專利名稱：維生素d化合物的釋放試劑的制作方法
維生素D化合物的釋放試劑背景信息本發(fā)明涉及用于釋放與維生素D -結(jié)合蛋白相結(jié)合的維生素D化合 物的試劑組合物，用于檢測25-羥基維生素D化合物的方法，其中通過 使用這種試劑，25-羥基維生素D化合物從維生素D-結(jié)合蛋白中釋放， 并且分析如此所獲得的混合物。本發(fā)明還涉及用于釋放維生素D化合物 的試劑的用途以及檢測25-羥基維生素D的試劑盒，其包含用于釋放除 常見免疫試劑之外的維生素D化合物的試劑。維生素D的充分供給是必需的，如術(shù)語"維生素(vitamin)，，早已暗示 的那樣。維生素D的缺乏導(dǎo)致嚴重的疾病如詢僂病或者骨質(zhì)疏松。雖然 在上個世紀的早期，維生素D仍然被看作一種單一物質(zhì)，但是在過去的 三十年內(nèi)，維生素D系統(tǒng)已經(jīng)變?yōu)橐环N維生素D代謝產(chǎn)物的復(fù)雜且多 樣的網(wǎng)絡(luò)。如今，40種以上的不同的維生素D代謝產(chǎn)物是已知的 (Zerwekh, J.E., Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281)。人類只能通過來自陽光的紫外線作用于皮膚上而產(chǎn)生D3維生素或 者維生素D2(calciferols)。在皮膚中產(chǎn)生的維生素D3結(jié)合到所謂的維生 素D-結(jié)合蛋白，其將它輸送到肝臟中，在此通過25-羥基化作用將它轉(zhuǎn) 化為25-羥基維生素D3。除皮膚和肝臟之外，許多其它組織目前已知涉 及維生素D新陳代謝，而上述兩個器官早已在下述文獻中提及，(參考 Schmidt-Gayk, H. et al. (eds.), "Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic AMP", Springer Verlag, Heidelberg (1990) pp. 24-47)。 25-羥基維生素D，更具體地說，25-羥基維生素D2和25-羥基維 生素D3，就其數(shù)量而言，是人有機體中的重要存儲形式。當需要時，這 些前體可以在腎中轉(zhuǎn)化而形成生物活性的la,25-二羥基維生素D，所謂 的D激素。生物活性的維生素D尤其調(diào)節(jié)從腸的鈣吸收、骨礦化，并 且影響許多其它代謝途徑如胰島素體系。測量維生素D水平本身是沒有多少益處的，當測定患者的維生素D 狀況時，因為取決于食物吸收，維生素D(維生素D2和維生素D》的濃度 變化很大。另外，在循環(huán)(24小時)中維生素D具有較短的生物半衰期，因此出于這種原因也不是合適的測定患者的維生素D狀況的參數(shù)。同樣也適用于生理活性形式的維生素D(l,25-二羥基維生素D)。這些生物活 性形式同樣以較小的且較大變化的濃度存在，相比于25-羥基維生素D 而言。由于全部這些原因，特別地，25-羥基維生素D的量化是一種合 適的全面分析患者的總的維生素D狀況的手段。25羥基維生素D或者其它維生素D化合物對維生素D-結(jié)合蛋白的 結(jié)合使得維生素D化合物的測定極大地復(fù)雜化。全部已知的方法要求待 分析的維生素D化合物從其與結(jié)合蛋白形成的復(fù)合物中釋放或者分離。 在下文中，為了簡化的目的，這被稱為從維生素D-結(jié)合蛋白中釋放維生 素D化合物，雖然當然其只能從維生素D化合物和維生素D-結(jié)合蛋白 的復(fù)合物中，而不是單獨地從維生素D-結(jié)合蛋白中被釋放。因為維生素D-結(jié)合蛋白具有恰當再摺起的高傾向，通常需要首先釋 放維生素D化合物，然后使待被分析的維生素D化合物與維生素D-結(jié) 合蛋白分離。由于25-羥基維生素D的高的臨床價值，許多方法從文獻中是已知 的，這使得25-羥基維生素D可以或多或少:故可靠地測定。Haddad, J.G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995, and Eisman, J.A. et al., Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305例如描述了使用高 壓液相色譜(HPLC)測定血液樣品中25-羥基維生素D的濃度。其它測定25-羥基維生素D的方法尤其是基于使用維生素D結(jié)合蛋 白，如牛奶中存在的那些。因此，Holick, M.F.和Ray, R. (US 5,981,779) 以及DeLuca等(EP 0 583 945)描述了用于羥基維生素D和二羥基維生 素D的維生素D分析，其基于這些物質(zhì)結(jié)合到維生素D-結(jié)合蛋白，其 中這些物質(zhì)的濃度是通過竟爭性測試程序測定的。然而，這種方法的先 決條件是待測定的維生素D代謝產(chǎn)物首先必需從原始的血液或者血清 樣品中分離并且必需通過例如色諳進行純化。Armbruster, F.P.等(W099/6721 l)教導(dǎo)了為通過乙醇沉淀法進行維 生素D測定，應(yīng)當制備血清或者血漿樣品。在這種方法中，通過離心作 用除去蛋白質(zhì)沉淀物，并且乙醇(ethanolic)上清液包含可溶維生素D代 謝產(chǎn)物。這些可以在竟爭性結(jié)合分析中進行測量?；蛘?，EP 0753743教導(dǎo)了蛋白質(zhì)可以和血液或者血清樣品分離，使 用高碘酸鹽。在這種情況下，在獲自用高碘酸鹽處理的樣品的無蛋白質(zhì)的上清液中測定維生素D化合物。在一些商業(yè)測試中，乙腈被推薦用于萃取血清或者血漿樣品(例如，在DiaSorin的放射免疫分析中或者在 "Immundiagnostik"公司的維生素D測試中)。最近幾年中，許多不同的釋放試劑被提出，其原則上應(yīng)當適于從樣 品中存在的結(jié)合蛋白中釋放維生素D化合物。然而，這種釋放或者脫附 (detachment)應(yīng)當在較溫和條件下進行，使得能夠在結(jié)合測試中直接使用 用釋放試劑處理的樣品(參見例如WO 02/57797和US 2004/0132104)。最 近幾年中雖然進行了很多努力，但是用于測定維生素D的所有可得的方 法具有缺點，如費力的樣品制備，差的標準化，測試程序間的差的協(xié)調(diào) 性或者加料(spiked)維生素D的差的回收(就此特別參見Zerwekh, J.E., 見上文)。特別難以使維生素D化合物的測試自動化。自動化要求解決非常困 難的問題，即鋼絲行走生存(surviving a tightrope walk): —方面，必需在 合適的釋放試劑的幫助下從維生素D-結(jié)合蛋白中釋放維生素D化合物， 另 一 方面，條件必需被選擇使得所述樣品可以直接進行進一 步的分析。 這種直接進一步的分析的先決條件是， 一方面，維生素D-結(jié)合蛋白在這 種分析期間沒有結(jié)合或者不再顯著地結(jié)合維生素D化合物并由此不妨 礙這種分析，而另一方面，所用的釋放試劑沒有妨礙檢測試劑如抗體結(jié) 合到待檢驗的維生素D-結(jié)合蛋白。另外，眾所周知，維生素D-結(jié)合蛋 白的不同的等位基因存在于人群中，其生物化學(xué)行為不同。維生素D化 合物的釋放和測量應(yīng)當對于各種等位基因/表型是可比較的。因此,本發(fā)明的目的是開發(fā)一種用于維生素D化合物的釋放試劑， 特別是用于羥基維生素D化合物的釋放試劑，其可以至少部分地解決現(xiàn) 有技術(shù)的問題。在下文中描述了并且由所附權(quán)利要求涵蓋了用于釋放維 生素D化合物的合適的試劑組合物，用于測定25-羥基維生素D化合物 的方法，試劑組合物的用途和使用該試劑組合物的用于測定25-羥基維 生素D化合物的試劑盒。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種從維生素D-結(jié)合蛋白中釋放維生素D化合物的試 劑組合物，其具有3.8-4.8的pH值并且包含5-30vol。/。的一種或多種選自 二甲亞砜(DMSO)和液體有機酰胺的兩性試劑以及任選地0.7-8volQ/。的短 鏈(C1-C3)醇。此外，本發(fā)明涉及一種免疫檢測25-羥基維生素D化合物的方法， 包括以下步驟a)混合待檢驗的樣品與用于從維生素D-結(jié)合蛋白中釋 放維生素D化合物的試劑，這形成了混合物，該混合物具有3.8-4.8的 pH值并且包含5-20volQ/。的一種或多種選自二曱亞砜(DMSO)和液體有 機酰胺的兩性試劑以及任選地0.5-5vol。/o的短鏈(Cl-C3)醇，和b)免疫分 析獲自a)的混合物。另外，描述了本發(fā)明的試劑組合物如何可用于從維生素D-結(jié)合蛋白 中釋放維生素D化合物。另外，公開了一種用于檢測25-羥基維生素D的試劑盒，其包含測 試程序所需的試劑和用于從維生素D-結(jié)合蛋白中釋放維生素D化合物 的根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物。在第一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及用于從維生素D-結(jié)合蛋白中 釋放維生素D化合物的試劑組合物，其具有3.8-4.8的pH值并且包含 5-30volQ/o的一種或多種選自二甲亞砜(DMSO)和液體有機酰胺的試劑以 及任選地0.7-8vol。/。的短鏈(Cl-C3)醇。液體有機酰胺全部是在20。C溫度下是液體的那些有機酰胺。優(yōu)選 的有機酰胺是二曱基曱酰胺(DMF)、曱基乙基-甲酰胺、N-曱基吡咯烷酮 (N-MP)、 N,N-二甲基乙酰胺、四甲基脲(TMU)、 1,3-二甲基-3,4,5,6-四氬 -2(1H)-嘧啶酮(DMPU)和六曱基磷酸三酰胺(HMPT)。根據(jù)本發(fā)明可以用于維生素D釋放試劑的化學(xué)試劑的基團具有常 見的特征，即它們是兩性化合物。用于釋放維生素D的試劑組合物更優(yōu) 選地包含7-20%的所述兩性試劑。釋放試劑優(yōu)選地包含DMSO、 DMF、 N-MP和/或DMPU。原則上，上述兩性試劑中的一些的混合物，例如由一些液體酰胺組 成的，可以存在于根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物中。優(yōu)選地，使用上述的兩 性試劑中的僅僅三個、更優(yōu)選地，僅僅兩個，還優(yōu)選地僅僅一個。還優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物的pH值是pH3.8-pH4.6,更優(yōu) 選地pH3.9-pH4.5,還優(yōu)選地pH4.0-pH4.5。如上所述，釋放試劑可以另外包含0.7-7vol。/。的短鏈(Cl-C3)醇。已 經(jīng)證明了當這種短鏈醇也存在于釋放試劑中時，是有利的。短鏈醇的比 例優(yōu)選的是0.8-5voP/0。在本發(fā)明的意義內(nèi)，短鏈醇是甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇。乙醇已 被特別證明是適合作為短鏈醇的，因此它是更優(yōu)選的。用于從維生素D-結(jié)合蛋白中釋放維生素D化合物優(yōu)選的試劑組合 物具有3.8-4.8的pH值，包含5-30volQ/o的一種或多種選自二曱亞砜 (DMSO)和液體有機酰胺的試劑以及0.7-8volQ/c)的短鏈(Cl-C3)醇。除維生素D本身之外，獲自維生素D新陳代謝的其它已知的化合 物結(jié)合到維生素D-結(jié)合蛋白。在人群中維生素D-結(jié)合蛋白的基因編碼 以不同的等位基因的形式出現(xiàn)。眾所周知通過這些等位基因編碼的多肽 在生物化學(xué)上是不同的，即它們導(dǎo)致不同的表型。這些生物化學(xué)的差異 還影響了維生素D化合物的結(jié)合和釋放。根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物適于 獨立于維生素D-結(jié)合蛋白的表型而釋放維生素D化合物。因此，本發(fā) 明的優(yōu)選的實施方案是根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物用于從維生素D -結(jié)合 蛋白中釋放維生素D化合物，或者如上所述用于從維生素D-結(jié)合蛋白 和維生素D化合物的配合物中釋放維生素D化合物的用途。根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物另外優(yōu)選地用于在那些包含或者可能包 含不同表型的維生素D-結(jié)合蛋白的樣品中釋放維生素D化合物。為了從維生素D-結(jié)合蛋白中釋放維生素D化合物，根據(jù)本發(fā)明的 試劑組合物與樣品(優(yōu)選地血清或者血漿)混合。釋放試劑和樣品的混合 比優(yōu)選的是10:1-1:10。另夕卜，優(yōu)選的是混合約1/3-3體積份更優(yōu)選地1/2-2體積份釋放試劑 與1體積份樣品。緩沖液組成和濃度由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇，使得在用維生素D的免 疫物質(zhì)培養(yǎng)期間調(diào)節(jié)兩性試劑的規(guī)定的pH范圍和期望的濃度。根據(jù)本 發(fā)明的試劑組合物優(yōu)選地包含20mM-400mM緩沖液部分。所述緩沖液 部分特別優(yōu)選地為30mM-350mM或者50mM-300mM。另外，本發(fā)明涉及一種免疫檢測25-羥基維生素D化合物的方法， 包括以下步驟a)混合待檢驗的樣品與用于從維生素D-結(jié)合蛋白中釋 放維生素D化合物的試劑，這形成了混合物，該混合物具有3.8-4.8的 pH值并且包含5-20vol。/。的一種或多種選自二曱亞砜(DMSO)和液體有 機酰胺的兩性試劑以及任選地0.5-5vol。/。的短鏈(Cl-C3)醇，和b)免疫分 析獲自a)的混合物。對免疫檢測根據(jù)本發(fā)明的25-羥基維生素D化合物必不可少的是獲自樣品的25-羥基維生素D化合物(-分析物)在上述用于混合物的條件下 用免疫物質(zhì)進行培養(yǎng)。在這種培養(yǎng)期間，pH特別優(yōu)選的是pH4.0-pH4.5。 根據(jù)本發(fā)明選擇的兩性試劑的濃度優(yōu)選的是7-15vol%，更優(yōu)選地 8-12vol%,在用免疫試劑培養(yǎng)分析物期間。在用免疫試劑的所述培養(yǎng)期 間，短鏈醇的濃度優(yōu)選的是0.7-1.5vol%,更優(yōu)選地，0.8-1.2vol%。如果沒有另外敘述，術(shù)語"維生素D化合物"將被理解為包括包含根 據(jù)以下結(jié)構(gòu)式I和II的維生素D2的主鏈或維生素D3的主鏈的所有化合 物。式I<formula>formula see original document page 8</formula>在結(jié)構(gòu)式I和II中，根據(jù)類固醇命名法，描述了維生素D的位置。25-幾基維生素D表示維生素D代謝產(chǎn)物，其在結(jié)構(gòu)式I和II,即25-羥 基維生素D2以及25-羥基維生素D3的位置25處羥基化。另外的25-羥 基-維生素D化合物是1,25和24,25-二羥基維生素D形式。1,25-二羥基維生素D是指在結(jié)構(gòu)式I和II的位置1以及位置25處 具有鞋基化作用的維生素D的活性形式(所謂的D激素)。其它已知的維生素D代謝產(chǎn)物是24-， 25-二羥基維生素D2和24,25-二羥基維生素D3。優(yōu)選地，進行維生素D化合物的免疫檢測，使得檢測到至少一個選 自25-羥基維生素D2、 25-羥基維生素03、 1,25 二羥基維生素D2和1,25-二羥基維生素D3的25-羥基維生素D化合物。如上文已經(jīng)提到的，25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3，特別 地，是用于診斷學(xué)的維生素D的相關(guān)形式。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，檢 測25-羥基維生素D2和/或25-羥基維生素D3是優(yōu)選的。原則上，全部蛋白質(zhì)結(jié)合配對(partem)如抗體或者其它結(jié)合一種或 多種25-羥基維生素D化合物的特異結(jié)合多肽可被用作免疫材料。在用 于檢測25-羥基維生素D化合物的上述方法中的先決條件僅僅是對待檢 驗的25-羥基維生素D化合物的結(jié)合是在所選擇的培養(yǎng)條件下發(fā)生的。術(shù)語抗體是指多克隆抗體、單克隆抗體、這些抗體的抗原結(jié)合片段 如Fab片段、F(ab)2'片段或者單鏈抗體。特別地，特異結(jié)合多肽是結(jié)合 配對(partem),如可通過噬菌體展示(McCafferty, J.等，Nature 348 (1990) 552-554)、重組DNA技術(shù)(US4,816,567)或重組(recombinatorial)抗體庫 (Lamck, J.W.和Fry, K.E. Hum. Antibod. Hybridomas, 2 (1991) 172-189) 獲得的那些。優(yōu)選的是使用以常規(guī)方式產(chǎn)生的多克隆或者單克隆抗體或 者其抗原結(jié)合片段。全部已知的維生素D代謝產(chǎn)物本身不是免疫原的。來自維生素D 新陳代謝的組分的化學(xué)活化以及其耦合到載體分子或者報道基團不是 微不足道的。因此，對于成功的免疫來說，有必要制備共軛體，其例如 包含25-羥基維生素D作為半抗原。術(shù)語半抗原是本領(lǐng)域技術(shù)人員所理 解的，為一種物質(zhì)，其本身不是免疫原的，但是通過耦合到較大的載體 分子，以能夠防止抗體產(chǎn)生的方式存在。用于生產(chǎn)半抗原共軛體的合適 的載體材料為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。牛血清白蛋白、P-半乳糖苷酶或者所謂的鑰孔蟲戚血蘭素(keyhole limpet hemocyanin) (KLH)通常用作載 體材料。如其示于通式I和II中的結(jié)構(gòu)的各種位置原則上適用于活化和耦合 到載體。經(jīng)由25-羥基維生素D2或者25-羥基維生素D3的位置3的耦合， 例如，已被證明有益于產(chǎn)生抗體，其以合適的方式結(jié)合25-羥基-維生素 D。在實施例中，詳細地描述了用于產(chǎn)生結(jié)合25-幾基維生素D2以及25-羥基維生素D3的抗體的方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物已被證明適用于25-羥基維生素D化合物 的自動化測試。本發(fā)明優(yōu)選地涉及根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物用于從維生 素D-結(jié)合蛋白中釋放維生素D化合物的用途，特別是在用于測定25-羥 基維生素D化合物的免疫測試中。25-羥基維生素D的測試優(yōu)選地完全自動化。在這種情況下，完全 自動化是指實驗員只需將樣品放置在自動化分析儀上，而全部進一步的 步驟自動地由分析器進行。完全自動化測試特別優(yōu)選地在獲自Roche Diagnostics的Elecsys⑧分一斤4義上進^亍。根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物優(yōu)選地用于檢測25-羥基維生素D2和/或 25-羥基維生素D3的方法中。測試優(yōu)選地以竟爭性免疫分析的形式進行，其中根據(jù)本發(fā)明的試劑 組合物被用作所謂的樣品緩沖液，即樣品與根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物的 混合。在這種竟爭性測試中，以規(guī)定數(shù)量添加到測試中的維生素D化合 物與來自樣品的相應(yīng)的維生素D化合物竟爭檢測抗體的結(jié)合部位。樣品 中存在的維生素D化合物越多，檢測信號越小。用于25-羥基維生素D化合物的免疫檢測的方法，可以——基于對 本發(fā)明的認識——以多種方式進行。例如并且以優(yōu)選的方式，樣品首先與根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物混合 并且培養(yǎng)，然后添加進一步的測試組分。另外并且以優(yōu)選的方式，樣品、根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物和免疫物 質(zhì)直接混合在一起，隨后進行培養(yǎng)。還可能并且優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物已經(jīng)包含免疫物質(zhì)。 這意味著，在這種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物另外優(yōu)選地包 含25-羥基維生素D的多克隆或者單克隆抗體。許多商用測試體系基于使用涂布有抗生物素蛋白或者抗生蛋白鏈菌素(SA)的固相，例如SA-涂布的微滴定板或者SA-涂布的膠乳。在測試程序之前或期間，生物素化的分析物衍生物，例如，結(jié)合到 這種SA固相。當檢測25-羥基維生素D時，這可以例如是生物素化的 25-羥基維生素D2和/或生物素化的25-羥基-維生素D3。當使用SA-涂布 的固相時，有可能并且優(yōu)選地，樣品、根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物、生物 素化的25-羥基維生素D衍生物和免疫物質(zhì)被混合并在一起培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠組裝一種測試試劑盒，其 包含檢測維生素D化合物所必需的全部組分。特別地，用于檢測維生素 D化合物的優(yōu)選的測試試劑盒的特征在于除維生素D化合物的抗體之 外，所述試劑盒包括具有3.8-4.8的pH值的試劑組合物并且包含 5-30vol。/。的一種或多種選自二曱亞砜(DMSO)和液體有機酰胺的兩性試 劑以及任選地0.7-8vol。/o的短鏈(Cl-C3)醇。通過以下實施例和附圖進一步解釋本發(fā)明。實際保護范圍源于本發(fā) 明所附的權(quán)利要求。


圖1:方法比較免疫分析(-DMSO)和LC-MS-MS 借助于聯(lián)合液相色譜和質(zhì)譜(LC-MS-MS)以及借助于免疫分析(IA) 來測定25-羥基維生素D，其中未添加DMSO的緩沖液(；DMSO)用于培 養(yǎng)。對總共53個樣品的結(jié)果(單位ng/ml)進行繪圖，X軸為LC-MS-MS， Y軸為IA。圖2:方法比較免疫分析(+DMSO)和LC+MS+MS 借助于LC-MS-MS以及借助于IA來測定25-羥基維生素D,其中在 IA中，包含DMSO的緩沖液^+DMSO)用于培養(yǎng)。對總共48個樣品的 結(jié)果(單位ng/ml)進行繪圖，X軸為LC-MS-MS, Y軸為IA。 圖3:方法比較免疫分析(-DMSO)和LC-MS-MS 借助于LC-MS、MS以及借助于IA來測定25-羥基維生素D,其中在 IA中，無DMSO的緩沖液用于培養(yǎng)。使用來自具有非洲血統(tǒng)的人的31 個樣品作為樣品。對總共78個樣品的結(jié)果(單位ng/ml)進行繪圖，X軸 為LC掘掘,Y軸為IA。圖4:方法比較免疫分析(+DMSO)和LC+MS+MS借助于LC-MS-MS以及借助于IA來測定25-羥基維生素D，其中在IA中，包含DMSO的緩沖液用于培養(yǎng)。其中，使用來自具有非洲血統(tǒng) 的人的31個樣品作為樣品。對總共79個樣品的結(jié)果(單位ng/ml)進行繪 圖，X軸為LC-MS-MS， Y軸為IA。圖5:方法比較免疫分析(+DMSO)和LC+MS+MS 借助于LC-MS-MS以及借助于IA來測定25-羥基維生素D,其中在 IA中，包含DMSO的緩沖液用于培養(yǎng)。其中，使用來自具有非洲血統(tǒng) 的人的81個樣品作為樣品。對總共136個樣品的結(jié)果(單位ng/ml)進行 繪圖，X軸為LC-MS-MS， Y軸為IA。圖6:方法比較免疫分析(+DMF)和LC+MS+MS 借助于LC-MS-MS以及借助于IA來測定25-羥基維生素D,其中在 IA中，包含二曱基曱酰胺的緩沖液^+DMF)用于培養(yǎng)。其中，使用來自 具有非洲血統(tǒng)的人的81個樣品作為樣品。對總共136個樣品的結(jié)果(單 位ng/ml)進行繪圖，X軸為LC-MS-MS, Y軸為IA。 圖7:方法比較免疫分析(+N-MP)和LC+MS+MS 借助于LC-MS-MS以及借助于IA來測定25-羥基維生素D，其中在 IA中，包含N-MP的緩沖液(^+N-MP)用于培養(yǎng)。其中，使用來自具有 非洲血統(tǒng)的人的81個樣品作為樣品。對總共135個樣品的結(jié)果(單位 ng/ml)進行繪圖，X軸為LC-MS-MS, Y軸為IA。 實施例1合成25-羥基維生素D3-3-半琥珀酸酯KLH對于這種合成來說，在位置3(參照通式II)對25-羥基維生素D3進行 化學(xué)活化，并且將其耦合到作為免疫原載體的KLH上。這種合成是經(jīng) 由中間體步驟25-羥基維生素Dr3-半琥珀酸酯和25-羥基維生素03-3-半 琥珀酸酯-N-輕基琥珀酰亞胺酯進行的。1.1制備25-羥基維生素D3-3-半琥珀酸酯將10mg(25(imol)25-羥基維生素D2(Sigma-Aldrich, No. H-4014)溶解 在l ml無水吡，定中并且在黑暗中與125mg(1.25mmol)琥珀酸酐一起在室 溫下攪拌4天。在10 ml乙酸乙酯中吸收反應(yīng)混合物并且在所有情況下 用2X10ml水、O.IM鹽酸和隨后再用水洗滌。使用約lg無水硫酸鈉干 燥有機相，過濾并且在真空中除去溶劑。在高真空中干燥殘余固體。獲 得了 10.5mg(收率84%)的無色固體。1.2 25-羥基維生素Dr3-半琥珀酸酉旨-N-羥基-琥珀酰亞胺酯的制備將10.0mg(20pmo1) 25-羥基維生素Dr3-半琥珀酸酯溶解在7 ml無 水二氯甲烷中并且與2.76mg(24)imol)N-羥基-琥珀酰亞胺和 3.72mg(24iLimol)N(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基-碳二亞胺(EDC)混合。在 氬氣下攪拌過夜，然后用10ml水洗滌有機相兩次，用約lg無水硫酸鈉 干燥并且過濾。在真空中除去溶劑，在高真空中干燥殘余反應(yīng)產(chǎn)物3h。 獲得了 11.3mg(收率94。/。)N-羥基琥珀酰亞胺酯，其用于共軛體而無需 進一步純化。1.3合成25-幾基維生素Dr3-半琥珀酸酯-KLH將150mg鑰孔蟲戚血蘭素(KLH; Sigma-Aldrich No. H 8283)溶解在 25ml0.1M磷酸鉀緩沖液中，添加在2mlDMSO中的pH=8.0和11.3mg 的N-羥基-琥珀酰亞胺酯。在室溫下攪拌過夜，隨后通過凝膠柱(AcA 202,柱體積0.5L; 0.1M磷酸鉀緩沖液，pHK7.0)純化產(chǎn)物。借助于UV 吸收(A^256nm)來檢測包含結(jié)合蛋白質(zhì)的級分并且集中起來(po01)。添加 10%甘油并且將灰乳白色的溶液用于免疫。實施例2生成和分離25-羥基維生素D3的抗體 2.1免疫抗體在綿羊(sheep)中產(chǎn)生。獲自實施例1的25-羥基維生素D3-3-半 琥珀酸酯KLH共軛體用于免疫。免疫劑量是0.1mg/動物。第一次免疫 在完全Freud's佐劑中進行。進一步的免疫在4周時間間隔在不完全 Freud's佐劑中進行，達10個月的時間。在各次免疫時間間隔的中間收 集血清。2.2純化多克隆綿羊抗體在Aerosil⑧(1.5。/。)的幫助下，從用25-羥基維生素Dr3-半琥珀酸酉旨 -LKH共軛體免疫的綿羊的血清中除去含脂質(zhì)的組分。隨后，使用硫酸 銨(1.7M)，沉淀免疫球蛋白。相對于15mM磷酸鉀緩沖液(包含50mM NaCl, pH=7.0),對沉淀物進行滲析，并且隨后通過DEAE瓊脂糖 (sepharose)進行色譜純化。從這種色鐠柱的流通(flow-through)中獲得IgG 級分^PAB〈25-羥基-維生素D3> S-IgG (DE)。2.3親和色語法以純化25-羥基維生素D-特異性抗體 制備用于多克隆抗體的免疫色譜純化的含共軛25-羥基維生素D2的 用作測定特異性的免疫吸附劑(immunadsorber)。通過以下步驟獲得免疫吸附劑(immunadsorber):a) 合成羥基維生素D2-3-2'-氰乙基醚在氬氣氣氛下在10 ml無水乙腈中將20.6mg(50jiimol)25-羥基維生素 D2(FlukaNo. 17937)溶解在具有內(nèi)部溫度計的25 ml三頸圓底燒瓶中。將 1.5 ml叔丁醇/乙腈(9:l)添加到溶液中并且在水浴中冷卻到6°C。隨后添 加820^1的丙烯腈溶液(86inl丙烯腈/1.0 ml乙腈)并且在6。C攪拌15分鐘。 然后添加205^1的氫化鉀溶液(25mg KH/0.5 ml叔丁醇/乙腈9:1)。短暫絮 凝出現(xiàn)，其后獲得了透明溶液。在6。C攪拌反應(yīng)溶液達進一步的45分 鐘，隨后在4。C攪拌60分鐘。隨后，用10ml甲基-叔丁基醚稀釋反應(yīng)溶液，并且洗滌2次，每次 用10mlH2O。用約lg無水石危酸鈉干燥有才幾相，在G3玻璃料上過濾并 且在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)。在高真空中將其千燥而形成粘稠透明的殘余 物，質(zhì)量約55mg。b) 合成羥基維生素Dr^3-氨丙基醚將以上獲得的全部腈溶解在15ml二乙醚中，與7.5mg氫化鋰在7.5 ml二乙醚中的懸浮液混合，同時攪拌。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物1小時。 然后，添加38.4氫化鋁鋰在6.6ml二乙醚中的懸浮液。這導(dǎo)致混合物的 強烈的混濁。在室溫下再攪拌反應(yīng)混合物1小時，然后在水浴中將反應(yīng) 混合物冷卻到0-5。C并且小心地添加35 ml水。通過添加6.6 ml 10M氫 氧化鉀溶液使得pH為強堿性的。將其萃取3次，每次使用65ml曱基-叔丁基醚。使用約5g無水硫 酸鈉干燥合并的有機相，過濾并且在室溫下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)。使用 油泵，干燥剩余物至質(zhì)量恒定。將粗產(chǎn)物溶解在5mlDMSO和3.0ml 乙腈中，借助于制備HPLC純化。洗提液AH敖孔-H2O+0.1%三氟乙酸；洗提液B二95。/。乙腈+5o/o微孔-H2O+0.1。/oTFA;梯度50%B-100%B，在100 min內(nèi)流速30ml/min溫度室溫柱尺寸0 = 5.0 cm; L = 25 cm; 柱材料Vydac C18/300A/15-20 pim 測定波長226nm根據(jù)分析HPLC(Vydac C18/300A/5pm; 4.6x250mm),產(chǎn)物含量大于 85%的級分被集中在圓底燒瓶中并且被凍干。獲得13.7mg(收率58%)， 為無色冷凍干燥物(lyophilisate)。c) 羥基維生素D2-3-3'-N-(半環(huán)庚)氨丙基-醚-N-羥基琥珀酰亞胺酯 的合成將n,7mg(25jumol)的氨基衍生物溶解在5 ml新蒸餾的DMF中并且 添加92mg(250)Limol)辛二酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯。添加3.5)li1三乙胺并 且在氬氣下攪拌該溶液過夜。由制備HPLC純化粗產(chǎn)物(條件如上)。凍 干后獲得了 10.1mg(收率56。/。)N-羥基琥珀酰亞胺酯。d) 合成羥基維生素D2免疫吸附劑(immunoadsorber)在G3玻璃料上用200 ml 0.5M氯化鈉溶液洗滌20 ml EAH瓊脂糖 (Amersham Biosciences, No. 17-0569-03),并且用200 ml 0.03 M磷酸鐘 緩沖液(pHN7.1)來平衡。在過量的液體已通過玻璃料排出后，在200ml 的相同的緩沖液中吸取懸浮液，并且添加1.7mg(2.3iLimol)N-輕基琥珀酰 亞胺酯/10mlDMSO。在振蕩器上在室溫下攪動反應(yīng)混合物過夜。其還 被轉(zhuǎn)移到玻璃料，使其排出，并且用500ml 0.05M磷酸鉀緩沖液/0.15M 氯化鈉(pH-7.0)洗滌。在完全排出后，將其再懸浮在25ml的相同的緩沖 液中，并且添加0.15ml的25%疊氮化鈉溶液以便保存。e) 純化抗體將來自d)的10ml的親合性基質(zhì)裝入柱中，并且用由50mM磷酸鉀、 150m畫aCl組成的、pH=7.5的緩沖液(PBS)平衡。將3.6g的PAB<25-羥基維生素D3〉S-IgG(DE)裝載到柱上。用PBS、0.5MNaCl溶液(含0.05% Tween⑧20和30mM氯化鈉)階式洗滌所述的柱。用3mMHCl溶液從親 合性基質(zhì)上分離特異性結(jié)合的免疫球蛋白。HC1洗脫物相對于lmM乙 酸乙酯進行滲析并且隨后凍干。將冷凍干燥物(lyophilisate)溶解在PBS 中，在Superdex200⑧上通過色譜除去聚集體，將如此獲得的免疫吸附 的多克隆抗體用于進一步的步驟。使用1M丙酸再生免疫親合性基質(zhì)并 且將其保存在含0.9%疊氮化鈉的PBS溶液中。實施例3用于檢測25-羥基維生素D的分析根據(jù)制造商的指導(dǎo)來使用商業(yè)分析。如文獻中所迷，借助于 HPLC(用于25(OH)維生素D3的測試，獲自"Immundiagnostik" Company,Bensheim,順序號KC 3400)或借助于LC-MS-MS(Vogeser, M等，Clin. Chem. 50 (2004) 1415-1417)進行25-羥基維生素D測定。用于新的免疫學(xué)測試的成分的制備和一般測試程序在下文中描述3.1合成羥基維生素D2-3-3'-N-(半環(huán)庚)氨丙基-醚-生物素 -(卩-Ala)-Glu-Glu-Lys(s)共軛體t Ag-Bi)將13.7mg(25nmol)輕基維生素Dr3-3'-氨丙基醚溶解在3.5 ml DMSO中，添加28.7mg(30)iimol)生物素-(卩-Ala)-Glu-Glu-Lys(s)-半-辛二 酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Roche Applied Science, No. U866656)和12.5|tU 三乙胺，在室溫下將其攪拌過夜。用4.5 mlDMSO稀釋反應(yīng)溶液,濾過 0.45pm微過濾器，隨后借助于制備HPLC(條件參見實施例2.3 b))進行純 化。將根據(jù)分析HPLC的包含大于85%產(chǎn)物的級分集中起來并且將其凍 干。獲得了9.8(收率30%)純化的生物素共軛體。3.2相對于通過親和色譜法純化的25-羥基維生素D^PAB-Ru)的多 克隆抗體的釕化(ruthenylation)將根據(jù)實施例2.3 e)的親合性-純化抗體轉(zhuǎn)移到100mM磷酸鉀緩沖 液(pl^8.5),將蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)到1 mg/mL。將釕化(ruthenylation)試劑(釕 (II)三(聯(lián)吡啶基)-N-羥基琥珀酰亞胺酉旨)溶解在DMSO中，并且將其添加 到抗體溶液中，摩爾比為7.5-1。在60min的反應(yīng)時間后，通過添加L-賴氨酸終止該反應(yīng)，在Sephadex G25上通過凝膠滲透色鐠法分離過量的 才示i己i式劑。3.3免疫分析中的測試程序使用獲自Roche Diagnostics公司的Elecsys 系統(tǒng)，測量樣品。25pl 樣品與30pl釋放試劑(A)混合，并且同時或順序地與15pl釕化 (ruthenylated)檢測抗體(B)混合并且培養(yǎng)9分鐘。在下一步驟中，添加生 物素化的壁抗原(C)(50pl),通過進一步添加釋放試劑(A)(50pl),將pH 值保持在期望的范圍內(nèi)。在進一步的9分鐘培養(yǎng)后，添加涂布有抗生蛋 白鏈菌素(SA)(3CHd)的可磁化的聚苯乙烯顆粒(D),并且在進一步的9分 鐘培養(yǎng)后，象通常一樣，測定結(jié)合釕化(ruthenylated)抗體的量。釋放試劑(A)包含220mM乙酸酯緩沖液，pH=4.00.1 %醋氧甲苯酸(oxypyrion)0.1% MIT1% EtOH0.1%聚乙二醇單十二醚(polydocanol) 0.2%兔IgG和兩性試劑，當規(guī)定時。具有釕化(ruthenylated;K25-OH-維生素D^元體共軛體的溶液(B),其 包含20mM 磷酸鹽緩沖液，pH=6.5 0.1 %醋氧甲苯酸(oxypynon) 0.1。/。MIT(N-甲基異多唑酮HC1) 1% EtOH(乙醇)0.1%聚乙二醇單十二醚(polydocanol) 1% 兔IgG(DET) 2.0昭/mlPAB-Ru(獲自實施例3.2) 以及兩性試劑，當^見定時。 具有生物素化的壁抗原的溶液(C)包含 20mM 磷酸鹽緩沖液，pH=6.5 0.1%醋氧曱苯酸(oxypyrion) 1% E認0.1 %聚乙二醇單十二醚(polydocanol) 0.2%兔IgG0.18|iig/ml Ag-Bi(獲自實施例3.1)以及兩性試劑，當規(guī)定時。具有SA-涂布的膠乳顆粒(D)的懸浮液包含0.72mg/ml具有470ng/ml的結(jié)合容量的SA-涂布的可磁化的聚苯乙烯顆粒。 實施例4添加/不添加兩性試劑的樣品培養(yǎng)緩沖液在先前試驗中，在用于檢測25-羥基維生素D的若干測試程序中， 觀察到獲自具有高加索血統(tǒng)的人的血清和獲自具有非洲血統(tǒng)的人的血 清的表現(xiàn)不同。具有不同種族血統(tǒng)的供體的正常血清因此已經(jīng)被特定地檢驗。4.1培養(yǎng)條件的比較，有和沒有DMSO(高加索人)以下兩種緩沖液組合物;故用作釋放試劑(a) 釋放試劑(A)、溶液(B)和溶液(C)(參見實施例3.3),沒有 DMSO卜DMSO)和(b) 釋放試劑(A)、溶液(B)和溶液(C)，其還包含10% DMSO(=+DMSO)。檢驗總共約50份獲自具有高加索血統(tǒng)的人的正常血清，并且每次 與標準方法LC-MS-MS比較。如在圖1中可見的，免疫學(xué)測試的值與 LC-MS-MS相關(guān)(借助于線性回歸確定r值為0.86)。然而，圖1還清楚 地顯示回歸線的斜率是極低的(計算為0.44)。這表示了樣品的非常錯構(gòu) (falsified)的回收。使用DMSO的LC-MS-MS和免疫學(xué)測試之間的方法比較示于圖2 中。在比較沒有DMSO的試劑組合物中，計算出較高的相關(guān)性(尸0.89) 和較高的斜率(0.60)。4.2培養(yǎng)條件的比較，有/沒有DMSO(高加索人和非洲人)對總共80份正常血清，其中約50份來自具有高加索血統(tǒng)的人，31 份來自具有非洲血統(tǒng)的人，進行免疫分析，并且每次與標準方法 LC-MS-MS比較。使用與實施例4.1中相同的緩沖液(a)和(b)。如在圖3 中可見的，免疫學(xué)測試的值與LC-MS-MS的相關(guān)性不是很好。通過線性 回歸確定r值為0.69。然而，圖3還清楚地顯示回歸線的斜率是才及小的(計 算為0.30)。這表示了樣品的非常錯構(gòu)(falsified)的回收。使用DMSO的LC-MS-MS和免疫學(xué)測試之間的方法比較示于圖4 中。相比于沒有DMSO的試劑組合物，發(fā)現(xiàn)明顯較高的相關(guān)性(產(chǎn)0.93) 以及大大改進的斜率(0.70)。實施例5各種兩性試劑的比較 使用以下緩沖液組合物(b)釋放試劑(A)、溶液(B)和溶液(C)，其還包含10% DMSO(=+DMSO),(b)釋放試劑(A)、溶液(B)和溶液(C),其還包含10%DMF(=+DMF),和(d)釋放試劑(A)、溶液(B)和溶液(C),其另外包含10%N-MP( = + N-MP)。使用不同的試劑組合物以從維生素D-結(jié)合蛋白中釋放維生素D化 合物，檢驗約135份獲自具有各種血統(tǒng)的人的正常血清，并且每次與標 準方法LC-MS-MS相比較。如從圖5、 6和7中可看出的，除DMSO之 外，DMF和N-MP也適合作為用于維生素D化合物的釋放試劑的添加 劑。對于全部三種添加劑，獲自免疫學(xué)測試的值與LC-MS-MS相關(guān)性極 好。使用線性回歸，確定r值分別為0.91(緩沖液(b))、 0.92(緩沖液(c)) 和0.92(緩沖液(d))。因而，根據(jù)本發(fā)明的組合物試劑使得可以獨立于維 生素D-結(jié)合蛋白的表型來測定25羥基維生素D?；诔醪絽⒄瘴锏闹担诒緦嵤├约霸缦鹊膶嵤├?，確定了免 疫學(xué)測試的絕對值，并且因此所述絕對值沒有有益的值。仍然必須進行 借助于LC-MS-MS的用于測定可靠的絕對值的參照物標準化。相對值顯 示出使用根據(jù)本發(fā)明的組合物試劑所實現(xiàn)的顯著的測試改進。
權(quán)利要求
1.用于釋放維生素D的試劑組合物，其具有3.8-4.8的pH值并且包含5-30vol％的一種或多種選自二甲亞砜(DMSO)和液體有機酰胺的兩性試劑以及任選地0.7-8vol％的短鏈(C1-C3)醇。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑組合物，其特征為二甲基甲酰胺(DMF)、 N,N-二曱基乙酰胺、四曱基脲(TMU)、 N-曱基吡咯烷酮(N-MP)、 1,3-二 曱基-3,4，5,6-四氫-2(lH)-嘧啶酮(DMPU)和六甲基磷酸三酰胺(HMPT)用 作兩性試劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或者2的試劑組合物，其特征為存在7-20vo10/0 的兩性試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任一項的試劑組合物，其特征為乙醇作 為短鏈醇存在。
5. 用于免疫檢測25-羥基維生素D化合物的方法，包括如下步驟a) 將待研究的樣品與從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D化合物的 試劑混合而形成混合物，其具有3.8-4.8的pH值并且包含5-20vol。/o的一 種或多種選自二曱亞砜(DMSO)和液體有機酰胺的兩性試劑以及任選地 0.5-5volQ/o的短鏈(Cl-C3)醇；b) 免疫分析獲自a)的混合物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中25-羥基維生素D化合物選自25-羥基維生素D2、 25-羥基維生素D3、 1.25-二羥基維生素D2和1.25-二羥 基維生素D3。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中測定25-羥基維生素D化合物、 25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的試劑組合物用于從維生素D-結(jié)合 蛋白中釋放維生素D化合物的用途。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的試劑組合物用于從維生素D-結(jié)合 蛋白中釋放維生素D化合物的用途，其中所述釋放獨立于維生素D-結(jié) 合蛋白的表型。
10. 檢測25-羥基維生素D的試劑盒，其包含免疫檢測至少25-羥基 維生素D化合物的組分，其特征為，所述試劑盒還包含根據(jù)權(quán)利要求 1-4中任一項的試劑組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于釋放與維生素D-結(jié)合蛋白相結(jié)合的維生素D化合物的試劑組合物，用于檢測25-羥基維生素D化合物的方法，其中使用這種試劑從維生素D-結(jié)合蛋白釋放25-羥基維生素D化合物并且分析如此獲得的混合物，用于釋放維生素D化合物的試劑的用途以及用于檢測25-羥基維生素D的試劑盒，除通常的免疫試劑之外，其包含用于釋放維生素D化合物的試劑。
文檔編號G01N33/82GK101273272SQ200680035942
公開日2008年9月24日 申請日期2006年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者A·基里亞特索利斯, A·普爾曼, E·休伯, L·馮普羅夫, N·霍恩, S·費爾德曼, U·科博爾德 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司