專利名稱：：鑒定蛋白質(zhì)折疊抑制劑的方法鑒定蛋白質(zhì)折疊抑制劑的方法本發(fā)明涉及用于鑒定抑制蛋白質(zhì)的折疊，從而抑制其生物學(xué)功能的抑制劑的方法，尤其是用于鑒定蛋白質(zhì)折疊、具有高度選擇性并且不產(chǎn)生抗性的肽類抑制劑的方法。發(fā)明背景蛋白質(zhì)起主要生理學(xué)作用的事實(shí)是本領(lǐng)域公知的。人們已經(jīng)在用蛋白質(zhì)作為治療劑，催化劑和具有特定性能的適宜材料方面作出了許多努力。許多疾病起源于導(dǎo)致蛋白質(zhì)喪失功能性的蛋白質(zhì)突變。在某些情況下，例如，由蛋白質(zhì)發(fā)揮的催化活性可能受損，從而導(dǎo)致代謝途徑發(fā)生改變(例如，苯fe酮尿癥)。在其它一些情況下，蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)特性可能受到影響，以致于導(dǎo)致物理功能性的喪失(例如，肌營養(yǎng)不良癥)。Creutzfeld-Jakob病和其它傳染性腦病可能由蛋白質(zhì)的改變其形狀和形成聚合物的結(jié)構(gòu)修飾引起[l]。類似地，疾病還可能由蛋白質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)化為聚合性/3-折疊的長鏈，并沉淀，形成原纖維的淀粉樣變引起P]。已知有許多癌癥的發(fā)生是由于蛋白質(zhì)的突變。在這個(gè)意義上，已知有約50%的人類癌癥由主要降低其穩(wěn)定性的腫瘤抑制因子P53的突變導(dǎo)致[3]。酶和受體是恢復(fù)功能，或者破壞傳染原或癌癥的藥物的常見靶點(diǎn)。蛋白質(zhì)科學(xué)的終極目標(biāo)是能根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測其結(jié)構(gòu)和活性(所謂的"折疊問題")，及抑制該活性[4,5]。有了這樣的成果，設(shè)計(jì)和合成新的催化劑，材料及藥理活性劑，尤其是適于抑制酶活性的藥物將成為可能。這些藥物可能顯示的主要特性是特異性(即，無毒)和有效性。通常，這可以通過將酶的活性位點(diǎn)加帽(競爭性抑制)，或者通過結(jié)合到該蛋白質(zhì)的某些其它區(qū)域/部分上，從而引起使該酶不適于與底物結(jié)合的結(jié)構(gòu)變化(變構(gòu)抑制)來實(shí)現(xiàn)。為了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)中的任何一個(gè)，必須優(yōu)化配體和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合。由于不僅需要計(jì)算酶和底物或其它配體間的能，而且還需要計(jì)算它們與水的相互作用能和反應(yīng)期間熵的變化這樣一個(gè)事實(shí)，因此這是個(gè)相當(dāng)艱巨費(fèi)時(shí)的問題。凈結(jié)合能是兩個(gè)大數(shù)之間的小差異。在靶點(diǎn)為顯示高突變率的病毒蛋白質(zhì)的情況下，出現(xiàn)的更復(fù)雜的問題是常常伴隨著眾所周知的抗性的發(fā)展。因此，策劃新的策略，使設(shè)計(jì)比已知的以活性位點(diǎn)為中心的設(shè)計(jì)更有效更經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)抑制劑成為可能，以及產(chǎn)生以阻斷酶與其底物間的相互作用為目的，不產(chǎn)生抗性的策略是至關(guān)重要的。許多實(shí)驗(yàn)性[6-8，38，41]和理論性[9,10]的研究顯示球狀單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(即，長度為N，包括60-150個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[28])通過分級機(jī)制(hierarchicalmechanism)折疊，所述分級機(jī)制即，由少數(shù)連續(xù)氨基酸組成小單元，由小單元構(gòu)成大單元，大單元再依次構(gòu)成更大的單元，最后形成完整蛋白質(zhì)。對天然態(tài)形成前氨基酸鏈段的折疊和締合的實(shí)驗(yàn)性研究鑒定了初期折疊事件中的部分類天然結(jié)構(gòu)[39]。這些結(jié)構(gòu)要素通常被稱為折疊結(jié)構(gòu)域或折疊子[9]。這些單元的操作定義是"蛋白質(zhì)從變性態(tài)開始折疊形成的最初可觀察的類天然結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)"。這些結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變可以嚴(yán)重限制正確折疊蛋白質(zhì)的形成[IO]。模型計(jì)算[11，12]顯示，小的單體單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的折疊從未折疊構(gòu)象開始，在依次發(fā)生下列分級事件后進(jìn)行1)形成少數(shù)(2-4個(gè))總體上含有所述蛋白質(zhì)的約20%至約30%的氨基酸(因此各含有該蛋白質(zhì)的5%至15%的氨基酸)的局部基本結(jié)構(gòu)(通常稱為LES)，所述LES通過少數(shù)沿所述多肽鏈接近的高度保守的強(qiáng)相互作用("熱")疏水氨基酸(小于所述蛋白質(zhì)氨基酸的10%)而得到穩(wěn)定；2)LES在(后臨界)折疊核對接(docking)[13],即形成使系統(tǒng)處于整個(gè)折疊過程的主要自由能障之上的天然接觸的最小集合；3)在折疊核形成后將剩余的氨基酸立刻松弛在天然結(jié)構(gòu)上。人們發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定LES的"熱"點(diǎn)對(非保守性)點(diǎn)突變非常敏感。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)穩(wěn)定能集中在這些位點(diǎn)，因此其中一個(gè)或兩個(gè)發(fā)生突變的可能性具有較高的使折疊構(gòu)象失穩(wěn)的概率。用模型計(jì)算的LES鑒定前段的折疊結(jié)構(gòu)域是正常的。同樣的模型表明，利用其序列與蛋白質(zhì)的LES的序列相同的肽(稱為p-LES)可能使該蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象失穩(wěn)[14]。這些折疊抑制劑相對于常規(guī)折疊抑制劑而言，具有兩個(gè)重要優(yōu)勢。第一，其分子結(jié)構(gòu)直接由靶蛋白質(zhì)提示。人們不必設(shè)計(jì)或優(yōu)化任何事物，只需找到靶蛋白質(zhì)的LES即可。由于LES的設(shè)計(jì)已經(jīng)由無數(shù)次病毒(或表達(dá)該蛋白質(zhì)的有機(jī)體)的增殖，以識(shí)別并彼此劇烈地相互作用，使該蛋白質(zhì)快速折疊并避免與其它蛋白質(zhì)發(fā)生聚集的演化而完成，所得抑制劑有望顯示較小的毒性。第二，其不太可能由于逃逸突變而無效。實(shí)際上，p-LES遵循使折疊核穩(wěn)定的相同范例與該靶蛋白質(zhì)的互補(bǔ)性LES結(jié)合，穩(wěn)定化由蛋白質(zhì)的"熱"氨基酸控制[15，16]。因此，逃逸突變必須包括那些為LES的穩(wěn)定和對接所必需的"熱"氨基酸上的突變。這些突變通常導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。換言之，不妨礙蛋白質(zhì)折疊成其天然生物活性狀態(tài)的結(jié)構(gòu)突變不能阻止局部基本結(jié)構(gòu)向折疊核的對接或p-LES的抑制作用。通過LES失穩(wěn)或其對接而阻礙折疊核形成的突變原則上避免了p-LES的作用，但其將由于突變蛋白質(zhì)不能折疊而不被表達(dá)。發(fā)明概述總而言之，本發(fā)明涉及使球狀單域蛋白質(zhì)(這些蛋白質(zhì)的典型長度為60-150)的LES個(gè)體化的簡單，經(jīng)濟(jì)且(基本)無誤差的方法。因此，本發(fā)明涉及不太可能產(chǎn)生抗性的這些蛋白質(zhì)的折疊的高度特異性強(qiáng)效抑制劑(p-LES肽)的個(gè)體化。由于球狀多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)通常被構(gòu)建成序列單元(結(jié)構(gòu)域，區(qū)組[17-24]或模塊[25，26])的組合，對于真核生物，所述序列單元的特征長度為約125個(gè)氨基酸，對于原核生物，特征長度為約150個(gè)氨基酸，序列單元如單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)那樣折疊，因此本發(fā)明還涉及用于鑒定蛋白質(zhì)折疊的肽抑制劑而不管蛋白質(zhì)的大小或模塊性的方法及三態(tài)多聚體的各個(gè)單體[29,30]。在下文中，我們在球狀蛋白質(zhì)或?qū)儆谌龖B(tài)多聚體的單體的序列單元的框架下對本發(fā)明進(jìn)行了解釋。發(fā)明目的本發(fā)明因此涉及用于鑒定在不誘導(dǎo)逃逸突變的條件下抑制蛋白質(zhì)折疊，從而抑制其特定生物活性的肽類抑制劑的方法。因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是用于鑒定含N個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的折疊的肽抑制劑的方法，該方法包括a)設(shè)計(jì)M個(gè)長度為L的肽，其各自顯示與靶蛋白質(zhì)的某區(qū)段同一的序列，以覆蓋全部蛋白質(zhì)，不同肽之間允許有一些重疊。L通常包含約IO個(gè)氨基酸，優(yōu)選在約4至約20之間變動(dòng)。因此，M的范圍為約5至約50，通常為約20。b)單個(gè)或集群制備M個(gè)所設(shè)計(jì)的肽。C)制備M份各自含有適當(dāng)摩爾比的所考慮的蛋白質(zhì)和一種肽的溶液，并在37"C孵育各溶液。d)利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評價(jià)上述溶液中肽的抑制效力或未折疊度或兩者，以鑒定對所述蛋白質(zhì)賦予抑制活性的肽。本發(fā)明的方法特別有優(yōu)勢，因?yàn)槠涫沟萌藗兛梢杂每煽壳曳浅：唵蔚姆椒◤腗個(gè)特意設(shè)計(jì)和制備的肽中鑒定出所考慮的蛋白質(zhì)具有抑制活性，甚至最高抑制活性的肽。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，除非另有說明，術(shù)語"肽"表示通常包括大約10個(gè)氨基酸的短肽鏈。優(yōu)選該肽包括L個(gè)氨基酸，其中L在約4至約20之間變動(dòng)。該"肽"的序列除非另有說明，與所述蛋白質(zhì)的同等長度的區(qū)段相同。此外，"肽類抑制劑"是指阻斷靶蛋白質(zhì)的折疊，從而阻斷其特定生物學(xué)功能的肽。g卩，該抑制劑具有與所述蛋白質(zhì)的LES基本同一的序列，因此也可以被稱為p-LES[14]。"LES"(局部基本結(jié)構(gòu))是指在折疊過程中形成得非常早的第一天然結(jié)構(gòu)[11,12](在文獻(xiàn)[9，10,38]中也被稱為折疊子或折疊結(jié)構(gòu)域)。這些結(jié)構(gòu)通過強(qiáng)相互作用，通常疏水的高度保守("熱")氨基酸得到穩(wěn)定。人們可以區(qū)別結(jié)構(gòu)良好的所謂的閉合LES和低結(jié)構(gòu)化的所謂的開放LES[15]。當(dāng)在溶劑中分離時(shí)，后一種類型的LES不顯示任何(重要)天然接觸。相反地，當(dāng)分離時(shí)，閉合LES卻顯示出了同樣在(后臨界)折疊核中起重要作用的天然接觸[13]。(后臨界)折疊核"FN"是指為克服整個(gè)折疊過程中蛋白所遇到的最高自由能障所需要的天然接觸的最小集合[13]。這些接觸大部分由LES的對接引起。該事件基本上由閉合LES控制。"熱"氨基酸是指在蛋白質(zhì)的折疊中起主要作用的氨基酸。這些氨基酸的非保守性突變通常導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性[16]。根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟(a)及其任何變體，M個(gè)長度為L的肽可以這樣設(shè)計(jì)，即顯示與所考慮的蛋白質(zhì)的某區(qū)段同一的序列。M和L的值的選擇應(yīng)能覆蓋所述蛋白質(zhì)的全部氨基酸序列，并且允許有一些重疊。通常L是IO個(gè)氨基酸(對于長度為N的單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，相當(dāng)于氨基酸總數(shù)N的約十分之一，即，L=N/10)，優(yōu)選在約4至約20之間變動(dòng)。因此，M的范圍為約5至約50，通常為約20。僅作為非限制性的解釋性的例子，本發(fā)明的方法可以通過設(shè)計(jì)19個(gè)氨基酸鏈長均為12個(gè)氨基酸的肽(g卩，M等于19)，用于對蛋白質(zhì)，例如，包括120個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)具有抑制活性的肽的鑒定。由上所述，當(dāng)19個(gè)長度均為12個(gè)氨基酸的肽顯示與所述蛋白質(zhì)的指定區(qū)段相同的序列，并且必須覆蓋全部蛋白質(zhì)序列時(shí)，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是將存在著具有重疊區(qū)段的肽(各相鄰肽之間的重疊在該特定例子中約為50%)。通常，本發(fā)明的方法的步驟(a)可以提供用于系統(tǒng)地設(shè)計(jì)指定的M個(gè)肽，通過從氨基酸1和下一個(gè)氨基酸開始，逐漸覆蓋全部蛋白質(zhì)(因此不同肽之間允許有約50%至約70%的重疊；常見下述實(shí)施例4)?；蛘?，所述M個(gè)肽可以通過從與接近氮和碳末端的蛋白質(zhì)區(qū)段及蛋白質(zhì)中心相應(yīng)的區(qū)域開始進(jìn)行設(shè)計(jì)，并且允許不同肽之間的再次重疊。步驟(b)包括根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備M個(gè)肽。所述方法可以包括，例如，任何已知的用于合成肽的合成方法，或者，可能按照已知方法通過在適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)切割蛋白質(zhì)而直接由蛋白質(zhì)獲得它們。通過將步驟(b)中所制備的任何一種肽與靶蛋白質(zhì)一起溶解在任何適宜的溶劑中而執(zhí)行步驟(c)。肽與蛋白質(zhì)的摩爾比可以在1:1-10:1(肽/蛋白質(zhì))的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)刈儎?dòng)；優(yōu)選相對濃度是3:1(肽/蛋白質(zhì))。這樣獲得的溶液在約37。C孵育數(shù)分鐘，例如，一直到10分鐘。或者，步驟b)和c)可以由計(jì)算機(jī)模擬取代，其利用蛋白質(zhì)的簡化模型(例如，全原子G5模型，CaG5-模型等[33]),加上熱力學(xué)取樣或模擬動(dòng)力學(xué)(例如，MonteCarlo算法，Newton動(dòng)力學(xué)等)，模擬蛋白質(zhì)在各個(gè)類型肽存在下的演變(從該蛋白質(zhì)的未折疊或折疊構(gòu)象開始)，從而確定蛋白質(zhì)本身在這些肽存在下的未折疊度。這些模擬實(shí)驗(yàn)可以提供有關(guān)與蛋白質(zhì)的區(qū)段相同的抑制劑的序列及其在溶液中的天然構(gòu)象的信息。與顯示小結(jié)構(gòu)和/或大波動(dòng)的抑制劑相比，顯示高度結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的抑制劑是優(yōu)選的。這與高度結(jié)構(gòu)化抑制劑(與所謂的"閉合"局部基本結(jié)構(gòu)(LES)，艮卩，顯示對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性重要的天然接觸的動(dòng)機(jī)區(qū)段相對應(yīng))有望比其它低結(jié)構(gòu)化的所謂的"開放"LES特異性更強(qiáng)，從而毒性更小的事實(shí)是一致的[11,12，15]。在這方面，值得注意的是，僅考慮殘基的CV原子的模型計(jì)算重視了存在于這兩種類型LES之間的差異。當(dāng)存在的系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)信息涉及與大量蛋白質(zhì)位點(diǎn)相關(guān)的0值[4]時(shí)，為了確定蛋白質(zhì)的"溫"和"熱"位點(diǎn)(即，在蛋白質(zhì)的折疊中起主要作用的部位[16]，相應(yīng)的占據(jù)它們的氨基酸是高度保守的)，可以最后對長度和蛋白質(zhì)上的初始和最終氨基酸數(shù)稍微進(jìn)行調(diào)整，以保證肽抑制劑包括所有熱氨基酸，并且，即使不是全部，也包括大多數(shù)溫氨基酸。迭代(iteration)過程可以常常通過利用適當(dāng)?shù)能浖?參見下述實(shí)施例1)計(jì)算與靶蛋白質(zhì)的不同氨基酸相關(guān)的0值來進(jìn)行。一旦設(shè)計(jì)了新的抑制劑，還可能通過按照上述步驟(d)的分析測試其效力。根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟(d)，上述溶液中肽的抑制效力或未折疊度或兩者可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行測定。作為非限制性例子，分光光度檢測，沉降平衡試驗(yàn)，圓二色譜和核磁共振技術(shù)都可以用來測定上述抑制作用。同樣地，吸收實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域[4]已知的當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是酶時(shí)用來測定抑制效力[4,31]的方法。如之前報(bào)道的那樣，一旦發(fā)現(xiàn)有效阻斷蛋白質(zhì)折疊的肽，就不必要繼續(xù)進(jìn)行檢査其余肽的抑制特性的過程，搜索和鑒定可以終止于該點(diǎn)。換言之，本發(fā)明的方法可以用來從所制備并如此測試的所有M個(gè)肽中鑒定出被賦予最高抑制活性的最佳肽。或者，如上文所述，步驟(c)的不同溶液可以按任何順序進(jìn)行測試，一旦發(fā)現(xiàn)具有預(yù)期抑制活性的肽便停止全部方法，而無需測試和制備所有溶液。這樣，根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案，步驟(a)可以包括設(shè)計(jì)長度為4-20的單個(gè)肽；步驟(b)可以包括制備所述肽；步驟(c)可以包括制備蛋白質(zhì)與所述相同肽的溶液；步驟(d)可以包括評價(jià)所述肽的抑制活性。如果發(fā)現(xiàn)所述肽的抑制效力令人滿意，則可以終止該方法，因?yàn)槠淠苋菀椎罔b定適當(dāng)?shù)碾囊种苿?。反之，如果抑制效力不佳，或者無論如何該肽缺乏任何顯著抑制效力，則用另一個(gè)肽重復(fù)步驟(a)至(d)，直到鑒定出最佳抑制劑。少數(shù)(1-4)抑制蛋白質(zhì)折疊，并被我們稱之為p-LES的肽鑒定了在折疊過程中導(dǎo)致LES的蛋白質(zhì)的氨基酸區(qū)段。由于蛋白質(zhì)為了實(shí)現(xiàn)其生物活性必須為天然(折疊)構(gòu)象，因此p-LES也有望成為蛋白質(zhì)功能的有效的且永久有效的特異性抑制劑。應(yīng)該測定p-LES在培養(yǎng)基中的溶解度，并且如果需要，可以對其進(jìn)行修飾，以降低其疏水性。例如，修飾可以通過以下方法進(jìn)行1)加入極性和/或帶電荷的氨基酸；2)縮短鏈長，即釋放C端或N端或此兩端的一個(gè)或兩個(gè)疏水氨基酸；3)保守突變，即用另一個(gè)疏水性稍小的氨基酸置換疏水性氨基酸。此外，由于p-LES是肽，因此其也可以被細(xì)胞消化和/或產(chǎn)生過敏反應(yīng)。在這種情況下，p-LES可以用作對應(yīng)于其模擬分子的折疊抑制劑，或者按照已知方法，利用D-氨基酸合成的最終具有相同氨基酸序列的肽的先導(dǎo)物。下面將通過實(shí)施例，同時(shí)參考肽模擬物和p-LES的溶解度更加詳細(xì)地描述本發(fā)明的各個(gè)方面和實(shí)施方案。所述實(shí)施例不希望限制本發(fā)明，因?yàn)槿藗儗⒄J(rèn)識(shí)到，可以在不超出本發(fā)明的范圍的條件下對本發(fā)明的方法的細(xì)節(jié)進(jìn)行修改。附圖圖l:srcSH3的晶體結(jié)構(gòu)的圖。(5個(gè))反向平行的/3-折疊被描畫為帶箭頭的(淺灰色)帶狀物，而a螺旋則以深灰色表示。圖2:在三種不同溫度下計(jì)算的單獨(dú)的SH3蛋白質(zhì)的序參數(shù)q的平衡分布概率，所述q的定義為天然接觸的相對數(shù)。qX).7時(shí)，該蛋白質(zhì)為天然構(gòu)象，q0.5時(shí)，該蛋白質(zhì)為變性態(tài)。天然和變性態(tài)的峰具有相同面積時(shí)的溫度T=0.843是折疊溫度。圖3:由Src-SH3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和三種與插圖中所示由第一個(gè)和最后一個(gè)氨基酸表征的蛋白質(zhì)區(qū)段之一具有相同序列的肽組成的系統(tǒng)的序參數(shù)q在T^.825時(shí)的平衡分布概率。圖4:T=0.825時(shí)計(jì)算的由Src-SH3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和三種與插圖中所示由第一個(gè)和最后一個(gè)氨基酸表征的蛋白質(zhì)區(qū)段之一具有相同序列的肽組成的系統(tǒng)的序參數(shù)q的平衡分布概率。圖5:T=0.825時(shí)由Src-SH3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和三個(gè)其序列與長度為6的起始于橫坐標(biāo)所示部位的蛋白質(zhì)片段同一的肽組成的系統(tǒng)的天然態(tài)群，其已相對于蛋白質(zhì)本身的天然態(tài)群(pN"-"S)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。肽以區(qū)段l-6開始，以區(qū)段55-60結(jié)束，不同肽之間的重疊為67%。線引導(dǎo)目光?？招膱A點(diǎn)提供了由輕微修飾兩種初始肽，即肽p-S2(=21-27)和p-S3(=35-40)而獲得的肽p-S'2(=18-28)禾Bp-S'3(=36-42)的抑制劑特性的信息(參見正文)。圖6:SrcSH3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在T=0.825時(shí)的天然態(tài)群(空心圓點(diǎn))。所示橫坐標(biāo)值為0的結(jié)果與野生型序列相對應(yīng)。其它結(jié)果與在位點(diǎn)9，30(冷，C)，5，49和55(溫，W)及18，26(熱，H)處具有突變的蛋白質(zhì)相對應(yīng)。T-0.825時(shí)，SrcSH3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在三種p-S3(35-40)存在下的天然態(tài)的相對群以實(shí)心三角形的方式顯示。圖線引導(dǎo)目光。不同突變位點(diǎn)的值與具有橫坐標(biāo)中所指突變的蛋白質(zhì)的野生型序列相對應(yīng)。圖7:利用改良G5模型計(jì)算的Src-SH3突變的自由能的變化AAG。并且還顯示了[AAG]和[AAG]+2d的值。AAG>[AAG]+2(7的位點(diǎn)(#18，26，27和40)被稱為熱氨基酸，而[AAG]<AAG<[AAG]+2ff的位點(diǎn)(#4，5，6，28，39，41，48，49，50和55)是溫氨基酸。系統(tǒng)計(jì)算和實(shí)驗(yàn)信息表明，單結(jié)構(gòu)域單球狀蛋白質(zhì)的"熱"和"溫"點(diǎn)以上述比例存在(參照[40]及其中的參考文獻(xiàn))。圖8:與圖7相同，但是是通過蛋白質(zhì)工程[32]經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的AAGu.N值。在這種情況下，位點(diǎn)IO，20，24和26是熱點(diǎn)，而位點(diǎn)5，7，18，23，38，41，44，48，49和50則是溫點(diǎn)。圖9:HIV-1-PR同二聚體的天然構(gòu)象的圖。各單體含有99個(gè)氨基酸。兩種單體用不同灰度級表示。在向右顯示的單體中，與該單體有關(guān)的LES的可能候選者以暗灰色表明[37]。圖10:利用廣義C。GG模型[37]計(jì)算的HIV-1-PR單體的許多位點(diǎn)(x軸)上的突變對該蛋白質(zhì)的天然態(tài)的穩(wěn)定性pw(y軸)的影響。實(shí)心十字與單獨(dú)的單體的天然構(gòu)象的穩(wěn)定性相對應(yīng)(生物學(xué)溫度T=2.5kJ/mol)，而實(shí)心圓點(diǎn)則顯示了該單體在三種p-S8(=83-93)型p-LES存在下的pw值。在突變位點(diǎn)=0處所畫十字和閉合圓點(diǎn)表示與野生型序列相關(guān)的結(jié)果。圖線引導(dǎo)目光。圖11:在肽83-93(1)，非抑制劑肽(2)，肽61-70(3)和肽9-19(4)(來自參考文獻(xiàn)[36])存在下HIV-1-PR活性基準(zhǔn)的吸光度作為時(shí)間的函數(shù)。實(shí)施例實(shí)施例1(Sre-SH3)該結(jié)構(gòu)域顯示5個(gè)反向平行的/3-折疊和a螺旋，由60個(gè)殘基組成(參見圖1)。對于本發(fā)明的方法，這是有趣的基準(zhǔn)，因?yàn)槠湟淹ㄟ^熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)被廣泛表征[32]。利用廣義G5模型[33]模擬SH3結(jié)構(gòu)域的折疊，并計(jì)算該結(jié)構(gòu)域?yàn)槠涮烊粯?gòu)象的概率(參見圖2)。對SH3結(jié)構(gòu)域與肽同時(shí)存在的每一種情況，我們重復(fù)該計(jì)算過程，所述肽顯示與28種長度為N/10(=6)的蛋白質(zhì)區(qū)段，即1-6，3-8，5-10，……，55-60之一同一的序列，并且肽-結(jié)構(gòu)域比例為3:1。結(jié)果見圖3，4和5。從這些結(jié)果可以清楚地指出肽p-S尸3-8，p-S2=21-27，p-S3=35-40和p-S4=45-50抑制了折疊，而p-S3肽是最有效的。因此，區(qū)段S,(卜l，2，3和4)是srcSH3結(jié)構(gòu)域的LES。圖6中所示結(jié)果證明了肽S,(i二l，2，3和4)不僅是有效抑制劑，而且還永久有效的事實(shí)。圖6中顯示了點(diǎn)突變對蛋白質(zhì)本身及在三種p-S3肽存在下的穩(wěn)定性的影響。不影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或折疊能力的突變(例如，在位點(diǎn)#9和#30處的突變)未改變p-S3肽的抑制能力。另一方面，逃逸突變(例如，在位點(diǎn)#(5，18，26，49和55)處的突變)不能折疊。這些結(jié)果與位點(diǎn)#(9，30)，#(5，49，55)和#(18，26)分別為冷，溫和熱點(diǎn)的事實(shí)一致。結(jié)合圖5和圖7中所示結(jié)果，為了確保4種抑制劑p-S,(i=l，2，3和4)包括所有熱點(diǎn)(位點(diǎn)#18，26，27和40)和大多數(shù)溫點(diǎn)(4，5，6，28，39,41，48，49，50，55)，可以稍微調(diào)整這4種抑制劑的長度和初始及最終氨基酸數(shù)。沿這些圖線進(jìn)行的第一次迭代的合理成果產(chǎn)生了P-S尸P-S—3-8(包括溫氨基酸4，5和6)，p-S'2=18-28(熱氨基酸18，26，27;溫氨基酸28)，p-S'3=36-42(熱氨基酸40;溫氨基酸39，41)，p-S'4=p-S4=45-50(溫氨基酸48，49，50)。注意該抑制劑肽的集合不包括單個(gè)(溫)氨基酸(#55)。這與不是所有參與(后臨界)FN的溫點(diǎn)必定屬于LES(例如，S36-模型蛋白質(zhì)的溫氨基酸弁16是后臨界FN的一部分，但不屬于任何LES[16])的事實(shí)是一致的。圖5中所示P-S2'和P"S3'的結(jié)果(空心圓點(diǎn))例證了迭代肽的改良的效力。值得注意的是，到現(xiàn)在為止報(bào)道的所有結(jié)果均來自于模型計(jì)算。由于在目前的情況(Src-SH3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域)下，存在的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)信息涉及在折疊過程中起重要作用的氨基酸(即從蛋白質(zhì)工程中了解AAG值[32]，參見圖8)，因此可能利用該信息去進(jìn)行迭代過程。從圖8所示結(jié)果可以指出分別與氨基酸#10，20,24,26和氨基酸#5，7，18,23，38,41,48,50相應(yīng)的"熱"和"溫"點(diǎn)。利用這些結(jié)果及圖5和6中所示結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)合理的第一次迭代產(chǎn)生了p-S—5-10(含有熱氨基酸10和溫氨基酸#5，7)，p-S2'=20-26(熱氨基酸#20，24，26;溫氨基酸#23)，p-S3'=38-44(溫氨基酸#38,41，44)和p-S4'=p-S4=45-50(溫氨基酸#48，50)。由上述方法確定的這些肽的抑制特性應(yīng)該通過本發(fā)明的方法的步驟(d)中所引用的分析法進(jìn)行測試。實(shí)施例2(HIV-PR，計(jì)算的)HIV-1-PR是由各自含有99個(gè)氨基酸的鏈構(gòu)成的同二聚體(圖9)。該酶的穩(wěn)定性已通過冗長的時(shí)間達(dá)數(shù)百納秒(ns)的全原子模擬進(jìn)行了研究。利用相應(yīng)的結(jié)果建立了廣義CsG5模型。然后其被用來模擬該酶折疊的全部動(dòng)力學(xué)演化，并將所得結(jié)果與可在文獻(xiàn)中獲得的全原子標(biāo)準(zhǔn)G5模型模擬實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)合獲自這些模擬實(shí)驗(yàn)的認(rèn)知和來自突變的信息(表l)，確定該蛋白質(zhì)的"熱"和"溫"點(diǎn)，并選出LES的可能候選者。尤其是，區(qū)域S^(83-93)(詳情參照[37]和其中的參考文獻(xiàn))。在3種p-Ss肽存在下模擬HIV-1-PR單體的折疊。將天然態(tài)的群Pw定義為鏈顯示出低于IO人的RMSD，并形成大于70%的天然接觸的標(biāo)準(zhǔn)化概率，一個(gè)結(jié)果顯示P^^0.28。該數(shù)值必須與相同生物學(xué)條件下單獨(dú)的蛋白質(zhì)的PN=0.87及該蛋白質(zhì)在具有與片段61-71和4-14相同的序列的對照肽存在下的數(shù)值PN=0.72和0.66進(jìn)行比較[37]。該抑制劑不產(chǎn)生抗性這一事實(shí)的證據(jù)見圖10。不影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或折疊能力的突變基本上未改變p-Ss肽的抑制特性(例如，在位點(diǎn)#19處的突變)。逃逸突變(例如，在位點(diǎn)#33處的突變)基本上不能折疊。實(shí)施例3(HIV-PR，實(shí)驗(yàn)性的)通過固相合成得到顯示與野生型HIV-1-PR單體的區(qū)段83-93(S8)和區(qū)段9-19及61-70具有同一的序列的肽。向20mM磷酸鹽緩沖液(pH6)中加入0.8mMNaCl，lnMEDTA和lmM二硫蘇糖醇，再加入2.78MgHIV-l蛋白酶和5.4pM肽(即，各不同肽的濃度為蛋白酶濃度的3倍)，制成各溶液。利用顯色底物[34]進(jìn)行光譜分析，測量其在310nm處的吸光度相對時(shí)間的變化[36]。圖11中報(bào)道了部分相應(yīng)結(jié)果?？梢钥吹?，肽83-93始終降低蛋白酶的活性，因此可以用作抑制劑。該序列因此可以被理解為產(chǎn)生了HIV-1-PR的L^S。如從圖9觀察到的那樣，該LES結(jié)構(gòu)良好，包含許多內(nèi)部天然接觸(其穩(wěn)定a螺旋轉(zhuǎn)角)。其因此是特異性尤其強(qiáng)的肽抑制劑。值得注意的是，不管是否由商品化藥物(目標(biāo)為抑制該蛋白酶的活性部位)誘導(dǎo)，在該片段[35]或其互補(bǔ)片段(即，片段24-34)中觀察到的突變都被發(fā)現(xiàn)是保守突變(參照表l)。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表l:參考文獻(xiàn)[35]中報(bào)道的觀察到的HIV-l-PR的突變。對于野生型序列的各殘基(wt)，列出了在治療和/或未治療患者中觀察到的突變(mut)和與這些突變中的最少保守性突變相關(guān)的PAM250分值(PAM250是由分析相關(guān)蛋白質(zhì)之間發(fā)生的氨基酸置換而得到的分值。其為通常發(fā)生在相關(guān)蛋白質(zhì)之間的置換(保守突變)規(guī)定各種正值，為不可靠置換(unlikelyreplacements)(非保守突變)規(guī)定零或負(fù)分值)。用粗體字報(bào)告了發(fā)生非保守性突變的位點(diǎn)。實(shí)施例4如果是含有N個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，可以制備長度為L=(N/10)±2，各顯示與該蛋白質(zhì)的某區(qū)段相同的序列的肽。肽#1與開始于氨基酸1和結(jié)束于氨基酸L的區(qū)段一致，肽#2與區(qū)段(L/z+l)—[(l+z)L/z]—致，…，而ith肽與區(qū)段(iL/z+l)—[(i+z)L/z]—致，其中i-l，2，…，im，其中i:n-zN/L-Z。因此，將產(chǎn)生的肽的最大數(shù)量是im+l。數(shù)量Z控制兩個(gè)相鄰肽之間允許的重疊。z的推薦值為導(dǎo)致50%和67%重疊的2和3。為了(現(xiàn)實(shí))例證的目的，我們選擇值N400，L=10，z=3。然后獲得im=27和67%的重疊。與28種可能肽各自的第一個(gè)和最后一個(gè)氨基酸相對應(yīng)的數(shù)集中在表2中。以HIV-1-PR二聚體的單體為例，我們關(guān)聯(lián)這些結(jié)果，并假定在抑制折疊的肽的搜索中所遵循的三種不同方案a)從氨基酸(aa)1開始有序搜索，并繼續(xù)進(jìn)行至aal00(即，從N端開始向C端進(jìn)行)，b)有序搜索，但以相反的順序進(jìn)行(由100至1，g卩，從C端到N端)，c)從蛋白質(zhì)的N端，C端和中間開始隨機(jī)搜索，然后從這些區(qū)域離開，以覆蓋全部蛋白質(zhì)。為找到p-LES抑制劑(表2的肽#26)，在第一種情況下，研究者需要進(jìn)行26次嘗試，在第二種情況下，需要3次嘗試，而在第三種情況下則需要12次嘗試(見表2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2:將HIV-1-PR的序列分割為肽的例子。各列分別顯示了肽的標(biāo)識(shí)號(hào)，指標(biāo)i(參見正文)，HIV-1-PR序列中的相應(yīng)片段和基本上同時(shí)從蛋白質(zhì)的中心及C和N末端開始進(jìn)行的非連續(xù)抑制試驗(yàn)的例子(以羅馬數(shù)字表示)。在這種情況下，當(dāng)測試肽#26時(shí)，搜索工作在12個(gè)步驟后結(jié)束。參考文獻(xiàn)1.A.L.HorwichandJ.S.Weissman，DeadlyConformations-ProteinMisfoldinginPrionDisease,Cell89(1997)4992.D.R.Boothetal.，Instabi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方法，其中肽/蛋白質(zhì)的摩爾比在1:1-10:1之間變動(dòng)。7.權(quán)利要求5的方法，其中肽/蛋白質(zhì)的摩爾比是3:l。8.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)和(c)可以由計(jì)算機(jī)程序模擬取代。9.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)和(C)通過分光光度檢測，沉降平衡試驗(yàn)，圓二色譜或核磁共振技術(shù)來進(jìn)行。10.通過權(quán)利要求l-8任一項(xiàng)中所定義的方法鑒定的肽抑制劑。11.權(quán)利要求9中所定義的肽抑制劑，其用作藥劑。12.權(quán)利要求l的方法，其用于多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的各個(gè)結(jié)構(gòu)域。全文摘要本發(fā)明涉及用于鑒定抑制蛋白質(zhì)的折疊，從而抑制其生物學(xué)功能的不產(chǎn)生抗性的肽抑制劑的方法。尤其是，本發(fā)明涉及具有高突變率的病毒酶的抑制劑。文檔編號(hào)G01N33/68GK101228443SQ200680026560公開日2008年7月23日申請日期2006年7月17日優(yōu)先權(quán)日2005年7月19日發(fā)明者圭多·蒂亞納,里卡多·布羅利亞申請人:米蘭大學(xué)