專利名稱：結(jié)核抗原的檢測分析及疫苗的制作方法
結(jié)核抗原的檢測分析及疫苗
相關(guān)申請
本申請要求申請日為2005年7月1日、名稱為"結(jié)核抗原 才t測分析及疫苗"的美國臨時申請No.60/696439的優(yōu)先權(quán)，并且 要求申請日為2005年9月14日、名稱為"結(jié)核抗原檢測分析及 疫苗"的美國臨時申請No.60/717062的優(yōu)先權(quán)。上述申請的全部 內(nèi)容在oHi通過引i正并入本文。
政府支持
本發(fā)明得到了來自于世界衛(wèi)生組織的No.TDA30469A號撥 款和來自于全國衛(wèi)生研究會No.NIH AI43529號撥款的全部或者 部分支持。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
全世界有多于三分之一的人感染過結(jié)核分枝桿菌，該細菌能 夠?qū)е陆Y(jié)核(TB)疾病。每年，有八百萬人感染結(jié)核，兩百萬人 死于結(jié)核疾病。結(jié)核給發(fā)展中國家?guī)砹?艮大的影響，也癥會世界 上的發(fā)達地區(qū)帶來了日益嚴重的困擾。
感染了結(jié)核的患者可能在相當長的一段時間內(nèi)是無癥狀的， 可能處于結(jié)核疾病的潛伏期。當?shù)竭_活性期時，結(jié)核疾病通常表 現(xiàn)為肺部的急性炎癥，并導致發(fā)燒以及千咳。如果不接受治療， 通常會導致嚴重的并發(fā)癥以及死亡?，F(xiàn)有的it斷檢測通常不夠準
確，不能夠辨別出病人是處于疾病的潛伏期還是處于疾病的活性 期。
當前，接種活細菌是一種對人體進行免疫以抵抗結(jié)核疾病的 方法。然而，接種帶有某些活細菌的結(jié)核疫苗的方法在一些國家 中引起了爭i義，包4舌美國，因此該方法沒有在美國進4亍廣;乏的4吏 用。除此之外，很多時候，當前的診斷測試不能區(qū)分哪些人是經(jīng) 過免疫的，哪些人是感染了結(jié)核的。
有效的4秦種疫苗以及對疾病進行準確的早期診斷，對于疾病 的控制是4艮重要的。因此，需要一種有效的診斷4全測，能夠探測 到結(jié)核細菌產(chǎn)生的活性感染。進一步的需要一種疫苗，所述疫苗 不需要使用活細菌，并且能夠提供針對該疾病的保護性免疫原性 應答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及分離的多肽分子，所述多肽分子具有結(jié)核分枝桿 菌抗原的免疫原部分，或者具有所述抗原的變體的免疫原部分， 其中所述變體的區(qū)別僅^義在于發(fā)生了保守性替代和/或修飾。所述
抗原具有序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列12、 序列14、序列16、序列18、序列20、序列22、序列24、序列 26、序列28、序列30、序列32、序列34、序列36、序列38、 序列40、序列42、序列44、序列46、序列48所示的氨基酸序 列、或者具有上述序列的組合所形成的氨基酸序列；或者具有由 核酸分子編碼的氨基酸序列，其中所述核酸分子具有序列1、序 列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序 列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、 序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序歹'J 43、序列45、序列47所示的序列、或者上述序列的組合所形成
的序列；或者該核酸分子具有序列1、序列3、序列5、序列7、 序列9、序歹'J 11、序歹'J 13、序歹'j 15、序歹'J 17、序歹'J 19、序列21、 序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列 35、序歹'J 37、序歹'J 39、序歹'J 41、序歹'J 43、序歹'J 45、序歹'J 47的 編碼區(qū)域、或者上述序列的組合的編碼區(qū)域；或者所述核酸分子 具有序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序歹'J 13、 序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列 27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序歹'J 39、 序列41、序列43、序列45、序列47的互^卜序列、或者上述序列 的組合所形成的序列的互補序列；或者該核酸分子具有與序列1、 序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、 序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列 29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、 序歹'J 43、序歹'J45、序列47進行雜交的序列、或者與上述序列的 組合進行雜交(例如，在高度嚴格的條件下)的序列。在一種實 施方式中，所述分離的多肽分子刺激宿主或者動物(例如，人類， 鼠類，豬，山羊，猴子)體內(nèi)的免疫原性特異性結(jié)核(TB)應答。 在另外一種實施方式中，本發(fā)明包括一種分離的多肽分子，所述 多肽分子具有結(jié)核分枝桿菌抗原的免疫原部分，其中所述的抗原 包4舌由核酸分子編碼的氨基酸序列，該序列與上述提及的序列中 的任意一個序列具有大于或者等于70%的序列同一性(例如，大 約80%的序列同一性，90%的序列同一性，大約95%的序列同 一性)。在一種實施方式中，本發(fā)明包括分離的多肽分子，該分 子中的氨基酸序列與上述提及的序列具有大于或者等于70 %的 序列相似性(例如，大約80%的序列相似性，大約90%的序列 相似性，大約95 %的序列相似性)。
本發(fā)明進一步描述了分離的核酸分子，所述的核酸分子編碼 含有結(jié)核分枝桿菌抗原的免疫原部分的多肽分子，或者編》馬含有
該抗原的變體的免疫原部分的多肽分子，其中所述的變體的區(qū)別僅僅在于發(fā)生了保守性替代和/或修飾。編碼所述抗原的核酸分子
具有序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、 序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列 27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、 序列41、序列43、序列45、序列47所示的序列、或者上述序列 的組合所形成的序列；或者該核酸分子具有序列1、序列3、序 列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序 列 19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、 序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列 45、序列47的編碼區(qū)i或、或者上述序列的組合的編碼區(qū)域；或 者所述核酸分子具有序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、 序列11、序列13、序列15、序列'17、序列19、序列21、序列 23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、 序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47的互補 序列、或者上述序列的組合所形成的序列的互補序列；或者該核 酸分子具有與序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、 序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列 25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序歹'J 37、 序列39、序列41、序列43、序列45、序列47進4亍雜交的序列、 或者與上述序列的組合進行雜交(例如，在高度嚴格的條件下) 的序列；或者所述核酸分子具有編碼序列2、序列4、序列6、序 列8、序列10、序列12、序列14、序列16、序列18、序列20、 序列22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列 34、序歹列 36、序列38、序列 40、序列 42、序列 44、序列 46、 序列48的序列、或者上述序列的組合所形成的序列。所述的分 離的核酸分子編碼多肽分子，該多肽分子能夠刺激免疫原性特異 性結(jié)核應答。本發(fā)明還包括分離的核酸分子，所述的核酸分子編 石馬含有結(jié)核分枝桿菌抗原的免疫原部分的多肽分子，其中多扁碼該 列同一'〖生(例如，大約80%的序列同一4"生，90%的序列同一性， 大約95°/。的序列同一性)。在一種實施方式中，本發(fā)明包4舌編碼 多肽分子的核酸分子，所述核酸分子的序列與上述提及的序列具 有大于或者等于70%的序列相似性(例如，大約80%的序列相 似性，大約90%的序列相似性，95 %的序列相似性)。
本發(fā)明的另外一種實施方式包4舌含有上述核酸分子或者編 碼上述多肽分子的載體、質(zhì)4立以及宿主細力包。所述的宿主細月包可 以是任何細胞，包括大腸埃希氏桿菌，酵母以及哺乳動物細胞。 除此之外本發(fā)明還包括在嚴格條件下(例如，高度嚴格或者中度 嚴格條件)與上述的核酸分子進行雜交的探針。
本發(fā)明包括與上述多肽分子中的一個或者一個以上相結(jié)合 的抗體。所述抗體可以是單克隆抗體，或者是多克隆抗體。本發(fā) 明還涉及融合蛋白，所述融合蛋白包4舌上述的一個或者一個以上 核酸分子(例如，兩個多肽分子)。除了本發(fā)明所述的多肽分子 之外，所述融合蛋白也可以包括其他結(jié)核分枝桿菌抗原，包括那 些存在于主要組織相容性復合體(MHC) 2級分子中的抗原(例 如，CD4+T細胞途徑結(jié)核抗原)。
本發(fā)明包括刺激個體中的特異性免疫原性結(jié)核應答、預防或 者緩解結(jié)核疾病的嚴重程度的方法，該方法向個體施用一定量的 上述多肽分子或者核酸分子(例如，以載體形式)。在另一個方 面，本發(fā)明包4舌含有上述多肽分子或者核酸分子的組合物(例如， 疫苗組合物或者藥物組合物)，所述多肽分子或者核酸分子存在 于生理可接受載體中。上述組合物還可以包括免疫應答增強劑 (例如，佐劑，另外一種結(jié)核抗原，免疫刺激性細胞因子或者趨 化因子)，或者可以與免疫應答增強劑一同施用。佐劑的例子包
括3D-MPL (3脫-O-?；?單磷酰脂A)以及QS21。上述組合 物可以;故制成水包油乳劑的形式。
本發(fā)明進一步描述了在個體中治療結(jié)核疾病的監(jiān)控方法。該 方法包括在來自于所述個體的樣品中探測上述一種或者一種以 上結(jié)核分枝桿菌抗原多肽的水平；并且與標準水平進行比較。高 于標準水平的結(jié)核抗原肽水平表明該治療是無效的，而低于或者 等于標準水平的水平表明該治療是有效的。監(jiān)控治療的方法也可 以包4舌在一個或者一個以上時間點上(例如，在治療開始時的第 一時間點上或者初始時間點上，以及在治療開始之后的第二時間 點上)#1測樣品中的 一 種或者 一 種以上如上所述的結(jié)核抗原肽的 水平，并且將上述時間點上探測到的水平進行比較。肽水平的增 加表明該治療是無效的，而肽水平的降l氐或者不變則表明該治療 是有效的。
本發(fā)明包括在個體中診斷結(jié)核疾病的方法，該方法#罙測如上 所述的一種或者一種以上多肽分子是否存在，或者探測上述一種 或者一種以上多肽分子的水平。本發(fā)明的診斷檢測也能夠區(qū)別患 有活性結(jié)核疾病的個體以及對結(jié)核產(chǎn)生免疫的個體。該方法包 括在個體中探測如上所述的一種或者一種以上多肽分子是否存 在，或者探測如上所述的一種或者一種以上多肽分子的水平，并 且測定該個體中的結(jié)核特異性免疫應答刺激。如果來自于個體的 樣品中不存在上述多肽分子，并且在個體中存在結(jié)核特異性免疫 應答，則表明該個體已經(jīng)獲得了針對結(jié)核疾病的一定程度的免 疫，而沒患有該疾病。對結(jié)核特異性免疫應答刺激的測量包括測 量來自于個體樣品中的細胞擴增，白細月包介素-12的生成，干擾 素-Y的水平，或者上述測量的組合。
在另外一種實施方式中，本發(fā)明包4舌探測生物才羊品中的結(jié)核 分枝桿菌感染的方法，通過檢測該樣品中是否存在如上所述的多
肽分子來實現(xiàn)該方法。存在上述一種或者一種以上多肽分子，則
表明存在結(jié)核分枝桿菌感染；不存在上述一種或者一種以上多肽 分子，則表明不存在結(jié)核分枝桿菌感染。特別的，該方法包括將 才羊品與結(jié)合于所述多肽分子的抗體(例如，可4罙測的標記抗體) 相4妄觸，^吏樣品與抗體充分接觸形成復合體，從而得到抗原-抗 體復合體；然后探測所述抗原-抗體復合體。上述復合體的存在 則表明結(jié)核分枝桿菌感染的存在，上述復合體的不存在則表明結(jié) 核分枝桿菌感染的不存在。在一個方面，該方法進一步包括將樣 品與另外一個抗體相接觸的步驟，所述的另外一個抗體對上述抗
原或者抗原-抗體復合體具有特異性。上述多肽或者抗體可以結(jié) 合在固體載體上，上述生物才羊品可以是尿液，血液，唾液，腦脊 髓液，或者組織樣品。
4果測生物樣品中的結(jié)核分4支桿菌感染的方法也可以包4舌在 聚合酶鏈式反應中使該樣品與至少兩個寡核苷酸引物進行接觸， 其中至少一個寡核苦酸引物(例如，至少大約IO個連續(xù)的石威基) 對于這里所迷的一種或者一種以上分離的核酸分子是具有特異 性的，能夠充分允許該引物進行擴增；并且探測該樣品中擴增的 核酸序列。如果存在任何一種擴增的核酸序列，則表明結(jié)核分枝 桿菌感染的存在，如果不存在任何一種擴增的核酸序列，則表明 結(jié)核分枝桿菌感染的不存在。探測生物樣品中的結(jié)核分枝桿菌感 染的另外 一 種方法包括在高度嚴格的條件下使該樣品與 一 種或 者一種以上寡核苷酸探針(例如，至少大約15個連續(xù)的堿基) 進行接觸，所述寡核苷酸探針對這里所述的核酸分子具有特異 性，使樣品與探針進行充分的雜交；然后探測樣品中與寡核苷酸 探針雜交的核酸分子。如果存在探針的雜交，則表明存在結(jié)核分 枝桿菌感染，如果不存在探針的雜交，則表明不存在結(jié)核分枝桿 菌的感染。
進一步的，本發(fā)明包括用以診斷人體中是否存在結(jié)核分枝桿 菌感染的試劑盒。所述試劑盒包括一種或者一種以上用于探測這 里所述的一種或者一種以上多肽分子或者核酸分子的試劑。這類 試劑可以包括那些用來進行酶聯(lián)免疫吸附測定、快速免疫色語測
定、流式細胞術(shù)分#斤、或者》文射性免疫4企測的試劑。所述的試劑 盒可以包括一種或者一種以上核酸分子，所述核酸分子具有序列 1、序列3、序列5、序列7、序列9、序歹'J 11、序歹'J 13、序列15、 序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列 29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、 序歹ij 43、序歹ij 45、序列47所示的序列、或者上述序列的組合所 形成的序列；或者具有上述序列的互補序列，以及與序列1、序 列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序 歹'J 17、序歹'J 19、序歹'J 21、序歹'J 23、序歹寸25、序歹'J 27、序列29、 序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列 43、序列45、序列47、或者上述序列的組合所形成的序列進4亍 雜交的核酸序列；所述試劑盒中還含有探測試劑。所述的試劑盒 可以包括其他試劑例如固體載體，以及探測劑(例如，信息基團， 如放射性同位素，熒光基團，發(fā)光基團，酶，生物素以及染色粒 子；與接合劑共軛連接的信息基團例如抗免疫球蛋白，蛋白G， 蛋白A以及外源凝集素)。
本發(fā)明的優(yōu)點有通過提供一種有效的疫苗組合物，從而提 供了預防或者減輕結(jié)核疾病的嚴重程度的新方法。本發(fā)明的檢測 4吏得對尿'液的檢測變得筒單和容易，從而有效的辨別出患有活性 結(jié)核的患者與非患病患者。新的疫苗組合物以及更加有效的i貪斷 檢測將有助于緩解現(xiàn)存的世界范圍內(nèi)的結(jié)核困擾。
附

圖1A-1G的示意圖表示的是氨基酸序列(粗體部分)(序 列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列 15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、 序列29以及序列31)以及相應的結(jié)核分枝桿菌多肽序列(并且體 部分)(序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列12、序 歹'J 14、序歹'J 16、序歹'J 18、序列20、序列22、序列24、序列26、 序列28、序列30以及序列32),上述序列是乂人感染有結(jié)核分斗支 桿菌的小鼠的巨噬細胞中的主要組織相容性復合體1級分子中洗 提出來的。附圖中還描述了來自于結(jié)核分斗支桿菌的類核酸序列以 及類多肽序列，它們與上述被分離的序列具有100%的同源性。
附圖1H的圖表表示的是結(jié)核分枝桿菌肽序列序列2、序 列6、序列10、序列14、序列18、序列22以及序列26，上述序 列是乂人感染有結(jié)核分枝桿菌的小鼠的巨噬細胞中的主要組織相 容性復合體1級分子中洗提出來的。該附圖還表示出染色體組研 究學會(TIGR)的注釋，Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫的命名，以及這些 蛋白的名稱。
附圖2的示意圖表示的序列30的粗體部分部分是一種肽， 所述的肽是在患有肺結(jié)核的病人尿液中發(fā)現(xiàn)的，以及它的相應的 氨基酸序列序列29。該附圖也表示了 DNA序列(序列31 )以 及它的相應的蛋白序列(序列32)，所述蛋白是發(fā)現(xiàn)于結(jié)核分枝 才干菌的類亞鉬嘌呤生物合成蛋白，其與序列30具有100%的同源 性。
附圖3的示意圖表示的是主要組織相容性復合體1級分子相 關(guān)肽的純化和測序方法，上述肽是從結(jié)核分枝桿菌感染型巨噬細 胞中分離得到的。
附圖4表示的是用于在樣品中探測本發(fā)明所述的結(jié)核抗原的 免疫色"i普測定方法的 一 個實施例。
附圖5的圖表表示的是結(jié)核分枝桿菌肽序列序列34，序列 38，序列42以及序列46,上述序列發(fā)現(xiàn)于肺結(jié)核患者的尿液中 以及結(jié)核分枝桿菌供體蛋白中。
附圖6A-B的示意圖表示的是核酸序列(凈且體部分和下劃線 部分)(序列33)以及相應的結(jié)核分枝桿菌多肽序列(粗體部分 和下劃線部分)(序列34)，上述序列發(fā)現(xiàn)于肺結(jié)核患者的尿'液當 中。該附圖還描述了來自于結(jié)核分枝桿菌的高絲氨酸氧乙酰轉(zhuǎn)氨 酶核酸序列以及多肽序列(分別為序列35和序列36)，上述序列 與凈皮分離的序列具有100%的同源性，該附圖以表格的形式表示 了染色體組研究學會(TIGR)給出的位點名稱，最初位點名稱， Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中的命名，推定的識別，基因符號，TIGR癥會出 的細胞功能，坐標，DNA分子名稱，基因長度，蛋白長度，分 子量，pl, GC百分含量，酶學委員會命名#，屬以及種。
附圖7A-C的示意圖表示的是核酸序列(粗體部分和下劃線 部分)(序列37)以及相應的結(jié)核分枝桿菌多肽序列(粗體部分 和下劃線部分)(序列38)，上述序列發(fā)現(xiàn)于肺結(jié)核患者的尿液當 中。該附圖還描述了來自于結(jié)核分4支桿菌的染色體隔離蛋白smc 核酸序列以及多肽序列(分別為序列39和序列40)，上述序列與 被分離的序列具有100%的同源性，該附圖以表格的形式表示了 染色體組研究學會(TIGR)給出的位點名稱，最初位點名稱， Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中的命名，推定的識別，基因符號，TIGR給出 的細胞功能，坐標，DNA分子名稱，基因長度，蛋白長度，分 子量，pl, GC百分含量，酶學委員會命名#，屬以及種。
附圖8A-B的示意圖表示的是核酸序列(粗體部分和下劃線 部分)(序列41)以及相應的結(jié)核分4支桿菌多肽序列(粗體部分 和下劃線部分)(序列42),上述序列發(fā)現(xiàn)于肺結(jié)核患者的尿液當 中。該附圖還描述了來自于結(jié)核分枝桿菌的鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移 酶核酸序列以及多肽序列(分別為序列43和序列44)，上述序列 與4皮分離的序列具有100%的同源性，該附圖以表格的形式表示 了染色體組研究學會(TIGR)給出的位點名稱，最初位點名稱， Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中的命名，推定的識別，基因符號，TIGR給出 的細胞功能，坐標，DNA分子名稱，基因長度，蛋白長度，分 子量，pl, GC百分含量，酶學委員會命名#,屬以及種。
附圖9A-B的示意圖表示的是核酸序列(4且體部分和下劃線 部分)(序列45)以及相應的結(jié)核分枝桿菌多肽序列(粗體部分 和下劃線部分)(序列46),上述序列發(fā)iE見于肺結(jié)核患者的尿液當 中。該附圖還描述了來自于結(jié)核分枝桿菌的磷酸腺苷磷酸硫酸酐 還原酶核酸序列以及多肽序列(分另iJ為序歹'J 47和序列48)，上述 序列與^皮分離的序列具有100%的同源,1"生，該附圖以表格的形式 表示了染色體組研究學會(TIGR)給出的位點名稱，最初位點 名稱，Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中的命名，推定的識別，基因符號，TIGR 給出的細胞功能，坐標，DNA分子名稱，基因長度，蛋白長度， 分子量，pl, GC百分含量，酶學委員會命名#，屬以及種。
附圖10是一個Western印跡圖〗象，表示的是來自于大腸桿菌 裂解物的重組MT1694、 MT2462以及MT2990的過表達和純化， 其中所述的大腸桿菌裂解物來自于非誘導培養(yǎng)(l號泳道)；來自 于異丙基-13 - D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導的培養(yǎng)(2號泳 道)；以及純化的重組蛋白(3號泳道)，以及分子量標記物 (MWM )。
附圖11是一個Western印跡圖4象，表示的是對結(jié)核分枝桿菌 完整細胞粗裂解物中的天然MTB1694以及MT2462的識別(1 號泳道)；培養(yǎng)濾液(CF)蛋白(2號泳道)；純化的重組蛋白(3 號泳道)；以及分子量標記物(MWM),其中對抗原進行電泳分 析，并且將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，之后使用兔類抗MTB1694 抗血清或者抗MT2462抗血清對其進行4罙測。
附圖12A的柱形圖表示的是擴增性應答對MT1694以及 MT2462的識別，用每分鐘計數(shù)(CPM)來表示，該擴增性應答 來自于健康的純蛋白衍生物H吏用純蛋白衍生物對針對結(jié)核蛋白 的應答進行皮下測試)陰性(供體1)個體以及純蛋白衍生物陽 性(供體2-5)個體，上述個體經(jīng)過了重組抗原(5微克/毫升) 的刺激。
附圖12B的柱形圖表示的是外周血單個核細胞(PBMC)中 干擾素-Y的生成對MT1694以及MT2462的識別，所述的外周 血單個核細胞來自于健康的純蛋白衍生物陰性(供體1)個體以 及純蛋白衍生物陽性(供體2-5)個體，上述個體經(jīng)過了重組抗 原(5微克/毫升)的刺激。
具體實施例方式
以下是關(guān)于本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的描述。
本發(fā)明涉及用于結(jié)核(TB )疾病的疫苗組合物以及免疫檢測。 本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)當宿主被一種能夠引起結(jié)核的細菌感 染時，在主要組織相容性復合體(MHC) 1級巨噬細胞中會出現(xiàn) 某些結(jié)核抗原肽，這種細菌凈皮稱為結(jié)核分枝桿菌。主要組織相容 性復合體(MHC) 1級巨噬細胞是在CD8+T細胞免疫應答途徑 中起作用的細胞。構(gòu)成本發(fā)明的基礎(chǔ)的另外一個發(fā)現(xiàn)是在感染
了活性結(jié)核的人的尿液中識別出結(jié)核肽的存在。對存在于主要組 織相容性復合體1級細胞中的特異性抗原結(jié)核肽的識別，以及對 存在于^皮感染患者的尿液中的結(jié)核肽的識別，為生產(chǎn)有效的疫苗 和/或進行診斷試驗提供了多肽序列。
本發(fā)明的結(jié)核疫苗組合物可以包4舌多肽序列或者核酸序列， 并且，^壬選的，包括其他免疫增強分子。因此，本發(fā)明的一部分 涉及發(fā)現(xiàn)的特異性抗原結(jié)核多肽序列，這些序列如附圖1、附圖
2、以及附圖5-9中所示的序列2、序列4、序列6、序列8、序 列10、序列12、序列14、序列16、序列18、序列20、序列22、 序列24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列34、序列 36、序列38、序列40、序列42、序列44、序列46、序列48以 及上述序列的組合。序列2、序列6、序列10、序列14、序列18、 序列22以及序列26是通過^f吏用大劑量的結(jié)核分枝桿菌對小鼠進 行感染的方法而分離的。在小鼠被感染后的大約兩周，根據(jù)實施 例1中詳細描述的方法，將小鼠的脾臟摘除，并且分離出含有 CD8+T細胞抗原的主要組織相容性復合體1級分子。在主要組織 相容性復合體1級分子中發(fā)現(xiàn)的大量的肽被鑒定為是結(jié)核分枝桿 菌的來源。序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、 序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列 25以及序列27,這些編碼上述#:識別的多肽的核酸序列，在附 圖1A-附圖H中^皮表示出來。
序列30， MVIIELMRR，是在患有肺結(jié)核的患者的尿液中發(fā) 現(xiàn)的肽，該序列與結(jié)核分枝桿菌生物合成蛋白——序列32具有 100%的同源性，如附圖2所示。編碼上述蛋白的核酸序列—— 序列31也如圖所示。除此之外，附圖5-附圖9中所示的序列 34、序列38、序列42以及序列46也是在患有肺結(jié)核的患者的尿 液中發(fā)工見的，這些序列分別與序列36、序列40、序列44以及序
列48具有100%的同源性。用來在感染了活性結(jié)核的患者的尿液 中識別這些結(jié)核蛋白的方法在實施例2中有所描述。
因此，本發(fā)明涉及序列1-序列48,這些序列被鑒定為能夠 有效的引發(fā)針對結(jié)核的保護性免疫應答，并且能夠有效的被用于 -珍斷才企測當中，以識別患有活性結(jié)核的患者。
多肽及其功能
本發(fā)明涉及分離的多肽分子，所述的多肽分子包括存在于被 感染宿主的主要組織相容性復合體1級分子中的結(jié)核序列的抗原 性部分，也涉及從被感染患者的尿液中分離得到的結(jié)核序列。本 發(fā)明包4舌含有任意一種抗原性結(jié)核氨基酸序列(序列2、序列4、 序列6、序列8、序歹'J 10、序歹'J 12、序列14、序列16、序歹'J 18、 序列20、序列22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列
32、 序列34、序列36、序列38、序列40、序列42、序列44、 序列46、序列48、或者上述序列的組合)。參見附圖1、附圖2、 以及附圖5-附圖9。本發(fā)明還涉及由序列1、序列3、序列5、 序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、 序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列
33、 序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、 序列47所示的核酸序列或者由上述序列的組合所形成的核酸序 列編碼的多肽分子。
這里4吏用的"多肽"包含任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋 白(即，抗原)，其中所述的氨基酸殘基通過共價肽鍵相結(jié)合。 因此，包4舌結(jié)核分枝桿菌抗原的免疫原部分的多肽可以完全由所 述的免疫原部分組成，也可以含有其他序列。所述的其他序列可 以來自于自身的結(jié)核分枝桿菌抗原，也可以是異源的，并且這類 序列可以(但不必須)是免疫原性的。通常，這里所述的多肽在
本質(zhì)上是純化的。優(yōu)選的，所述的多肽至少大約80%是純化的， 更優(yōu)選至少大約90%是純化的，最優(yōu)選至少大約99%是純化的。
本發(fā)明所說的"分離的，，抗原性結(jié)核多肽指的是那些跟多肽 相同來源的其他蛋白及細胞材料進行分離了的多肽。分離的抗原 性結(jié)核多肽，這些由結(jié)核分枝桿菌的感染而形成的肽，包括本質(zhì) 上純的蛋白，化學合成得到的蛋白，生物合成和化學合成方法的 組合得到的蛋白，以及通過重組方法得到的蛋白。本發(fā)明所述的 蛋白可以使用實施例中描述的步驟進行分離，并且按照其物理性 質(zhì)被定義，并使用實驗室技術(shù)來完成蛋白的純化。這些技術(shù)包括， 例如，鹽析法，免疫沉淀法，柱層析，高效液相色譜法或者電泳 法。
本發(fā)明的組合物以及方法也包括上述多肽以及DNA分子的 變體。這里使用的多肽"變體"指的是與上述多肽的區(qū)別僅僅在 于發(fā)生了保守性替代和/或修飾而得到的多肽，這樣一來，多肽的 治療特性、抗原性特性和/或免疫原特性都被保留下來。特異性結(jié) 核分枝桿菌抗原的變體因此會刺激針對于上述抗原的細胞擴增 和/或Thl細J包中的干護C素-Y的上升。多肽變體優(yōu)選的表玉見出 與被指定的多肽具有至少大約70 %的同源性，更優(yōu)選具有至少大 約90%的同源性，最優(yōu)選具有至少大約95%的同源性。對于具 有免疫反應特性的多肽來說，變體也可以通過如下方式進行識 別對一種多肽的氨基酸序列進行修飾，并且對修飾后的多肽的 免疫反應性進行評價?？梢酝ㄟ^例如這里描述的代表性方法對這 類修飾后的多肽進行制備和檢測。
這里使用的"保守性替代"指的是一種氨基酸被另外一種性 質(zhì)相似的氨基酸所替代，這樣一來，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠預期， 多肽的二級結(jié)構(gòu)以及親水特性在本質(zhì)上不發(fā)生變化。通常，下列 氨基酸基團表現(xiàn)為保守性改變(1)丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸， 谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，絲氨酸，蘇氨酸；(2) 半胱氨酸，絲氨酸，酪氨酸，蘇氨酸；(3)纈氨酸，異亮氨酸， 亮氨酸，曱硫氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸；(4)賴氨酸，精氨酸， 組氨酸；以及(5)苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，組氨酸。
變體還含有、或者只含有其他修飾，包括氨基酸的缺失和添 加，這類缺失和添加對多肽的抗原性、二級結(jié)構(gòu)以及親水特性產(chǎn) 生最小的影響。例如，可以在多肽的N末端蛋白上共軛結(jié)^^個 信號序列(或者前導序列)，上述序列能夠與翻譯一同(co-translationally )或者在翻譯后(post — translationally )介導蛋白6々 轉(zhuǎn)移。也可以將上述多肽共扼結(jié)合到 一個連接體或者其他序列 上，4吏所述多肽易于^皮合成、純4匕或者識別(例如，聚組氨酸)， 或者加強該多肽與固體載體的結(jié)合。例如，可以將多肽共扼結(jié)合 于免疫球蛋白Fc片段上。
本發(fā)明也包括結(jié)核蛋白和多肽及其變體，或者包括那些具有 與這里描述的抗原性結(jié)核多肽的氨基酸序列相類似的氨基酸序 列的多肽。這樣的多肽在這里凈皮稱為抗原性結(jié)核類似物(例如， 同系物)，或者誘變物或衍生物。"類似的"或者"同源的"氨基 酸序列指的是與任意 一 種結(jié)核氨基酸序列具有足夠的同 一 性的 氨基酸序列，因而其具有任意一種天然結(jié)核多肽所具有的生物活 性(例如，引發(fā)針對結(jié)核細菌的保護性免疫應答的能力)。例如， 可以通過氨基酸序列的"沉默，，變化來生產(chǎn)類似的多肽，上述氨 基酸序列中的一個或者一個以上氨基酸殘基不同于任意一種結(jié) 核蛋白中的氨基酸殘基，但其仍然具有結(jié)核蛋白的功能或者生物 活性。這種差別的例子包括結(jié)核氨基酸序列殘基的添加、缺失或 者取代。本發(fā)明還包括類似的多肽，與本發(fā)明所述的任意一種結(jié) 核蛋白相比，上述多肽表現(xiàn)出更強或者更弱的生物活性。這類多 肽可以通過在本發(fā)明所述的分離的結(jié)核分子上進行一個或者一
個以上氨基酸殘基或者核酸殘基的i秀變(例如，取代，缺失或者 添加)來獲得。可以4吏用本發(fā)明描述的方法以及本領(lǐng)域已知的方
法來完成這些i秀變。4爭別的，本發(fā)明涉及同源性多肽分子，所述 分子與序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列12、序 歹'J 14、序歹'J 16、序歹ij 18、序列20、序列22、序列24、序列26、 序列28、序列30、序列32、序列34、序列36、序列38、序列 40、序歹'J42、序歹'J44、序歹'J46、序歹'J 48、或者上述序歹'J的纟且合 所形成的序列具有至少大約70% (例如，75%, 80%, 85%， 90 %或者95%)的序列同一性或者序列相似性。"同一性"百分數(shù) 指的是在兩個核苷酸序列或者氨基酸序列之間存在的相同的核 苷酸或者氨基酸的數(shù)量。這里使用的"相似性百分數(shù)"指的是在 兩個氨基酸序列之間存在的相似氨基酸或者保守氨基酸的數(shù)量。
本發(fā)明所述的多肽包4舌那些有助于刺激針對結(jié)核的免疫原 性特異性免疫應答或者保護性免疫應答的全長序列、部分序列、 功能性片段以及同系物。這里使用的"免疫原性"指的是能夠引 發(fā)例如人類的患者體內(nèi)、或者生物樣品中的免疫應答(例如，細 ^ 的)的能力。特別的，具有免疫原性的抗原(以及抗原的免疫 原部分)能夠刺激包4舌一種或者一種以上細胞(例如，t細月包， NK細胞，B細胞以及巨噬細胞)的生物樣品中的細胞擴增，白 細月包介素-12的生成和/或干護C素-y的生成。這樣的細月包來自 于結(jié)核分枝桿菌免疫型個體。如上所述的抗原的免疫原部分可以 《吏用這里描述的^t術(shù)進行制備和鑒定。其他技術(shù)，例如在Paul 于1993年在Fundamental Immunology, 3rd ed., Raven Press, pp.243-247 (《免疫學基礎(chǔ)》，第3版，Raven出版社，243-247頁) 中的文章以及該文章引用的參考文獻中4既述的#支術(shù)，也可以祐J吏 用。這類4支術(shù)包4舌對天然抗原的多肽部分的免疫原性進4于篩選。 在這類檢測中，多肽的免疫原部分產(chǎn)生的免疫應答(例如，擴增， 干才尤素-y的生成和/或白細力包介素-12的生成)與全長4元原產(chǎn) 生的免疫應答在本質(zhì)上是相似的。換句話說，在這里描述的模型 擴增4企測中，抗原的免疫原部分產(chǎn)生的擴增占全長抗原產(chǎn)生的擴
增的至少大約20%,優(yōu)選大約100%。在才莫型4僉測中，免疫原部 分也可以、或者可以刺激干護G素-Y和/或者白細月包介素-12的 生成，其生成量占全長抗原刺激產(chǎn)生的生成量的至少大約20 % , 優(yōu)選大約100%。這里使用的"結(jié)核"或者"結(jié)核疾病"指的是 由結(jié)核分枝桿菌的感染而引起的疾病。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定同源性多肽?？梢?使用例如BLAST網(wǎng)絡服務器在NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中 心)針對GeneBank、 EMBL以及SwissProt tt據(jù)庫進4亍初始的同 源性才全索。參見Altschuler, S.F.等人(于1990年)在J.Mol.Biol. (《分子生物學雜志》)215: 403中發(fā)表的文章；Altschuler， S.F. (于1998年)在Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)25: 3389- 3402 中發(fā)表的文章。可以4吏用Genetics Computing Group ( GCG, 8.0 片反本)軟件的MOTIFS子程序和FindPattems子程序來完成核苦 酸序列的計算才幾分4斤。根據(jù)Higgins和Sharp描述的方法來完成 蛋白和/或核苦酸的比對(參見Higgins, D.G以及Sharp, P.M. 于1998年在Gene《基因》73: 237 — 244中發(fā)表的文章，例:i口， 使用缺省參數(shù))。
除此之外，本發(fā)明所述的各種分離的多肽是具有生物活性或 者功能性的，并且也在細菌中起到不同的作用。例如，如序列6 所示的分離的多肽是一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)運-爭膜蛋白ABC轉(zhuǎn)運蛋白。 同樣的，序列22所示的是一種陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運膜本體蛋白， 而序列26所示的是一種陽離子轉(zhuǎn)運P型腺苦三磷酸斷ATPase )。 序列32所示的是一種亞鉬噪呤生物合成蛋白。本發(fā)明包4舌上述 分離的氨基酸序列的片段，這些片段仍然具有所述序列的功能或 者生物活性。例如，可以〗吏用熟知的實-驗室方法來i殳計和表達包
括抗原性結(jié)核蛋白的缺失型變體的多肽片段?？梢园凑毡景l(fā)明的 描述對這些多肽片#炎、同源性多肽或者相似性多肽進行評價。
本發(fā)明也包括上述抗原性結(jié)核多肽的生物活性衍生物或者 類4以物，在這里^皮稱為才莫擬肽?？梢証吏用本領(lǐng)域^支術(shù)人員已知的
才支術(shù)i殳計并且制備才莫擬肽(例如參見美國專利Nos.4612132; 5643873以及5654276)。這些才莫擬肽可以以例如特異性結(jié)核氨基 酸序列為基礎(chǔ)，并且保留了相應氨基酸序列上的相應位置。這些
且與相應的抗原性結(jié)核氨基酸序列相比李支而言，這些才莫擬肽還具 有一種或者一種以上下述特性的"生物進步性，，溶解性，穩(wěn)定 性，以及水解和蛋白質(zhì)水解靈敏性。
制備模擬肽的方法包括修飾N末端氨基，C末端羧基，和/ 或4奪肽中的一個或者一個以上酰胺鍵變?yōu)榉酋０?囊?？梢栽谝环N 模擬肽分子中進行兩種或者多種這樣的修飾。對肽進行修飾以獲 得模擬肽的方法在美國專利Nos.5643873以及5654276中有所描 述。本發(fā)明包含的其他形式的抗原性結(jié)核多肽包括那些"功能性 等價物"。這里使用的術(shù)語"功能性等價物"指的是模擬結(jié)核多 肽的生物活性和/或結(jié)核多肽的功能性結(jié)構(gòu)域的任何核酸序列及 其編碼的氨基酸。
結(jié)核核酸序列，質(zhì)粒，載體以及宿主細胞
本發(fā)明在一種實施方式中包括分離的核酸分子，所述的核酸 分子具有如序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、 序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列 25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、 序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的序列、或 者上述序列的組合所形成的序列。參見附圖1、附圖2、附圖5
-附圖9。本發(fā)明包括那些在附圖1、附圖2、附圖5-附圖9中 戶斤示的序列，以及這些序列的編石馬區(qū)&戈。
這里使用的術(shù)語"DNA分子，，或者"核酸分子"包括正義鏈 和反義鏈，cDNA，染色體組DNA，重組DNA, RNA，以及全 部或者部分合成的核酸分子。核苷酸"變體，，是一種區(qū)別于上述 核苷酸序列的序列，這種區(qū)別在于發(fā)生了 一個或者一個以上核苷 酸的缺失、取代或者添加。可以使用標準的誘變技術(shù)很容易的導 入這些修飾，例如使用寡核苷酸指導的定點誘變4支術(shù)，該項纟支術(shù) 在例如Adelman等人(于1983年在DNA2: 183中)發(fā)表的文章 中有所教導。核苷酸變體可以是自然形成的等位基因變體，也可 以是非自然形成的變體。變體核苷酸序列優(yōu)選的與正常序列具有 至少大約70%的同源性，更優(yōu)選的具有至少大約80%的同源性， 最優(yōu)選的具有至少大約90%的同源性。在嚴格條件下，這類變體 核苷酸序列通常會與正常的核苷酸序列發(fā)生雜交。在一種實施方 式中，"嚴格條件，，指的是在6倍的SSC和0.2%的SDS (十二 烷基磺酸鈉)溶液中預清洗；在65。C時，在6倍的SSC和0.2。/。 的SDS (十二烷基磺酸鈉)中雜交過夜；在65。C時，使用1倍 的SSC和0.1 %的SDS (十二烷基磺酸鈉)洗滌兩次，每次洗滌 30分鐘，之后在65。C時，使用0.2倍的SSC和0,1 %的SDS (十 二烷基磺酸鈉)洗滌兩次，每次洗滌30分鐘。
本發(fā)明也包4舌那些編碼結(jié)核多肽的分離的核酸序列，特別 的，包4舌那些編石馬具有序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、 序列12、序列14、序列16、序列18、序列20、序列22、序列 24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列34、序列36、 序列38、序列40、序列42、序列44、序列46、序列48戶斤示的 氨基酸序列、或者具有上述序列的組合所形成的氨基酸序列的多 肽分子的分離的核酸序列。這里也進一步的描述了上述結(jié)4亥核酸
序列編碼的多肽，所述的多肽能夠刺激針對結(jié)核分枝桿菌的保護 性免疫應答，和/或在上述職能中發(fā)揮作用。
核苷酸序列通常(例如，在天然形式中)具有側(cè)翼基因或者 側(cè)翼核苷酸序列(例如，在染色體中序列中)，但這里4吏用的"分 離的"基因或者核苷酸序列不構(gòu)成核苷酸序列的側(cè)翼基因或者側(cè)
翼核苷酸序列，和/或已經(jīng)從其他轉(zhuǎn)錄序列(例如，在cDNA文 庫或者RNA文庫中)中^皮完全純化或者部分純化出來。因此， 分離的基因或者核苷酸序列可以包4舌通過4匕學方式或者重組方 式進4亍合成的基因或者核苷酸序列。存在于載體中的核酸構(gòu)建體 也包4舌在本發(fā)明所述的"分離的"的定義之內(nèi)。分離的核苷酸序 列還包括重組核酸分子和異源宿主細胞，以及存在于溶液中的部 分或者全部的或者純化的核酸分子。本發(fā)明所述的體內(nèi)RNA轉(zhuǎn) 錄體以及體外RNA轉(zhuǎn)錄體也包含在"分離的，，核苷酸序列之內(nèi)。 這類分離的核苷酸序列能夠作為4笨針#1有效的用于#1編碼的4元 原性結(jié)核多肽的生產(chǎn)當中，用來分離同源序列(例如，從其他種 類的哺乳動物或者其他生物體中)，用于基因定位(例如，通過 原位雜交)，或者用來探測細胞或者組織中相關(guān)基因的存在(例 ^口，通過Southern印跡分才斤)或者表達(例j口，通過Northern 印跡分析)。
本發(fā)明所述的抗原性結(jié)核核酸序列包4舌同源的核酸序列。 "類似的"或者"同源的"核酸序列指的是與結(jié)核核酸序列中的 任意一種序列具有充分同一性的核酸序列，這樣一來，當該序列 -故編碼至多肽中時，它們具有上述抗原性結(jié)核多肽中的任意一種 所具有的生物活性。例如，可以對序列進行"沉默，，改變來制備 類似的核酸分子，改變后的序列與上述結(jié)核多肽中的4壬意一種具 有一個或者一個以上不相同的核苷酸，盡管如此，當將改變后的 序列編碼至多肽中時，其仍然具有功能性或者生物活性。這類改
變的例子包括添加、缺失或者取代。本發(fā)明還包括編碼類似多肽 的核酸序列，所述的多肽與本發(fā)明中的結(jié)核蛋白相比，表現(xiàn)出更 強或者更弱的生物活性。特別的，本發(fā)明涉及一類核酸分子，所
述的核酸分子與序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列 11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、 序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列 37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47或者上述序 列的組合所形成的序列具有至少大約70% (例如，75%, 80%， 85%, 90%或者95% )的序列同一'J"生。
本發(fā)明進一步描述的核酸分子包括全長序列、部分序列、功 能性片段以及同系物， 一旦被編碼至多肽中時，它們將引發(fā)特異 性免疫原性結(jié)核應答，或者具有多肽的功能。可以使用本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的方法確定同源性核酸序列，也可以-使用本發(fā)明描述 的方法，包4舌那些用于確定同源性多肽序列的方法。然后，可以 4吏用例如Edman化學法之類的^支術(shù)對免疫抗原進行測序。參見
80: 116- 132中發(fā)表的文章。
本發(fā)明還包括與編碼抗原性結(jié)核多肽的DNA序列在本質(zhì)上 互補的核酸序列、DNA或者RNA,本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，這些 核酸序列、DNA或者RNA能夠在嚴格條件下與編碼抗原性結(jié)核 多肽的DNA序列進行特異性雜交。這里定義的"本質(zhì)上互補" 指的是該核酸不必要表現(xiàn)出與結(jié)核序列準確一致的序列，但必須 與結(jié)核核酸序列充分的相似，使其能夠在高度嚴格的條件下與結(jié) 核核酸序列進行雜交。例如，非互補堿基可以交替分布于核香酸 序列中，或者核苷酸序列可以長于或者短于結(jié)核核酸序列，保證 上述序列與結(jié)核序列具有足夠數(shù)量的互4卜堿基，以允許兩者進行 雜交。嚴格條件在例如Ausubel, F.M.等人(于1994年，Current
Protocol)所著的文章Current Protocols in Molecular Biology (《分 子生物學當代規(guī)程》)，以及Brown等人(于1993年)在Nature (《自然》)366: 575發(fā)表的文章中有所描述；該條件也可以在某 些試-驗中被進一步定義。
本發(fā)明也包括核酸分子，染色體組DNA, cDNA, RNA或者 它們的組合物，其中上述物質(zhì)與本發(fā)明所述的DNA序列在本質(zhì) 上互補，并且能夠在充分嚴格的條件下(例如，高度嚴格)與抗 原性結(jié)核核酸序列進4亍特異性雜交，來識別具有足夠的相同核酸 的DNA序列。
本發(fā)明也包括通過合成方法或者重組方法制備的結(jié)核分枝 桿菌抗原的部分或者其他變體。具有少于大約100個氨基酸的合 成多肽的制備方法，以及通常具有少于大約50個氨基酸的合成 多肽的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。例如，可以使用 任意 一 種商業(yè)可獲得的固相技術(shù)來合成這種多肽，例如使用 Merrifield (梅里菲爾德)固相合成方法，其中氨基酸神皮按順序的 添加到增長的氨基酸鏈中。參見Merrifield于1963年在 J.Am.Chem.Soc.85: 2149 - 2146中發(fā)表的文章。自動合成多肽的 裝置可以從才是供者處購買獲得，例如從Applied BioSystems， Inc., Foster City, Calif.(應用生物系統(tǒng)公司，福斯特市，加利福尼亞) 處購買，并且可以根據(jù)使用說明書進行操作。可以使用標準的誘 變技術(shù)來制備天然抗原的變體，例如通過寡核苷酸指導的定點"i秀 變技術(shù)。還可以使用標準技術(shù)去除DNA序列的片段，來制備截 4豆型多肽。
在另外一種實施方式中，本發(fā)明包括在高度嚴格或者中度嚴 格條件下雜交于序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列 11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、 序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列
37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的結(jié)核 序列上的、或者上述序列的組合所形成的結(jié)核序列上的核酸分子 (例如，探針或者引物)。在一個方面，本發(fā)明包括那些具有至少 大約20個連續(xù)核普酸長度或者更長(例如，50, 100, 200, 300, 400， 500, 600， 700， 800， 900， 1000， 1100, 1200， 1300， 1400， 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700， 2800， 2900, 3000, 3100, 3200, 3300， 3400, 3500, 3600， 3700, 3800， 3900,或者4000)的分子，或者包括 那些雜交于至少大約20個連續(xù)核苷酸長度或者更長(例如，50， 100, 200， 300， 400， 500， 600， 700， 800, 900， 1000， 1100， 1200, 1300, 1400， 1500， 1600， 1700， 1800, 1900， 2000， 2100， 2200， 2300, 2400， 2500， 2600, 2700， 2800， 2900， 3000， 3100， 3200， 3300, 3400, 3500, 3600， 3700， 3800, 3900，或者4000) 的分子。這類分子能夠在高度嚴格的條件下雜交于一種結(jié)核核酸 序列之上。本發(fā)明包"fe這類分子，以及編碼具有這里所述的功能 或者生物活性的多肽的分子。
通常情況下，核酸探針包括一個核酸序列(序列1、序列3、 序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、 序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列 31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、 序列45、序列47,或者上述序列的組合序列)，并且具有足夠的 長度和互補性，能夠特異性的雜交于編碼結(jié)核抗原多肽的核酸序 列之上。例如，核酸探針可以具有結(jié)核核酸序列長度的至少大約 5%, 10%, 20%, 30%， 40%, 50%, 60%， 70%, 80%或者 90 % 。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以4艮容易的確定所需的足夠長度和互補 性。本發(fā)明也描述了適當?shù)碾s交條件(例如，高度嚴格的條件)。 除此之外，本發(fā)明包括這里所述的多肽的片段或者編碼多肽的核 酸序列，其中所述的多肽具有這里所述的結(jié)核多肽的生物活性。
這類片段能夠作為探針或者作為試驗工具被有效應用于本 發(fā)明描述的檢測當中，如果是核酸片段的話，可以作為引物被應 用。 一種優(yōu)選的實施方式包括引物和探針，它們能夠特異性的雜 交于編碼任意一種結(jié)核多肽的核酸構(gòu)建體之上。例如，編碼本發(fā) 明所述的任意一種結(jié)構(gòu)域的核酸片段也包含在本發(fā)明的范圍之 內(nèi)。
雜交的嚴格條件指的是能夠使一個核酸序列與另一個核酸 序列進4亍雜交的溫度和緩沖組合物，這個條件取決于進行雜交的 兩個序列之間的同一性程度。因此，"高度嚴格的條件，，指的是 只有非常相似的核酸序列之間才能進行雜交的條件。在中度嚴格 的條件下進行雜交的序列可以具有較小的相似性。如果在低度嚴 格的條件下進行雜交，進行雜交的兩個序列之間可以具有更小的 相似性。通過改變雜交條件的嚴格程度，從沒有雜交的水平到首 先觀察到雜交的水平，可以確定一個給定序列跟與其最相似的序 列發(fā)生雜交所需的條件。確定一個特定的雜交反應的嚴格程度的 精確條件不僅僅包括離子強度、溫度、以及去穩(wěn)定劑例如甲酰胺
的濃度，還包括i者如核酸序列長度、堿基組合物、兩個序列間配 錯對的堿基對百分數(shù)、以及其他非同一性序列中出現(xiàn)該序列的子 集(例如，短的重復延伸)的頻率之類的因素。設定雜交條件， 使用清洗這一步驟來確定兩個發(fā)生雜交的序列之間具有的最小 水平的相似性。通常情況下，從《又僅能夠發(fā)生同源性雜交的最^f氐 溫度開始，對于^f壬意選定濃度的SSC來i兌，兩個序列之間的1% 的錯配比例會導致熔化溫度(Tm)降低1°C。通常來講，SSC濃 度增加一倍，將導致熔化溫度(Tm)升高大約17°C。利用這些 指標，可以根據(jù)錯配的水平憑借經(jīng)驗來確定清洗的溫度。在 Current Portocols in Moecular Biology (《分子生物學當代規(guī)孝呈》) (Ausubel, F.M.等人編輯，John Wiley&Sons, Inc., 1995年，具
有補充的更新內(nèi)容)第2.10.1至2.10.16頁以及第6.3.1至6.3.6
頁中解釋了雜交條件以及清洗條件。
可以發(fā)生雜交的高度嚴格的條件包括(1 ) 1倍的SSC (10 倍的SSC = 3M氯化鈉，0.3M 二水合檸檬酸鈉(88克/升)，用1M 鹽酸調(diào)PH至7.0), 1%SDS (十二烷基橫酸鈉)，0.1-2毫克/毫 升變性的小牛胸腺DNA， 65°C; (2)1倍的SSC， 50%的甲酰胺， 1%SDS, 0.1-2毫克/毫升變性的小牛胸腺DNA, 42°C; (3)1 %牛血清白蛋白(片IS:V)， lmM乙二胺四乙酸二鈉，0.5mM石粦 酸氫鈉(pH7.2 ) ( 1M磷酸氫鈉=每升含有134克七水合磷酸氬 二鈉，4毫升85%的石粦酸)，7%SDS, 0.1 -2毫克/毫升變性的小 牛胸腺DNA， 65°C; ( 4 ) 500/0甲酰胺，5倍的SSC, 0.02M Tris -鹽酸(pH7.6 )， 1倍的Denhardt，s溶液(100倍=10克Ficoll 400, 10克聚乙烯吡p各烷酮，IO克牛血清白蛋白(片革殳V)，加水至500毫升胸腺DNA, 42°C; (5)5倍的SSC, 5倍的Denhardt，s溶液，1 %SDS， 100微克/毫升變性的小牛胸腺DNA, 65°C;或者(6) 5 倍的SSC, 5倍的Denhardt，s溶液，50%曱酰胺，1%SDS， 100 微克/亳升變性的小牛胸腺DNA, 42°C,并且使用(1) 0.3-0.1 倍的SSC, 0.1%SDS在65。C時，或者(2) ImM乙二胺四乙酸 二鈉，40mM磷酸氬鈉(pH7.2)， 1 % SDS在65°C時進行高度嚴 格條件下的清洗。上述條件可以被用來進行具有50個堿基對或 者更長的DNA-DNA雜交物的雜交。當雜交物的長度被認為是少 于18個堿基對時，雜交溫度和清洗溫度應該比該雜交物計算得 到的熔化溫度(Tm)低5-10°C，其中熔化溫度(Tm) °C = (2 xA堿基和T堿基的數(shù)量)+ (4xG堿基和C堿基的數(shù)量)。如 果雜交物的長度被認為是在大約18到大約49個堿基對之間時， 熔化溫度(丁111)°。= ( 81.5。C + 16.6 (log10M) +0.41 (%G+C) -0.61 (%曱酰胺)-500/L),其中"M，，代表單價陽離子(例 如，鈉離子)的體積摩爾濃度，而"L"代表雜交物的堿基對長 度。
可以發(fā)生雜交的中度嚴格的條件包括(1)4倍的SSC (10 倍的SSC = 3M氯化鈉，0.3M 二7K合種檬酸鈉(88克/升)，用1M 鹽酸調(diào)PH至7.0)， 1%SDS (十二烷基磺酸鈉)，0.1-2毫克/亳 升變性的小牛胸腺DNA， 65°C; (2)4倍的SSC, 50%的曱酰胺， 1%SDS, 0.1-2亳克/毫升變'I"生的小牛胸腺DNA, 42°C; (3) 1 %牛血清白蛋白(片^:V)， lmM乙二胺四乙酸二鈉，0.5mM4, 酸氫鈉(pH7.2) (1M蜂酸氫鈉-每升含有134克七水合磷酸氫 二鈉，4毫升85%的石粦酸)，7%SDS, 0.1 -2毫克/毫升變性的小 牛胸腺DNA, 65°C; (4)50%甲酰胺，5倍的SSC, 0.02M Tris -鹽酸(pH7.6 ), 1倍的Denhardt，s溶液(100倍=10克Ficoll 400, IO克聚乙烯吡咯烷酮，IO克牛血清白蛋白(片段V),加水至500 毫升)，10%硫酸葡聚糖，1%SDS， 0.1-2毫克/毫升變性的小牛 胸腺DNA， 42°C; ( 5 ) 5倍的SSC, 5倍的Denhardt，s溶'液，1 %SDS， 100微克/毫升變性的小牛胸腺DNA， 65°C;或者(6) 5 倍的SSC， 5倍的Denhardt，s溶液，50%甲酰胺，1%SDS, 100 孩t克/毫升變性的小牛胸腺DNA， 42°C,并且使用1倍的SSC， 0.1%SDS在65。C時進行中度嚴格條件下的清洗。上述條件可以 -波用來進行具有50個堿基對或者更長的DNA-DNA雜交物的雜 交。當雜交物的長度被認為是少于18個堿基對時，雜交溫度和 清洗溫度應該比該雜交物計算得到的熔化溫度(Tm)低5-10 。C，其中熔化溫度(Tm) 。C = (2xA堿基和T堿基的數(shù)量)+ (4xG堿基和C堿基的數(shù)量)。如果雜交物的長度被認為是在大 約18到大約49個堿基對之間時，熔化溫度(Tm) 。C = (81.5 °C + 16.6(log10M) +0.4H %G + C) _0.61( %甲酰胺)-500/L), 其中"M"代表單價陽離子(例如，鈉離子)的體積摩爾濃度， 而"L"代表雜交物的堿基對長度。
可以發(fā)生雜交的〗氐度嚴格的條件包^舌(1)4倍的SSC ( 10 倍的SSC = 3M氯化鈉，0.3M 二水合檸檬酸鈉(88克/升)，用1M 鹽酸調(diào)PH至7.0), 1 % SDS (十二烷基磺酸鈉)，0.1-2毫克/毫 升變性的小牛胸腺DNA， 50°C; (2)6倍的SSC， 50%的曱酰胺， 1%SDS， 0.1-2亳克/毫升變性的小牛胸腺DNA， 40°C; (3)1 %牛血清白蛋白(片段V)， lmM乙二胺四乙酸二鈉，0.5mM磷 酸氫鈉(pH7.2 ) ( 1M磷酸氫鈉=每升含有134克七水合磷酸氫 二鈉，4毫升85%的磷酸)，7%SDS, 0.1-2毫克/毫升變性的小 牛胸腺DNA， 50°C; (4)50%曱酰胺，5倍的SSC， 0.02M Tris -鹽酸(pH7.6 ), 1倍的Denhardt，s溶液(100倍=10克Ficoll 400, IO克聚乙烯吡咯烷酮，IO克牛血清白蛋白(片段V),加水至500 毫升)，10%石危酸葡聚并唐，1%SDS， 0.1-2亳克/毫升變性的小牛 胸腺DNA， 40°C; (5)5倍的SSC， 5倍的Denhardt，s溶液，1 %SDS, 100微克/毫升變性的小牛胸腺DNA, 50°C;或者(6 ) 5 倍的SSC, 5倍的Denhardt，s溶液，50%曱酰胺，1%SDS, 100 -徵克/毫升變性的小牛胸腺0忖八，401:，并且使用(1 )2倍的SSC， 0.1。/。SDS在50。C時，或者(2) 0.5%牛血清白蛋白(片^殳V)， lmM乙二胺四乙酸二鈉，40mM磷酸氫鈉(pH7.2 ), 5 % SDS進 4亍低度嚴格條件下的清洗。上述條件可以被用來進行具有50個 堿基對或者更長的DNA-DNA雜交物的雜交。當雜交物的長度凈皮 i人為是少于18個堿基對時，雜交溫度和清洗溫度應該比i亥雜交 物計算得到的熔化溫度(Tm)低5-l(TC,其中熔化溫度(Tm) °C = (2x A堿基和T堿基的數(shù)量)+ (4xG堿基和C堿基的數(shù) 量)。如果雜交物的長度被認為是在大約18到大約49個堿基對 之間時，熔4匕溫度(Tm) °C = ( 81.5°C + 16.6 (log10M) +0.41 (%G + C) -0.61 (%甲酰胺)-500/L)，其中"M，，代表單價 陽離子(例如，鈉離子)的體積摩爾濃度，而"L"代表雜交物 的堿基對長度。 本發(fā)明所述的結(jié)核核酸序列或者該序列的片^更也可以用來 分離其他的同系物。例如，可以使用標記過的結(jié)核核酸序列對來
自于適當生物體的cDNA文庫或者染色體組DNA文庫進行篩選， 以識別同源性基因，例如在Ausubel等人編輯的Current Protocols in Molecular Biology (《分子生物學當代j見程》)，John Wiley&Sons， New York (紐約)(于1997年)中有所描述。
可以Y吏用編-馬抗原的DNA序列重組制備免疫抗原，所述 DNA序列可以^皮插入表達載體中并且在適當?shù)乃拗骷毎羞M行 表達。例如，可以利用患有結(jié)核分枝桿菌感染的患者的血清在適 當?shù)慕Y(jié)核分枝桿菌染色體組DNA或者cDNA表達文庫中進行篩 選，以識別編碼結(jié)核分枝桿菌抗原的DNA序列?？梢岳帽绢I(lǐng) 域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來完成上述篩選，例如在Sambrook等人 于1989年在Cold Spring Harbor Laboratories ， N.Y.(紐約冷7良港 實驗室)發(fā)表的Molecular Cloning: A Laboratory Mannual (《分 子克隆實驗室手冊》)中描述的方法?？梢栽O計并且合成用于 上述篩選方法中的簡并寡核苦酸序列，利用該序列完成上述篩 選。也可以利用聚合酶鏈式反應(PCR)，使用上述寡核苷酸， 通過本領(lǐng)域熟知的方法從cDNA文庫或者染色體組文庫中分離 核酸探4十。然后，可以4吏用分離的探針完成對文庫的篩選。該方 法可以^壬選的包4舌標i己過的結(jié)核抗原探針。
或者，可以使用外周血單個核細胞(PBMCs)或者T細i包或 者來自于一個或者一個以上結(jié)核分枝桿菌免疫型個體的克隆物 直才妄對來自于結(jié)核分4支桿菌的染色體組文庫或者cDNA文庫進 行篩選。通常情況下，用來進行上述篩選的外周血單個核細胞 (PBMCs)和/或T細胞可以采用后面描述的方法進行制備。通常 可以對表達重組蛋白庫i秀導T細萬包內(nèi)擴增和/或干4尤素-y生成
的能力進4亍檢測，來實現(xiàn)對文庫的直接篩選，其中所述的T細月包 來自于結(jié)核分枝桿菌免疫型個體。
本發(fā)明也提供了含有一種或者一種以上結(jié)核核酸分子的載 體、質(zhì)粒或者病毒(例如，具有序列1、序列3、序列5、序列7、 序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、 序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列 35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所 示的序列，或者上述序列的組合序列)。用在真核細萬包以及原才亥 細胞中的適當?shù)脑泽w是本領(lǐng)域已知的，并且能夠商業(yè)購買得到， 或者由4支術(shù)人員^艮容易的制備得到。其他的載體也可以在例如 Ausubel， RM.等人(于1994年，Current Protocol)所著的Current Protocols in Molecular Biology (《分子生物學當K》見禾呈》)，以及 Sambrook等人(于1989年)所著的"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(《分子克隆實驗室手冊》)第二版中找到。
可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的各種4支術(shù)通過編石馬多 肽的DNA序列來容易的制備含有部分天然抗原和/或天然抗原變 體的重組多肽。例如，可以使用購買獲得的過濾器首先對適當?shù)?宿主/載體系統(tǒng)的上清液進行濃縮，其中所述宿主/載體系統(tǒng)將重 組蛋白分泌到培養(yǎng)介質(zhì)中。濃縮之后，可以將濃縮物置于適當?shù)?純化基質(zhì)例如親和性基質(zhì)或者離子交換樹脂中。最后，進行一種 或者一種以上反相高效液相色^普(HPLC)步驟，進一步純化重 組蛋白。
本領(lǐng)域普通4支術(shù)人員已知的各種表達載體中的任意一種都 可以用來表達本發(fā)明所述的重組多肽。表達可以在任4可適當?shù)乃?主細胞中進4亍，所述的宿主細胞已經(jīng)被含有編碼重組多肽的DNA 分子的表達載體進行了轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染。適當?shù)乃拗骷毎黕會原核 細胞，酵母以及更高級的真核細胞。優(yōu)選的，使用的宿主細胞是
大腸桿菌，酵母，或者哺乳細胞系例如cos (非洲青猴腎細胞)
或者CHO (中國倉鼠卵巢細胞)。通過這種方式表達的DNA序 列能夠編碼天然形成的抗原，天然形成的抗原的部分，或者它們 的變體。
含有克隆的結(jié)核受體或者受體片段的質(zhì)粒、載體或者病毒的 用途包括下列中的一種或者一種以上(l)制備雜交探針，用以 在組織中^果測和測量結(jié)核的水平，或者分離結(jié)核同系物；(2)在 體內(nèi)或者體外制備結(jié)核mRNA或者結(jié)核蛋白；以及(3)制備轉(zhuǎn) 基因非人類動物宿主細萬包或者重組宿主細月包。
在一種實施方式中，本發(fā)明包括經(jīng)過上述質(zhì)粒、載體或者病 毒轉(zhuǎn)4匕的宿主細胞。核酸分子可以^皮插入到一個構(gòu)建體中，所述 構(gòu)建體可以任選的利用已知的方法;陂復制和/或整合到重組宿主 細胞中。所述的宿主細胞可以是真核細胞或者原核細胞，包4舌例 如酵母(例如畢赤酵母pastorius或者釀酒酵母)，細菌(例如大 腸桿菌，結(jié)核分枝桿菌，或者枯草芽孢桿菌)，動物細胞或者組 織，昆蟲Sf9細胞(例如被桿狀病毒感染的SF9細胞)或者哺乳 動物細胞(體細胞或者胚細胞，人胚腎(HEK)細胞，中國倉鼠 卵巢細胞，海拉細胞，人類293細胞以及猴子COS-7細胞)。適 用于本發(fā)明的宿主細胞還包括哺乳動物細胞，細菌細胞，酵母細 胞，昆蟲細胞，以及才直物細胞。
可以通過已知的方法將核酸分子導入或者插入到宿主細萬包 中。適當?shù)霓D(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)化細胞的方法的例子包括磷酸鉀沉淀，電 泳，微注射，感染，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，以及直接攝取法。這里使用的 "轉(zhuǎn)化，，或者"轉(zhuǎn)染"指的是通過導入其他的核酸來獲得新的遺 傳特性或者改變的遺傳特性，其〗也的核酸例如DNA。宿主細胞^ 遺傳信息的"表達"是一種技術(shù)術(shù)語，指的是指導DNA的轉(zhuǎn)錄 以生成RNA，所述RNA再被翻譯成多肽。制備這類重組宿主細
胞并且導入核酸的方法在例如Sambrook等人(于1989年)所著 的"Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(《分子克隆實 驗室手冊》)第二版，以及Ausubel等人(于1992年)所著的 "Current Protocols in Molecular Biology"(《分子生物學當K關(guān)見 程》)中有更加詳細的描述。
之后，將宿主細胞保持在合適的條件下，使其表達并且再生 本發(fā)明所述的抗原性結(jié)核多肽。通常，將細胞保持在合適的緩沖 物和/或生長培養(yǎng)基中，或者保持在適合細胞生長以及基因產(chǎn)物表 達的營養(yǎng)源中。所述的生長培養(yǎng)基對于本發(fā)明而言不是至關(guān)重要 的，通常是本領(lǐng)域已知的，包括碳源，氮源以及硫源。培養(yǎng)基的 例子包括Luria肉湯培養(yǎng)基，Superbroth (超級肉湯)培養(yǎng)基，使 用Dulbecco，s <奮飾的Eagles培養(yǎng)基(DMEM )， RPMI國1640培養(yǎng) 基，M199培養(yǎng)基以及Grace，s昆蟲培養(yǎng)基。所述的生長培養(yǎng)基可 以含有緩沖成分，對緩沖成分的選擇對于本發(fā)明而言不是至關(guān)重 要的?？梢詫彌_介質(zhì)的pH值進行選擇，通常是宿主細胞耐受 的，或者是適合宿主細胞生長的最佳pH值。
將宿主細胞在適當?shù)臏囟纫约按髿庵??；蛘撸绻拗骷氃掳?是好氧的，將該宿主細胞保持在大氣環(huán)境下或者其他適合生長的 環(huán)境下。對溫度的選擇應當是宿主細胞能夠耐受的溫度，并且可 以是例如在大約13'C到40。C之間。
4元體及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包4舌在樣品中檢測本發(fā)明所述的抗原性結(jié)核多肽是 否存在的方法。合適的檢測包括免疫學方法，例如放射性免疫檢 測，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA),化學發(fā)光檢測，以及'tfe速免 疫色譜測定。任何現(xiàn)在已知的方法或者將來發(fā)展出的方法都可以 用來測定抗原性結(jié)4亥多肽。 可以4吏用與序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列 12、序列14、序列16、序列18、序列20、序列22、序列24、 序列26、序列28、序列30、序列32、序列34、序列36、序列 38、序歹'J 40、序歹'J 42、序歹'J 44、序歹'J 46、序歹'j 48、或者上述序 列的組合序列、或者上述序列的部分序列所示的抗原性結(jié)核多肽 中的4壬意一種相關(guān)的抗體。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述的抗 體與抗原性結(jié)核多肽或其部分進行特異性結(jié)合。所述抗體可以是 多克隆的或者單克隆的，因而術(shù)語抗體意在包括多克隆抗體和單 克隆抗體，以及它們的功能性片,殳。術(shù)語多克隆和單克隆指的是 抗體制備過程中的均一性程度，并不意在限定制備抗體的特定方 法。
在幾種優(yōu)選的實施方式中，4果測本發(fā)明所述的抗原性結(jié)核多 肽是否存在及其水平的免疫學技術(shù)是通過抗結(jié)核抗體(例如，一 種或者一種以上抗體)的方式來進行的。術(shù)語"抗結(jié)核抗體，，包 括單克隆抗體和/或多克隆抗體，以及它們的混合物，指的是對含 有序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列12、序列14、 序列16、序列18、序列20、序列22、序列24、序列26、序列 28、序列30、序列32、序列34、序列36、序列38、序列40、 序列42、序列44、序列46、序列48、或者上述序列的纟且合序列、 或者上述序列的部分序列所示的序列的多肽具有特異性的抗體。
抗體可以作用于適當?shù)拿庖咴?，例如這里描述的分離的和/ 或重組的抗原性結(jié)核多肽，及其類似物或者一部分(包括合成分 子，例如合成肽)。在一種實施方式中，抗體作用于這里描述的 分離的和/或重組的抗原性結(jié)核多肽或其一部分(例如， 一種肽)， 或者作用于表達重組抗原性結(jié)核多肽的宿主細胞。除此之外，這 里所述的表達重組抗原性結(jié)核多肽的細l包例如轉(zhuǎn)染細胞，可以作 為免疫原，或者用來篩選結(jié)合了受體的抗體。
抗體或者單克隆抗體。本領(lǐng)域存在各種不同的方法(例如參見
Kohler等人(于1975年)在Nature (《自然》)256: 495 -497 中發(fā)表的文章，以及(于1976年)在Eur丄Immunol.(《歐洲免 疫學雜志》)6: 511 - 519中發(fā)表的文章；Milstein等人(于1977 年)在Nature (《自然》)266: 550 — 552中發(fā)表的文章；Koprowski 等人申請的美國專利No.4172124; Harlow, E.和D丄ane于1988 年所著的Antibodies: A Laboratory Manual,(《抗體實驗室手 冊》)(Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor， N.Y. (冷泉港實驗室冷泉港，紐約))；Ausubel, RM.等人(John Wiley&Sons:紐約，N.Y.)(于1991年)編寫的Current Protocols in Molecular Biology (《分子生物學當代規(guī)程》)，第2巻(增刊 27, 1994年夏天)第11章)。通常，將適當?shù)挠郎毎祷蛘吖?髓瘤細月包系例如SP2/0與抗體生產(chǎn)細胞進行融合，能夠產(chǎn)生雜交 瘤。使用感興趣的抗原對動物進4于免疫，能夠生成抗體生產(chǎn)細月包， 優(yōu)選是來自脾臟或者淋巴結(jié)的細月包。選擇性培養(yǎng)方法分離抗體生 成雜交瘤細胞，而有限稀釋4支術(shù)生成這種雜交瘤細力包。研究者可 以使用適當?shù)臋z測法例如酶聯(lián)免疫吸附測定，來選擇具有所期望 的特異性的抗體生成細胞。
其他合適的方法能夠生成或者分離具有所需特異性的抗體。 這類方法的例子包括從文庫中選擇重組抗體，或者依靠轉(zhuǎn)基因動 物例如小鼠的免疫。
方法與不存在活性結(jié)核的人體(例如，存在潛伏的結(jié)核，沒有被 結(jié)核感染，或者已經(jīng)對結(jié)核感染進行了免疫)進行比較。當人體 感染了結(jié)核分枝桿菌，并且該細菌是休眠的或者滅活的，則發(fā)生潛 伏性結(jié)核。活性結(jié)核感染指的是人體感染了結(jié)核分枝桿菌并且該
細菌快速侵染了肌體的某些部分，包括肺以及其他組織。本發(fā)明
基于下述發(fā)現(xiàn)在患有活性結(jié)核的患者的尿液中發(fā)現(xiàn)了某些結(jié)核 抗原的存在，因而本發(fā)明包4舌用來確定活性結(jié)核感染是否存在的 檢觀'J方法。
才艮才居上述方法，檢測能夠確定生物沖羊品中是否存在抗原性結(jié) 核多肽，以及抗原性結(jié)核多肽的水平。這類檢測包括在適于使抗 體和抗原性結(jié)核多肽形成復合體的條件下，將待測樣品與抗體進 4亍混合，所述的抗體對本發(fā)明所述的抗原性結(jié)核多肽具有特異 性，并且探測或者測定(直接的或者間接的)復合體的形成。所 述樣品可以是直接獲得的或者間4妄獲得的(例如，由衛(wèi)生保健機 構(gòu)提供)，也可以通過適合于特定樣品(例如，尿液，唾液，腦 脊髓液，全血，富含血小板的血漿，缺乏血小板的血漿，血清) 以及檢測形式的方法進行制備?；旌系姆椒ㄒ约疤綔y復合體形成 的方法也可以與4企測形式相協(xié)調(diào)。
某些適當?shù)臉擞浳锟梢员恢苯犹綔y，例如放射性標記物、熒 光標記物或者化學發(fā)光標記物。也可以4吏用標記物進4 亍間4妄探 測，例如酶標i己物以及其他抗原性結(jié)合配偶子或者特異性結(jié)合配 偶子例如生物素。這類標記物的例子包括熒光標記物例如熒光 素、若丹明，化學發(fā)光標記物例如熒光素酶，放射性同位素例如 32P， 1251, 1311,酶標記物例如辣根過氧化物酶，以及堿性磷酸酶， 牛乳糖苷酶，生物素，抗生物素蛋白，自旋標^己物以及類4以物。 也可以利用免疫學方法通過第二抗體來4笨測復合體中的抗體，之 后再對第二抗體進行探測(例如，使用標記物的形式)。常規(guī)方 法或者其他適當?shù)姆椒軌蛑?妄的或者間接的標記抗體。可以商 業(yè)購買獲得標記過的初級抗體以及次級抗體(第二抗體)，也可 以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行制備(參見Harlow, E. 和D.Lane于1988年戶斤著的Antibodies: A Laboratory Manual,
(《抗體實驗室手冊》)(Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y.(冷泉港實-驗室冷泉港，紐約))。
在一種優(yōu)選的實施方式中，使用酶聯(lián)免疫吸附測定、夾心酶 聯(lián)免疫吸附測定、或者免疫色譜測定來確定抗原性結(jié)核多肽是否 存在，或者探測抗原性結(jié)核多肽的水平。為了探測一個適當樣品 中的抗原性結(jié)核多肽，需要先收集樣品(例如，尿液)?？梢允?用本4頁&戈已知的方法處理樣品。上述方法進一步包4舌將一個適當 的樣品與一種組合物進行混合，所述的組合物含有作為探測劑的
抗結(jié)核多肽抗體(例如，生物素化抗結(jié)核多肽單克隆抗體以及辣 才艮過氧4匕物酶鏈霉抗生物素蛋白，或者辣才艮過氧化物酶共軛連4妻 的抗結(jié)沖亥多肽單克隆抗體)，以及固體載體，例如孩么量滴定才反或 者量油尺，抗結(jié)核多肽捕獲抗體結(jié)合(例如，直接的或者間接的) 在固體載體之上。所述探測劑抗體結(jié)合在另 一個不同的抗原性結(jié) 核多肽抗原決定基上，并且在那里^皮捕獲抗體識別，在適于復合 體形成的條件下。之后，該方法包括探測樣品中的復合體的形成。 如果來自于個體的樣品中存在一種或者一種以上抗原性結(jié)核多 肽，則表明該個體存在活性結(jié)核感染，而如果不存在結(jié)核多肽， 則表明該患者不存在活性結(jié)核感染。
可以將抗結(jié)核多肽抗體或者結(jié)核特異性抗原直4妄或者間接 的涂覆在固體載體例如微量滴定板，量油尺，珠，襯墊，帶條， 或者其他適當載體上。例如，可以將抗結(jié)核多肽抗體涂覆在孩i量 滴定板上，或者向經(jīng)過鏈霉抗生物素蛋白涂覆的載體上添加生物 素化抗結(jié)核多肽單克隆抗體。在免疫色i普測定方法中，可以把特 異于所述抗原的抗體涂覆于襯墊或者帶條上，當含有一種或者一 種以上所述抗原的樣品與抗體發(fā)生接觸時，形成的復合體在探測 劑的幫助下會改變顏色，這將在本發(fā)明中有進一步描迷。參見附
圖4。可供使用的固定化方法或者涂覆方法以及固體載體有很多， 可以才艮據(jù)所需要的形式進行選擇。
在一個免疫色譜測定方法中，可以把含有本發(fā)明所述結(jié)核抗 原的才羊品加入到上述沉淀中，如附圖4中所示。樣品在金標i己抗 體(單克隆抗體#1)中擴散，所述金標記抗體對所述抗原的部分 具有特異性，樣品中的抗原與上述抗體形成復合體。形成的復合 體進一步在含有第二抗體(單克隆抗體#2)的村墊中擴散，第二 抗體結(jié)合到抗原的其他部分上。當復合體接觸到標記為"l號線" 的線時，被標記的復合體改變顏色，對照線("2號線")也會改 變顏色。如果上述樣品中不含有本發(fā)明所述的結(jié)核抗原，則l號 線不會改變顏色，因為金標記抗體不會與樣品發(fā)生結(jié)合，因此也 不會與1號線發(fā)生接觸。
在另外一種實施方式中，將樣品(或者抗原性結(jié)核多肽標準) 同時與固體載體以及探測劑抗體進行混合，并且任選的與一種或
者一種以上用于監(jiān)控探測過程的試劑進行混合。例如，可以將樣 品同時與固體載體以及(a)辣根過氧化物酶共軛連接的抗結(jié)核 多肽單克隆抗體，或者(b)生物素化抗結(jié)核多肽單克隆抗體以 及辣根過氧化物酶鏈霉抗生物素蛋白進行混合。
可以準備已知劑量的抗原性結(jié)核多肽標準，并且按照如上所 述的方法對其進行處理，作為一個適當?shù)臉悠?。這種抗原性結(jié)核 多肽標準能夠幫助量化探測到的抗原性結(jié)核多肽的劑量，通過將 才羊品中的抗原性結(jié)核多肽水平與標準中的水平進4亍比對來完成。
內(nèi)科醫(yī)師、技術(shù)員、使用儀器或者有資格的人員能夠?qū)⑻綔y 到的復合體的劑量與適當?shù)膶φ战M進行比對，以確定樣品中的水 平是否升高了。例如，可以將處理后的抗原性結(jié)核多肽的水平與 處理前的基線水平進4亍比對，或者與正常個體或適當?shù)膶φ战M中
的水平進行比對。與基線水平相比，如果尿液中一種或者一種以 上結(jié)核多肽的水平降低或者保持不變，則表明該處理是有效的， 而水平的增加則表明該處理是無效的。
通常用于檢測抗原性結(jié)核多肽的方法是順序檢測法，在該方 法中，在一個平^反上涂覆第一抗體，加入樣品，洗滌平^反，加入 另外一個標記抗體(第二抗體)，之后洗滌平板，并且量化其上 結(jié)合的第二抗體。在另外一種實施方式中，將抗體與樣品同時加 入，形成竟爭性酶聯(lián)免疫吸附測定反應，能夠獲得更高的靈敏性。
許多方法都能夠測定復合體中抗原性結(jié)核多肽的量。例如， 當4吏用辣才艮過氧4匕物酶作為標i己物時，可以加入適當?shù)牡孜锢?br> OPD (鄰苯二胺)，按照結(jié)合的抗結(jié)核多肽單克隆抗體的比例、 /人而按照樣品中抗原性結(jié)核多肽的比例直接增加顏色的亮度(通 過例如光學密度來評價)。
技術(shù)員、內(nèi)科醫(yī)師、有資格的人員或者利用儀器可以將結(jié)果 與適當?shù)膶φ战M進行比對，對照組是例如標準或者是來自于相同 個體的樣品中的抗原性結(jié)核多肽的基線水平。例如，可以使用已 知劑量的抗原性結(jié)核多肽標準代替樣品來進行;險測，得到標準化 曲線?？梢詫⑿纬傻幕蛘咛綔y到的復合體的劑量與已知劑量的抗 原性結(jié)核多肽進行比較。
也可以4吏用雜交的方法檢測編碼抗原性結(jié)核多肽的核酸，例 如，將這里提供的結(jié)核序列中的一種(例如，序列1、序列3、 序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、 序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列 31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、 序列45、序列47所示的序列，或者上述序列的組合序列)或者 來自于上述序列之一的寡核苷酸與來自于人體的含有DNA或者RNA的組織樣品進行雜交。這樣的雜交序列可以連接一個可探 測的標i己，例如^t射性標i己或者熒光標i己等等，以〗吏雜交產(chǎn)物3皮 探測到。這類方法包括在高度嚴格的條件下，將樣品與一種或者 一種以上寡核苷酸探針(例如，至少大約15個連續(xù)的堿基)相 接觸，所述的探針特異于這里所述的核酸分子3使樣品與探針進 行充分的雜交；然后，探測雜交于樣品中的寡核苷酸探針的核酸 分子。如果探針發(fā)生了雜交，則表明存在結(jié)核分枝桿菌感染，如 果探針沒有發(fā)生雜交，則表明不存在結(jié)核分枝桿菌感染。雜交的 方法是熟知的，并且這類方法在Jacobs等人申請的美國專利 No.5837490中有記載，該文獻的全部教導在此引入作為參考。對 寡核苷酸探針的設計優(yōu)選具有下列參數(shù)(a)所述探針應該被設 計在含有最少多義堿基("Ns")的序列區(qū)域內(nèi)，如果存在的話， 并且(b )所述探針應該祐 沒計為具有大約80°C的熔化溫度(Tm ) (假定每個A堿基或者T堿基需要2"C，每個G堿基或者C堿基 需要4'C )。
本發(fā)明包括利用PCR (聚合酶鏈式反應)方法，使用本發(fā)明
中的結(jié)核多肽的方法。例如，可以4吏用序列1、序列3、序列5、 序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、 序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列 33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、 序列47、或者上述序列的組合序列通過PCR (聚合酶鏈式反應) 探測本發(fā)明所述的序列。PCR (聚合酶鏈式反應)是一種目標序 列的選擇性擴增，利用序列特異性引物以及熱穩(wěn)定性聚合酶，通 過多輪重復的核酸復制來完成。PCR (聚合酶鏈式反應)使完整 的序列在其兩端退火為已知序列。具體的，在一個PCR(聚合酶 鏈式反應)反應中，將樣品與至少兩個寡核苦酸引物進行接觸， 所述寡核苷酸引物(例如，至少大約10個連續(xù)的堿基)中的至 少一個對本發(fā)明所述的分離的核酸分子中的一種或者一種以上 具有特異性。樣品與引物充分4妄觸，4吏引物發(fā)生擴增。探測樣品 中擴增的核酸序列。如果存在任何一種擴增的核酸序列，則表明
存在結(jié)核分枝桿菌感染，如果不存在任何一種擴增的核酸序列，
則表明不存在結(jié)核分枝桿菌感染。PCR(聚合酶鏈式反應)的方 法在本發(fā)明中有盧斤描述，并且該方法是本領(lǐng)域已知的。
因此，本發(fā)明包括用來探測序列2、序列4、序列6、序列8、 序列10、序列12、序列14、序列16、序列18、序列20、序列 22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列34、 序歹U 36、序歹'J 38、序歹'J 40、序歹'J 42、序歹'J 44、序歹'j 46、序歹'J 48、或者上述序列的組合序列的試劑盒，所述試劑盒也可以用來 量化這些序列，試劑盒中含有特異于這些序列的抗體，或者上述 抗體的一部分，或者含有能夠雜交于編碼這些序列的核酸的核酸 序列。
可以使用本領(lǐng)域已知的方法進行其他種免疫檢測或者核酸 4企測。本領(lǐng)域已知的檢測方法或者未來發(fā)展出的檢測方法都可以 用來檢測樣品中的抗原性結(jié)核多肽。
除了測定樣品中抗原性結(jié)核多肽的存在之外，這類檢測還能 夠測定結(jié)核疫苗的功效性(例如，對免疫應答的刺激程度)?？?以同時使用這些不同類型的檢測，對人體內(nèi)的結(jié)核狀況進行全面 評價。例如，如果一個個體中存在結(jié)核特異性免疫應答，但其樣 品中 一種或者一種以上抗原性結(jié)核多肽的檢測結(jié)果呈陰性，則表 明該個體對結(jié)核疾病具有一定水平的免疫性。然而，如果一個個 體中存在結(jié)核特異性免疫應答，并且對本發(fā)明所述的抗原性結(jié)核 多肽的檢測結(jié)果呈陽性，則表明該個體可能患有結(jié)核。
可以通過對注射過疫苗的人體內(nèi)的免疫應答進4亍測定來"i平 Y介結(jié)核疫苗的功歲文性。這里所i兌的本發(fā)明的結(jié)核抗原(及其免疫 原性部分)具有誘導免疫應答的能力。更具體的，這種抗原具有 i秀發(fā)T細月包、NK細月包(腫瘤殺傷細月包)、B細月包和/或巨噬細胞^ 內(nèi)的擴增和/或細胞因子的生成(即，干擾素-y和/或白細胞介 素-12的生成)的能力，其中所述的T細胞、NK細胞(腫瘤殺 傷細胞)、B細胞和/或巨噬細胞來自于結(jié)核分枝桿菌免疫型個體。 參見實施例3。
可以才艮才居所期望的應答來選擇細月包類型，用于測定4十對抗原 的免疫應答。例如，使用含有B細胞和/或巨噬細胞的樣品能夠 最容易的測定白細胞介素-12的生成量。結(jié)核分枝桿菌免疫型個 體被i人為是通過激發(fā)針對結(jié)核分枝桿菌的有效的T細胞應答來 抵抗結(jié)4亥的形成(即，本質(zhì)上不存在疾病癥4犬)。這類個體可以 基于下列特征凈皮識別利用純蛋白^汙生物(PPD),得到針對結(jié) 核蛋白的強陽性(即，大于大約10毫米直徑的硬結(jié))皮下測試 應答，以及不存在有關(guān)結(jié)核疾病的任何跡象或者癥狀。可以使用 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法，制備來自于結(jié)核分枝桿菌免疫 型個體的T細胞、NK細胞(腫瘤殺傷細胞)、B細胞和巨噬細胞。 例如，可以通過制備PBMCs (即，夕卜周血單個核細胞)的方法 來制備，而不需要進一步分離成分細胞。通常，可以-使用例如 Ficoll (菲可)(Winthrop Laboratories, NY)密度離心法制備外 周血單個核細胞。也可以將本發(fā)明所述的檢測方法中〗吏用的T細 月包從外周血單個核細l包中直接分離純化出來?；蛘撸梢?吏用對 分枝桿菌蛋白具有活性的強化T細胞系，或者對個體分枝桿菌蛋 白具有活性的T細J包克隆。這類T細力包克隆可以通過例如^f吏用分 枝桿菌蛋白對來自于結(jié)核分枝桿菌免疫型個體的外周血單個核 細胞進行2-4周的培養(yǎng)而獲得。這種方法只允許分枝桿菌蛋白 特異性T細月包發(fā)生擴張，4尋到全部由該細胞組成的細月包系。然后，
可以4吏用本領(lǐng)域普通^支術(shù)人員已知的方法對上述細胞進行克隆，
并且使用個體蛋白進行檢驗，從而更準確的定義個體t細胞的特 異性。通常，在對來自于結(jié)核分枝桿菌免疫型個體的t細胞、 nk細胞(肺瘤殺傷細胞)、b細胞和/或巨嗟細胞中的擴增和/或 細胞因子的生成(即，干擾素_ y和/或白細胞介素- 12的生成) 進行檢測時，呈陽性的抗原被認為是免疫原性的。可以使用例如 后面描述的代表性方法來進行上述檢測?？梢允褂妙愃频臋z測方 法識別上述抗原的免疫原性部分，該部分可以存在于本發(fā)明所述 的多肽之內(nèi)。
可以通過將細胞(例如，t細胞和/或nk細胞)與多肽(例 如，免疫抗原或其部分，或者它們的變體)進行接觸并且測定細 月包擴增的方法來評價上述多肽誘導細胞擴增的能力。通常，足夠 用于評^f介大約105個細1包的擴增的多肽的量在大約10納克/毫升 至大約100微克/亳升的范圍內(nèi)，并且優(yōu)選為大約10樣t克/毫升。 4吏用細月包對多肽進行的培養(yǎng)通常是在37°C下培養(yǎng)大約6天。多肽 培養(yǎng)之后，4企驗細胞的擴增性應答，可以〗吏用本領(lǐng)域普通^支術(shù)人 員已知的方法對其進4亍評價，例如將細胞暴露于一束;^文射性標記 的胸苦Ji^沖中，并且測量導入到細胞dna的標記物。通常情況 下，所導致的擴增比背景水平(即，不使用多肽進行培養(yǎng)的細胞 中觀察到的擴增)增加至少3倍的多肽被認為是能夠誘導擴增的 多肽。
一種多肽具有的刺'激細月包內(nèi)干護O素-v和/或白細胞介素-12的生成的能力可以通過下述方式進行評〗介將細胞與多肽進行 才妄觸，并且測定細胞生成的干4無素-y或者白細月包介素-12的水 平，如實施例3中所示范的。通常，足夠用于評i^介大約105個細 胞的擴增的多肽的量在大約10納克/毫升至大約100微克/毫升的 范圍內(nèi)，并且優(yōu)選為大約10孩￡克/毫升。所述的多肽可以^f旦不必
須#皮固定于固體載體例如珠或者生物可降解孩O求體上，如美國專
利Nos.4897268和5075109中所述的載體。細胞對多肽的培養(yǎng)通 常是在37。C下培養(yǎng)大約6天。在多肽培養(yǎng)之后，對細胞中的干擾 素-Y和/或白細月包介素-12 (或者一種或多種上述物質(zhì)的亞基) 進行檢測，這可以通過本領(lǐng)域普通^支術(shù)人員已知的方法來進4亍， 例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，或者如果是對白細胞介素-12 P70亞基進行4企測，則使用例如測定T細胞擴增的生物檢測方 法。通常，如果每毫升培養(yǎng)上清液(每毫升中含有104 - 105個丁 細胞)中生成至少50匹克的干擾素-Y,則產(chǎn)生該結(jié)果的多肽 被認為具有刺激干擾素-Y生成的能力。如果在多肽的刺激下， 每105個巨嗟細力包或者B細"包(或者每3 x 105個外周血單個核細 胞)能生成至少10匹克/毫升的白細胞介素-12 P70亞基，和/ 或至少100匹克/毫升的白細月包介素-12 P40亞基，則該多肽4皮 i人為具有刺激白細胞介素-12生成的能力。
通常，免疫抗原能夠刺激T細胞、NK細胞(腫瘤殺傷細胞)、 B細胞和/或巨喧細胞中的擴增和/或細胞因子的生成(即，干擾 素-Y的生成和/或白細l包介素-12的生成)，所述T細月包、NK 細胞(腫瘤殺傷細胞)、B細胞和/或巨噬細胞來源的個體中有至 少大約25%的個體是結(jié)核分枝桿菌免疫型個體。在這類免疫抗原 中，可以根據(jù)在上述檢測中得到的應答的量級以及才艮據(jù)觀察到應 答的個體的百分數(shù)來甄別具有優(yōu)異治療特性的多肽。除此之外， 如果細胞來源的個體中有多于大約25 %的個體不屬于結(jié)核分枝 桿菌免疫型，則具有優(yōu)異治療特性的抗原不能在體外刺激細胞內(nèi) 的擴增和/或細胞因子的生成，從而消除了不是由結(jié)核分枝桿菌應 答細l包引起的特異性應答。當T細月包、NK細胞(腫瘤殺傷細胞)、 B細J包和/或巨噬細胞樣品來源的個體中有高比例的結(jié)核分枝桿 菌免疫型個體時(來自于其他個體的細胞樣品應答的發(fā)生率低)， 誘導上述細胞中的應答的抗原具有優(yōu)異的治療特性。
融合蛋白，疫苗組合物，給藥形式
本發(fā)明所述的結(jié)4亥多肽可以以共扼蛋白或者融合蛋白的形 式存在，上述形式可以由本領(lǐng)域已知的方法進行制備。特別的，
序列2、序列4、序列6、序列8、序歹'J 10、序歹'J 12、序列14、 序列16、序列18、序列20、序列22、序列24、序列26、序列 28、序歹'J 30、序歹'J 32、序歹'J 34、序歹ll 36、序歹'J 38、序歹'J 40、 序列42、序列44、序列46或者序列48中的兩個或者多個序列 之間可以彼此融合，或者與其他蛋白進行融合，以提供更加有效 的疫苗組合物，刺激增強的免疫應答。用來制備上述融合蛋白的 其他蛋白包括刺激免疫應答的CD4+T細胞途徑的結(jié)核抗原。這 類抗原的例子包括抗原85b， ESAT-6， MtB41, Mtb39。本發(fā)明 所述的抗原多肽是從主要組織相容性復合體(MHC) 1級分子中 分離得到的，已知該分子中存在針對CD8+T細胞的抗原。盡管 這些多肽也可能存在于CD4+T細胞途徑中，將CD4+T細胞途徑 抗原與本發(fā)明所述的多肽中的一種進行融合，可以增強結(jié)核疫苗 的功效。可以根據(jù)已知的重組DNA 4支術(shù)制備融合蛋白。例如， 可以從核酸分子中進行融合蛋白的表達，所述核酸分子包括編碼 結(jié)核多肽的生物活性部分或者編碼整個結(jié)核多肽的序列，々o序列 2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列12、序列14、序列 16、序列18、序列20、序列22、序列24、序列26、序列28、 序列30、序列32、序列34、序列36、序列38、序列40、序列 42、序列44、序列46、序列48所示，或者上述序列的《且合序列， 以及融合配偶子(fusion partner),例如本發(fā)明中的其他序列，編 碼免疫5求蛋白分子的一部分、或者來自于CD4+T細胞途^5的其 他結(jié)核多肽的序列。例如，在某些實施方式中，將編碼免疫^求蛋 白序列的核酸交叉入適當?shù)谋磉_載體，噬菌體載體，或者其他可 購買獲得的載體中。將得到的構(gòu)建體導入適當?shù)乃拗骷毎羞M行 表達。在表達中，通過親和基質(zhì)將融合蛋白從細胞中分離并純化
出來。通過測定由重組結(jié)核蛋白的表達而引發(fā)的轉(zhuǎn)染細胞的功能 的轉(zhuǎn)變，可以將細月包本身或者由該細月包生產(chǎn)的結(jié)核蛋白應用于各 種篩選4企測方法中。
如上所述，在某些情況下，本發(fā)明的組合物包括融合蛋白或
者DNA融合分子。每個融合蛋白包括兩個本發(fā)明所述的多肽(一 種第一多肽和一種第二多肽)，或者包4舌一個本發(fā)明所述的多肽 和一個已知的結(jié)^亥分坤支才干菌抗原，以及這類融合蛋白的一些變 體。本發(fā)明所述的融合蛋白也可以包括一個連接肽，存在于第一 多肽和第二多肽之間。本發(fā)明所述的DNA融合分子包括兩個分 離的DNA分子，每個分離的DNA分子編碼本發(fā)明所述的結(jié)核分 枝桿菌抗原或者編碼已知的結(jié)核分枝桿菌抗原。
編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA序列是通過已知的重組 DNA技術(shù)進行構(gòu)建的，將單獨編碼第一多肽的DNA序列和單獨 編碼第二多肽的DNA序列聚集在一個適當?shù)谋磉_載體中，下文 中會有詳細描述。編石馬第一多肽的DNA序列的3，端通過或者不 通過肽連接體與編碼第二多肽的DNA序列的5'端進行連接，因 而兩個序列的閱讀才醫(yī)在同一相中，/人而將兩個DNA序列中的 mRNA翻譯為一個單獨的融合蛋白，同時保留了第一多肽和第二 多肽的生物活性。
可以使用肽連接序列分離第一多肽和第二多肽，使分離的距 離足夠確保每個多肽都能夠折疊成各自的二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)
融合蛋白中。可以根據(jù)下列因素來選擇適當?shù)碾倪B接序列(1) 適應柔性伸展構(gòu)型的能力；(2)無法形成二級結(jié)構(gòu)的能力，因為 所述的二級結(jié)構(gòu)能夠與第一多肽以及第二多肽上的功能性抗原 決定基發(fā)生相互作用；以及(3)不存在疏水殘基或者帶電殘基， 因為上述殘基可能與多肽的功能性抗原決定基發(fā)生反應。優(yōu)選的
肽連4妄序列包括甘氨酸殘基、天冬酰胺殘基以及絲氨酸殘基。其 4也接近中性的氨基酸例如蘇氨酸和丙氨酸也可以作為連接序列 被使用。可以被有效用來作為連接序列使用的氨基酸序列包括在
Maratea等人于1985年在Gene (《基因》)40: 39-46中發(fā)表的 文章、Murphy等人于1986年在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83: 8258
-8262中發(fā)表的文章、美國專利No.4935233以及美國專利 No.4751180中所述的氨基酸序列。這類連接序列可以具有1個到 大約50個氨基酸的長度。如果所述第一多肽和第二多肽具有非 必需N-末端氨基酸區(qū)域，則不需要使用肽序列，因為非必需N
-末端氨基酸區(qū)i或可以#皮用來分離功能性結(jié)構(gòu)域，并且防止位阻 影響。
i皮連才妾的DNA序列可操作的連4妻于適當?shù)霓D(zhuǎn)錄控制元4牛或 者翻譯控制元件上。應答于DNA表達的調(diào)控元件僅定位在編碼 第一多肽的DNA序列的5，端。類似的，結(jié)束翻譯終止信號和轉(zhuǎn) 錄終止^f言號所需的終止密碼子僅存在于編碼第二多肽的DNA序 列的3'端。
可以對含有本發(fā)明所述的分離序列的疫苗的功效性進行測 定，這種測定以抗原具有的下述能力為基準在進4于了試-瞼性感 染的才兆戰(zhàn)試^驗之后，所述的抗原具有減少至少大約50% (例如， 大約60%，大約70%，大約80%,大約90%，或者大約100%) 細菌數(shù)量的能力，和/或降低至少大約40% (例如，大約50%， 大約60°/。，大約70%,大約80%，大約90%,或者大約100% ) 死亡率的能力。合適的試驗性動物包括小鼠，豚鼠以及靈長類。
優(yōu)選的爿夸本發(fā)明所述的組合物配置成藥物組合物或者疫苗， 用來誘導患者體內(nèi)針對結(jié)核桿菌的保護性免疫性。所述的患者可 以是受疾病4斤磨的患者，或者是不存在可4果測的疾病和/或感染的
患者。換句話說，保護性免疫性的誘發(fā)能夠預防、減輕結(jié)核的嚴 重禾呈度、或者治療結(jié)核。
在一種實施方式中，本發(fā)明所述的藥物組合物包括一種或者 一種以上上述多肽，上述多肽可以以混合物的形式存在，或者以 融合蛋白的形式存在，該組合物中還包括生理可接受載體。類似 的，疫苗包4舌一種或者一種以上上述多肽，以及非特異性免疫應 答增強劑，例如佐劑或者脂質(zhì)體(在其中導入所述多肽)。
在另外一種實施方式中，本發(fā)明所述的藥物組合物和/或疫苗
可以含有本發(fā)明所述的一種或者一種以上DNA分子，上述DNA 分子以混合物的形式存在，或者以DNA融合分子的形式存在， 每個DNA分子編碼如上所述的一種多肽，因而上述多肽是在原 位生成的。在這類疫苗中，所述DNA可以存在于本4頁i戈普通4支 術(shù)人員已知的各種運送系統(tǒng)中的4壬意一種中，包4舌核酸表達系 統(tǒng)，細菌表達系統(tǒng)和真菌表達系統(tǒng)。適當?shù)暮怂岜磉_系統(tǒng)含有在 患者體內(nèi)進;f亍表達所必需的DNA序列(例如適當?shù)膯幼雍徒K 止信號)。細菌運送系統(tǒng)包括細菌(例如卡介苗)的施用，該細 菌在其細胞表面表達多肽的免疫原性部分。在一種優(yōu)選的實施方 式中，可以4吏用病毒表達系統(tǒng)(例如，牛痘或者其他痘病毒，逆 轉(zhuǎn)錄酶病毒，或者腺病毒)導入DNA,其中可以4吏用非致病性 (缺陷型)可復制型病毒。將DNA導入這類表達系統(tǒng)中的4支術(shù)是 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。所述的DNA也可以是"棵"DNA, 例如在Ulmer等人于1993年在Science (《科學》)259: 1745-1749中發(fā)表的文章中有所描述，并且在Cohen于1993年在 Science (《科學》)259: 1691 - 1692中發(fā)表的文章中有所評論。 通過將棵DNA涂覆于生物可降解的珠上來增加對棵DNA的掘_ 取，這樣能夠?qū)⑵溆行У霓D(zhuǎn)移到細胞內(nèi)。
本發(fā)明所述的抗原性結(jié)核分子可以與載體或者不與栽體一 同施用。術(shù)語"藥物可接受載體"或者"載體"指的是相對惰性 并且無毒性的常規(guī)可^妄受賦形劑或者藥物運送組合物。范例性的 載體包括無菌水，鹽溶液(例如羅格氏溶液)，酒4青，凝膠，滑 石，粘性石蠟，脂肪酸酯，羥曱基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，碳 酸鈣，石友水化合物(例如乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露糖)，白蛋
白，淀粉，纖維素，硅膠，聚乙二醇(PEG)，干燥脫脂乳，米 粉，硬脂酸鈉，以及類似物。合適的配比以及其他載體在 Remington's Pharmaceutical Sciences (《雷明頓制藥矛牛學》)(17th Ed., MackPub. Co.， Eastern, PA)中有所描述?？梢詫@些成分 進《亍殺菌，如果需要的話，可以與助劑進4于混合，助劑是例3口潤 滑劑，防腐劑，穂、定劑，潤濕劑，乳化劑，影響滲透壓的鹽類， 緩沖劑，著色劑，防腐劑和/或芳香物質(zhì)以及類似物，上述物質(zhì)不 會與活性化合物產(chǎn)生有害的反應。常^L的防腐劑可以包括山梨酸 鉀，偏亞硫酸氯鈉，對羥基苯甲酸曱酯，對羥基苯曱酸丙酯，硫 柳汞鈉等等。如果需要的話，也可以將上述組合物與其他活性物 質(zhì)例如酶抑制劑進行混合，以減少代謝性降解。施用上述化合物 時優(yōu)選使用載體(例如，藥物可接受性載體)，但不是必須使用 的。
上述組合物可以是液體溶液，懸浮液，乳液，片劑，丸劑， 月交嚢，緩釋配方，或者粉末。給藥的方法能夠決定該組合物^皮配 置成4可種形式。例如，可以將上述組合物與傳統(tǒng)的粘合劑以及載 體例如甘油三酸酯配置成4全劑形式?？?良配方可以包纟舌標準的載 體例如藥物級甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素， 碳酸鎂，等等。
本發(fā)明所〗吏用的抗原性結(jié)核分子可以通過吸入、才直入、注射、 或者栓劑的方式進行靜脈內(nèi)給藥、非腸道給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮
下纟會藥、口月艮給藥、鼻內(nèi)給藥、局部給藥。上述組合物可以以單 一劑量的形式或者以多于 一 種劑量的形式在 一 羊殳時間內(nèi)進^亍施 用，以達到所期望的效果。
上述4匕合物或者藥物的實際有效劑量可以4艮據(jù)^吏用的特定 纟且合物、給藥形式以及患者的年齡、體重和情況而不同。例如， 正如這里所使用的,該藥物的有效劑量指的是能夠減少細菌數(shù)量 的劑量。對于一個特定的患者而言，給藥劑量可以由本領(lǐng)域普通 4支術(shù)人員^f艮據(jù)常規(guī)的因素來確定(例如，依靠適當?shù)摹⒊Ｒ?guī)的藥 理學方案)。
如果是用于腸道或者用于黏膜(包括用于口腔黏膜以及鼻黏 膜)，特別合適的形式是片劑，液體，滴劑，栓劑或者膠囊。如 果需要使用甜味溶媒，可以使用糖漿，酏劑或者類似物。脂質(zhì)體， 樣t球體以及^f效膠嚢也是可以利用的和可以使用的。
可以4吏用例如本4頁」或已知的各種運送裝置中的4壬意 一種進
4亍肺部給藥，例如使用吸入器。參見例如S.P.Newman (于1984 年)在Aerosols and the Lung (《氣霧劑和肺臟》)，Clarke和Davis (編輯)，Butterworths, London (倫敦)，England (英國)，197
-224頁發(fā)表的文章；PCT公開申請No.W092/16192; PCT公開
申請No.W091/08760。
如果是非腸道形式給藥，特別合適的形式是注射劑，無菌溶 液，優(yōu)選的是油溶液或者含水溶液，以及懸浮液，乳液，或者是 植入劑，包括栓劑。特別的，用于非腸道給藥的載體包括葡萄糖 的含水溶液，鹽水，純凈水，乙醇，甘油，丙二醇，花生油，芝 麻油，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，以及類似物。安瓿是方 l吏的單位劑量。
生4勿可降解的樣史j求體(例如，polylactic galactide )也可以4皮 用來作為載體用于本發(fā)明所述的藥物組合物中。適當?shù)纳锟山?解微球體在例如美國專利Nos.4897268以及5075109中被公開。
在本發(fā)明所述的疫苗中可以使用各種佐劑中的任意 一 種，以 增強免疫應答。大部分的佐劑含有能夠保護抗原免受快速分解代 謝的物質(zhì)，例如氫氧化鋁或者礦物油，以及非特異性免疫應答刺 激劑，例3口油月旨A， Bortadella pertussis或者結(jié)4亥分才支桿菌。合適 的佐劑可以購買獲得，并且包4舌例如弗氏不完全佐劑以及弗氏完 全佐劑(Difco實-驗室)和Merck佐劑65 ( Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.)。其他合適的佐劑包括明鞏，生物可降解的 微球體，單磷酰脂A，以及基質(zhì)quilA。
在本發(fā)明的疫苗中，優(yōu)選所述的佐劑i秀導包4舌Thl方面的免 疫應答。適當?shù)淖魟┫到y(tǒng)包括，例如，單磷酰脂A與鋁鹽的組合 物，所述的單》粦酰脂A優(yōu)選為3-脫氧-乙酰4匕單《,酰脂A (3D-MLP)。 一種增強的系統(tǒng)包括單-粦酰脂A和惠素書f生物的組 合物，特別是3-脫氧-乙酰化單磷酰脂A (3D-MLP)和皂素 QS21的組合物，例如在WO94/00153中7>開的，或者是具有壽交 弱反應原性的組合物，其中QS21凈皮膽固醇進4亍了硬:化，例如在 W096/33739中公開的。先前的試驗已經(jīng)證明，3 -脫氧-乙?；?單4,酰脂A (3D-MLP)和QS21的組合物在i秀導體液細月包以及 Thl型細J!包免疫應答時產(chǎn)生了明顯的協(xié)同效應。 一種特別有效的 佐劑組合物包括存在于水包油乳液中的QS21, 3-脫氧-乙?；?單磷酰脂A ( 3D-MLP),以及生育酚，例如在WO95/17210中乂> 開的，上述組合物是優(yōu)選的佐劑組合物。
本發(fā)明所述的抗原性結(jié)核多肽分子可以與其他化合4勿同時 施用，或者按時間順序分別施用。上述的DNA疫苗和/或藥物組 合物可以與本發(fā)明所述的其他多肽同時施用，或者4要順序施用，
已知的結(jié)核分枝桿菌抗原、免疫增強劑、或者本領(lǐng)域已知的其他 化合物也可以與上述疫苗 一 同施用。所述的化合物可以與抗原性 結(jié)核分子同時施用，也可以在它之前或者之后施用。因此，術(shù)語 "共同施用"在這里指的是按時施用抗原性結(jié)核分子和其他的化 合物(例如，免疫刺激化合物)以完成特異性結(jié)核免疫應答，如 本發(fā)明中所述。本發(fā)明所述的方法對化合物的施用順序沒有限 制，只要該化合物的施用足夠及時，能產(chǎn)生所期望的效果即可。
本發(fā)明所述的藥物組合物和疫苗的給藥路徑以及給藥頻率 和劑量可以才艮才居不同的個體而改變，并且可以與通常用于免疫接
種的卡介苗(BCG)并朽"使用。通常，上述藥物組合物和疫苗可 以通過注射方式(例如，皮內(nèi)注射，月幾肉內(nèi)注射，靜月永內(nèi)注射或 者皮下注射)、鼻內(nèi)方式(例如，通過抽吸)、肺內(nèi)方式、或者口 月良方式給藥?？梢允┯靡粍┑饺齽┑膭┝?，持續(xù)1-36周時間。 優(yōu)選的，每3-4個月時間施用三劑的劑量，之后周期性的進行 疫苗的接種。對不同的患者使用不同的方案是恰當?shù)?。當按照?述方法進行施用時，能夠在免疫型患者體內(nèi)激發(fā)足以保護患者在 至少1-2年內(nèi)不受結(jié)核分枝桿菌感染的免疫應答的劑量的多肽 或者DNA的量是合適的劑量。通常，每千克宿主體內(nèi)存在的多 肽的劑量(或者通過DNA原位生成的劑量)是大約1匹克至大 約100毫克，典型的是大約10匹克至大約1亳克，優(yōu)選的是大 約100匹克至大約1微克。合適的劑量會根據(jù)患者的體重而有所 不同，但是通常是在大約0.1毫升至0.5毫升之間。
實施例
實施例1:與主要組織相容性復合體(MHC) l級分子相關(guān)
的結(jié)核分^i干菌肽
探測體內(nèi)感染型小鼠巨噬細胞中的主要組織相容性復合體1 級分子相關(guān)的結(jié)核分枝桿菌肽，來識別其感染的微生物制劑。
在被感染細胞中尋找與主要組織相容性復合體1級分子相關(guān) 的結(jié)核分枝桿菌抗原的理論依據(jù)是基于下述事實這些宿主細胞 分子是將抗原呈遞至CD8+T細胞的至關(guān)重要的分子，CD8+T細 月包是T細胞的子集，能夠抵抗結(jié)核。因此，這種探索抗原的方法對于抵抗這種疾病的疫苗的形成方法產(chǎn)生直直的影響。
上述主要組織相容性復合體1級分子相關(guān)的結(jié)核分枝桿菌肽 是從C57BL/6小鼠的粘著性脾細胞中分離得到的，所述的 C57BL/6小鼠是被107CFU (菌落形成單位)個結(jié)核分枝桿菌感 染過的。C57BL/6小鼠被認為是相對抵抗結(jié)核分枝桿菌感染的， 因此是用于該項研究的理想材料。4吏用高4妄種量進行感染是重要的，能夠在試一驗動物的脾細月包內(nèi)形成高度細月包內(nèi)感染。在感染之 后的10天至14天時，被感染小鼠的脾臟里含有的細胞比未經(jīng)感 染的小鼠脾臟里的細胞多5倍。這些脾細胞中4艮大一部分是感染 了結(jié)核分枝桿菌的巨噬細胞。將小鼠處死并獲得它們的脾粘連細 月包，使用CHAPS清潔劑(Boehringer Mannheim 公司，印第安納 波利斯，IN)對其進4亍裂解，并使用G蛋白瓊脂糖凝膠柱通過親 和純化分離主要組織相容性復合體1級分子，該分子與抗H-2 K/Db單克隆抗體(ATCC HB-ll)發(fā)生了連接。附圖3中概述了這一過程。
將洗提得到的肽通過5kDa截流分子量的Millipore Ultrafree -CL進行超濾，其中所述的肽包括小于5 kDa的分子混合物， 超濾之后再通過樣史孑L反向高效液相色i普(Delta-Pak C18斗主， 300A孔隙，5微米粒子)進行分餾。得到的高效液相色譜曲線呈 現(xiàn)出幾個峰值，使用毛細管液相色譜以及電噴霧質(zhì)譜耦聯(lián)的裝置 (LC-MS)對每個峰值進行分析，從而測定分子量以及全部類型 的肽的分布量。之后，通過石並撞活化解離(CAD)串聯(lián)質(zhì)^普 (MS/MS)獲得4美選肽的質(zhì)量。
測定上述肽序列與結(jié)核分枝桿菌數(shù)據(jù)庫以及鼠類染色體組 數(shù)才居庫(The Institute for Genomic Research染色體纟且研究學會) 中的已知蛋白之間的同一性。其中幾種肽與鼠類蛋白具有很高的 同源性。然而，有7種肽和核酸序列4皮鑒定為是來源于結(jié)核分^支 桿菌的(附圖1 )。使用標準，技術(shù)將編碼這些肽蛋白供體的相應基 因進行克隆并且被表達。除此之外，制備含有這些結(jié)核分枝桿菌 基因的細菌質(zhì)粒DNA。這些重組蛋白以及質(zhì)粒DNA都將凈皮應用 于免疫學草案中，目的在于調(diào)查這些分子具有的保護小鼠4氐抗惡 性結(jié)核分枝桿菌的保護性潛能。這種蛋白配方可以被用來測試 CD4+應答，而DNA免疫將作用于CD8+T細胞應答。
實施例2:在感染型小鼠的尿液中發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌抗原
在感染型小鼠的尿液中探測結(jié)核分#支桿菌抗原，來識別患有 活性結(jié)核的患者尿液中的微生物抗原。
抗原探測分析與常規(guī)的血清學相反，4果測的是疾病的'ft況， 而不是宿主抗體針對疾病發(fā)病原因的應答。因此，抗原探測分析 可以作為診斷和治療的根據(jù)。在本方案中，使用在人類患者的尿 液中識別結(jié)核分枝桿菌抗原的抗原探測方式。此外，生產(chǎn)并且驗 i正作為活性疾病的才示i己的重《且蛋白。
將各種尿液(15亳升)》文至容量為15毫升的Vivaspin 5K MWCO (截留分子量為5K的超濾濃縮離心管)中，在4C下， 3000G過濾并且離心，直至滲余物的體積小于2毫升。^吏用6M 的尿素以及100mM的碳酸氫銨進行漂洗，將濃縮物從膜上分離。 <吏用pH為8.5的6M尿素以及100mM碳酸氬銨將最終的濃縮物 補足至4毫升。向每個蛋白濃縮樣品中加入20毫升2M的DTT (二硫蘇糖醇)。對樣品進行渦流攪拌，并且在37。C下培養(yǎng)1小時。 通過向每個樣品中添加200毫升0.5M的碘乙酰胺，使還原的半 胱氨酸發(fā)生烷基化。對樣品進行渦流攪拌，并且在室溫環(huán)境下避 光反應1小時。4吏用15毫升的2M的DTT (二辟b蘇糖醇)4中制 殘余的橫乙酰胺。從4毫升原料樣品中取出300微升用來進行膠 體分析。
使用裝配有IO倍微距鏡頭的Kodak DC280數(shù)碼相機拍才聶凝 月交的照片。使用Adobe Photoshop對該照片進行處理并且將照片 打印出來。4吏用干凈的刀片將凝膠切成33個凝膠薄片，同時標 記每個薄片上的切點位置。之后，將薄片放置于2毫升的離心管 中。在雙重隔離的生物安全拒中完成對所有樣品的進一步處理。 使用50%的甲醇和5°/。的乙酸將裝有凝膠薄片的管填充至2毫 升，并且再使用等量的50%的甲醇和5%的乙酸漂洗三次。倒出 褪色的溶液，并且在管中填充2毫升的乙腈。振蕩30分4中后， 倒出乙腈，取而代之的是100mM的碳酸氫銨。30分鐘之后，倒 出碳酸氫鈉溶液，并且在管中裝滿乙腈。將這種乙腈、碳酸氫銨 漂洗步驟重復進行一次。在消化反應之前倒出最后的乙腈洗液， 并且在真空離心濃縮系統(tǒng)(speedvac)中將凝膠薄片干燥30分鐘。 將裝有干燥的凝月交薄片的管置于冰上進4亍冷卻。在冰凍的50mM 碳酸氫銨中溶解Promega測序級胰蛋白酶，達到13.3毫克/毫升 的濃度。利用可重復^f吏用的移液器將125毫升的力夷蛋白酶溶液加 入到每個管的底部。使凝膠薄片在冰上溶脹15分鐘，在此之后
再向每個管中加入125毫升50mM的碳酸氫銨。然后將管密封， 并且在37。C下培養(yǎng)16小時。消化反應之后，向每個管中加入650 毫升50mM的碳酸氳銨。之后，在37。C下對樣品進行培養(yǎng)1小 時。取出第一批提取物，將其置于Axygen商標的1.5毫升的管 中，使用650毫升的碳酸氬銨進行第二次提取，并將得到的提取 物與第一批提取物混合。之后，把這些提取物凍干，同時使用650 毫升50%的乙腈以及0.1%的蟻酸進行兩次酸式提取。將所有提 取物冷凍至-80°C ,并且在ThermoSavant SC280真空離心濃縮 系統(tǒng)中在小于10mTorr(毫托)的壓力下凍干至千燥。將得到的 凍干物重新溶解于200毫升5%的乙腈以及0.1 %的蟻酸中。將適 當體積的每種提取物(1-6, 10毫升)(7-12, 20毫升)(13 -18, 35毫升)(19-33， 50毫升)加入到96孔i咅養(yǎng)斧反中，4吏其 接近蛋白體積摩爾濃度以及來自于每個凝膠分子量區(qū)域的蛋白， 將培養(yǎng)纟反冷凍至-80°C,并且再次凍干。將所有樣品重新溶解于 12毫升5%的乙腈以及O.l %的蟻酸中。
然后，對樣品進行質(zhì)譜分析，〗吏用來自于Thermofinnigan (菲 尼根)蛋白質(zhì)組X工作站的LCQ DECA XP plus (液相質(zhì)譜聯(lián)用 4義)。每運行一次分析，都使用Famos自動進樣器注入每種重新 構(gòu)建的樣品IO毫升，而分離的過程是在裝填有C18介質(zhì)的75毫 米內(nèi)徑xl8厘米高的柱中完成的，分離過程中的流速為每分鐘 235納升(nL)，這種流速是由帶有液體分流器的Surveyor液相 色譜輸液泵提供的，在90分鐘(2.5小時的運行)、180分鐘(4 小時的運行)、或者400分鐘(8小時的運行)中以梯度形式逐漸 供給5-60%的水，0.1%的蟻酸，乙腈，0.1%的蟻酸。
在對每組樣品進行分析之前，使用兩種標準的5 Angio混合 肽(Michrom Bio Resources )來確定柱的性能，并且》見察可能發(fā) 生的任《可潛在的轉(zhuǎn)移。在LCQ中對前五種構(gòu)型進4亍一次質(zhì)i普
(MS )掃描和五次串聯(lián)質(zhì)i普(MS/MS )掃描。將動態(tài)排阻(Dynamic exclusion) i殳置為1,時限為30秒。在Bioworks 3.1搜索軟件中 使用Suquest進行肽的識另'J 。在NCBI (美國國立生物4支術(shù)信息中 心)RefSeqHuman數(shù)據(jù)庫中，使用差式脲曱基半胱氨酸和氧化型 甲硫氨酸進行Sequential數(shù)據(jù)庫的檢索，在此之后使用差式修飾 4勿(differential modifications)進4亍進一步的檢索。4吏用Sequest 軟件在RefSeqHuman Gnomon predicted protein數(shù)據(jù)庫中進行二 級檢索。這一次，已知蛋白(實驗蛋白)和理論蛋白相吻合，不 需要將全部數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學顯著性進行折衷。當單電荷離子的 Xcorr (互相關(guān)系數(shù))為1.8，雙電荷離子的Xcorr為2.5,以及三 電荷離子的Xcorr為3.0時，并且delta CN ( ACN)值等于0.1， RSP值等于1時，選定肽打分臨界值。每種肽的互相關(guān)值確保其 在不同電荷的情況下《呆持高置^f言度的匹配，而delta CN ( ACN) 臨界值確保了相吻合的肽的唯一性。RSP值為l確保了肽在初級 打分時與最接近的肽相吻合，從而肽碎片文件只能與一種蛋白相 匹配。使用這種方法，識別出幾種人類的肽，但最重要的是，迄 今為止，我們能夠從六種被研究的尿液樣品中的三種中識別至少 五種結(jié)核分4支桿菌肽。上述被識別的肽序列中的 一 種 (MVIIELMRR-序列30)與結(jié)核分枝桿菌蛋白的推導序列具有 相同的同源性(附圖2 )[The Institute for Genomic Research( TIGR ) (染色體組研究學會)，以及SWISS-PROT/TrEMBL AC #033183]。 還識別到了其〗也四個序列，序列34，序列38,序列42，序列46， 分別表示于附圖5-附圖9中。這些肽序列是從6個結(jié)核患者的 尿液樣品中的3個樣品中發(fā)現(xiàn)的。從結(jié)核分枝桿菌染色體組DNA 中設計并合成PCR引物，并將其用來擴增編碼該蛋白的全長基 因。得到一個DNA片段(大約lkb)，在其5，端具有一個Nde I <立點，并且在其3，端具有一個Bam HI位點，并普遍用其來克隆 和表達上述基因。 實施例3:結(jié)核分枝桿菌重組蛋白的生產(chǎn)、純化以及定義
已經(jīng)做了大量的努力來生產(chǎn)、純化并且定義復制品重組蛋 白，這些重組蛋白是在肺結(jié)核患者尿液中發(fā)現(xiàn)的5種結(jié)核分枝桿 菌蛋白的復制品，如本發(fā)明所述。已經(jīng)獲得了這些蛋白中的三種 (MTP1694(序歹'j 42 ), MTP2462 (序歹'J 46 )),以及(MT2990(序 列38)),并且定義了它們的生化特性和生物特性。這三種蛋白是 從內(nèi)含體中純化出來的，其產(chǎn)量是每升誘導培養(yǎng)液中產(chǎn)生10到 15毫克的純化蛋白。附圖10描述了三種重組分子MT1694， MT2462以及MT2990在大腸桿菌中的過表達，并且表示出它們 在凝月史中發(fā)生遷移，遷移到與它們所預計的分子量(MW)相對 應的位置上。重組蛋白在含有6個組氨酸標簽的氨基末端殘基的 大腸桿菌BL-21(DE3)/pLysS宿主細胞中表達。使用Ni-NTA瓊脂 糖介質(zhì)通過親和層析對蛋白進行純化。使用SDS-PAGE (聚丙烯 酰胺凝膠電泳)(4 - 20 %的梯度聚丙烯酰胺凝膠)對純度進行評 價，并進行考馬斯亮藍染色。由于MT2990基因編碼一個分子量 為130.6 kDa的蛋白，作為重組蛋白，這是一個難以表達的分子 大小，因而克隆并且表達該分子的重疊形式/截短形式。附圖10 中描述的經(jīng)過克隆和表達的蛋白代表全長基因的一個片段，其跨 越了 100個氨基酸，結(jié)核分枝桿菌蛋白(MT2990)的上游氨基 酸序列以及下游氨基酸序列與在結(jié)核患者的尿液中發(fā)現(xiàn)的肽具 有相同的同源性。這個分子的片段被選定，因為這一部分蛋白是 穩(wěn)定的并且能夠4氐抗宿主的蛋白水解酶機制，因此是疫苗目標 物。
已經(jīng)生產(chǎn)出MTP1694以及MTP2462重組蛋白的兔類抗血 清，因此MT2990的抗血清可以-故生產(chǎn)并且已經(jīng)被生產(chǎn)出來。 MTP1694以及MTP2462的抗血清被用來驗證識別的蛋白是否是 真正的結(jié)核分枝桿菌分子，這個過程可以通過Western印跡分析
來完成，使用結(jié)核分枝桿菌抗原的粗抗原性樣品(全細菌細胞提
取物)以及培養(yǎng)濾液(CF )或者培養(yǎng)濾液抗原(由Dept. Microbiol. Immunol. Pathol.， Colorado State University, Fort Collins CO提 供)。在還原條件下，在4-20%的梯度凝膠中對抗原進行電泳分 析，將抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，之后使用兔類抗MTB1694 抗血清或者抗MT2462抗血清進《亍探測。 <吏用過氧化物酶標i己的 山羊4元兔類(goat - anti - rabbit)免疫^求蛋白對抗原的反應原性 進行探測，并且4吏用化學發(fā)光試劑(ECL)對其進行顯影。附圖 11表明，抗MTP1694抗血清在分4支桿菌裂解物以及培養(yǎng)濾液才羊 品中識別出一段大約37kDa的抗原(1號泳道和2號泳道)以及 所期望的重組蛋白(3號泳道)。與此相反，抗MTP2462抗血清 僅僅在細菌裂解物中識別出一段大約27kDa的抗原，并沒有在培 養(yǎng)濾液中識別出蛋白。兩個抗原的分子量區(qū)域都與預測的分子量 相匹配。除此之外，重組分子的分子量稍樣i:高于天然分子，這種 結(jié)果是可以預計的，因為除了含有天然分子所具有的序列之外， 重組分子還具有一段16個氨基酸的延伸(6個組氨酸形成的標 簽，^使其易于純化，以及一個凝血酶位點，由10個氨基酸組成， 用來清除組氨酸標簽)，來自于克隆載體。因此這些結(jié)果證明了 MTP1694以及MTP2462都是真正的結(jié)核分枝桿菌蛋白，是在細 菌生長的過程中凈皮積^ L的生產(chǎn)出來的。除此之外，由于抗原 MTP2694存在于培養(yǎng)濾液樣品中("結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白")， 這個結(jié)果表明該分子作為疫苗是有效的。
為了對識別出的抗原作為作用于人類的疫苗所產(chǎn)生的作用 進行評價，分析外周血單個核細胞(PBMC)對這些抗原的應答， 其中所述外周血單個核細胞來自于健康的純蛋白衍生物(^吏用純 蛋白衍生物對針對結(jié)核蛋白的應答進行皮下測試)陽性供體。迄 今為止，已經(jīng)使用MTP1694抗原和MTP2462抗原對四種^:康的 純蛋白衍生物陽性供體和一種純蛋白衍生物陰性供體進行了測
試。在這些測試進4亍的時候還無法獲得上面提及的重組蛋白
(MT29卯)。為了對抗原的識別進行測試，在使用重組抗原(5 微克/毫升)進行刺激之后，既要利用誘導擴增應答的抗原，也要 利用誘導生成干擾素-Y的抗原。通過[3H]TdR (氚-胸腺嘧啶 核苷)滲入法來測量擴增情況，測量結(jié)果使用每分鐘計婆t(CPM) 來表示。通過在培養(yǎng)上清液中進行夾心酶聯(lián)免疫吸附測定來測量 干擾素-Y。測量結(jié)果表示在附圖12A和12B中，上述結(jié)果表 明，在四個純蛋白衍生物陽性供體中，有三個陽性供體的外周血
單個核細胞能夠容易的識別上述兩種抗原。在來自于純蛋白衍生 物陰性供體的外周血單個核細胞中觀察不到應答。這些結(jié)果提示
了上述抗原能夠被含有高百分含量的健康的純蛋白衍生物的陽 性個體所識別H叚定的有抵抗力的)。除此之外，由于干擾素-
Y的生成伴隨著擴增應答的發(fā)生，MT1649和MT2462與針對結(jié) 核的保護相關(guān)，因此這些分子都是疫苗目標物。
這里引用的全部文獻、專利和/或?qū)＠暾埖南嚓P(guān)教導的全部 內(nèi)容在此引入作為參考。
下述專利文件中教導的全部內(nèi)容在此引入作為參考名稱為 "Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis antigens and their uses (結(jié)核分枝桿菌抗原的融合蛋白及其應用)"的美國專利 No.6627198;名稱為"Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use(用于進行結(jié)核診斷和免疫 治療的化合物及其使用方法)"的美國專利No.6613881;名稱為 "Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis (用于進4亍結(jié)核的it斷和免疫治療的化合物及方法)" 的美國專利No.6592877;名稱為"Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods of their uses (用于進4亍結(jié)^ti貪斷的4t合 物及其4吏用方法)"的美國專利No.6555653;名稱為"Fusion
proteins of Mycobacterium tuberculosis antigens and their uses (結(jié) 核分4支桿菌抗原的融合蛋白及其應用)"的美國專利No.6544522; 名稱為 "Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis (診 斷結(jié)核的化合物及方法)"的美國專利No.6458366;名稱為 "Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis (診斷結(jié)核 的化合物及方法)"的美國專利No.6338852;以及名稱為 "Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis (用于進行結(jié)核的"^斷和免疫治療的化合物及方法)" 的美國專利No.6290969。
盡管本發(fā)明參照優(yōu)選的實施方式進行了詳細的公開和描述， 本領(lǐng)域r汰術(shù)人員應該理解，在其基礎(chǔ)之上對細節(jié)和形式上進4亍的 任何改變都不會背離由隨后的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽分子，包括結(jié)核分枝桿菌抗原的免疫原部分，或者所述抗原的變體的免疫原部分，該變體的區(qū)別僅僅在于發(fā)生了保守性替代和/或修飾，其中所述抗原具有選自下面組中的氨基酸序列a)由核酸分子編碼的氨基酸序列，其中所述核酸分子具有序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的序列、或者上述序列的組合所形成的序列；b)由核酸分子編碼的氨基酸序列，其中所述核酸分子具有序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的編碼區(qū)域、或者上述序列的組合所形成的編碼區(qū)域；c)由序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的互補序列、或者上述序列的組合所形成的序列的互補序列編碼的氨基酸序列；d)由核酸分子編碼的氨基酸序列，其中所述核酸分子與序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的序列、或者上述序列的組合所形成的序列進行了雜交；以及e)序列2、序列4、序列6、序列8、序列1O、序列12、序列14、序列16、序列18、序列20、序列22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列34、序列36、序列38、序列40、序列42、序列44、序列46、序列48所示的氨基酸序列、或者具有上述序列的組合所形成的氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多肽分子，其中所述的分離的 多肽分子在宿主體內(nèi)刺激免疫原特異性結(jié)核細菌(TB )應答。
3. —種分離的多肽分子，包括結(jié)核分枝桿菌抗原的免疫原部 分，其中所述抗原具有選自下面組中的氨基酸序列a)由 核酸編碼的氨基酸序列，其中所述4t酸與序列1、序列3、 序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列 17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列 29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列 41、序歹'J43、序列45、序列47所示的序列、或者上述序列 的組合所形成的序列具有大于或者等于大約70 %的序列同 一性；b)由核酸分子編碼的氨基酸序列，其中所述核酸分 子與序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序 列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序 列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、序 歹'J 37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47/斤示 序列的編碼區(qū)域、或者上述序列的組合所形成的序列的編碼 區(qū)i或具有大于或者等于大約70%的序列同一性；c)由互補 序列編碼的氨基酸序列，其中所述互補序列與序列1、序列 3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、 序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、 序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、 序歹'J41、序歹ij 43、序歹寸45、序歹'J 47戶斤示的序歹'J、或者上述 序列的組合所形成的序列具有大于或者等于大約70%的序 列同一性；d)由核酸分子編碼的氨基酸序列，其中所述核 酸分子與雜交于序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、 序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、 序歹'J 23、序列25、序歹'J 27、序列29、序歹'J 31、序列33、 序歹'J 35、序歹'J 37、序列39、序列41、序列43、序列45、大約70%的同一性；以及e)與序列2、序列4、序列6、序 列8、序列10、序列12、序列14、序列16、序列18、序列 20、序列22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列 32、序列34、序列36、序列38、序列40、序列42、序列 44、序列46、序列48聲斤示的序列、或者具有上述序列的纟且 合所形成的序列具有大于或者等于大約7 0 %相似性的氨基 臥復序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多肽分子，其中所述的分離的 多肽分子在宿主體內(nèi)剌激免疫原特異性結(jié)核細菌應答。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多肽分子，其中所述的核酸分 子分別與所述的序列具有大于或者等于大約80%的同一性 或者相似性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的多肽分子，其中所述的核酸分 子分別與所述的序列具有大于或者等于大約90%的同一性 或者相4以小生。
7.—種編碼多肽分子的分離的核酸分子，其中所述的多肽分子 包4舌結(jié)核分枝桿菌抗原的免疫原部分，或者所述抗原的變體 的免疫原部分，該變體的區(qū)別僅僅在于發(fā)生了保守性替代和 /或4務飾，其中編碼所述抗原的核酸分子具有選自下面組中的 序列a)序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、 序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、 序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、 序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所 示的序列，或者上述序列的組合序列；b)序列l(wèi)、序列3、 序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、序列 17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、序列 29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、序列 41、序歹'J43、序列45、序列47所示序列的編石馬區(qū)i或、或者 上述序列的組合所形成的序列的編碼區(qū)域；c)序列1、序列 3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列15、 序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列27、 序歹ij 29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列39、 序列41、序列43、序列45、序列47所示序列的互補序列、 或者上述序列的組合所形成的序列的互補序列；d)與序列1、 序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列 15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列 27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列 39、序列41、序列43、序列45、序列47所示的序列、或者 上述序列的組合所形成的序列進行雜交的序列；以及e)編 石馬序列2、序列4、序列6、序列8、序列10、序列12、序 列14、序列16、序列18、序列20、序列22、序列24、序 列26、序列28、序列30、序列32、序列34、序列36、序 歹'J 38、序列40、序列42、序列44、序列46、序列48所示 的序列、或者編碼上述序列的組合序列的序列。
8. 才艮據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的核酸分子，其中所述的分離的 核酸分子編碼的多肽分子在宿主體內(nèi)刺激免疫原特異性結(jié) 核應答。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的核酸分子，其中所述的核酸分 子是RNA分子。
10. —種編碼多肽分子的分離的核酸分子，其中所述的多肽分子 包括結(jié)核分枝桿菌抗原的免疫原部分，其中編碼所述抗原的%的同一性a)序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、 序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、 序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、 序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、 序列47所示的序列，或者上述序列的組合序列；b)序列1、 序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、序列 15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、序列 27、序列29、序列31、序列33、序列35、序列37、序列 39、序列41、序列43、序列45、序列47所示序列的編石馬區(qū) 域、或者上述序列的組合所形成的序列的編碼區(qū)域；c)序 列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、序列13、 序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、序列25、 序列27、序歹ij 29、序歹'J 31、序列33、序列35、序列37、 序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所示序列的 互補序列、或者上述序列的組合所形成的序列的互補序列； d)與序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序列11、 序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序列23、 序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序列35、 序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、序列47所 示的序列、或者上述序列的組合所形成的序列進4亍雜交的序 歹'J;以及e)編石馬序列2、序列4、序列6、序列8、序歹'J 10、 序列12、序列14、序列16、序列18、序列20、序列22、 序歹'J 24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列34、 序列36、序列38、序列40、序列42、序列44、序列46、 序列48所示的序列、或者編碼上述序列的組合序列的序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離的核酸分子，其中所述的核酸 分子與所述序列具有大于或者等于大約80%的同一性。
12. 才艮據(jù)權(quán)利要求16所述的分離的核酸分子，其中所述的核酸 分子與所述序列具有大于或者等于大約90%的同一性。
13. —種載體或者質(zhì)粒，其中包括權(quán)利要求7所述的核酸分子。
14. 一種宿主細月包，其<吏用權(quán)利要求7所述的核酸序列進行轉(zhuǎn)染。
15. —種抗體，其與權(quán)利要求1所述的多肽相結(jié)合。
16. —種融合蛋白，包4舌選自下面組中的多肽a)斥又利要求1 中所述的多肽中的至少一種；b)權(quán)利要求1中所述的多肽 中的至少兩種；c)權(quán)利要求1中所述的多肽中的至少一種， 和一種已知的結(jié)核分枝桿菌抗原；以及d)權(quán)利要求1中所 述的多肽中的至少一種，和一種存在于主要組織相容性復合 體2級分子中的結(jié)核分枝桿菌抗原。
17. 刺激個體中的特異性免疫原性結(jié)核應答、或者預防或緩解結(jié) 核疾病的嚴重禾呈度的方法，該方法包4舌施用 一定量4又利要求 1中所述的一種或者一種以上多肽分子。
18. 才艮據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的多肽分子或者核 酸分子通過載體進4亍施用。
19. 剌激個體中的特異性免疫原性結(jié)核應答、或者預防或緩解結(jié) 核疾病的嚴重程度的方法，該方法包括施用一定量權(quán)利要求 7中所述的一種或者一種以上核酸分子。
20. 對個體的結(jié)核疾病的治療進行監(jiān)控的方法，該方法包括a) 在來自于所述個體的樣品中探測權(quán)利要求1中所述的一種或 者一種以上多肽分子的水平；并且b)將上述一種或者一種 以上分子的水平與標準水平進行比較；其中高于標準水平的 分子水平表明該治療是無效的，而低于或者等于標準水平的 水平表明該治療是有效的。
21. 對個體的結(jié)核疾病的治療進行監(jiān)控的方法，該方法包括a) 在不止一個時間點上探測樣品中存在的權(quán)利要求1中所述的 一種或者一種以上多肽分子的水平；并且b)將上述一個或 者一個以上時間點上探測到的水平進行比較，其中分子水平 的增加表明該治療是無效的，而分子水平的降低或者不變則 表明該治療是有效的。
22. 在個體中診斷結(jié)核疾病的方法，該方法包括探測權(quán)利要求1 中所述的一種或者一種以上多肽分子是否存在。
23. 區(qū)分個體內(nèi)結(jié)核疾病以及對結(jié)核疾病的免疫性的方法，該方 法包括a)探測權(quán)利要求1中所述的一種或者一種以上多 肽分子的存在或缺失；以及b)測定個體中結(jié)核特異性免疫 應答的刺激作用。
24. 才艮據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中測定個體中結(jié)核特異性 免疫應答的剌激作用包4舌測定來自于所述個體的^f羊品中的 細胞擴增，白細胞介素-12的生成，干擾素-Y的水平，或 者上述因素的組合。
25. 在生物才羊品中探測結(jié)核分^支桿菌感染的方法，該方法包4舌測 定所述樣品中是否存在4又利要求1所述的一種或者一種以上 多肽分子，該分子的存在表明存在結(jié)核分枝桿菌感染；而該 分子的不存在則表明不存在結(jié)核分^U干菌感染。
26. 在生物樣品中纟果測結(jié)核分枝桿菌感染的方法，該方法包括 a)爿夸才羊品與一種抗體相接觸，所述抗體與^又利要求1所述 的多肽分子相結(jié)合，使樣品與抗體充分接觸形成復合體，從 而得到抗原-抗體復合體；并且b )纟采測所述抗原-抗體復 合體；其中，上述復合體的存在則表明結(jié)核分枝桿菌感染的 存在，上述復合體的不存在則表明結(jié)核分枝桿菌感染的不存 在。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抗體是經(jīng)過可探測 寸生才示i己的。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中該方法進一步包括將樣 品與第二抗體相^妄觸，所述第二抗體對所述抗原或者抗原-抗體復合體具有特異性。
29. 才艮據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的多肽或者抗體結(jié) 合于固體載體之上。
30. 才艮據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的生物樣品是尿液。
31. 在生物樣品中探測結(jié)核分枝桿菌感染的方法，該方法包括 a)在聚合酶鏈式反應中使該樣品與至少兩個寡核苷酸引物 進4亍接觸，其中至少一個寡核苷酸引物對于權(quán)利要求7中的 一種或者一種以上分離的核酸分子是具有特異性的，能夠充 分允i午該引物進4亍擴增；并且b)探測該才羊品中擴增的核酸 序列；其中，存在擴增的核酸序列，則表明結(jié)核分枝桿菌感 染的存在，不存在擴增的核酸序列，則表明結(jié)核分枝桿菌感 染的不存在。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的至少一個寡核苷 酸引物包括至少大約IO個連續(xù)的堿基。
33. 在生物才羊品中纟笨測結(jié)一亥分4支才干菌感染的方法，該方法包4舌 a)使該樣品與一種或者一種以上寡核苦酸探針進行接觸， 所述寡核苷酸探針在高度嚴格的條件下特異于權(quán)利要求7中 的核酸分子，充分允許樣品與4果針發(fā)生雜交；并且b)在樣 品中探測與所述寡核苷酸探針進行雜交的核酸分子；其中， 存在探針的雜交則表明結(jié)核分枝桿菌感染的存在，不存在探 針的雜交則表明結(jié)核分枝桿菌的不存在。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的探針包括至少大 約15個連續(xù)的堿基。
35. —種組合物，包括權(quán)利要求1所述的多肽序列和生理可接受 性載體。
36. 才艮據(jù)權(quán)利要求35所述的組合物，其進一步包括免疫應答增 強劑。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述的免疫應答增強 劑是佐劑或者其他的結(jié)核抗原。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述的組合物是疫苗 組合物。
39. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述的佐劑包括選自 3D-MPL和QS21中的至少一種纟且分。
40. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述的組合物被制成 7jc包油乳液的形式。
41. 才艮據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述的免疫應答增強 劑是免疫刺激性細胞因子或者趨化因子。
42. —種用于診斷人體是否患有結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒，所 述試劑盒包括用來探測權(quán)利要求1所述的多肽分子的一種或 者一種以上試劑。
43. —種試劑盒，包4舌a) —種或者一種以上核酸分子，所述 核酸分子具有序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、序 列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、序 歹'J 23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、序 歹'J 35、序歹'J 37、序歹'J 39、序列41、序列43、序歹'J 45、序 列47所示的序列，或者上述序列的組合序列；上述序列的 互4卜序列，以及與序列1、序列3、序列5、序列7、序列9、 序列11、序列13、序列15、序列17、序列19、序列21、 序列23、序列25、序列27、序列29、序列31、序列33、 序列35、序列37、序列39、序列41、序列43、序列45、 序列47所示的序列、或者上述序列的組合序列進4于雜交的 才亥酸序列；以及b)探測-試劑。
44. 一種藥物組合物，包括權(quán)利要求1所述的多肽，以及載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的結(jié)核(TB)抗原，所述的結(jié)核抗原能夠被有效應用于刺激結(jié)核(TB)特異性免疫應答的治療組合物和疫苗組合物中。上述被鑒定的抗原同樣可以有效的應用于診斷檢測中，用以確定個體中的活性結(jié)核的存在。因此，本發(fā)明包括多肽分子，核酸分子，疫苗組合物，診斷檢測，以及對這些結(jié)核(TB)抗原的診斷方法，和對于針對這些結(jié)核(TB)抗原的治療方法的監(jiān)控。
文檔編號G01N33/569GK101365714SQ200680026910
公開日2009年2月11日 申請日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月1日
發(fā)明者安東尼奧·坎波斯-尼托, 蘇利·S·凱什諾 申請人:福賽特兒童口腔醫(yī)院