèi)皮縮血管肽ETA-受體正向5'-TACAAGGGCGAGCAGCACAGGA-3, 反向5' -CACAGGGCGAAGATGACAACCAA-3'內(nèi)皮縮血管肽EL-受體正向5,-TGACGCCACCCACTAAGAC-3, 反向5'-GACAGCCAGAACCACAGAGA-3'用GeneAmp RNA PCR試齊寸盒(Perkin Elmer, Foster City, USA) 在Perkin Elmer DNA熱循環(huán)4義中進(jìn)行總RNA至cDNA的逆轉(zhuǎn)錄和隨后 的PCR。使用隨機(jī)六聚物作為引物在20-|u 1反應(yīng)體積中從1 總RNA 合成第一鏈cDNA。將反應(yīng)混合物在25C孵育IO分鐘，42°C 15分鐘， 加熱至99。C 5分鐘，并冷卻至5°C 5分鐘。對于每個引物對，通過 PCR在50|u 1終體積中擴(kuò)增來自所得到cDNA的9 n 1部分。用以下的 方案進(jìn)行PCR: 95" 5分鐘，1個循環(huán)；接著95X: 1分鐘，57C1分 鐘和72X: 3Q秒鐘，3Q個循環(huán)；在72C進(jìn)行最后延伸7分鐘。在所有 實驗中包括空白(水)。對照實驗顯示出30個循環(huán)在PCR的指數(shù)期內(nèi) (未顯示)。通過如下的限制分析證實PCR產(chǎn)物的鑒定用SpH I(Boehringer Mannheim, Germany)消化內(nèi)皮縮血管肽EL產(chǎn)物，產(chǎn)生三個分別為27， 78和159個堿基對的片段。用Eco RV (Boehringer )切割內(nèi)皮縮血管 肽ETr產(chǎn)物，產(chǎn)生兩個分別為106和454個堿基對的片段。取出后將肺組織在-80r快速冷凍。使用FastRNA Kit-GREEN和 FastPrep FP120Cell Disrupter ( B皿Ol, Qbiogene， Carlsbad CA， USA)按照供應(yīng)商的說明提取總細(xì)胞RNA。最后將所得到的沉淀再溶解于10pL焦磷酸二乙酯(DEPC)-處理的水中。使用GeneAmp RNA PCR 試劑盒(PE Applied Biosystems, Foster City, USA )在Perkin Elmer DNA熱循環(huán)儀中進(jìn)行總RNA至cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。使用隨機(jī)的六聚物作為 引物在20-ju 1反應(yīng)體積中從1 ji g總RNA合成第一鏈cDNA。將反應(yīng)混 合物在25匸孵育IO分鐘，42X:i5分鐘，加熱至99。C5分鐘，并冷卻 至5匸5分鐘。在GeneAmp 5700測序系統(tǒng)(Perkin-Elmer， Applied Biosystem， Foster City, CA， USA)中使用GeneAmp SYBR⑧Green試 劑盒(Perkin-Elmer， Applied Biosystems Foster City, CA， USA) 進(jìn)行實時PCR,在50 jiL反應(yīng)體積中使用如上合成的cDM作為模板。 在所有實驗中包括無模板對照。GeneAmp 5700測序系統(tǒng)使用光學(xué)和成 像系統(tǒng)，通過熒光染料與雙鏈DNA的結(jié)合，實時監(jiān)測DNA的生長。如 下設(shè)計用于大鼠ETA和ETB受體的特異性引物EL受體正向5'-ATTGCCCTCAGCGAACAC-3' 反向S'-CAACCAAGCAGAAAGACGGTOEL受體正向5'-GATACGACAACTTCCGCTCCA-3' 反向5'-GTCCACGATGAGGACAATGAG-3'將延伸因子-1 ( EF-1 ) mRNA用作參照，因為這是管家基因的產(chǎn)物， 在細(xì)胞中連續(xù)表達(dá)至恒定的量。如下設(shè)計EF-l引物 EF-1正向5'-GCAAGCCCATGTGTGTTGAA-3' 反向5'-TGATGACACCCACAGCAACTG"^用以下方案進(jìn)行實時PCR: 50匸2分鐘，IO分鐘，95°C 15 秒x 40，和60°C 1分鐘。為了證明EF-1的cDNA和ET受體在實時PCR過程中以相同效率擴(kuò)增，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中將CT-值對cDNA濃度作 圖，基于等式CT- (lg (1 + E)rig (濃度)，其中E是擴(kuò)增效率， 最佳值為1。為了證明每個引物對只產(chǎn)生一個PCR產(chǎn)物，進(jìn)行對PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。藥物PCR:用于PCR測定的寡核苷酸和試劑購自Perkin-Elmer ， Appl ied Biosystems Fosty City, CA， USA。計算PCR:對n只sephadex處理的大鼠和n只鹽水處理的大鼠進(jìn)行PCR 實驗。通過公式X。/R。-2etR—"x相對于相同樣品中EF-lmRNA的量計算 EL和ETB受體mRNA的量，其中X。-ET受體mRNA的最初含量，R。=EF-1 mRNA的最初含量，CtR-對于EF-1的C廣值，CtX-對于ET受體的CT-值。進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，其中認(rèn)為p<0. 05是顯著的。實施例8其他受體的分子生物學(xué)數(shù)據(jù)表明了其他受體，實例為AL 5-耵18和也受到上調(diào)?？?能存在其他還沒有明確的受體，這些受體在肺病的情況中得到改變或 過表達(dá)，其可能也引起了孝喘中的過度血管收縮。附帶地，不僅是膜結(jié)合的受體引起肺流的調(diào)節(jié)，它們與不同類型 的離子通道的活性的偶聯(lián)也是相關(guān)的。總地來看，鑒定潛在有益的生 物活性劑的有效方法需要留意不同機(jī)理的能力。,g ^炎承使用FastRNA -Kit-GREEN( BIO 101, Carlsbad CA， USA)按照供應(yīng)商的說明提取總細(xì)胞RNA。最后用75%乙醇洗滌所得到 的沉淀，風(fēng)干并再溶解于40juL焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中。用GeneAmp RM PCR試劑盒(PE Applied Biosystems,Foster City,USA)在Perkin Elmer DNA熱循環(huán)儀中進(jìn)行總RM至cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。 使用隨機(jī)六聚物作為引物在40 反應(yīng)體積中從總RM合成第一鏈 cDNA。將反應(yīng)混合物在25"C孵育IO分鐘，加熱至42X:i5分鐘，進(jìn)一 步加熱至99C5分鐘，并冷卻至51C5分鐘。在GeneAmp "00測序系 統(tǒng)中使用GeneAmp SYBR Green試劑盒(Perkin-Elmer ， Applied Biosystems Foster City, CA， USA)進(jìn)行實時PCR,在50jnL反應(yīng)體 積中使用如上合成的cDNA作為模板。在所有實驗中包括無模板對照。 GeneAmp 5700測序系統(tǒng)使用光學(xué)和成像系統(tǒng)，通過熒光染料與雙鏈DNA 的結(jié)合，實時監(jiān)測DNA的生長。如下設(shè)計用于AT,和AL受體，ACE和 NF-kB的特異性引物 AL受體正向5' -GGATGGTTCTCAGAGAGAGTACAT-3, 反向y-CCTGCCCTCTTGTACCTGTTG -3'AT2受體正向5' -TCTGTTAGTGGGATGCATGTAATCA-3' 反向5'-TGTGGGCCTCCAAACCATT-3'ACE正向S'-CCCGGAAATACGAAGAATTGd 反向5'-GGCTCTCCCCACCTTGTCTC-3'NF-kB正向5'-GAGAGCCAGTAGCACGCATG-3, 反向5'-CCTGGGTTCGTGGAATGAGT-3'將延伸因子-1 UF-1)和甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH) mRNA用 作內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)，如下設(shè)計引物 EF-1正向5'-GCAAGCCCATGTGTGTTGAA-3' 反向5' -TGATGACACCCACAGCAACTG-3'GAPDH正向V-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3' 反向y-CGGCATGTCAGATCCACAAC-3'使用以下方案進(jìn)行實時PCR: 50。C 2分鐘，接著40個循環(huán)的95 °C 15秒鐘和60t; 1分鐘。計算戶^:每個測試的引物，對5-6只大鼠進(jìn)行PCR實驗(每個樣品一 式雙份)。通過公式X。/R。= 2"H"相對于相同樣品中EF-1和GAPDH mRNA 的含量計算mRNA的含量，其中X。-目標(biāo)mRNA的最初含量， R。=EF-1/GAPDH mRNA的最初含量，CtR-對于EF-1/GAPDH的C廣值，CtX= 對于目標(biāo)的C廣值。CT-值指的是在特定的時間點在一個樣品中的每個 基因產(chǎn)物進(jìn)行的PCR循環(huán)數(shù)。數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM。用非配對的 Student' s t-檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析并且^人為P<0. 05是顯著的。實施例9 蛋白質(zhì)印跡使用蛋白質(zhì)印跡來證實細(xì)支氣管中激活的(磷酸化的)MAPK的存 在。將用于蛋白質(zhì)印跡的細(xì)支氣管的片段培養(yǎng)0. 5， 1， 2， 3或24h, 在液氮中快速冷凍，隨后儲存在-80'C直至使用。將用于蛋白質(zhì)印跡的組織最初在500 |u L的Laemml i溶液中孵育并 用polytron ( IKA labor technik,德國)勻漿。將裂解物以5000 x g 4 。C離心5分鐘并將上清液轉(zhuǎn)移至新的管中。加入更多的Laemmli溶液 來獲得大約75mg組織/mL的濃度。將裂解物存儲在-20"C直至使用。將蛋白質(zhì)加熱至97-100°C 3-5分鐘來使大多數(shù)蛋白質(zhì)變性。將等量的煮過的上清液部分上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠上，通過電泳來分 離(Mini-protein 3, Bio-Rad， CA )，然后通過半干印跡(Trans-blot SD， Bio-Rad)轉(zhuǎn)移至semi-blot PVDF膜(Bio-Rad)上。用TBS-T (TBS中0. 1%吐溫-20)中5%脫脂乳溶液封閉蛋白質(zhì)印跡并在含有脫 脂乳和合適稀釋度的多克隆抗體的TBS-T中4C孵育過夜。將膜在 TBS-T中洗滌，與抗-兔子IgG辣根過氧化物酶-標(biāo)記的二抗(1: 50 000 ) 孵育90分鐘。進(jìn)一步洗滌后，將PVDF膜接受SuperSignal West,并 通過Luminiscent圖象分析儀(Fujifilm Science Imaging systems, 日本)檢測化學(xué)發(fā)光。在p38和Akt-蛋白質(zhì)激酶凝膠中，將來自大鼠 細(xì)支氣管的細(xì)胞提取物施加至凝膠作為陽性對照。對于該方法的更多 詳細(xì)內(nèi)容參見(Frodin等，2002 )。將山羊多克隆抗體用于檢測ERK1/2 ( Santa Cruz Biotechnology, USA),而將多克隆兔子抗體(Promega, USA)用于檢測磷酸-ERK1/2 激酶。將兔子多克隆抗體(Cell Signaling Technology, USA)用來 檢測p38 MAP激酶，磷酸-p38 MAP激酶(Thrl80/Tyr182 ) ， Akt蛋白 激酶，磷酸-Akt蛋白激酶(Thr308 )和磷酸-Akt (Ser473 )。將過氧 化物酶綴合的抗山羊(DAK0，丹麥)和抗-兔子(Amersham Pharmacia Biotech, UK )免疫球蛋白用作二抗。為了顯影，我們使用了 SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce, Perbio, USA)。實施例10DSP與煙堿的比較DSP含有0. 11mg/L煙堿，因此將該濃度用于檢查在DSP誘導(dǎo)的血 管舒張的降低中煙堿是否是關(guān)鍵物質(zhì)。與煙堿相比較，DSP在降低Ach-誘導(dǎo)的擴(kuò)張中具有顯著更強(qiáng)烈的效果。然而，與DMSO(對照)相比較， 煙堿沒有產(chǎn)生任何顯著的血管擴(kuò)張的降低(

圖1)。
權(quán)利要求
1.評價脂溶性煙霧顆粒對血管或細(xì)支氣管中的平滑肌細(xì)胞的影響的方法，包括步驟a.提供來自動物的細(xì)支氣管或血管，b.將所述細(xì)支氣管或血管暴露于脂溶性煙霧顆粒，c.在解剖所述細(xì)支氣管之前誘導(dǎo)一種或多種介導(dǎo)緊張性的受體的上調(diào)，d.將所述解剖的細(xì)支氣管浸入介質(zhì)中并對所述細(xì)支氣管或血管施加張力，e.測定所述解剖的細(xì)支氣管或血管的收縮應(yīng)答，和f.評價脂溶性煙霧顆粒對血管或細(xì)支氣管中的平滑肌細(xì)胞的影響。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述脂溶性煙霧顆粒來自煙草煙霧。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項的方法，其中受體選自內(nèi)皮縮血管 肽、血管緊張素、5-羥色胺和緩激肽。
4. 根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中該方法包括另外兩個步 驟，在步驟d)和e )之間加入生物活性劑的第一個步驟和獲得能夠降 低煙霧對血管或細(xì)支氣管中的平滑肌細(xì)胞的影響的生物活性劑的第二 個最終步驟。
5. 根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中生物活性劑是激酶抑制劑。
6. 根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中細(xì)支氣管或血管選自大 鼠，小鼠，豚鼠，狗，貓，馬或其合成形式。
7. 根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的方法，其中該方法包括一個或多個 另外的步驟從所述解剖的細(xì)支氣管或血管獲得一片樣品。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中在所述樣品片中在mRNA水平測 定所述受體的表達(dá)。
9. 通過根據(jù)任一項權(quán)利要求的方法獲得的生物活性劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的生物活性劑的用途，用于治療涉及細(xì)支氣 管或血管收縮的病癥，例如在慢性阻塞性肺病或細(xì)支氣管哮喘之后。
全文摘要
本發(fā)明涉及評價煙霧對血管或細(xì)支氣管中的平滑肌細(xì)胞的影響以及鑒定生物活性劑的方法，該活性劑能夠降低煙霧對細(xì)支氣管或血管的影響。
文檔編號G01N33/50GK101223443SQ200680024948
公開日2008年7月16日 申請日期2006年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月8日
發(fā)明者L·埃德溫松, 徐倉寶 申請人:普羅納斯制藥股份公司