專利名稱：：通過測量維生素e-相關(guān)的代謝物診斷結(jié)腸直腸癌和卵巢癌的方法通過測量維生素E-相關(guān)的代謝物診斷結(jié)腸直腸癌和卵巢癌的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及結(jié)腸直腸癌和卵巢癌(分別為CRC禾卩OC)的診斷。本發(fā)明描述內(nèi)源小分子和CRC或OC之間的關(guān)系。具體地，本發(fā)明涉及通過測量維生素E-相關(guān)的代謝物而診斷CRC和OC。本發(fā)明還涉及在所述方法中鑒定的診斷標(biāo)記。發(fā)明背景結(jié)腸直腸癌是世界上第三大最常見的惡性病，并且代表大約10%的世界總癌癥發(fā)生率[l]。由于世界范圍人口的老齡化，CRC代表一種嚴重的公眾健康問題，其需要將這種疾病的影響減小到最低的新的措施。CRC的存活機會與診斷時疾病的階段非常相關(guān)(如在表1中顯示；http:〃www.alternative-cancer-treatments,com/colon畫cancer-prognosis,htm);診斷越早，存活的可能性越大。例如，當(dāng)在疾病時限末期診斷時(杜克階段D)，存在小于5%的5年存活的機會，而當(dāng)在早期診斷時(杜克階段A)，存在大于90%的5年存活機會。因此，由于早期手術(shù)治療的效用，CRC患者將極大地受益于早期檢測。目前，CRC的危險因子尚未得到充分的理解。事實上，除了日常飲食之外，對于所述疾病幾乎沒有確定具體的危險因子。炎性腸病和家族性腺瘤息肉病(FAP)增加危險，但是只占總的CRC發(fā)生率的很小部分。由于在移民和他們的后代中的發(fā)生率上升很快，達到東道國的發(fā)生率，所以種族和人種差異，以及移民研究，表明環(huán)境因素在疾病病因?qū)W中起作用[2,3]?？傊陀?5%的CRC病例是家族性的，這表明日常飲食、環(huán)境和生活方式對所述疾病的病因有巨大的影響。目前最常見的CRC篩查檢測為1)大便潛印血檢測(fecaloccultbloodtest)(FOBT)，其基于這樣的假設(shè)，即，癌癥應(yīng)該出血，并且因此可以使8用化學(xué)或免疫學(xué)檢測在大便中檢測到；和2)鑒定肥胖異常(grossabnormalities)的侵入性方法。FOBT是用于CRC的最廣泛的檢測，并且包括血紅蛋白中血紅素的過氧化酶樣活性的初步檢測。然而，由于不是所有的腺瘤和CRCs都出血的事實，所以所述檢測的靈敏性只有大約50%，對于腺瘤有20%靈敏性[2]。鑒定肥胖異常的方法可以包括靈活的乙狀結(jié)腸鏡檢查和結(jié)腸鏡檢査，以及雙重對比的鋇灌腸和仿真結(jié)腸鏡檢査。結(jié)腸鏡檢査是用于具有陽性FOBT的患者的下一步檢測，并且具有80%的假陽性率，這對許多個體施加了不必要的風(fēng)險和危險。結(jié)腸鏡檢查通常是用于篩査患有CRC病史或先前的腺瘤息肉病，或其它易患疾病諸如炎性腸病的超過50歲的平均和增加的危險的個體的優(yōu)選方法。沒有證據(jù)表明只使用結(jié)腸鏡檢査的篩査在平均-危險群體中減小發(fā)病率或死亡率[3]，然而，乙狀結(jié)腸鏡檢査和包括上述技術(shù)組合的綜合評估可以減小超過給定的時間長度的更高危險性個體中的預(yù)見的CRC率[4]。盡管結(jié)腸鏡檢査仍然是存在或不存在息肉病和CRC的標(biāo)準(zhǔn)檢測，它可能未察覺15%的直徑>1cm的損傷[5]。使用結(jié)腸鏡檢查的并發(fā)癥可能包括穿孔、出血、呼吸微弱、心律失常、和感染[6]。大約1/1,000的患者患有穿孔，和3/1,000的患者患有出血。在10,000例檢測中有1-3例死亡是因為所述方法而發(fā)生[3]。其它缺點，諸如缺少經(jīng)過訓(xùn)練的人員、患者不適、和高成本，將可能阻止所述結(jié)腸鏡檢查成為用于一般群體的常規(guī)CRC篩查方法(見表2)。認為大部分偶發(fā)性CRCs是從良性腺瘤發(fā)展的，這些良性腺瘤中只有少量將不斷發(fā)展成惡性瘤。假定從良性腺瘤到惡性瘤發(fā)展的時間階段是5到10年，那么通過結(jié)腸鏡檢查/乙狀結(jié)腸鏡檢査在一般群體中檢測腺瘤將需要對患者進行明顯的過度治療，這是成本高的并且潛在有害的[7]。計算機體層攝影結(jié)腸術(shù)(CTC)，或虛結(jié)腸鏡檢査，是用于結(jié)腸成像的最近的非侵入性技術(shù)，主要由于在患者制備物中和分析所用的硬件與元件的技術(shù)差別，在關(guān)于所述檢測的性能特點上有顯著不同的報道(特異性在.39%-94%之間)。CTC的其它局限性包括高的假陽性讀數(shù)，不能檢測扁平腺瘤，沒有去除息肉的能力，反復(fù)和累積的放射給藥，和成本[6]。隨著我們理解CRC的分子病理學(xué)的進步，已經(jīng)出現(xiàn)了一些基于大便樣品DNA分析的新篩查方法。這些是用于鑒定已知發(fā)生在腺瘤-到-癌癥序列中或發(fā)生在家族CRC中的突變的典型的基于PCR的檢測。常規(guī)篩選的基因突變包括""&7P5J,^PC，以及檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和高度甲基化的DNA。表2，由Davies等重現(xiàn)[7]，比較了目前用于CRC的篩查方法。上述所有方法都典型地只能檢測腺瘤形成后的CRC，并且通常不理想地適用于大規(guī)模群體篩查。上述檢測中沒有一種提供CRC-陽性或陰性促進環(huán)境的定量評估。上述檢測的任一種都沒有提供CRC對于正常人生物化學(xué)和相關(guān)健康狀態(tài)的作用的定量評估?；诨蚪M的檢測是否將導(dǎo)致對于偶發(fā)性CRC的高診斷準(zhǔn)確率尚待觀察。Davies等[7]概括了用于CRC的理想的篩查檢測的特點，如下1)成本低;2)實行簡單；3)非侵入性；4)描述整個結(jié)腸；5)明確的結(jié)果解釋(即，高靈敏性，特異性，陽性預(yù)測值,和陰性預(yù)測值);6)容易教導(dǎo)；和7)容易保持質(zhì)量控制。由于能夠檢測特異性代謝物的檢測的開發(fā)相對簡單并且每次檢測成本低，所以基于血清中的小分子或代謝物的診斷檢測滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。所述檢測將是最低程度侵入性的，并且將是疾病狀態(tài)的指征而不管結(jié)腸的臨近性。將所述方法轉(zhuǎn)換成與當(dāng)前臨床化學(xué)實驗室硬件相容的臨床檢測將是商業(yè)可接受的和有效的，并且將導(dǎo)致快速的世界范圍內(nèi)的應(yīng)用。此外，將消除對操作和解釋檢測的高度訓(xùn)練過的人員的需要。在人血清中的CRC-特異性生物標(biāo)記，其可以提供CRC存在的評估，CRC-促進或抑制性環(huán)境的評估，CRC生理負擔(dān)的評估，或這些特點的組合的評估，將極大地有利于CRC危險、預(yù)防和治療的管理。由于它將是最低程度侵入性的，并且可能在釆用常規(guī)篩査方法之前或者與常規(guī)篩査方法組合用于監(jiān)測個體對疾病的敏感性，所以設(shè)計成檢測這些生物標(biāo)記的檢測將被一般群體廣泛接受。卵巢癌是在婦女中癌癥死亡的第五最重要的原因[8]。據(jù)估計今年將診斷超過22,000例新卵巢癌病例，只在美國就預(yù)計有16，210例死亡[9]。典型地，直到患者己經(jīng)達到第m或iv階段卵巢癌才能被鑒定，并且具有低的預(yù)后(5年存活大約25-30%)[10]。目前用于卵巢癌的篩查方法包括雙手骨盆檢查、透過陰道的超聲檢査和血清CA125檢測的結(jié)合[9]。由于缺少所述篩査減小死亡率的證據(jù)，并且它沒有詳細檢查與假陽性結(jié)果相關(guān)的危險，所以這種用于卵巢癌的篩査方法的功效目前益處是未知的[8,ll]。按照美國癌癥協(xié)會(AmericanCancerSociety),CA125檢測和透過陰道的超聲檢查不是卵巢癌的可靠的篩查或診斷檢測，并且當(dāng)前唯一用于進行精確診斷的方法是外科手術(shù)(http:〃www.cancer.org)。CA125,癌癥抗原-125，是一種高分子量黏蛋白，與正常細胞相比，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在大部分卵巢癌細胞中升高[9]。高于30-35U/ml的CA125檢測結(jié)果被典型地接受為處于升高的水平[9]。由于定義升高的CA125的不同的閾值，檢測的患者組的變化的大小，和患者年齡與種族的廣泛范圍，很難確定用于卵巢癌的CA125篩查的精確性、靈敏性和特異性[8]。按照約翰霍普金斯大學(xué)的病理學(xué)網(wǎng)頁，CA125檢測只在約50%的第I階段患者中，和在約80%的第II、III和IV階段中獲得準(zhǔn)確的卵巢癌陽性結(jié)果(http:〃pathology2.jhiLedu)。己經(jīng)報道子宮內(nèi)膜異位、良性卵巢囊腫、骨盆炎病以及甚至懷孕的第一個三個月增加CA125的血清水平[ll]。美國全國衛(wèi)生研究所網(wǎng)頁陳述CA-125不是卵巢癌的有效的通用篩査檢測。他們報道在100名具有升高的CA125水平的健康婦女中只有大約3名真正發(fā)現(xiàn)患有卵巢癌，并且約20%的診斷為卵巢癌的患者實際上具有升高的CA1257JC平(http:〃www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/007217.htm)。因此，由于所述檢測是非侵入性的，并且可以用于在常規(guī)方法之前或與常規(guī)方法結(jié)合監(jiān)測個體對疾病的敏感性，所以，鑒定在人血清中的高度特異性和靈敏性的卵巢癌生物標(biāo)記將是極其有益的。血清檢測是最低程度侵入性的，并且將被一般群體廣泛接受。發(fā)明概述在本發(fā)明的一個實施方案中，提供鑒定用于診斷CRC和OC的代謝物標(biāo)記的方法，其包括步驟將來自表現(xiàn)出所述疾病狀態(tài)的患者的樣品，所述樣品含有多種未鑒定的代謝物，引入到高分辨率質(zhì)譜儀中，例如，傅里葉變換離子回旋加速共振質(zhì)譜儀(FourierTransformIonCyclotronResonanceMassSpectrometer(FTMS));獲得、鑒定并且定量關(guān)于所述代謝物的數(shù)據(jù)；生成所述鑒定和定量的數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫；將來自所述樣品的鑒定和定量數(shù)據(jù)與來自對照樣品的相應(yīng)的數(shù)據(jù)進行比較；鑒定有差別的一種或多種代謝物；并且選擇最佳診斷所需要的最少數(shù)目的代謝物標(biāo)記。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供用于研發(fā)診斷生物體的健康狀態(tài)的代謝物生物標(biāo)記檢測的方法，其包括獲得來自多種健康狀態(tài)的生物體的生物樣品；將所述生物樣品引入到高分辨率/精確質(zhì)量質(zhì)譜儀中，以獲得關(guān)于在所述生物樣品中包含的代謝物的鑒定和定量數(shù)據(jù)，從而找到在多種健康狀態(tài)之間在強度上不同的代謝物；應(yīng)用多變量統(tǒng)計學(xué)鑒定區(qū)分所述健康狀態(tài)必需的最小的生物標(biāo)記組；應(yīng)用獨立的MS方法驗證這些生物標(biāo)記；并且產(chǎn)生用于檢測被鑒定和驗證的生物標(biāo)記目標(biāo)性高通量方法。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供鑒定結(jié)腸直腸癌-特異性代謝標(biāo)記的方法，其包括步驟將來自診斷患有結(jié)腸直腸/卵巢癌的患者的樣品，所述樣品包含多種未鑒定的代謝物，引入到傅里葉變換離子回旋加速共振質(zhì)譜儀(FTMS)中；獲得關(guān)于所述代謝物的鑒定和定量數(shù)據(jù)；生成所述鑒定和定量數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫；將來自所述樣品的鑒定和定量數(shù)據(jù)與來自對照樣品的相應(yīng)的數(shù)據(jù)進行比較；鑒定有不同的一種或多種代謝物；其中所述代謝物選自由在表3中所示的一種或多種代謝物、或其片段或衍生物組成的組。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供鑒定結(jié)腸直腸癌-特異性代謝標(biāo)記的方法，其包括步驟將來自診斷患有結(jié)腸直腸/卵巢癌的患者的樣品，所述樣品包含多種未鑒定的代謝物，引入到傅里葉變換離子回旋加速共振質(zhì)譜儀(FTMS)中；獲得關(guān)于所述代謝物的鑒定和定量數(shù)據(jù)；生成所述鑒定和定量數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫；將來自所述樣品的鑒定和定量數(shù)據(jù)與來自對照樣品的相應(yīng)的數(shù)據(jù)進行比較；鑒定有不同的一種或多種代謝物；其中所述代謝物選自由下列各項組成的組具有或基本上等于446.3406，448.3563，450.3726,464.3522，466.3661,468.3840,538.4259,592.4711和594.4851的以道爾頓測量的中性精確質(zhì)量和在圖13-21中任一附圖中所示的LC-MS/MS片段模式的代謝物或其片段或衍生物；并且選擇最佳診斷所需的最小數(shù)目的代謝物標(biāo)記。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供鑒定卵巢癌-特異性代謝標(biāo)記的方法，其包括步驟將來自診斷患有結(jié)腸直腸/卵巢癌的患者的樣品，所述樣品包含多種未鑒定的代謝物，引入到傅里葉變換離子回旋加速共振質(zhì)譜儀(FTMS)中；獲得關(guān)于所述代謝物的鑒定和定量數(shù)據(jù)；生成所述鑒定和定量數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫；將來自所述樣品的鑒定和定量數(shù)據(jù)與來自對照樣品的相應(yīng)的數(shù)據(jù)進行比較；鑒定有不同的一種或多種代謝物；其中所述代謝物選自由下列各項組成的組具有或基本上等于446.3406,448.3563,450.3726,464.3522,466.3661,468.3840，538.4259,592.4711和594.4851的以道爾頓測量的精確中性質(zhì)量(neutralmass)和在圖13-21中任一附圖中所示的LC-MS/MS片段模式的代謝物或其片段或衍生物；并且選擇最佳診斷所需的最小數(shù)目的代謝物標(biāo)記。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供CRC/OC癌癥-特異性代謝物標(biāo)記，其選自在表3中列出的代謝物或其片段或衍生物。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供CRC/OC癌癥-特異性代謝物標(biāo)記，其選自由下列各項組成的組具有或基本上等于446.3406，448.3563,450.3726,464.3522,466.3661,468.3840,538.4259,592.4711禾P594.4851的精確中性質(zhì)量(以道爾頓測量)的代謝物，或其片段或衍生物，其中+/-5ppm的差別將指示相同的代謝物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供結(jié)腸直腸/卵巢癌-特異性代謝物標(biāo)記，其選自由下列各項組成的組具有或基本上等于446.3406，448.3563，450,3726,464.3522,466.3661,468.3840，538.4259，592.4711和594.4851的以道爾頓測量的精確中性質(zhì)量和在圖13-21中任一附圖中所示的LC-MS/MS片段模式的代謝物或其片段或衍生物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供結(jié)腸直腸/卵巢癌-特異性代謝物標(biāo)記，其選自由具有下列分子式的代謝物組成的組C28H4604，C28H4804,C28H50O4,C28H4805，C28H50O5,C28H5205,C32H5806,C36H6406和C36H6606。在本發(fā)明的另一個方面，提供診斷患者存在結(jié)腸直腸或卵巢癌或者處于發(fā)展CRC或OC的危險中的方法，其包括步驟篩查來自所述患者的樣品存在或不存在一種或多種代謝物標(biāo)記，所述代謝物標(biāo)記選自由在表3列出的代謝物或其片段或衍生物組成的組，其中在一種或多種所述代謝物標(biāo)記強度中的差別指示CRC或OC的存在。在本發(fā)明這一方面的另一個實施方案中，提供診斷患者存在結(jié)腸直腸或卵巢癌的方法，其包括步驟篩查來自所述患者的樣品存在或不存在一種或多種代謝物標(biāo)記，所述代謝物標(biāo)記選自由具有或基本上等于446.3406,448.3563,450.3726，464.3522,466.3661,468,3840，538.4259,592.4711和594.4851的精確中性質(zhì)量的代謝物組成的組；其中一種或多種所述代謝物標(biāo)記的不存在指示CRC或OC的存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供診斷在未知疾病狀態(tài)的測試受試者中存在或不存在CRC或OC的方法，其包括從所述測試受試者獲得血液樣品；分析所述血液樣品，以獲得關(guān)于選自由下列各項組成的組的分子的定量數(shù)據(jù)鑒定為中性精確質(zhì)量446.3406,448.3563,450.3726,464.3522,466.3661,468.3840,538.4259,592.4711和594.4851的分子，或具有基本上等于這些分子的質(zhì)量的分子或其片段或衍生物；將在所述測試受試者中關(guān)于所述分子獲得的定量數(shù)據(jù)，與從來自多名CRC或OC-陽性的人的所述分子獲得的定量數(shù)據(jù)或從多名CRC或OC-陰性的人獲得的定量數(shù)據(jù)進行比較；并且應(yīng)用所述比較，來確定所述測試受試者是CRC/OC陽性或陰性的概率。本發(fā)明還公開維生素E樣代謝物的鑒定，所述維生素E樣代謝物在CRC-和OC-陽性患者的血清中相對健康對照差異性地表達。這種公開的差異性表達是CRC和OC特異性的。在本發(fā)明的一個實施方案中，應(yīng)用選自由維生素E樣代謝物組成的組的代謝物最佳子集研發(fā)的血清檢測，可以用來診斷CRC/OC的存在、或者CRC或OC-促進或抑制環(huán)境的存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，應(yīng)用選自由維生素E樣代謝物組成的組的代謝物最佳子集研發(fā)的血清檢測，可以用來診斷由診斷患有CRC的患者的治療作用而導(dǎo)致的CRC健康狀態(tài)。治療可以包括化學(xué)治療、手術(shù)、放射治療、生物治療、或其它治療。在本發(fā)明的另一個實施方案中，應(yīng)用選自由維生素E樣代謝物組成的組的代謝物最佳子集研發(fā)的血清檢測，可以用來縱向監(jiān)測處于CRC治療的患者的CRC狀態(tài)，以確定用于所述患者的適當(dāng)?shù)膭┝炕蛱貏e的治療。本發(fā)明還公開其中的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)被還原的Y-生育酚/生育三烯酚(tocotrienol)代謝物的鑒定，所述其中的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)被還原的Y-生育酚/生育三烯酚代謝物相對于健康對照在CRC-和OC-陽性患者的血清中差異性表達。所述公開的差異性表達是CRC和OC特異性的。本發(fā)明公開在人血清中存在這樣的，生育酚/生育三烯酚代謝物，艮口，其中存在附著到含有羥基苯并二氫吡喃結(jié)構(gòu)的-OC2H5，-OC4H9,或-OC8H17部分。本發(fā)明還公開a-生育酚代謝物的鑒定，其相對于健康對照在CRC-陽性患者的血清中差異性地表達。所述公開的差異性表達是CRC特異性的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供鑒定和診斷將受益于抗氧化劑治療的個體的方法，其包括從所述測試受試者獲得血液樣品；分析所述血液樣品，以獲得關(guān)于生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物種類的代謝衍生物的全體或子集的定量數(shù)據(jù)；將在所述測試受試者中關(guān)于所述分子獲得的定量數(shù)據(jù)與從多名CRC-或OC-陰性的人的分析獲得的參考數(shù)據(jù)進行比較；并且應(yīng)用所述比較來確定所述測試受試者將受益于所述治療的概率。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供確定受試者處于發(fā)展OC或CRC的危險的概率的方法，其包括獲得來自無CRC或OC癥狀的受試者的血液樣品；分析所述血液樣品，以獲得關(guān)于生育酚、生育三烯酚、或所述代謝物種類的代謝衍生物的全體或子集的定量數(shù)據(jù)；將在所述測試受試者中獲得的關(guān)于所述分子的定量數(shù)據(jù)與從多名CRC-或OC-陰性的人的分析獲得的參考數(shù)據(jù)進行比較；應(yīng)用所述比較來確定所述測試受試者處于發(fā)展OC或CRC的危險的概率。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供診斷這樣的個體的方法，即，所述個體應(yīng)答設(shè)定預(yù)防、治愈或穩(wěn)定CRC或OC或者改善與CRC或OC相關(guān)的癥狀的日常飲食、化學(xué)或生物治療策略，所述方法包括通過單次收集或隨時間的多次收集從所述測試受試者獲得一份或多份血液樣品；分析所述生物樣品，以獲得關(guān)于生育酚、生育三烯酚、維生素E樣分子、或所述代謝物種類的代謝衍生物的全體或子集的定量數(shù)據(jù)；將在所述測試受試者樣品中關(guān)于所述分子獲得的定量數(shù)據(jù)與從來自多名CRC-或OC-陰性的人的所述分子而獲得的參考數(shù)據(jù)進行比較；并且應(yīng)用所述比較來確定所述測試受試者的代謝狀態(tài)是否在所述治療策略過程中得到改善。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供鑒定鑒定缺乏維生素E和相關(guān)代謝物的細胞吸收或轉(zhuǎn)運的個體的方法，其通過使用各種策略分析血清或組織而進行，所述各種策略包括，但不限于放射性標(biāo)記追蹤研究，維生素E轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達或蛋白表達分析，維生素E轉(zhuǎn)運蛋白中基因組異常或突變的分析，維生素E轉(zhuǎn)運蛋白水平的體內(nèi)或先體外后體內(nèi)成像，維生素E轉(zhuǎn)運蛋白的基于抗體的檢測(酶聯(lián)免疫吸附測定，ELISA)。本發(fā)明的這一概述不必描述本發(fā)明的所有特點。附圖簡述本發(fā)明的這些和其它特點將從下述描述中變得更加明顯，其中對附圖進行參考，其中圖1顯示按照本發(fā)明的一個實施方案鑒定CRC/OC診斷生物標(biāo)記組包括的步驟的總結(jié)。圖2顯示微點陣分析(PAM)訓(xùn)練誤差(trainingerror)(圖2A)和橫向驗證錯分類誤差(圖2B)圖的預(yù)測。圖3顯示基于在圖2中產(chǎn)生的分類法(classifier)對于所有樣品的PAM輸出橫向-驗證的診斷概率。圖4顯示基于橫向-驗證的概率的接收-操作者特征性曲線。圖5顯示當(dāng)一半樣品用于訓(xùn)練和另一半用作不知情檢測組時的不知情檢測樣品的診斷預(yù)測。圖6顯示基于不知情檢測組診斷的預(yù)測結(jié)果(圖6A)和接收-操作者特征曲線(圖6B)。圖7顯示關(guān)于六種選擇的生物標(biāo)記的原始FTMS光譜(顯示FTMS中性質(zhì)量；圖7A-7F)。頂部組，5種正常樣品；底部組，5種CRC-陽性樣品。圖8顯示6種生物標(biāo)記的QSTAR提取的離子層析(顯示指定的檢測質(zhì)量；圖8A-8F)。頂部組，5種正常樣品；底部組，5種CRC-陽性樣品。圖9顯示關(guān)于滯留時間窗口的平均提取質(zhì)譜；當(dāng)在QSTAR上檢測時對于5種正常的(圖9A)禾Q5種CRC(圖9B)血清樣品為16-17分鐘，和凈差異(圖9C)。圖10顯示5種CRC和5種正常樣品通過FTMS(圖IOA)和Q-star(圖IOB)分析的平均CRC生物標(biāo)記強度。對于每種生物標(biāo)記，第一列是CRC-陽性的；對于每種生物標(biāo)記，正常的顯示在第二列。圖11顯示在FTMS數(shù)據(jù)中檢測的為維生素E樣家族的部分的30種代謝物的圖表。這些可以依據(jù)它們包含的碳數(shù)目分成組。還顯示Y(GT)和a生育酚(AT)的強度。圖12顯示通過MSMS和NMR確定的y生育酚和生育三烯酚(圖12A和12B)以及6種含有C28-維生素E樣分子(圖12C-12H)的結(jié)構(gòu)。圖13顯示中性質(zhì)量生物標(biāo)記448.3726(028114804)的主要MS/MS片段的推定的結(jié)構(gòu)。圖14顯示中性質(zhì)量生物標(biāo)記464.3522((:28&805)的主要MS/MS片段的推定的結(jié)構(gòu)。圖15顯示中性質(zhì)量生物標(biāo)記446.3522(<:28114604)的主要MS/MS片段的推定的結(jié)構(gòu)。圖16顯示中性質(zhì)量生物標(biāo)記466.3661(028115()05)的主要MS/MS片段的推定的結(jié)構(gòu)。圖17顯示中性質(zhì)量生物標(biāo)記450.3726(028115()04)的主要MS/MS片段的推定的結(jié)構(gòu)。圖18顯示中性質(zhì)量生物標(biāo)記468.3840((:2必5205)的主要MS/MS片段的推定的結(jié)構(gòu)。圖19顯示中性質(zhì)量生物標(biāo)記538.4259((:32&806)的主要MS/MS片段的推定的結(jié)構(gòu)。圖20顯示中性質(zhì)量生物標(biāo)記592.4711((336116406)的主要MS/MS片段的推定的結(jié)構(gòu)。圖21顯示中性質(zhì)量生物標(biāo)記594.4851((:36&606)的主要MS/MS片段的推定的結(jié)構(gòu)。圖22顯示448.3406(C28H4804)的'H-NMR光譜。圖23顯示464.3522(C28H4805)的、H-NMR分析。圖24顯示446.3406(C28H4604)的'H-NMR分析。圖25顯示466.3661(C2SH50O5)的H-NMR分析。圖26顯示MS/MS高通量篩查方法的概括。圖27顯示6種CRC生物標(biāo)記轉(zhuǎn)換和內(nèi)標(biāo)轉(zhuǎn)換(圖27A-27F)、和持家轉(zhuǎn)換(圖27G)的分析屏幕截圖。每一頁顯示兩種生物標(biāo)記在典型的"正常"和典型的"CRC陽性"個體中的轉(zhuǎn)換的峰面積。頂部4幅圖來自正常的，底部4幅圖來自CRC陽性的。BM:生物標(biāo)記，IS:內(nèi)標(biāo)。圖28顯示基于288例沒有疾病的個體的最終HTS輸出的正常群體分布。-1.3顯示截點值，其選擇作為低于其認為人有CRC高危險的點(見圖29)。圖29顯示HTS診斷輸出。選擇基于正常受試者分布的截點比例，如在圖28中所示，以獲得90.5%的特異性。這意味著得分在-4和-1.3之間的患者有高CRC危險，得分在-1.3和-0.8之間的患者有中等的危險，和得分大于-0.8的患者有低危險。顯示推薦的作用過程。圖30顯示脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的Y-生育酚/生育三烯酚中和。本圖顯示不飽和脂肪酸的自動氧化(圖30A)，y-生育酚對過氧化氫自由基的穩(wěn)定(圖30B)，Y-生育酚自由基對過氧化氫自由基的反應(yīng)(圖30C)和由7-生育酚形成的兩種半穩(wěn)定過氧化物(圖30D)。圖31顯示在鐵存在下？生育酚過氧化物的內(nèi)部降解。圖31A顯示從亞麻酸產(chǎn)生的C30系列生育酚代謝物。圖31B顯示從亞油酸產(chǎn)生的C32系列生育酚代謝物。圖31C顯示從油酸產(chǎn)生的C36系列生育酚代謝物。圖32顯示在鐵存在下氫過氧化物的降解。圖33顯示自由基的自發(fā)降解。圖33A顯示短鏈垸烴自由基和長鏈醛，其由在虛線"A"所示的鍵處的降解產(chǎn)生，和圖33B顯示短鏈醛和長鏈垸烴自由基，其將由在鍵"B"(虛線B)處的自發(fā)降解產(chǎn)生。圖34顯示Y-生育酚可以中和游離的烷烴自由基。丫-生育酚/生育三烯酚的不受阻礙的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)可以接受來自烷烴自由基的氫自由基，形成穩(wěn)定環(huán)的生育酚/生育三烯酚自由基和穩(wěn)定的烯烴(圖34A)。這種氫自由基接受反應(yīng)可以發(fā)生4次，將環(huán)結(jié)構(gòu)還原成單一的雙鍵(圖34B)。圖35顯示由肝P450代謝導(dǎo)致的co羧化作用。圖36顯示關(guān)于維生素E及相關(guān)的代謝物在正常狀態(tài)(圖36A)和在18CRC與OC(圖36B)中的作用的假說。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及結(jié)腸直腸癌和卵巢癌(分別為CRC和OC)的診斷。本發(fā)明描述內(nèi)源小分子和CRC或OC之間的關(guān)系。具體地，本發(fā)明涉及通過檢測維生素E同種型和相關(guān)的代謝物而診斷CRC和OC。更具體地，本發(fā)明涉及在人血清中的維生素E-相關(guān)的代謝物和它們參與CRC和OC之間的關(guān)系。本發(fā)明第一次公開特異性與CRC相關(guān)的清楚而明確的生物化學(xué)變化。這些發(fā)現(xiàn)還意味著這些生物標(biāo)記的檢測可能提供檢測CRC治療功效的通用方式。由于可以應(yīng)用簡單的生化檢測來評估新治療的可行性(viability),所以這將顯著降低進行臨床試驗的成本。此外，將不必等到腫瘤發(fā)展或等到患者死亡才能確定所述治療是否提供了任何益處。這樣的檢測的應(yīng)用將使得研究者能夠在數(shù)月內(nèi)而不是數(shù)年內(nèi)確定劑量、制劑和CRC治療的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的功效。本發(fā)明涉及診斷CRC或OC的方法，其通過檢測存在于人血清中的特異性小分子的水平并且將它們與"正常"參考水平進行比較而進行。在本申請的一個實施方案中，描述一種用于CRC或OC的早期檢測和診斷以及監(jiān)測對CRC和OC的治療的效果的新穎方法。優(yōu)選的方法包括應(yīng)用從選自表3的代謝物子集研發(fā)的高通量篩查(HTS)檢測，用于診斷一種或多種疾病或具體的健康-狀態(tài)。通過研發(fā)能夠診斷CRC-陽性健康-狀態(tài)的HTS檢測而證明并且驗證本申請方法的用途。由于確實地每個人可以在它們的一生中縱向進行篩查，以評估危險并且早些檢測這些疾病，所以這樣的檢測對CRC和OC的作用將是巨大的。假定所述檢測的性能特點代表普通CRC群體，那么這種檢測單獨可以優(yōu)于任何其它目前可用的CRC篩查方法，原因在于它可以具有在常規(guī)方法可以檢測到之前檢測到疾病進展的潛力。疾病的早期檢測對陽性治療結(jié)果很關(guān)鍵。為了確定在特定群體中是否存在給定健康-狀態(tài)的生化標(biāo)記，將需要一組代表健康狀態(tài)(即，特定的疾病)的患者和一組"正常的"副本。然19后可以將從處于特定健康-狀態(tài)類別的患者采取的生物樣品與從正常群體采取的相同樣品進行比較，以鑒定在這兩組之間的差異，其通過使用各種分析平臺，包括但不限于，傅里葉變換離子回旋加速共振質(zhì)譜儀(FTMS)和液相色譜質(zhì)譜儀(LC-MS)，提取樣品并且分析而進行。所述生物樣品可以來源于機體內(nèi)的任何部位，包括，但不限于，血液(血清/血漿)、腦脊液(CSF)、尿、大便、呼吸氣、唾液或任何實體組織的活組織切片，所述實體組織包括腫瘤、臨近的正常部位、平滑肌和骨骼肌、脂肪組織、肝、皮膚、頭發(fā)、腎、胰腺、肺、結(jié)腸、胃或其它。對于所述的CRC診斷檢測的方法，血清樣品獲自健康的CRC-和OC-陰性個體和專業(yè)診斷為CRC-陽性患者的代表性群體。貫穿整個本申請，將使用術(shù)語"血清"，但是對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該清楚，血漿、全血或全血的亞級分可以用于本方法中。當(dāng)血液樣品從患者提取時，存在可以處理所述樣品的一些方法。處理的范圍可以如不作處理那樣少(即，冷凍全血)或者如分離特別的細胞類型那樣復(fù)雜。這種最常見和常規(guī)的方法包括從全血制備血清或血漿。本發(fā)明也考慮所有的血液樣品處理方法，包括將血液樣品點樣到固相支持物上，諸如濾紙或其它固定的材料上。然后進一步處理上述處理的血液樣品，以使得其與用于檢測和測量包含在所述處理的血液樣品(在本情形中，血清樣品)中的生化劑的解析性分析技術(shù)相兼容。處理的類型可以從如沒有進一步處理那樣少到如差別萃取和化學(xué)衍生那樣復(fù)雜。萃取方法包括，但不限于，超聲、soxhlet萃取、微波輔助的萃取(MAE)、超臨界流體萃取(SFE)、加速溶劑萃取(ASE)、加壓液體萃取(PLE)、加壓熱水萃取(PHWE)、和/或在普通溶劑中的表面活性劑-輔助的萃取，所述普通溶劑諸如甲醇、乙醇、醇和水的混合物、或有機溶劑，諸如乙酸乙酯或己烷。萃取用于FTMS非目標(biāo)性分析的代謝物的優(yōu)選方法是進行液體/液體萃取，其中非極性代謝物溶解在有機溶劑中，且極性代謝物溶解在水性溶劑中。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過超聲和用力攪拌(漩渦攪拌)而將血清樣品中包含的代謝物分離成極性和非極性的萃取物。通過直接注射或在層析分離之后，生物樣品的提取物適合在基本上任何質(zhì)譜儀平臺上進行分析。典型的質(zhì)譜儀由使樣品內(nèi)分子離子化的能源(source)和檢測所離子化的顆粒的檢測器組成。常規(guī)能源的實例包括電子碰撞，電霧化電離(ESI),大氣壓化學(xué)電離(APCI),基質(zhì)輔助的激光解吸附電離(MALDI),表面增強的激光解吸附電離(SELDI)，和它們的衍生物。常規(guī)離子檢測器可以包括基于四極的系統(tǒng)、飛行時間(TOF)、磁性部分、離子回旋加速器和它們的衍生物。按照本發(fā)明，通過已知為無目標(biāo)性分析的方法鑒定小分子。無目標(biāo)性分析包括盡可能多地檢測樣品中的分子，在分析之前沒有任何己有的關(guān)于成分的認識或選擇(參見WO01/57518，其于2001年8月9號公布)。因此，相對于檢測預(yù)先確定的分子列表的目標(biāo)性方法，無目標(biāo)性分析發(fā)現(xiàn)新的代謝物生物標(biāo)記的潛力更高。本發(fā)明應(yīng)用無目標(biāo)性方法來鑒定在CRC-陽性和健康個體之間不同的代謝物成分，然后研發(fā)關(guān)于從所述無目標(biāo)性分析中鑒定的代謝物子集的高通量目標(biāo)性檢測。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該清楚，其它代謝物剖析策略可以潛在地用來發(fā)現(xiàn)本申請中公開的一些或全部差別調(diào)控的代謝物，并且本文所述的代謝物，不管是發(fā)現(xiàn)的還是檢測的，代表不依賴于可以用于檢測并且測量它們的解析性技術(shù)的獨特的化學(xué)實體。按照這種分析，可以鑒定數(shù)百種在CRC-陽性血清和正常血清之間有差別性豐度的小分子、代謝物或代謝物片段。本發(fā)明公開480種代謝物質(zhì)量，如在表3中所列出，發(fā)現(xiàn)它們在CRC-陽性血清和正常血清之間有統(tǒng)計學(xué)顯著的差別性豐度。在兩種群體之間統(tǒng)計學(xué)差異的所有這些特點具有潛在的診斷用途。然而，將480種信號結(jié)合到商業(yè)診斷檢測中是不切實際的，因此進行選擇最適宜的標(biāo)記或代謝物診斷組的公知方法。從在本專利中所述的方法，選擇一組9種代謝物作為區(qū)分CRCs和正常的最適合代謝物。在本發(fā)明中，鑒定了直腸結(jié)腸癌-特異性的代謝物標(biāo)記，其選自由具有或基本上等于446.3406，448.3563,450.3726，464.3522,466.3661,468.3840,538.4259,592.4711,和594.4851的精確中性質(zhì)量(以道爾頓測量)的代謝物組成的組，其中+/-5ppm的差別將指示相同的代謝物。因此，這些標(biāo)記可以用于診斷檢測，以篩査患者存在CRC。在上述9種代謝物中，進一步選擇6種用于高通量篩查(HTS)檢測中。所述HTS檢測基于常規(guī)三聯(lián)-四極質(zhì)譜技術(shù)(概述參見圖26)。HTS檢測通過將血清提取物直接注射到三聯(lián)-四極質(zhì)譜儀中而工作，然后所述三聯(lián)-四極質(zhì)譜儀通過單一離子監(jiān)測(SIM)而單獨分離所述6種親本分子中的每一種。這之后使用惰性氣體(叫作碰撞氣體，綜合參考誘導(dǎo)碰撞的解離或CID)將每種分子斷裂。然后通過叫作多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)的方法，檢測并記錄來自每種親本生物標(biāo)記的特異性片段的強度。另外，內(nèi)標(biāo)分子也添加到每種樣品中，并且也經(jīng)受斷裂。如果方法和使用儀器操作正確，那么這種內(nèi)標(biāo)片段應(yīng)該在每種樣品中具有相同的強度。當(dāng)收集所有6種生物標(biāo)記片段的強度，以及內(nèi)標(biāo)片段的強度時，計算生物標(biāo)記與IS片段的比例，并且將所述比例進行對數(shù)轉(zhuǎn)換。然后，將關(guān)于每種患者樣品的六種生物標(biāo)記中的最低值與先前確定的疾病-陽性和對照的分布進行比較，從而確定該人對于所述疾病是陽性還是陰性的相對概率。取決于要檢測的分子，存在多種類型的當(dāng)前可用的低成本檢測平臺選擇。這些可以包括比色化學(xué)檢測(UV,或其它波長)，基于抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)，基于芯片和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的核酸檢測測定，基于珠子的核酸檢測方法，測量尺化學(xué)檢測(dipstickchemicalassays),成像分析諸如MRI、petscan、CT掃描和各種基于質(zhì)譜的系統(tǒng)。按照本發(fā)明的這一方面，提供使用在前部分中鑒定的MS/MS斷裂模式篩查CRC患者的商業(yè)方法的研發(fā)。對于世界范圍內(nèi)應(yīng)用所述檢測存在無數(shù)選擇。最明顯的兩種為1.研發(fā)與當(dāng)前實驗室使用儀器和已經(jīng)在全世界的許多實驗室中就位的三聯(lián)-四極質(zhì)譜儀相兼容的的MS/MS方法，和/或2.建立檢測設(shè)施，在那里可以在一個位置裝運并且分析樣品，并且將結(jié)果寄回給患者或患者的醫(yī)生。在一系列物理和化學(xué)性質(zhì)研究后，確定所選代謝物的結(jié)構(gòu)說明。例如，通常用于這種鑒定的主要特征是精確質(zhì)量和分子式確定，極性，酸/堿性質(zhì)，NMR光譜，和MS/MS或MSn光譜。使用本發(fā)明的代謝物的性質(zhì)的說明，可以鑒定參與疾病發(fā)展的一種或多種代謝途徑?；谒鼈兊木_中性質(zhì)量、極性和電離特征，9種優(yōu)選的診斷標(biāo)記(446.3406,448,3563,450.3726,464.3522,466.3661,468.3840,538,4259,592.4711,和594,4851)的分子式確定為C28H4604，C28H4804,C28H50O4,C28H4805,C28H50O5,C28H5205,C32H5806,C36H6406,C36H6606。按照本發(fā)明，已經(jīng)確定這些代謝物由半飽和苯并二氫吡喃環(huán)和植基側(cè)鏈組成，并且因此與維生素E-相關(guān)的結(jié)構(gòu)一致。已經(jīng)進行了關(guān)于維生素E在體外和CRC動物模型的作用的有意義的研究，而關(guān)于維生素E和OC進行了非常少的研究。早在1980年，Cook和McNamara[12]表明維生素E在小鼠中對化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸癌的保護作用。然而，人類研究沒能提供維生素E在CRC的預(yù)防、引發(fā)、治療或支持性治療的任一種中起顯著作用的任何令人信服的證據(jù)。Coulter等表明在38次研究中，ci-生育酚治療對任何單個癌癥沒有顯著作用，并且匯集的單一相對危險為0.91(95%CI:0.74m1.12)[13]。術(shù)語"維生素E"籠統(tǒng)指8種天然存在的同種型，4種生育酚(oi，卩，y和5)和4種生育三烯酚(a，(3，y和5)。在西方日常飲食中發(fā)現(xiàn)的主要形式為Y-生育酚，而在人血清/血漿中發(fā)現(xiàn)的主要形式是a-生育酚。生育三烯酚也存在于日常飲食中，但是更多集中在糧食谷物和某些蔬菜油諸如棕櫚和稻麩油中。有趣地，表明在預(yù)防心血管疾病和癌癥中生育三烯酚可能比生育酚更有潛力[14]。這可能歸因于生育三烯酚在脂膜內(nèi)增加的分布，更強的與自由基相互作用的能力，和比生育酚副本更快地快速再循環(huán)的能力[15]。己經(jīng)證明，在大鼠肝臟微粒體中，ot-生育三烯酚保護抗鐵-介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的功效高于a-生育酚的功效40倍[15]。然而，在人血漿中的檢測表明，可能由于導(dǎo)致優(yōu)先的bilary排泄的更高的親脂性，三烯甘油酯要么沒有檢測到要么以微小的濃度存在[16]。關(guān)于這些同種型己經(jīng)進行了相當(dāng)多量的關(guān)于a和Y生育酚分布之間的差異的研究。早在1974年就己知并且報道Y-和a-生育酚具有相似的腸吸收，但是具有顯著不同的血漿濃度[18]。在Bieri和Evarts研究中[18]，將大鼠耗盡維生素E10天，然后喂給含有0.5的ot:Y比例的日常飲食14天。在第14天，觀察到血漿a:Y比例為5.5！作者將這歸因于y-生育酚的顯著更高的轉(zhuǎn)換，然而，這種增加的轉(zhuǎn)換的起因未知。據(jù)信生育酚的血漿濃度受到肝生育酚結(jié)合蛋白的緊密調(diào)控。已經(jīng)表明這種蛋白優(yōu)先結(jié)合a-生育酚[19]。在a-生育酚消耗中的大增加只導(dǎo)致血漿濃度中的小增加[20]。相似的觀察對于生育三烯酚保持正確，在這種情形中表明高劑量的補充導(dǎo)致大約只有1-3微摩爾的最大血漿濃度[21]。更近地，Birringer等[17]表明，盡管50%以上的吸收的，生育酚被人肝細胞瘤HepG2細胞通過co-氧化代謝成為各種醇和羧酸，但是低于3。/。的a-生育酚通過這一途徑代謝。這一系統(tǒng)似乎負責(zé)增加的a-生育酚轉(zhuǎn)換。在這一論文中，他們表明從？生育酚產(chǎn)生coC00H以比從a-生育酚產(chǎn)生類似的coC00H高〉50X的速率發(fā)生。Birringer還表明三烯甘油酯通過類似的但是更復(fù)雜的需要輔助酶的co羧化作用途徑代謝[17]。可能地，這兩種結(jié)構(gòu)選擇性作用的存在具有生物意義。Birringer等[17]提議？生育酚-特異性P450co羥化酶的目標(biāo)是優(yōu)先消除Y-生育酚/三烯甘油酯，成為2,7,8-三甲基-2-(p-羧基-3'-羧基乙基)-6-羥基苯并二氫吡喃(Y-CEHC)。然而，我們主張，如果生物學(xué)目標(biāo)只是簡單消除，生育酚/三烯甘油酯，那么通過選擇性羥化作用和葡糖醛酸化作用將更簡單得多并且更加能量有效性。這兩種作用的純生物學(xué)作用，其尚未在維生素E文獻中得到評論，在于，當(dāng)在首次通過新陳代謝過程中進入肝臟時，兩種主要飲食維生素E同種型(a和Y)分流進入兩種獨立的代謝系統(tǒng)。系統(tǒng)l將最生物活躍的抗氧化劑同種型(ct-生育酚)快速運到血流中，以為機體組織補充足夠水平的這種主要的維生素。系統(tǒng)2將Y-生育酚快速轉(zhuǎn)化成coCOOH。在本發(fā)明中，公開在正常的人血清中總是存在顯著濃度的Y-生育酚/生育三烯酚coCOOH的6種同種型。通過測量膽酸，一種用于三聯(lián)-四極方法的包含有機可溶的羧酸的內(nèi)標(biāo)，我們能夠估計這些分子的每一種在人血清中的濃度在低的微摩爾范圍。這在先前報道的關(guān)于，生育酚的0.5-2微摩爾的血漿濃度范圍內(nèi)(低于a-生育酚的濃度約20倍)[22]。因此，全部6種新，生育酸(Y-tocophericacids)在血清中的累積總量不是微不足道的，并且可能超過丫-生育酚本身的量。在血清中沒有檢測到任何一種Birringer等[17]所述的其它短鏈長度的丫-生育酚/三烯甘油酯代謝物。此外，在這一工作報道的研究中所用的患者的血清中也沒有檢測到a和Y生育三烯酚，這表明y-生育酚/三烯甘油酯-特異性P450CD羥化酶的主要目的是形成coCOOH和非y-CEHC。不受所述理論的正確性的束縛，因此這表明，在本申請中公開的各種y-生育酚/生育三烯酚coCOOH代謝物是新穎的生物活性劑，并且它們行使維持正常的健康和預(yù)防疾病的特異性和必24需的生物功能。已經(jīng)表明哺乳動物能夠在體內(nèi)將三烯甘油酯轉(zhuǎn)化成生育酚的事實也是相關(guān)的[23,24]。由于所述新穎的6種維生素E-樣代謝物中的兩種包含飽和植基側(cè)鏈，并且因此生育酚樣，和其余4種攜帶半飽和植基側(cè)鏈，這表明生育三烯酚來源。由于哺乳動物不能引入雙鍵，因此，可能所有6種分子都來源于生育三烯酚-樣前體。正是由于己經(jīng)報道三烯甘油酯具有與生育酚分離的生物活性[25]，所以Y-生育酚已被報道具有與a-生育酚分離并且不同的生物功能。例如，a生育酚和a生育三烯酚之間的主要差別包括a生育三烯酚通過調(diào)控特異的細胞死亡調(diào)控因子而特異性預(yù)防神經(jīng)退化的能力[26]，三烯甘油酯降低膽固醇的能力[27]，減少氧化蛋白損害和延長秀麗隱桿線蟲(C.elegans)生命期限的能力[28]，和抑制乳腺癌細胞生長的能力[29,30]。a和Y形式的生育酚之間的主要差別包括Y減少大鼠炎癥損傷中的促炎性類花生酸(proinflammatoryeicosanoids)[31]并且抑制環(huán)加氧酶(COX-2)活性[32]。在Jiang等[32]中，報道丫-生育酚經(jīng)過8-24小時才有效，并且花生四烯酸(arachadonicacid)競爭性抑制Y-生育酚的抑制活性。假設(shè)丫-生育酚的coCOOH代謝物可能是負責(zé)其抗炎活性的主要生物活性種類?；ㄉ南┧徂D(zhuǎn)化成類花生酸是炎癥中的關(guān)鍵步驟。更可能的是，由于它們與花生四烯酸的結(jié)構(gòu)相似性，Y-生育酚的coCOOH形式是比天然Y-生育酚更有潛在競爭性的本制劑的抑制劑。在本發(fā)明的一個方面中，提供人血清中新的丫-生育酚/生育三烯酚代謝物。這些Y-生育酚/生育三烯酚代謝物以使芳香環(huán)結(jié)構(gòu)被還原。在本發(fā)明的這一方面，所述人血清中的Y-生育酚/生育三烯酚代謝物包括附著到羥基苯并二氫吡喃結(jié)構(gòu)的-OC2H5，-OC4H9,或-OC8H17部分。不受任何具體理論的束縛，本發(fā)明公開關(guān)于y-生育酚/生育三烯酚可以怎樣與烷烴自由基反應(yīng)而產(chǎn)生穩(wěn)定的烯烴和穩(wěn)定的Y-生育酚/生育三烯酚自由基的假說。本發(fā)明表明，通過這種機制，一分子的i生育酚/生育三烯酚可以中和達到六分子的烷烴自由基。本發(fā)明還表明Y-生育酚/生育三烯酚自由基可以怎樣與脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)并且隨后將所述脂質(zhì)過氧化物中和成穩(wěn)定的Y-生育酚/生育三烯酚烷基醚和穩(wěn)定的脂質(zhì)醛。本發(fā)明還表明，鐵的存在可以催化這一反應(yīng)。相對于血漿，，生育酚的吸收和濃度在結(jié)腸上皮細胞中顯著不同。Tmn和Chan[33]表明，相對于a-生育酚，，生育酚優(yōu)先由人的內(nèi)皮細胞吸收，和Nair等[34]表明，，生育酚在人結(jié)腸上皮細胞中的體內(nèi)濃度高于oc-生育酚濃度2倍。因此，主要由血液供給營養(yǎng)的組織優(yōu)先富含a-生育酚[18]，而結(jié)腸上皮細胞，其直接從大腸吸收生育酚，具有代表這些同種型的飲食比例的濃度[34]。本申請公開相對于對照，a-生育酚/生育三烯酚濃度在CRC患者血清中顯著下降，而在OC、前列腺、腎細胞、胸腺或肺癌中沒有下降。本申請還公開相對于對照，y-生育酚和，生育酚/生育三烯酚-相關(guān)的代謝物強度在CRC和OC患者血清中顯著下降，而在前列腺癌、腎細胞癌、乳腺癌或肺癌中沒有下降。不希望受到任何具體的理論的束縛，在本發(fā)明中，假設(shè)本文公開的新代謝物是維生素E活性的指征，并且所述代謝物的減少是下列情形中的一種的指征1.以超過由飲食供給的速率消耗維生素E及相關(guān)代謝物的高度氧化或代謝狀態(tài)。2.維生素E及相關(guān)代謝物的飲食缺乏或減弱的吸收。3.維生素E相關(guān)代謝物的飲食缺乏或減弱的吸收/上皮細胞轉(zhuǎn)運。特別是關(guān)于血清維生素E濃度和CRC的關(guān)聯(lián)，尚不存在相對于對照在CRC患者中顯著減少的維生素E水平的報道。最近和最強的研究是Ingles等的研究[35]。在這一研究中，作者闡述"我們檢測了來自這一先前基于乙狀結(jié)腸顯微鏡檢查的研究的332例患有結(jié)腸直腸腺瘤的受試者和363例對照受試者的血裝oc和，生育酚濃度。增加的a和下降的y-生育酚水平與大的(^lcm)而不是小的(《lcm)腺瘤的減少的發(fā)生相關(guān)；然而，在調(diào)整潛在的混淆變量后，這些趨勢不明顯。"在所有前文提及的關(guān)于維生素E和CRC的流行病學(xué)研究中，研究的焦點圍繞日常飲食對疾病發(fā)生的參與作用。這些研究都沒有考慮疾病對這些內(nèi)在代謝物的作用。因此，一種潛在的假說是，特異性維生素或營養(yǎng)的飲食缺乏導(dǎo)致增加的特別疾病的危險。沒有考慮所述疾病狀態(tài)導(dǎo)致重要營養(yǎng)或維生素缺乏的假說?；谠诒旧暾堉泄_的發(fā)現(xiàn)，考慮盡管飲食缺乏可能增加CRC發(fā)生的危險(這尚未最終證明)，但是CRC的存在導(dǎo)致維生素E同種型和相關(guān)代謝物的減少。由于在流行病學(xué)研究中將揭示出這樣強的相關(guān)性，所以這些減少的水平不可能是簡單純的飲食缺乏的結(jié)果。如果CRC引起這些代謝物的減少，并且不是反之亦然，那么在維生素濃度和CRC之間的弱流行病學(xué)聯(lián)系可能只是存在于假定正常的群體中的早期的、未檢測的CRC的結(jié)果，原因在于己知CRC可以持續(xù)許多年才能呈現(xiàn)出可被結(jié)腸顯微鏡檢査檢測到的大小和程度?；谠诒旧暾堉泄_的發(fā)現(xiàn)，還考慮維生素E-樣代謝物減少的水平不是單純飲食缺乏的結(jié)果，而是結(jié)腸上皮細胞對維生素E和相關(guān)代謝物攝取的消弱。因此，這代表在氧化壓力負荷下充分供給上皮細胞抗氧化劑能力的限速步驟。在這一模型中，通過紅色肉類、高度飽和的脂肪、和減少的纖維(導(dǎo)致減少的鐵螯合作用[36])增加鐵消耗的飲食作用導(dǎo)致先前提及的芬頓-誘導(dǎo)的自由基傳播，它的充分清除取決于維生素E的充足的上皮水平。因此，上皮自由基負荷的增加，與維生素E-相關(guān)的轉(zhuǎn)運缺陷組合，將反映在作為抗氧化劑的維生素E-樣代謝物的減少，以及由肝攝取和P450-介導(dǎo)的代謝導(dǎo)致的還原羧化同種型的減少。最近已經(jīng)表明，攝取維生素E進入CaCo-2結(jié)腸上皮細胞是飽和過程，主要取決于蛋白-調(diào)控事件[37]。由于蛋白轉(zhuǎn)運子主要是酶，并且遵循典型的米-曼動力學(xué)，維生素E可以被吸收進入結(jié)腸上皮細胞的速率將達到最大速率(Vmax)，其可能不能為CRC的發(fā)展提供充分的抗氧化劑保護作用。因此，在某種程度上，高于維生素E可以轉(zhuǎn)運進入結(jié)腸上皮細胞的速率的氧化壓力增加的速率最終將耗盡結(jié)腸內(nèi)/上皮儲蓄。因此，關(guān)于CRC發(fā)展的假說不但基于鐵的增加和飲食中的低纖維，而且基于上皮攝取維生素EY和相關(guān)代謝物的缺乏。這與表明在CRC發(fā)生和飲食維生素E補充之間缺乏任何顯著相關(guān)性的許多流行病學(xué)研究一致，原因在于在這種模型下的大劑量的維生素E將不由增加的上皮細胞內(nèi)水平所反映。CRC病理學(xué)特異性的9種代謝物的精確中性質(zhì)量(轉(zhuǎn)換成中性質(zhì)量的M-H離子)通過FTICR-MS確定為446.3406,448.3563,450.3726,27464.3522,466.3661,468.3840,538.4259,592.4711,禾卩594.4851?；谶@些精確中性質(zhì)量值，確定所述9種優(yōu)選的診斷標(biāo)記的分子式分別為C28H4604,C28H4804,C28H50O4,C28H4805,C28H50O5,C28H5205,C32H5806,C36H6406,C36脳06。這些代謝物的M-H離子特征在于具有碰撞誘導(dǎo)的解離(CID)MS/MS斷裂模式，其包括在圖13-21中所示的一種或多種子離子(daughterions)。更特別地，這7種代謝物的M-H離子特征在于具有碰撞誘導(dǎo)的解離(CID)MS/MS斷裂模式，其包括在圖13-21中所示的每一種子離子。基于精確質(zhì)量MS/MS光譜，為每種生物標(biāo)記指定推定的結(jié)構(gòu)。所述生物標(biāo)記的MS/MS光譜的綜合解釋表明它們都包含羧酸部分(由失去C02表明)和至少一個羥基部分(由失去H20表明)。此外，除了C28H4604之外所有的結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生C,sHxOy片段，其中x^31和y^2，表示高度飽和的脂肪酸側(cè)鏈。這一信息與成為，生育酚和Y-生育三烯酚代謝物的C28分子一致。后來假設(shè)Cn和(:36生物標(biāo)記分別是由Y-生育酚與亞麻酸和油酸殘基的脂質(zhì)過氧化物的反應(yīng)導(dǎo)致的代謝副產(chǎn)物。對于所選的6種代謝物中4種的確定的結(jié)構(gòu)，和其中2種的推定的結(jié)構(gòu)顯示在圖12中。本發(fā)明還參考下述實施例定義，所述實施例不解釋為限制。實施例實施例1:相對于正常健康對照在CRC-陽性中差異表達的代謝物的發(fā)現(xiàn)和鑒定本發(fā)明中所述的CRC生化標(biāo)記來源于來自CRC-陽性患者(24名TNM階段1/11，和16名階段ni/IV)的40例血清樣品和來自健康對照的50例血清樣品的分析。所有樣品都是單一時間點收集，并且CRC樣品在手術(shù)切除腫瘤之前立即或在手術(shù)切除腫瘤之后立即采取。所有樣品都在化學(xué)或放射治療之前采取。在科學(xué)文獻中已經(jīng)描述了多種非目標(biāo)性代謝物組學(xué)策略，包括NMR[38],GC-MS[39-41],LC-MS,和FTMS策略[38,42-44]。在本申請中用于發(fā)現(xiàn)差異表達的代謝物的代謝概述策略是由PhenomenomeDiscoveries(Phenomenome發(fā)現(xiàn))發(fā)明的非目標(biāo)性FTMS策略[40,44-47]。本文所述的發(fā)明包括分析來自90名個體(40名CRC，50名正常的)的血清提取物，其通過在陽極和陰極模式中直接注射到FTMS并且通過ESI或APCI電離而進行分析。FTMS比其它基于MS的平臺的優(yōu)點是允許分離只有幾百道爾頓差異的代謝物的高分辨能力，這些代謝物中的許多將被更低分辨率的儀器遺漏。有機(100%丁醇)樣品提取物在甲醇0.P/。(v/v)氫氧化銨(50:50，v/v)中稀釋3倍或6倍，用于陰極電離模式，或者在甲醇0.P/。(v/v)甲酸(50:50,v/v)中稀釋3倍或6倍，用于陽極電離模式。對于APCI，直接注射乙酸乙酯有機樣品提取物而不稀釋。所有分析在裝配7.0T活性屏蔽超導(dǎo)磁體的BrukerDaltonicsAPEXIIIFTMS(BrukerDaltonics，Billerica,MA)上進行。使用ESI和APCI直接注射樣品，流速為每小時600pL。使用絲氨酸、四丙氨酸、利血平、Hewlett-Packard調(diào)諧混合物和促腎上腺皮質(zhì)激素片段4-10的標(biāo)準(zhǔn)'混合物，最優(yōu)化離子遷移/檢測參數(shù)。另外，按照儀器供應(yīng)商的推薦，將儀器條件調(diào)諧到最優(yōu)化離子強度和超過100-1000amu質(zhì)量范圍的寬波段累積。為了超過100-1000amu獲得范圍的質(zhì)量精確性，將上文提及的標(biāo)準(zhǔn)的混合物用來在內(nèi)部校準(zhǔn)每份樣品光譜。對于每份樣品，獲得總共6種獨立的分析，包括提取物和電離模式的夕±A5口a:水性提取1.陽極ESI(分析模式1101)2.陰極ESI(分析模式1102)有機提取3.陽極ESI(分析模式1201)4.陰極ESI(分析模式1202)5.陽極APCI(分析模式1203)6.陰極APCI(分析模式1204)應(yīng)用線形最小平方回歸線，校準(zhǔn)質(zhì)量軸值，以致與其理論質(zhì)量相比，每個內(nèi)標(biāo)質(zhì)量峰具有<1ppm的質(zhì)量誤差。使用BrukerDaltonics公司的XMASS軟件，獲得1兆字節(jié)的數(shù)據(jù)文件大小，并且補零成2兆字節(jié)。在傅里葉變換和量級計算之前進行sirim數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。將來自每次分析的質(zhì)量光譜整合，產(chǎn)生包含每個峰的精確質(zhì)量和絕對強度的峰列表。分析了在100-2000m/z范圍內(nèi)的化合物。為了比較和總結(jié)不同電離模式和極性之間的數(shù)據(jù)，假定形成氫加成物，將所有檢測到的質(zhì)量峰都轉(zhuǎn)換成它們相應(yīng)的中性質(zhì)量。然后使用DZSCOMmetrics軟件(Phenomenome發(fā)現(xiàn)公司，Saskatoon,SK,加拿大)，產(chǎn)生自我-產(chǎn)生的二維(質(zhì)量相對樣品強度)點陣。將來自多份文件的數(shù)據(jù)整合，然后處理這一結(jié)合的文件，從而確定所有獨特的質(zhì)量。確定每一獨特質(zhì)量的平均值，代表y-軸。對于原始選擇進行分析的每份文件產(chǎn)生一列，代表x-軸。然后將在所選的每份文件中發(fā)現(xiàn)的每一質(zhì)量強度填到其代表性x,y坐標(biāo)中。不含有強度值的坐標(biāo)保持空白。當(dāng)在點陣中時，進一步處理、顯現(xiàn)和解釋數(shù)據(jù)，并且確定推定的化學(xué)性質(zhì)(chemicalidentities)。然后將每一光譜最高排列，以獲得所有檢測的代謝物的質(zhì)量和強度。然后將這些來自所有模式的數(shù)據(jù)合并，以產(chǎn)生每份樣品一個數(shù)據(jù)文件。然后將來自所有90份樣品的數(shù)據(jù)合并并且排列，以產(chǎn)生二維代謝物點陣，其中每份樣品由一列代表，并且每種獨特的代謝物由單行代表。在與給定的代謝物樣品組合相對應(yīng)的單元中，顯示在所述樣品中的代謝物的強度。當(dāng)數(shù)據(jù)以這種格式表示時，可以確定在樣品組(即，正常的和癌癥)之間表現(xiàn)出差異的代謝物。斯氏T-檢驗用來選擇在正常和CRC-陽性樣品之間不同的代謝物(p<0.05)。滿足這一標(biāo)準(zhǔn)的代謝物(480種)顯示在表3中。這些是在兩種群體之間以統(tǒng)計學(xué)顯著方式不同的所有特征，并且因此具有潛在的診斷應(yīng)用。所述特征通過它們的精確質(zhì)量和分析模式描述，精確質(zhì)量和分析模式共同充分提供每種代謝物的推定的分子式和化學(xué)特征(諸如極性和推定的官能團)。然而，將480種信號結(jié)合并且開發(fā)進入商用測定中是復(fù)雜的，因此應(yīng)用監(jiān)督統(tǒng)計學(xué)方法(supervisedstatisticalmethods)從480種代謝物中選取最佳診斷特點組，如下文所述。應(yīng)用稱為微點陣預(yù)測分析(PAM)(http:〃www-stat.stanford.edu/~tibs/PAM/)的監(jiān)督統(tǒng)計學(xué)方法從原始點陣中選擇具有最佳診斷特點的代謝物特征[48]。所述方法包括使用具有相對應(yīng)已知的診斷的樣品訓(xùn)練歸類運算法則，然后其可以用于診斷未知的樣品(即，測試組)。存在一些監(jiān)督方法，其中任一種可以用于鑒定最好特點組，包括人工神經(jīng)網(wǎng)(artificialneumnetworks,ANNs)、支持載體機械(supportvectormachines,SVMs)、部分最小平方判別式分析(PLSDA)、亞線性締合方法、貝氏推論方法、監(jiān)督主要成分分析(PCA)、縮小的質(zhì)心(本文所述)或其它方法(綜述參見[49])。由于在本研究中只有40份CRC樣品工作，PAM方法對于診斷CRC的正確性以兩種方式檢測。第一，使用所有90份樣品(CRC和正常的)，沒有為測試組留下任何樣品，產(chǎn)生交叉-驗證的訓(xùn)練分類方法。第二種方法包括將樣品隨機分成兩半，一半用來產(chǎn)生分類法，另一半作為不知情"測試組"用于診斷。由于第一種方法使用更多的樣品產(chǎn)生分類法，所以預(yù)測它的預(yù)測準(zhǔn)確性將高于第二種方法，并且因此對于高診斷準(zhǔn)確性應(yīng)該需要更少的代謝物。關(guān)鍵點是在第一種方法中鑒定的相同的診斷特點也包含在第二種方法鑒定的子集中?；谶@些結(jié)果，和來自質(zhì)譜數(shù)據(jù)的信號-對-噪聲強度信息，選擇7種代謝物作為進一步結(jié)構(gòu)特征描述的最佳CRC診斷的生物標(biāo)記組。圖2A中的圖表明在不同閾值獲得給定的訓(xùn)練誤差所需要的代謝物的數(shù)目(使用者-定義的PAM參數(shù))。本圖表明具有小于10%誤差率(0.1訓(xùn)練誤差)的訓(xùn)練分類法可以具有少至7種代謝物特點(約5.8的閾值，見箭頭)。值得注意的是，最低的訓(xùn)練誤差可以使用300種或更多的代謝物特點獲得，然而，所述誤差只比使用7種代謝物特點低少量的百分數(shù)，并且使用數(shù)百個特點對于臨床應(yīng)用將是復(fù)雜的。圖2B中的圖在概念上與2A中的圖相似，然而，在2B中的圖表示在PAM程序必需的交叉-驗證步驟后用于CRC和正常個體的訓(xùn)練分類法的錯分類誤差。由菱形連接的線反映先前的結(jié)果，表明關(guān)于CRC-陽性個體的最小交叉-驗證的錯分類誤差可以使用少如7種的代謝物獲得。它還表明，由正方形表示的正常個體可以只使用一種代謝物特點而準(zhǔn)確地診斷為正常，但是在這一閾值，關(guān)于CRC的錯分類誤差大于95W(見箭頭)。因此，基于這種方法的最佳代謝物特點組合，其可以陽性和陰性地診斷CRC，包括7種代謝物特點的組合。這些包括是或基本上等于446.3406,450.3726,466.3661,538.4259,468.384,592.4711,和594.4851的質(zhì)量。在本研究中關(guān)于90名個體的每一個的單個交叉-驗證的診斷概率在圖3中顯示。所有這些CRC-陽性樣品在圖的左側(cè)列出，并且正常個體在右側(cè)。每份樣品在圖上包括2個點，一個點表示患有CRC的概率(菱形)，和一個點表示沒有患有CRC的概率(即，正常的，正方形)?？梢钥闯觯嬖?種CRC樣品，其分類為正常(在圖的左側(cè)圈出)和分類為CRC-陽性的兩種正常樣品(在圖的右側(cè)圈出)。然后，將預(yù)測的概率用來通過應(yīng)用JROCFIT(http:〃www.rad.jhmi.edu/jeng/javarad/roc/JROCFITi.html)而產(chǎn)生圖4中的接收者-操作特征(receiver-operatingcharacteristic,ROC)曲線，其表示相對于假陽性部分(預(yù)測患有CRC的正常個體)的正確陽性部分(預(yù)測患有CRC的患有CRC的那些)。曲線下的面積是95%,靈敏性82.5%,和特異性96%?？傊诮徊?驗證的設(shè)計方案，診斷的準(zhǔn)確性是90%。這7種代謝物進一步選擇用于結(jié)構(gòu)特征性描述?？梢杂米饔?xùn)練組的樣品越多，得到的分類法在診斷未知樣品時應(yīng)該越準(zhǔn)確。這是使用所有90種樣品鑒定上述最佳診斷標(biāo)記組的原因。然而，這種方法的缺點是它沒有留下可以用作不知情測試組的樣品(其不包含在訓(xùn)練組中)。為了解決這一問題，將樣品隨機分成兩組一組用來產(chǎn)生分類法，和一組用作測試組。訓(xùn)練組包括21份CRC樣品和27份正常。使用這些樣品關(guān)于最低錯分類誤差所需要的代謝物的最佳數(shù)目是16，在圖5的底部列出。在這16種內(nèi)包含上述7種的子集。然后分類法用來預(yù)測其余樣品的診斷(不知情的；22例CRC和27例正常)。預(yù)測不知情的測試樣品為CRC-陽性或正常的概率在圖5中繪圖。結(jié)果表明CRC-陽性樣品中有兩種給出更高的為正常的概率，和正常的中有兩種給出更高的為CRC-陽性的概率。圖6A列出用于測試組的這些患者，和它們的實際和預(yù)測的診斷。然后將來自圖5的概率轉(zhuǎn)換成ROC曲線，如在圖6B中所示。基于所述不知情測試組的分類的性能特征為靈敏性91%，特異性92.6%,和綜合診斷準(zhǔn)確性91.8%。為了驗證通過所述分類法選擇的所述7種代謝物真正表示CRC和正常血清之間的差異，顯現(xiàn)原始光譜數(shù)據(jù)。用于5種正常的和5種CRC樣品的所述7種生物標(biāo)記中的6種的光譜顯示在圖7A-7F中(正常的在每組的頂部，和CRCs在底部)。在每種情形中，所述標(biāo)記在正常樣品中存在，而在CRC樣品中不存在。32基于這些結(jié)果，在CRC-陽性患者和健康(非CRC)個體的血清之間可以做出清楚的區(qū)分。因此，能夠鑒定并且區(qū)分CRC-陽性和CRC-陰性血清的這樣的發(fā)現(xiàn)，可以形成在本申請中所述的CRC診斷檢測的基礎(chǔ)。實施例2:證實所發(fā)現(xiàn)的代謝物的獨立方法使用獨立的質(zhì)譜方法，檢驗對于使用FTMS方法發(fā)現(xiàn)的7種診斷代謝物的正常的和CRC血清之間的強度差別。使用與ABIQSTAR②質(zhì)譜儀界面連接的HP1050高效液相色譜，通過LC-MS分析5種代表性CRC-陽性樣品提取物和5種代表性正常樣品提取物。將來自5種CRC和5種正常樣品提取物的乙酸乙酯級分在氮氣下蒸發(fā)，并且在70jiL異丙醇甲醇甲酸(10:90:0.1)中再生。將10再生樣品進行HPLC(HP1050，具有HypersilODS5u,125x4mm柱，安捷倫技術(shù)(AgilentTechnologies))用于完全掃描，和30pL用于MS/MS，流速為1ml/分鐘。將來自HPLC的洗脫物使用在陰極模式裝配大氣壓化學(xué)電離(APCI)能源的ABIQSTARXL質(zhì)譜儀進行分析。完全掃描模式的掃描類型是飛行時間(TOF)，累積時間1.0000秒，質(zhì)量范圍在50和1500Da之間，和持續(xù)時間55分鐘。，能源參數(shù)如下離子能源氣體1(GS1)80;離子能源氣體2(GS2)10;Curtain氣體(CUR)30;噴霧器電流(NC)-3.0;溫度400。C;解聚電勢(DP)-60;聚焦電勢(FP)-265;解聚電勢2(DP2)-15。在MS/MS模式中，掃描類型是產(chǎn)物離子，積聚時間是1.0000秒，掃描范圍在50和650Da之間，和持續(xù)時間55分鐘。所有的能源參數(shù)與上述相同，具有-35V的碰撞能量和5psi的碰撞氣體(CAD,氮氣)。對于所述生物標(biāo)記中的6種當(dāng)在QSTAR⑧中檢測的提取的離子色譜(EICs)表示在圖8A-8F中。每圖的頂部組顯示5種正常的EICs，和底部組顯示5禾中CRCEICs。此外，當(dāng)與FTMS比較時，QSTAR⑧的靈敏性更好，導(dǎo)致在正常和CRC群體之間關(guān)于所選擇的生物標(biāo)記更大量級的強度差別圖9顯示在16-17分鐘保留時間窗口的關(guān)于6種代謝物的三組提取的質(zhì)譜(EMS)。圖9A代表5種正常樣品的平均EMS，而圖9B代表5種CRC樣品的平均EMS。圖9C顯示在頂部兩種光譜之間的純差異。可以看出，在CRC組中，在質(zhì)量范圍約445和600Da之間的所有峰都幾乎不能檢測到(框起的區(qū)域)。在Q-Trap上檢測到在FTMS平臺上鑒定的所有7種生物標(biāo)記，并且是在這一質(zhì)量范圍內(nèi)7種最豐富的峰(箭頭突出表示)。對于正常的和CRC患者在FTMS和Q-Star上檢測的7種標(biāo)記的平均值分別顯示在圖IOA和圖10B中。使用這兩種平臺，在CRC-陽性群體中觀察到這些分子的可重現(xiàn)的和一致的消耗。盡管PAM運算法則已經(jīng)選擇具有"最佳"診斷性能的7種特點，但是基于分子式、化學(xué)性質(zhì)和電離信息，我們重新檢驗關(guān)于似乎與這7種代謝物相關(guān)的代謝物的原始FTMS發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)。我們能夠鑒定所選的與7種PAM相關(guān)的多于30種分子，其在CRC患者群體中全部都表現(xiàn)出減少的表達。按照碳含量，可以將這些進一步分類，即，28，32或36個碳(見圖ll)。另外，在CRC群體中，鑒定了天然a和Y-生育酚，并且它們也表現(xiàn)出減小的強度(圖ll，GT和AT)?；谶@一信息，我們重新評估哪些分子應(yīng)該繼續(xù)在高通量篩查方法中運行，并且由于它們一向似乎是兩種群體(CRC和正常)之間最強的辨別者，而決定使用6種包含C28的分子。實施例3:主要代謝物生物標(biāo)記的結(jié)構(gòu)說明(NMR,FTIR和MSMS)通常用于新代謝物結(jié)構(gòu)說明的主要特點是精確質(zhì)量和分子式確定，極性，酸/堿性質(zhì)，NMR光譜，和MS/MS或MSn光譜。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該顯而易見，在嘗試確定其結(jié)構(gòu)時，可以應(yīng)用代謝物的其它特點?；谒鼈兊木_中性質(zhì)量，極性和電離特點，確定9種優(yōu)選的診斷標(biāo)記的分子式為C28H4604,C28H4804,C28H50O4,C28H4805,C28H5005，C28H5205,C32H5806,C36H6406,C36H6606。按照本發(fā)明，這些代謝物已確定由半飽和苯并二氫吡喃環(huán)和植基側(cè)鏈組成，并且因此與維生素E-相關(guān)的結(jié)構(gòu)一致。使用C18柱，將含有目的代謝物的提取物進行反相LC-MS，并且通過在上述詳細方法中所述的MS進行分析。在這些HPLC條件下，對于所有所述維生素E-樣生物標(biāo)記的保留時間為約16.5分鐘。提取條件還提供關(guān)于生物標(biāo)記的化學(xué)性質(zhì)的認識。將所有7種代謝物標(biāo)記萃取到有機乙酸乙酯級分中，表明這些代謝物在酸性條件下是非極性的。此外，它們優(yōu)選在陰極APCI模式中電離，表明在分子中存在酸性質(zhì)子。給定的分子的結(jié)構(gòu)將在對所述分子特異的(等價于人的指紋)定義的條件下指示特異性斷裂模式。甚至分子結(jié)構(gòu)的微小變化都可能導(dǎo)致不同的斷裂模式。除了提供分子性質(zhì)的指紋外，通過CID產(chǎn)生的片段可以用來獲得關(guān)于分子結(jié)構(gòu)的認識。MS/MS分析在ABI-QSTARXL上進行，所有參數(shù)如先前所提及，使用氮氣作為在5psi的碰撞氣體，和-25,-35和-50伏特的CE設(shè)置。使用碰撞-誘導(dǎo)的解離(CID)，將鑒定為具有最佳診斷能力和用于HTS開發(fā)的適用性的6種代謝物進行MS/MS斷裂。從最初的9種中選擇6種，以將組縮小到所有含有C28的分子和全部可以在相同的分析模式中檢測的分子。圖12A和12F將6種分子的結(jié)構(gòu)與y形式的生育酚和生育三烯酚進行比較。本附圖可以參考下文的顯示詳細結(jié)構(gòu)描述。基于精確質(zhì)量MS/MS光譜，為每種生物標(biāo)記指定推定的結(jié)構(gòu)。概言之，生物標(biāo)記MS/MS光譜的綜合解釋表明，它們都包含羧酸部分(由失去C02表明)和至少一個羥基部分(由失去H20表明)。此外，除了C28H4604之外所有的結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生018^(^片段，其中x>31和y》2，表示高度飽和的脂肪酸側(cè)鏈。這一信息與成為y-生育酚代謝物的C28分子一致。后來假設(shè)C32和C36生物標(biāo)記分別是由y-生育酚與亞麻酸和油酸殘基的脂質(zhì)過氧化物的反應(yīng)導(dǎo)致的代謝副產(chǎn)物(圖19-21)。MS/MS光譜支持這一假說。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該顯而易見，較輕微的修飾(包括，但不限于，雙鍵位置，羥基位置，某些碳原子的立體或手性朝向)將不會顯著地分散所述生物標(biāo)記的性質(zhì)。關(guān)于下文進一步描述的6種標(biāo)記的片段結(jié)構(gòu)的指定顯示在圖13-21中，并且列在表5-10中。MS-MS結(jié)果報道的質(zhì)量指檢測的質(zhì)量，而不是中性質(zhì)量。這些叫作M-l質(zhì)量，并且由于它們在質(zhì)譜儀上陰極電離模式中檢測，相對于在前面部分中提及的它們的中性負體，似乎在質(zhì)量上少l道爾頓，或在分子式中少一個氫。然而，M-l質(zhì)量代表與中性負體相同的分子。隨后的NMR部分指中性質(zhì)量。特別地，對于每種生物標(biāo)記，單獨分析在陰極電離模式中獲得的MS/MS數(shù)據(jù)，用于結(jié)構(gòu)指定，特別是官能團的置換。每種生物標(biāo)記的MS/MS光譜表示由于失水(M-18)和二氧化碳(M-44)的峰。這些保證臨近三級或二級碳分子的游離羥基和羧酸基的存在。還通常觀察到葉綠醇鏈片段的失去，但是所述鏈的分裂發(fā)生在不同位置。對于C28H4704(表5,圖13)，觀察到初始失去水和二氧化碳(m/z385;C27H450)。代表m/z279(019^50)的下一個片段表示在01-C9隨之發(fā)生的苯并二氫吡喃環(huán)開環(huán)和在C10-C4位置的葉綠醇鏈的分裂。對于C28H47Os(表6,圖14)，其具有2個游離羥基官能性，表現(xiàn)出失去2個水分子以及規(guī)則的二氧化碳失去(mZz-383;C27H430)。在01-C9相繼的開環(huán)接著在C18-C19之間分裂在此處也是產(chǎn)生C22H350(m/z315)的指征。隨后還觀察到與m/z297(C22H33)相對應(yīng)的信號，代表從打開的環(huán)片段失去水分子。與在生物標(biāo)記3(m/z448.3726)中不同，葉綠醇鏈的分裂發(fā)生在C12-C13，在那里在C28H4805的MS/MS光譜中觀察到關(guān)于分子m/z241(C14H2503),223((:14112302)的兩個等分部分(halves)的信號。這種特別的斷裂是官能團分布在苯并二氫吡喃環(huán)和葉綠醇鏈的有力證據(jù)。C28H4504的MS/MS光譜(表7,圖15)表現(xiàn)與C28H4705的光譜相似的模式。觀察到水(m/z427;(:28114303)和二氧化碳(111^401;027114502)的失去是交替和瞬時發(fā)生的(m/z383;C27H430)。如在C28H4705中那樣，在初始失去C17-C18之間的水之后，葉綠醇鏈的分裂發(fā)生在C12-C13，產(chǎn)生m/z223((:14&302)的片段。其它相反片段，還觀察到d4H2,0(m/z205)，并且還代表另外兩種連續(xù)的片段，m/z177(CnHnO)和162((:!11140)的親本離子，表示分別失去C2H8和CH3。有趣地，在C28H4905中(表8,圖16)，除了習(xí)慣的失水(m/z447;C28H4704)和失二氧化碳(m/z421;(:261"14503)之外，還檢測到失去乙醇片段(m/z433;€27仏504)然后失去乙烯基片段(111/2405;C26H4503)。這些觀察表示苯并二氫吡喃環(huán)在C2-C3假定的開環(huán)和C27甲基的羥化，產(chǎn)生甲醇和乙烯片段的可行前體。由于葉綠醇側(cè)鏈的斷裂觀察到一些不同的片段。在C18-C19的分裂(m/z349;C22H3703)，在C18-C17之間的初始失水后在Cl-C2的分裂(m/z297;C18H3303),然后失去另一個水分子(m/z279;C18H3102)，和在C15-C16的分裂(m/z185;C13H1903)在它們之中。在C12-C13之間預(yù)測的斷裂也觀察為兩種相反分子-離子等分部分，m/z241(C,sH2902)和223(C3HI903)。C28H4904的MS/MS光譜(表9,圖17)也表現(xiàn)出預(yù)測的失水和失二氧化碳(111/2431;(:28]^4904,405;(:27}14902)。與C28H4705的相似，這表示由于失去兩個水分子而形成的片段(m/z413;C28H4502)。這表明在結(jié)構(gòu)中存在兩個游離的羥基。葉綠醇環(huán)的分裂發(fā)生在兩個位置，在C15-C16之間(m/z281;(:18&302)和在C16-C17之間然后失去水分子(m/z277;C19H330)。這些片段確定在葉綠醇鏈中不存在羥基和在C17-C18之間的不飽和性。因此組裝生物標(biāo)記7的結(jié)構(gòu)。C28H510j々MS/MS光譜(表10,圖18)表示失去兩個水分子(m/z431;C2SH4703)和同時失去水和二氧化碳分子的另一種片段(m/z405;C27H4902)，表明存在兩個游離羥基和羰基官能性。在這里觀察到的一些片段與C28H4905的片段相同，其中與C28H5105的唯一區(qū)別是大量的不飽和度。在C18-C17之間初始失水之后在Cl-C2的分裂(m/z297;d8H3303)然后失去另一個水分子(m/z279;(:18113102)在它們之中。后來從C18H3102失去CH4由分子離子峰m/z263(<:17&702)代表。111/2215(<:12&303)分子離子峰表示由于C13-C14間斷裂然后失去CH3而形成的葉綠醇鏈的片段。觀察到由于葉綠醇鏈在C15-C16的斷裂形成的片段(m/z187;(:1()111903)為另外兩種連續(xù)的片段的親本離子，分別由于從C1QH1903失去一個水分子(m/z169;(:1()111702)和乙烯基片段(m/z141;(:8111302)而導(dǎo)致。除了所述6種含有C28的分子之外，還進行非C28維生素E樣分子的MSMS分析，如在圖19-21中所示。認為這些C32和C36生物標(biāo)記分別是由Y生育酚和亞麻酸與油酸殘基的脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)而導(dǎo)致的代謝副產(chǎn)物。MS/MS光譜支持在圖19-21中所示的這種假說。對于NMR和FTIR方法，所有的化學(xué)劑和培養(yǎng)基購自O(shè)NOakville的西格瑪-奧德里奇加拿大有限公司(Sigma-AldrichCanadaLtd.,Oakville,ON)。所有溶劑都是HPLC級的。分析薄層層析(TLC)在預(yù)先包被的硅膠TLC鋁制薄片(EM科學(xué)，Kieselgel60F254，5x2cmx0.2mm)上進行?；衔镌赨V光(254/366nm)下顯現(xiàn)，或者置于碘蒸汽罐中，并且通過將平板浸沒在含有1%(w/v)硫酸高鈰和4%(v/v)H2S04的5。/。7K性(w/v)磷鉬酸溶液中，然后加熱而進行。制備薄層層析(prepTLC)在硅膠平板(EM科學(xué),60F25420x20cm，0.25mm厚)上進行?；衔镌赨V光和碘中顯現(xiàn)。HPLC使用高效液相色譜進行，其裝配四元泵、自動注射器、除氣器和HypersilODS柱(5|um顆粒大小的硅石，4.6i.dx200mm)和半制備柱(5pm顆粒大小的硅石，9.1i.dx200mm)，使用內(nèi)嵌濾器。移動相在52分鐘內(nèi)以1.0ml/分鐘的流速的線性梯度H20-MeOH至100%MeOH。在BrukerAvance光度計上記錄NMR光譜；對于^(500MHz)，5值參考CDCl3(CHC13，在7.24ppm)，并且對于13CNMR(125.8MHz)參考CDC13(77.23ppm)。高分辨率(HR)質(zhì)譜(MS)在陰極模式具有大氣壓化學(xué)電離(APCI)能源的Brukerapex7T傅里葉變換離子回旋加速共振(FT-ICR)和QStarXLTOF質(zhì)譜儀上記錄。傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜在Bio-RadFTS-40分光計上記錄。光譜通過在分散在KBr中的樣品上進行漫反射系數(shù)方法而測量。通過制備TLC，純化在'HNMR光譜中表現(xiàn)出Y-生育酚樣和Y-生育三烯酚樣化合物的混合物的半純化的合并的血清提取物HPLC級分(32mg)，以產(chǎn)生如在圖12C-12F中所示的結(jié)構(gòu)；C(3,3.6mg)，D(4,2.5mg),E(5,3.4mg),和F(6,4.6mg)。在下述部分中我們將這些新的結(jié)構(gòu)叫作y-tocosnoicacids=>Y-tocoenoic酸3的分子式；圖12C(3)通過HRAPCI-MS確定為C28H4804(中性)，具有5個不飽和度。在3315(br)和1741cm"的FTIR吸收表示羥基和羰基。'H和"CNMR分光數(shù)據(jù)(表11和12)的分析表明存在6個甲基，4個烯烴碳和如在Y-生育三烯酚中存在的長葉綠醇鏈；圖12B(2)[50,51]。HMQC和HMBC數(shù)據(jù)的分析在指定結(jié)構(gòu)中是有幫助的(instrumental)。使用在其MS/MS光譜中觀察到的二氧化碳的失去，將表現(xiàn)出與在5H2.24(H-22)的次甲基質(zhì)子的一種長范圍相關(guān)性(longrangecorrelations)的在5C173.8(C-23)存在的唯一的羰基樣碳證實為羧酸官能度。類似地，在Sc74.2(C-9)碳表現(xiàn)出與在SH2.28(H-4)的亞甲基質(zhì)子的相關(guān)性，其與在SH2.28(H-6)的另一個亞甲基質(zhì)子一起表現(xiàn)出與在5c130.5(C-10)的^碳的HMBC相關(guān)性。這些是如在？生育三烯酚中存在的半飽和苯并二氫吡喃環(huán)系統(tǒng)的指征(圖12B)。在葉綠醇側(cè)鏈上，在SH1.55(H-26)的甲基質(zhì)子和在5c123.2(C-13)的sp2碳之間，在5H1.01(H-12,H-15)的亞甲基質(zhì)子和在5C140.2(C-14)的sp"碳之間，在5H0.91(H-25)的甲基質(zhì)子和在5c56.6(C-18)的四級碳之間，觀察到長范圍相關(guān)性。MS/MS光譜分析證實由于失去水和二氧化碳和在C9-01位置的開環(huán)然后失去葉綠醇側(cè)鏈片段(m/z279;<:18113102)而形成的片段。因此，這種Y-tocoenoic酸的結(jié)構(gòu)指定為3(圖12C)。Y-Tocoenoic酸4;圖12D(4)具有表示5個不飽和度的分子式C28H4805(HRAPCI-MS)。在3437(br)和1743cm"的FTIR吸收表示羥基和羰基。'H和13CNMR光譜與C28H4804的光譜非常相似。唯一的差別包括一個額外的羥基，當(dāng)與C28H4804比較時由在MS/MS斷裂中額外的失H20而表示，考慮亞甲基質(zhì)子，H-5(5H2.21-2.25)和H-7((5h1.47-1.53)，與次甲基質(zhì)子，H-6(SH3.69-3.71)，的&-]HCOSY相關(guān)性，其指定在C-6上。MS/MS光譜分析還證實存在羧基，其由失去C02分子和由于在C12和C13之間的分裂形成的片段，C14H2503(m/z241)和C14H2302(m/z223)，而指征，其進一步支持將二烯分配到葉綠醇側(cè)鏈上和在苯并二氫吡喃環(huán)上的羥基化作用。因此，指定y-tocoenoic酸4的結(jié)構(gòu)如圖12D所示。Y-Tocoenoic酸5;圖12E(5)具有表示6個不飽和度的分子式C28H4604(HRAPCI-MS)。在3125(br)和1736cm"的FTIR吸收表示存在羥基和羰基。'H和"CNMR光譜與C28H4804的光譜非常相似；唯一的差別是在半飽和苯并二氫吡喃環(huán)系統(tǒng)中的一個額外的雙鍵，其由在C6和C7之間的高脫氫傾向而形成。MS/MS光譜分析證實存在羧基，由于失水形成的片段以及由于在C12和C13之間的分裂形成的片段，CuH2302[m/z223;(C14H2503-H20)和C14H210(m/z205;C14H2302-H20)，與對于C28H4805所觀察到的相似。因此，指定Y-tocoenoic酸5的結(jié)構(gòu)如圖12E所示。Y-Tocopheric酸6(圖12F)具有表示4個不飽和度的分子式C28H5()05(HRAPCI-MS)。在3314(br)和1744cm"的FTIR吸收表示羥基和羰基。和"CNMR光譜表現(xiàn)出與C28H4804和C28H4805的光譜的一些相似性，但是也存在一些觀察到的顯著差別。相似性包括存在6個甲基，4個sp2雜化碳，和在5c174.1(C-23)的羰基樣碳，表現(xiàn)出與在Sh2.28(H-22)的次39甲基質(zhì)子的長范圍相關(guān)性。差別包括苯并二氫吡喃環(huán)系統(tǒng)的打開，'HNMR光譜表現(xiàn)出旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)，所述旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)含有在3H4.27-4.29(H-27a,dd,J=4.0,12.0Hz)禾口5H4.04-4.14(H-27b,dd,J=6.0,12.0Hz)的兩個亞甲基質(zhì)子，所述兩個亞甲基質(zhì)子彼此偶聯(lián)并且與在5H5.12(H-2，m)的次甲基質(zhì)子偶聯(lián)，這應(yīng)用'H-'HCOSY和'H-同核退偶實驗確定。另外，C28H5005的HMBC和-]HCOSY沒有表現(xiàn)出在甲基質(zhì)子和sp"碳之間的長范圍相關(guān)性，其是其它tocotrienoic酸C28H4804，C28H4805和C28H4604的共有事實，表示葉綠醇側(cè)鏈的飽和性，其將這一結(jié)構(gòu)限制為Y-生育酸的衍生物。MS/MS光譜分析證實存在羧基，由于失水形成的片段以及由于C12和C13之間的分裂的結(jié)果形成的兩種常見的片段，m/z241和223。這表明除了在C2和C3之間的開環(huán)以及葉綠醇側(cè)鏈的飽和性之外，其余的結(jié)構(gòu)特征與其它鑒定的tocoenoic酸C28H4804,C28H4805和C28H4604的那些結(jié)構(gòu)特征相似。因此，指定Y-生育酸的結(jié)構(gòu)如圖12F的6。通過分別評估它們的MS/MS斷裂數(shù)據(jù)，如在圖12G和12H中所示，組裝其余兩種生物標(biāo)記，C58H50O4(7,圖12G)和C28H5205(8,圖12H)的結(jié)構(gòu)，所述兩種生物標(biāo)記不能通過使用檢測的溶劑系統(tǒng)的制備TLC而分離。從血清中分離代謝物，并且通過NMR再次證實結(jié)構(gòu)。使用乙酸乙酯(500mL,3X)總共提取200mL血清，使用氮氣蒸發(fā)器干燥，并且將提取物在4mL甲醇中再生。將所述提取物以級分收集模式(100pL注射,40x)進行LC/MS，級分在1分鐘的窗口收集持續(xù)52分鐘。預(yù)測的代謝物，其在15-17分鐘內(nèi)洗脫下來，收集起來并且使用氮氣蒸發(fā)器濃縮至干燥(約32mg)。將在'HNMR光譜中表現(xiàn)出生育酚相關(guān)化合物的混合物的半純化的級分進行制備TLC，用CH2C12-己垸(2:l)展層，以產(chǎn)生Y-tocoenoic酸3(3.6mg)和Y-tocoenoic酸4(2.5mg)。將其余的條帶合并(約22mg)，并且進一步用于制備TLC,使用環(huán)己烷-CH2Cl2-EtOAc(35:5:1,2次)，以產(chǎn)生Y-tocoenoic酸5(3.4mg),丫-生育酸6(4.6mg)和證明是混合物的級分(6.6mg)。y-Tocoenoic酸3TLCRf=0.81(環(huán)己烷-CH2Cl2-EtOAc,10:4:1);關(guān)于'H和"CNMR光譜，參見表11和12;FTIR(cm")3315(br),2935,2852，1741，1465,1377,1178,726;HRAPCI-MSm/z:測量的447.34卯([M-H]-，關(guān)于C28H470ji~算的447.3480)。MS/MSm/z(相對強度)447([M-H〗-,50°/。)，429(45%),403(100%),385(20%),279(10%)。丫-Tocoenoic酸4TLCRf=0.21(環(huán)己烷-CH2Cl2-EtOAc,10:4:1);關(guān)于'H和。CNMR光譜，參見表11禾Q12;FTIR(cm,3347(br),2935,2868,1743,1466，1377,1057,958;HRAPCI-MSm/z:測量的463.3449([M-H]-，關(guān)于(^281^4705計算的463.3429);MS/MSm/z(相對強度)463([M-H]-,100%),445(50%)，419(90%)，401(25%)，241(20%)。Y-Tocoenoic酸5TLCRf=0.79(環(huán)己烷-CH2Cl2-EtOAc，10:4:1，UV活性點)；關(guān)于和'3CNMR光譜，參見表11禾卩12;FTIR(cm-1)3125(br),2941,2855,1736,1556,1466，1377,1177,1008,773;HRAPCI-MSm々:測量的445.3333([M-H]-,關(guān)于(:28114504計算的445.3323)。MS/MSm/z(相對強度)445([M-H]-，100%)，427(60%)，401(85%)，383(),223(12%)，205(20%),177(10%),162(18%)。Y-生育酸6TLCRf=0.62(環(huán)己垸-CH2Cl2-EtOAc,10:4:1，UV活性點)；關(guān)于和'3CNMR光譜，參見表11禾tU2;FTIR(cm'1)3314(br)，2926,2854,1744,1465,1379,1253,1145,722;HRAPCI-MSm/z:測量的465.3588([M-H]\關(guān)于(:28:4905計算的465.3585)。MS/MS附/z(相對強度)465([M-H〗',100%),447(50%),421(35%),403(20%),349(10%),279(18%)。實施例4.高通量篩査(HTS)方法研發(fā)和獨立品組的分析然后，對于應(yīng)用FTMS方法發(fā)現(xiàn)并且應(yīng)用LC-MS方法證實的6種主要的生物標(biāo)記，研發(fā)高通量的分析方法。如所述提取血清樣品用于非目標(biāo)性FTMS分析。乙酸乙酯有機級分用于分析每份樣品。向每份120pL乙酸乙酯的樣品等分試樣中加入15pL內(nèi)標(biāo)(在甲醇中的1ng/mL的(24-"C)-膽酸)，總體積135^L。自動取樣器通過流動-注射分析將100樣品注射到4000QTRAP中。載體溶劑是90%甲醇10%乙酸乙酯，流速360(^L/分鐘，進入APCI源中。MS/MSHTS方法在四極線性離子捕獲.ABI4000QTrap質(zhì)譜儀上展開，所述質(zhì)譜儀裝配TurboVTM源，具有APCI探頭。能源氣體參數(shù)如下CUR:10.0,CAD:6,NC:-3.0,TEM:400,GS1:15,界面加熱器打開。"化合物"設(shè)置如下入口電勢(EP):-10,和碰撞元件出口電勢(collisioncellexitpotential(CXP)):-20.0。本方法基于每種代謝物一種親本離子轉(zhuǎn)換，內(nèi)源持家基因的一次轉(zhuǎn)換和內(nèi)標(biāo)的單一轉(zhuǎn)換的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。每種轉(zhuǎn)換監(jiān)測250毫秒，持續(xù)2.3秒的總循環(huán)時間。每份樣品的總獲得時間是約1分鐘。完整方法的概括在圖26中顯示。概言之，本方法測量所述6種生物標(biāo)記中每一種的強度，和內(nèi)標(biāo)(IS)轉(zhuǎn)換(如在圖27A-27F中所示)，以及先前確定內(nèi)源存在于人的血清中的"持家"生物標(biāo)記轉(zhuǎn)換(圖27G)。持家生物標(biāo)記是鑒定為不隨疾病狀態(tài)改變的代謝物，并且應(yīng)該在任何正確制備的血清樣品中檢測到。因此，"持家"生物標(biāo)記的目的是保證從多個位點收集的樣品與所述HTS檢測相容。然后通過確定每名患者的所述6種測量的生物標(biāo)記IS轉(zhuǎn)換的最低平均-標(biāo)準(zhǔn)化的1og(2)轉(zhuǎn)化比例而產(chǎn)生患者得分。然后，將這一值與從正常個體產(chǎn)生的得分分布進行比較，并且因此指定CRC危險因子。我們證實使用上述方法ABI4000QTmp能夠準(zhǔn)確地測量轉(zhuǎn)換峰面積，其通過繪制6種生物標(biāo)記的每一種以及持家代謝物的生物標(biāo)記轉(zhuǎn)換相對內(nèi)標(biāo)轉(zhuǎn)換的峰面積比例而進行(圖26)。另外，HTS方法還結(jié)合一系列參照血清材料的稀釋物，其允許確定并且保證儀器的線性。如果沒有檢測到持家代謝物，或者校正曲線具有X).98的RS值，那么認為樣品運行失敗并且所述樣品需要重新運行。為了驗證所述維生素E樣分子與CRC相關(guān)的最初發(fā)現(xiàn)，使用上述HTS方法分析一個獨立的樣品組，其包括186份CRC，288份正常，24份前列腺癌，25份卵巢癌，30份腎細胞癌，25份肺癌和20份乳腺癌樣品。這種42分析的結(jié)果總結(jié)在表13A中，其表明，當(dāng)應(yīng)用-1.3的截點比例來確定誰應(yīng)該被認為處于存在CRC的高危險時(參見圖28中的正常分布和圖29的診斷輸出)，所述方法關(guān)于CRC的靈敏度約78%。這一結(jié)果無可辯駁地驗證這些新維生素E樣分子減少的水平與結(jié)腸癌的存在。然而，這里還確定橫向癌癥比較分別表明在卵巢癌中70%的靈敏度，對腎細胞和肺癌為36-40%的靈敏度。這些靈敏度值是基于對于CRC89。/。的特異性截點而選擇的(這等于約5%的假陽性率，由于正常分布，如在圖28中所示，是基于通過結(jié)腸顯微鏡檢查沒有被證實無病的個伴)。先前己經(jīng)清楚地報道，當(dāng)內(nèi)窺鏡檢查時，達到10%的平均到低危險性群體關(guān)于高級發(fā)育異常是陽性的，這不能在我們的分布中得到解釋[52]。盡管非CRC癌癥組在數(shù)量上相對少，但是檢測結(jié)果與卵巢癌的重疊是顯著的，因此卵巢癌的診斷包含在本申請中。最后，需要檢測更大的非CRC癌癥群體以驗證這些結(jié)果。我們還是要用隨機選擇的正常和CRC-陽性個體的子集來驗證由于年齡、種族、BMI和性別引起的偏好，并且在任何這些變量種類內(nèi)的所述生物標(biāo)記水平中沒有觀察到顯著的差別(表13B)。另外，我們沒有觀察到對分組為CRC階段I/II或III/IV(TNM)的患者或者對存在或不存在息肉的患者的偏好(表13B)。實施例5:在CRC和OC中紊亂的代謝途徑的生物學(xué)解釋基于6種生物標(biāo)記的結(jié)構(gòu)說明，和FTMS數(shù)據(jù)的進一步研究，假設(shè)與自由基形成和CRC相關(guān)的其它洞察力。對推定的生育酚和tocotrienal代謝物的進一步研究表明，在CRC患者群體中觀察到血清中a和Y-生育酚的濃度都顯著下降(見圖11)。我們計算a/丫-生育酚的比例為6.3，這與先前報道的文獻值一致。特別表明這樣的觀察，盡管觀察到血清ot-生育酚強度顯著高于Y的強度，但是在正常和在CRC患者中都觀察到具有與co-氧化的，生育酚/生育三烯酚代謝物相對應(yīng)的分子式的6種代謝物，所述代謝物從未在文獻中報道過，而沒有觀察到co-氧化的a-生育酚代謝物。這些發(fā)現(xiàn)與Sontag和Parker[53]最近的發(fā)現(xiàn)一致，其中表明，在人肝HepG2細胞中對于Y-生育酚的coCOOH形成比a-生育酚高出50X更多。對于生育三烯酚也已經(jīng)觀察到這種co羧化事件和隨后的生育酚成為各種羥化苯并二氫吡喃醇的代謝[17]。據(jù)信，Sontag和Parker[53]或Birringer等[17]沒有發(fā)現(xiàn)這些代謝物的原因是這些科學(xué)家所述的(O-氧化機制是在未修飾的cc-和Y-生育酚/生育三烯酚代謝物上進行的。我們的結(jié)果表明，co-氧化發(fā)生在、-生育酚/生育三烯酚己經(jīng)與自由基反應(yīng)之后，可能在結(jié)腸/卵巢上皮細胞中，或者在結(jié)腸/卵巢上皮細胞中同時發(fā)生。在CRC中觀察到減少的許多其它代謝物具有與推測鑒定為Y-生育酚或？生育三烯酚-相關(guān)的那些相似的分子式。基于碳分子數(shù)目，這些代謝物屬于三大類，具體地，它們是否具有30個、32個或36個碳(圖ll)。后來假設(shè)這些代謝物來源于Y-生育酚和來自亞麻酸、亞油酸和油酸脂質(zhì)殘基的過氧自由基之間的反應(yīng)(下文所述)。在肝臟中首次通過代謝過程中，這些Y-生育酚/生育三烯酚的代謝衍生物隨后通過P450進行co氧化。不希望受到任何具體理論的束縛，本發(fā)明公開一種假說(圖36)，通過考慮特異性脂肪酸、維生素E同種型和相關(guān)代謝物的減少的水平不是單純飲食缺乏的結(jié)果，而是維生素E和相關(guān)分子的結(jié)腸上皮攝取的消弱，而將維生素E和相關(guān)代謝物的作用包含在CRC和OC的確定和發(fā)展中。這種消弱代表在正?；蛏叩难趸瘔毫ω摀?dān)下充分提供抗氧化劑能力的限速步驟。在這種模型中，CRC或OC發(fā)展的起始事件是在結(jié)腸上皮細胞中缺乏維生素Ey。假定在兩名個體中相等的飲食，具有向結(jié)腸上皮細胞減弱的維生素E轉(zhuǎn)運的人具有升高的自由基。然后這變成直接與減少的血清維生素E代謝物成比例，如在本申請中所述。然而，所述假說還考慮到，由于對花生四烯酸的減小的競爭性抑制作用，如在本申請中先前所述，所得到的血清中減少的co-COOH代謝物水平將對前列腺素生物合成途徑具有負抑制作用。我們假設(shè)所得到的前列腺素途徑的活化參與其它上皮細胞來源的癌癥的發(fā)展，特別是卵巢癌的發(fā)展。我們還考慮到CRC中的COX途徑通過這一機制的進一步活化，其可以解釋非類固醇抗炎藥物(NSAIDS)作為CRC和其它癌癥的預(yù)防藥劑的充分確定的作用。關(guān)于CRC和OC的治療策略，這些發(fā)現(xiàn)是有意義的。在這些疾病中，炎癥是危險因素。已經(jīng)表明Y-生育酚和Y-羧基乙基羥基色原垸醇(CEHC)減少花生四烯酸介導(dǎo)的炎癥。這種Y-生育酚活性的延遲表明Y-生育酚可能是實際的生物活性分子的前體。多種C0COOH丫-生育酚/生育三烯酚代謝物的發(fā)現(xiàn)表明這些是內(nèi)源的抗炎藥劑，并且在這些代謝物中的減少可以導(dǎo)致或者成為與CRC和OC相關(guān)的炎癥的指征很久以來一直認為自由基在結(jié)腸癌的病因?qū)W中其作用[36],[54],[55]。在本申請中，我們第一次闡述完整的假說，所述假說表明CRC與慢性過氧化物壓力相關(guān)，并且y-生育酚具有獨特的抗氧化性質(zhì)，所述抗氧化性質(zhì)對于維持結(jié)腸和卵巢上皮細胞的健康氧化狀態(tài)很重要。盡管[56]提及y-生育酚的抗氧化性質(zhì)，但是假定這些性質(zhì)等價于a-生育酚的那些性質(zhì)。本發(fā)明鑒定表明？生育酚/三烯甘油酯或相關(guān)代謝物可能具有獨特的脂質(zhì)自由基清除機制的獨特的代謝物。這些發(fā)現(xiàn)對CRC和OC相對其它癌癥的高選擇性程度(表13)—一與先前的報道結(jié)合，先前的報道表明優(yōu)先將y-生育酚攝取到結(jié)腸上皮細胞中，在結(jié)腸上皮細胞中相對a-生育酚更高濃度的y-生育酚，相對生育酚提高的三烯甘油酯生物活性，和相對a-生育酚的y-生育酚提高的轉(zhuǎn)換一一是支持y-生育酚/三烯甘油酯-相關(guān)作用選擇性參與上皮細胞動態(tài)平衡的假說的有利證據(jù)。已經(jīng)充分確定，抗氧化劑隨著它們作用的過程消耗，并且這一功能實時運行；即，一天過量的抗氧化劑能力不彌補另一天不足的抗氧化劑能力。除了相對較小的再循環(huán)機制，抗氧化劑具有有限的能力和保存時間，并且一旦它們被用盡，氧化反應(yīng)不受限制地進行。由于這一原因，選擇能夠中和多種自由基分子的抗氧化劑分子將是生物學(xué)有利的。提議單個丫-生育酚/生育三烯酚分子可以中和多達6個自由基分子的機制，并且得到關(guān)于自由基傳播的分析數(shù)據(jù)和先前的文獻的支持。己經(jīng)廣泛研究了脂質(zhì)氧化的過程。圖30舉例說明不飽和脂肪酸(亞麻酸用作實例)的自動氧化過程。概言之，氫自由基從烴分子上被奪取(圖30A)。這種奪取，由光、熱、放射、金屬離子或自由基調(diào)控，相對飽和烴在不飽和烴中非常有利。在生物系統(tǒng)中，過氧化物形成是起始步驟(圖30A)。然后過氧化物自由基可以a)通過？生育酚-羥化物穩(wěn)定(圖30B)，或b)它可以與y-生育酚過氧化物自由基反應(yīng)(圖30C)，在兩種情形中都形成半穩(wěn)定的過氧化物。然后這兩種過氧化物通過鐵-催化的芬頓反應(yīng)[36]或在通過氧化氮的不依賴鐵的方式中[57],[58]轉(zhuǎn)化成羥化物自由基。盡管45已經(jīng)表明在體外解毒二氧化氮中y-生育酚優(yōu)于a-生育酚[59]，但是Stone等[60]的體內(nèi)研究清楚地證明，在用比例分別為2:l和h18的高或低y/a-生育酚比例的飲食飼養(yǎng)的大鼠中，使用推薦的每日鐵量或富含8倍的飲食，觀察到增加的鐵離子顯著減少結(jié)腸細胞中(32%)和血漿中(18%)的y-生育酚水平和在結(jié)腸細胞中的01-生育酚水平(22%)。增加的鐵對肝或糞便中的a-或y生育酚的濃度沒有影響。相對于小腸，在胃腸道中增加的鐵濃度基本上在結(jié)腸中更高。估計在結(jié)腸中的鐵濃度比在其它組織中發(fā)現(xiàn)的那些高10倍[36]。因此，在結(jié)腸中的自由基形成更可能是鐵催化的事件。羥基自由基奪取氫自由基，以形成穩(wěn)定的水分子，并且留下脂質(zhì)自由基。所有的生育酚和生育三烯酚可以中和這些羥基自由基，由此防止脂質(zhì)自由基形成。然而，當(dāng)脂質(zhì)自由基形成時，抗氧化劑的活性與它同脂質(zhì)自由基協(xié)同定位能力相關(guān)。已經(jīng)表明，維生素e同種型包含最佳的植基側(cè)鏈長度，從而結(jié)合到脂質(zhì)膜中，這使得這些分子適合消除來自膜的脂質(zhì)自由基。沒有消除的脂質(zhì)自由基容易與氧反應(yīng)以形成脂質(zhì)過氧化物自由基(圖30A)。生育酚/生育三烯酚可以為脂質(zhì)過氧化物提供氫自由基，導(dǎo)致通過chromanin結(jié)構(gòu)而穩(wěn)定的生育酚/生育三烯酚自由基和得到的脂質(zhì)氫過氧化物的形成(圖30B)。當(dāng)正常條件下，自由基傳播在這一步停止。生育酚/生育三烯酚自由基能夠與第二個脂質(zhì)過氧化物自由基反應(yīng)，形成生育酚/生育三烯酚過氧化物，其為偶電子分子(圖30C)。盡管氫/烷基過氧化物分子不是自由基，但是O-O鍵是高能量的，它的斷裂是高能有利的(圖30D)。已知促進氫過氧化物斷裂的兩種最有潛力的催化劑是銅和鐵。由于在本申請中先前已經(jīng)提及，大腸是特別集中的鐵來源。因此，這些氫過氧化物可以斷裂成羥基自由基和脂質(zhì)氧化物自由基，由此重新起始自由基傳播順序。如同游離脂質(zhì)氫過氧化物，推測在鐵或銅存在下，生育酚/生育三烯酚過氧化物對斷裂敏感。本發(fā)明提出關(guān)于這種過氧化物內(nèi)部降解成為穩(wěn)定的生育酚/生育三烯酚烷基醚和脂質(zhì)酵的新機制。所提出的反應(yīng)產(chǎn)生兩種熱動力學(xué)穩(wěn)定的產(chǎn)物。提出由在內(nèi)源脂質(zhì)中存在的三種主要不飽和脂肪酸殘基一一亞麻酸、亞油酸和油酸一一形成的過氧化物，通過這種機制被生育酚/生育三烯酚中和(圖31a-c)。這種機制似乎是y-生育酚選擇性的，并且得到這樣的觀察的支持，即，在人中形成C30、C32和C36，丫-生育酚而不是a-生育酚的副產(chǎn)物。對于通過起始氫過氧化物的降解產(chǎn)生穩(wěn)定的產(chǎn)物不存在這樣的機制，所述起始氫過氧化物從在鐵存在下降解的中性生育酚/生育三烯酚反應(yīng)產(chǎn)生(圖32)。這一反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基和脂質(zhì)氧化物自由基，并且因此需要通過常規(guī)方法進行中和。所述脂質(zhì)氧化物自由基可以自發(fā)降解成醛和自由基烷烴或烯烴(圖33)。我們提出生育酚/生育三烯酚可以中和得到的自由基垸烴的另外的機制。我們提議y-生育酚/生育三烯酚的不受阻礙的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)可以接受來自自由基烷烴的氫自由基，形成環(huán)-穩(wěn)定的生育酚/生育三烯酚自由基和穩(wěn)定的烯烴(圖34)。通過這種機制，y-生育酚/生育三烯酚將能夠中和多達6種烷烴自由基。這種假說得到y(tǒng)-生育酚代謝物的觀察的支持，其中所述芳香環(huán)還原成單一的雙鍵。因此，表明y-生育酚可以接受最多4個氫自由基(圖34)。這兩種機制的結(jié)果，一分子y-生育酚/生育三烯酚能夠中和6分子自由基。如先前所討論，在肝臟中首次通過代謝過程中，由這些提議的機制導(dǎo)致的丫-生育酚-相關(guān)代謝物通過P450進行co-氧化(圖35)。參考文獻1.Boyle,P.禾口M.E.Leon,E^'afew/o/ogyo/co/orecta,ca"cer(結(jié)腸直腸癌流行病學(xué)).BrMedBull，2002.64:第1-25頁.2.Ahlquist,D.A,，等，尸eca/6/ocxi/eve/sz'"Aea/Aa"<ij*辦,>gT/emogz^mK健康和疾病中的便血水平.應(yīng)用HemoQuant的研究).NEnglJMed(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志),1985.312(22):第1422-8頁,3.Winawer,S.,等,Co/orecto/c""cerweew/"g朋dswrvez7/a"ce,'c//w'ca/gta,de/z'wesawe/ra"o"a/e-^da&6asedwewev,'c3fe"ce(纟吉腸直腸癌蹄查禾口監(jiān)督基于新跡象的臨床指導(dǎo)和原理-更新).(3astroenterology(腸胃病學(xué))，2003.124(2):第544-60頁.4.Rex,D.K.,等,C。/orecto//revew"'cwrecomwe"(ia&'07Mo/」werz'c<3"Cb〃egeo/Gas^roe"ero/ogy(鄉(xiāng)吉月l/直月湯癌預(yù)防2000:美國腸胃病學(xué)學(xué)院的篩查建議).AmericanCollegeofGastroenterology(美國腸胃病學(xué)學(xué)院).AmJGastroenterol(美國腸胃病學(xué)雜志)，2000.95(4):第868-77頁.5.Hixson,L丄,等,尸mspec"ve加辦o/f/e7fe《wewc7必fn'6幼'o"。/，/;^mz'M^co/omwcopj(結(jié)腸顯微鏡檢查遺漏的息肉的頻率和大小分布的預(yù)測研究).JNatlCancerInst(國家癌癥協(xié)會雜志)，1990.82(22):第1769-72頁.6.Lidofsky,S.,Detectionandpreventionofcoloncancer:colonoscopy,virtualcolonoscopy,andDNAstooltests(結(jié)腸癌的測和預(yù)防結(jié)腸顯微鏡檢查，虛結(jié)腸顯微鏡檢査，和DNA大便檢測).MedHealthRI(羅得島醫(yī)學(xué)和健康)，2005.88(3):第82-5頁.7.Davies,R丄，R.Miller,禾卩N.Coleman,Co/orecto/c<a"cer^cree"/"gvpra，加/ormo/ecw/or加o/a"a/戸's(結(jié)腸直腸癌篩査分子大便分析的前景),NatRevCancer(自然癌癥綜述),2005.5(3):第199-209頁.8.Screem'"gT^ovaWa"ca"ce廣'recomwem/加'ow加fe777eMf(篩查卵巢癌建議綜述).AnnFamMed(家庭醫(yī)學(xué)年刊)，2004.2(3):第260-2頁.9.Chu,CS.禾口S.C.Rubin，Screem7govarz'awca"cer〃犯geem/;wpw/fl"'o"(在普通群體中篩查卵巢癌).BestPractResClinObstetGynaecol(臨床產(chǎn)科學(xué)和婦科學(xué)的最佳實踐和研究)，2005.10.Haraia，L.禾口M.Adams,iVeve""owo/ovanb"ca"ce廠(卵巢癌預(yù)防).BestPractResClinObstetGynaecol(臨床產(chǎn)科學(xué)和婦科學(xué)的最佳實踐和研究),2005.11.Rosenthal,A,禾口I.Jacobs,T^mz7/a/ovan'awca"cerscreem."g(家族卵巢癌篩査).BestPractResClinObstetGynaecol(臨床產(chǎn)科學(xué)和婦科學(xué)的最佳實踐和研究)，2005.12.Cook,M.G.禾卩P.McNamara,^fe"0/v/tomZ"五c^'wef/7;v//y^iraz/e-z>Z(iMcedco/om.cfwmors&wz.ce(在/j、歸、中t欠食鄉(xiāng)佳生素E對二甲肼-誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤的作用的).CancerRes(癌癥研究)，1980.40(4):第1329-31頁.13.Coulter,I.D.,等,AntioxidantsvitaminCandvitamineforthepreventionandtreatmentofcancer(抗氧化劑維生素C和維生素e用于癌癥的預(yù)防和治療).JGenInternMed(普通內(nèi)科醫(yī)學(xué)雜志)，2006.21(7):第735-44頁.14.Theriault,A.,等,Tocotrienol:areviewofkstherapeuticpotential(生育三烯酚其治療潛力的綜述).ClinBiochem(臨床生物化學(xué))，1999.32(5):第309-19頁.15.Serbinova,E,,等，F(xiàn)reeradicalrecyclingandintramembranemobilityintheantioxidantpropertiesofalpha-tocopherolandalpha-tocotrienol(在a-生育酚和a-生育三烯酚的抗氧化劑性質(zhì)中的自由基再循環(huán)和膜內(nèi)移動).FreeRadicBiolMed(自由基生物醫(yī)學(xué)),1991.10(5):第263-75頁.16.Lee,B.L.,A丄.New,禾卩C,N.Ong,iSVmw/towe。wscfefe環(huán)/"加'owo/人血清中同時確定生育三烯酚、生育酚、視黃醇和主要的類胡蘿卜素).ClinChem(臨床化學(xué)),2003.49(12):第2056-66頁.17.Birringer,M.,等,IdentitiesanddifferencesinthemetabolismoftocotrienolsandtocopherolsinHepG2cells(在'HepG2細胞中生育三烯酚和生育酚代謝的相同和差別).JNutr(營養(yǎng)學(xué)雜志)，2002.132(10):第3113-8頁18.Bieri,J.G.禾口R.P.Evarts,Gam/watoco_p/7.era/.'/weto^o/z'sm,6z.o/ogz'ca/aw/w'gmyctmcez,"/z畫anw.tom/"五(y-生育酚在人維生素E營養(yǎng)中的代謝、生物活性和重要性).AmJClinNutr(美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志)，1974.27(9):第980-6頁.19.Traber，M.G.,DeterminantsofplasmavitaminEconcentrations(血漿維生素E濃度的確定).FreeRadicBiolMed(自由基生物醫(yī)學(xué))，1994.16(2):第229-39頁.20.Princen,H.M.,等,5"wp//emew^if/owwzY/z/ow(ioseso/v"am^z五protectsLD丄々cw/z)/(ipemx7'(ia〃owz>we"wcwew(在男人禾口女人中補充低齊!j量的維生素E防止LDL脂質(zhì)過氧化作用).ArteriosclerThrombVaseBiol(動脈硬化、血栓和血管生物學(xué))，1995.15(3):第325-33頁.21.Schaffer,S,,W.E.Muller,禾口G.REckert,Tbcofn'ewo/ivcora故wfz'o"(2/e#ectoag^gcfeea"(生育三烯酚在衰老和疾病中的組成性作用).JNutr(營養(yǎng)學(xué)雜志)，2005.135(2):第151-4頁.22.Winklhofer-Roob,B,M"M.A.van'tHof,禾口D.H.Shmerling,i咖雷eSw&s;opw/a",on力"附,o"(iw/f/wc^'"i^'Miteii々ri"eayo"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2S.0b2723.824.530.1b21.6621.0b62.928litrr:919:2*2911.811,819.8b12.3bU.7bM言號從在HMQC和HMBC光譜中的交叉峰的位置確定和指定.b指定可以相反75<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>B西班牙人/男性相對年齡<60BMI<25有息肉相階段I/II亞洲l人相女性歲相對〉相對>25對無息肉相對III/IV對白種人60歲p-值0.310.620.330,240.250.56140名CRC-陽性的西班牙人/亞洲人，40名正常的西班牙人/亞洲人，40名CRC-陽性白種人和40名正常的白種人2所有受試者320名CRC-陽性〈60歲，20名正常<60歲，20名CRC-陽性〉60歲，20名正常〉60歲425名CRC-陽性BMI<25，25名正常BMI<20，25名CRC-陽性BMI>25，25名正常BMI〉25529名CRC-陽性有息肉，29名CRC-陽性無息肉630名CRC-陽性TNM階段I或II,30名CRC-陽性TOM階段III或IV權(quán)利要求1.鑒定用于在受試者中診斷結(jié)腸直腸癌(CRC)或卵巢癌(OC)的代謝物標(biāo)記的方法，其包括步驟將來自表現(xiàn)出結(jié)腸直腸癌的患者的樣品引入到高分辨率質(zhì)譜儀中，所述樣品含有多種未鑒定的代謝物；獲得、鑒定并且定量關(guān)于所述代謝物的數(shù)據(jù)；生成所述鑒定和定量的數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫；將來自所述樣品的鑒定和定量數(shù)據(jù)與來自對照樣品的相應(yīng)的數(shù)據(jù)進行比較；鑒定有差別的一種或多種代謝物，其中一種或多種所述代謝物可以用于在受試者中診斷結(jié)腸直腸癌和卵巢癌。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述代謝物選自由在表3中列出的代謝物組或它們的片段或衍生物組成的組。3.權(quán)利要求2的方法，其還包括選擇最佳診斷所需的最小數(shù)目的代謝物標(biāo)記的步驟。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述高分辨率的質(zhì)譜儀是傅里葉變換離子回旋加速共振質(zhì)譜儀(FTMS)。5.權(quán)利要求3的方法，其中所述代謝物選自由下列各項組成的組具有或基本上等于446.3406,448.3563，450.3726,464.3522,466.3661,468.3840,538.4259,592.4711和594.4851的以道爾頓測量的精確中性質(zhì)量的代謝物，或其片段或衍生物。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述代謝物選自由下列各項組成的組具有或基本上等于446.3406,448.3563，450.3726,464.3522,466.3661,468.3840，538.4259,592.4711和594.4851的以道爾頓測量的精確中性質(zhì)量和在圖13-21中任一附圖中所示的LC-MS/MS片段模式的代謝物或其片段或衍生物。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述代謝物選自由具有下列分子式的代謝物組成的組C28H4604,C28H4804,C28H50O4,C28H4805,C28H50O5C28H5205,C32H5806,C36H6406和C36H6606。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述代謝物是生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物的代謝衍生物。9.CRC/OC癌-特異性代謝標(biāo)記，其選自由在表3中列出的代謝物或它們的片段或衍生物組成的組。10.權(quán)利要求9的標(biāo)記，其選自由具有或基本上等于446.3406,448.3563，450.3726,464.3522,466.3661,468.3840,538.4259,592.4711,和594.4851的精確中性質(zhì)量(以道爾頓測量)的代謝物或其片段或衍生物組成的組，其中+/-5ppm的差別將指示相同的代謝物。11.權(quán)利要求10的標(biāo)記，其中所述標(biāo)記選自由下列各項組成的組具有或基本上等于446.3406,448.3563,450.3726,464.3522,466.3661,468.3840,538.4259,592.4711和594.4851的以道爾頓測量的精確中性質(zhì)量和在圖13-21中任一附圖中所示的LC-MS/MS片段模式的代謝物或其片段或衍生物。12.權(quán)利要求ll的標(biāo)記，其中所述標(biāo)記選自由具有下列分子式的代謝物組成的組C28H4604,C28H4804,C28H50O4,C28H4805,C28H50O5,C28H5205,C32H5806,C36H6406和C36H6606。13.權(quán)利要求12的標(biāo)記，其中所述代謝物是生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物的代謝衍生物。14.診斷患者存在CRC或OC或者處于發(fā)展CRC或OC的危險中的方法，其包括步驟篩查來自所述患者的樣品存在或不存在一種或多種代謝物標(biāo)記，所述代謝物標(biāo)記選自由在表3列出的代謝物或其片段或衍生物組成的組，其中在一種或多種所述代謝物標(biāo)記強度中的差別指示CRC或OC的存在，或者發(fā)展CRC或OC的危險。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述代謝物標(biāo)記選自由具有或基本上等于446.3406,448.3563,450.3726,464.3522,466.3661,468.3840，538.4259,592.4711和594.4851的精確中性質(zhì)量的代謝物標(biāo)記或其片段或衍生物組成的組；其中一種或多種所述代謝物標(biāo)記的不存在指示CRC或OC的存在，或者發(fā)展CRC或OC的危險。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述標(biāo)記選自由下列各項組成的組具有或基本上等于446.3406,448.3563,450.3726,464.3522，466.3661,468.3840,538.4259,592.4711和594.4851的以道爾頓測量的精確質(zhì)量和在圖13-21中任一附圖中所示的LC-MS/MS片段模式的代謝物或其片段或衍生物。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述標(biāo)記選自由具有下列分子式的代謝物組成的組C28H4604，C28H4804，C28H50O4,C28H4805，C28H50O5:C28H5205,C32H5806,C36H6406和C36H6606。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述代謝物是生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物的代謝衍生物。'19.在未知疾病狀態(tài)的測試受試者中診斷CRC或OC的存在或不存在或者處于發(fā)展CRC或OC的危險中的方法，其包括獲得來自所述測試受試者的血液樣品；分析所述血液樣品，以獲得關(guān)于選自由表3列出的代謝物或其片段或衍生物組成的組的分子的定量數(shù)據(jù)；將在所述測試受試者中獲得的關(guān)于所述分子的定量數(shù)據(jù)與從多名CRC-或OC-陽性的人的所述分子獲得的定量數(shù)據(jù)或從多名CRC-或OC-陰性的人獲得的定量數(shù)據(jù)進行比較；應(yīng)用所述比較來確定所述測試受試者是CRC或OC陽性或陰性或處于發(fā)展CRC或OC的危險的概率。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述分子選自由通過446.3406,448.3563,450.3726,464.3522，466.3661,468.3840,538.4259,592.4711和594.4851的精確中性質(zhì)量鑒定的分子或者具有基本上等于這些分子的質(zhì)量的分子或它們的片段或衍生物組成的組。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述分子選自由下列各項組成的組具有或基本上等于446.3406,448.3563,450.3726，464.3522,466.3661,.3840,538.4259，592.4711和594.4851的以道爾頓測量的精確中性質(zhì)量和在圖13-21中任一附圖中所示的LC-MS/MS片段模式的分子或其片段或衍生物。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述分子選自由具有下列分子式的分子組成的組C28H4604,C28H4804,C28H50O4,C28H4805,C28H50O5,C28H5205,C32H5806,C36H6406和C36H6606。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述分子是生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物的代謝衍生物。24.權(quán)利要求22的方法，其中所述分子通過液體層析一質(zhì)譜(LC-MS)方法或直接注射三聯(lián)—四極質(zhì)譜方法進行分析。25.權(quán)利要求24的方法，其中測量每一種所述分子的強度轉(zhuǎn)換和內(nèi)標(biāo)的強度轉(zhuǎn)換。26.權(quán)利要求25的方法，其中患者得分通過為所述患者確定所述分子中的最低平均一標(biāo)準(zhǔn)化的1og(2)轉(zhuǎn)換比例而產(chǎn)生。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述患者得分與從正常個體產(chǎn)生的患者得分比較，由此診斷CRC或OC的存在或不存在，或者發(fā)展CRC或OC的危險。28.鑒定和診斷將從抗氧化劑治療受益的個體的方法，其包括步驟獲得來自所述測試受試者的血液樣品；分析所述血液樣品，以獲得關(guān)于生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物種類的代謝衍生物的全體或子集的定量數(shù)據(jù)；將在所述測試受試者中關(guān)于所述分子獲得的定量數(shù)據(jù)與從多名CRC-或OC-陰性的人的分析獲得的參考數(shù)據(jù)進行比較；并且應(yīng)用所述比較來確定所述測試受試者將受益于所述治療的可能性。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物種類的代謝衍生物選自由表3列出的代謝物或其片段或衍生物組成的組。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物種類的代謝衍生物選自具有或基本上等于446.3406,448.3563,450.3726,464.3522,466.3661,468.3840,538,4259，592.4711,和594.4851的精確中性質(zhì)量(以道爾頓測量)的代謝物或其片段或衍生物組成的組，其中+/-5ppm的差別將指示相同的代謝物。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物種類的代謝衍生物選自由下列各項組成的組具有或基本上等于446.3406，448.3563,450.3726,464.3522,466.3661，468.3840，538.4259,592.4711和594.4851的以道爾頓測量的精確中性質(zhì)量和在圖13-21中任一附圖中所示的LC-MS/MS片段模式的代謝物或其片段或衍生物。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物種類的代謝衍生物選自由具有下列分子式的代謝物組成的組C28H4604,C28H4804,C28H50O4,C28H4805,C28H50O5,C28H5205,C32H5806,C36H6406和C36H6606。33.診斷應(yīng)答于被設(shè)計用于預(yù)防、治愈、或穩(wěn)定CRC或OC或改善與CRC或OC相關(guān)的癥狀的飲食、化學(xué)、或生物學(xué)治療策略的個體的方法，其包括步驟通過單次收集或隨時間的多次收集從所述測試受試者獲得一份或多份血液樣品；分析所述生物樣品，以獲得關(guān)于生育酚、生育三烯酚、維生素E樣分子、或所述代謝物種類的代謝衍生物的全體或子集的定量數(shù)據(jù)；將在所述測試受試者樣品中關(guān)于所述分子獲得的定量數(shù)據(jù)與從來自多名CRC-或OC-陰性的人的所述分子而獲得的參考數(shù)據(jù)進行比較；并且應(yīng)用所述比較來確定所述測試受試者的代謝狀態(tài)是否在所述治療策略過程中得到改善。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物種類的代謝衍生物選自由表3列出的代謝物或其片段或衍生物組成的組。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物種類的代謝物衍生物選自具有或基本上等于446.3406,448.3563,450.3726,464,3522,466.3661,468.3840,538.4259,592.4711,和594.4851的精確中性質(zhì)量(以道爾頓測量)的代謝物或其片段或衍生物組成的組，其中+/-5ppm的差別將指示相同的代謝物。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物種類的代謝衍生物選自由下列各項組成的組具有或基本上等于446.3406，448.3563，450.3726,464.3522,466.3661,468.3840,538.4259，592.4711和594.4851的以道爾頓測量的精確中性質(zhì)量和在圖13-21中任一附圖中所示的LC-MS/MS片段模式的代謝物或其片段或衍生物。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述生育酚、生育三烯酚、維生素E-相關(guān)的代謝物或所述代謝物種類的代謝衍生物選自由具有下列分子式的代謝物組成的組C28H4604,C28H4804,C28H50O4,C28H4805,C28H50O5,C28H5205,C32H5806,C36H6406和C36H6606。全文摘要本發(fā)明涉及結(jié)腸直腸癌和卵巢癌(分別為CRC和OC)的診斷。本發(fā)明描述內(nèi)源小分子和CRC或OC之間的關(guān)系。具體地，本發(fā)明涉及通過測量維生素E-同種型及相關(guān)的代謝物而診斷CRC和OC。本發(fā)明還涉及在所述方法中鑒定的診斷標(biāo)記。本發(fā)明涉及CRC的潛伏情形和癥狀之前的階段，CRC各個階段和嚴重性的診斷，CRC的早期檢測，監(jiān)測并且診斷治療對CRC和OC健康狀態(tài)的作用。文檔編號G01N33/574GK101263391SQ200680033461公開日2008年9月10日申請日期2006年9月12日優(yōu)先權(quán)日2005年9月12日發(fā)明者肖恩·里奇,達揚·古登奧韋申請人:菲諾梅諾米發(fā)現(xiàn)公司