專利名稱：整體活體動物中神經(jīng)系統(tǒng)的非侵入性體內(nèi)熒光成像的制作方法
整體活體動物中神經(jīng)系統(tǒng)的非侵入性體內(nèi)熒光成像發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及包括對轉(zhuǎn)基因動物中表達的熒光蛋白進行非侵入性成像 的方法。發(fā)明背景帕金森病(PD)是位于阿耳茨海默癡呆癥之后居于第二位的最常見的 神經(jīng)變性病癥。據(jù)估計，僅在美國就有超過一百萬個體患有這種致殘疾 病，并且每年出現(xiàn)超過50,000新病例(Fahn and Przedborski, 2000)。作為 一種以運動徐緩、靜止性震顫、強直和步態(tài)障礙為特征的進行性、年齡 相關(guān)的神經(jīng)變性疾病，PD還以黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的大量進行性破壞 為特征。如同很多其它的神經(jīng)退行性疾病，PD自身主要表現(xiàn)為偶發(fā)情況， 意味著不存在任何遺傳連鎖，但是在罕見病例中，PD也可以作為簡單的 孟德爾性狀出現(xiàn)，與多種基因的缺陷連鎖。盡管臨床上和病理學上偶發(fā)和家族性PD可以在幾個重要方面不同， 4旦是它們共有相同的生化腦部異常，即腦多巴胺的顯著減少(Dauer and Przedborski, 2003)。 PD患者顯示低水平腦多巴胺的原因源于黑質(zhì)紋狀體 多巴胺能途徑的退化，所述多巴胺能途徑由多巴胺能神經(jīng)元構(gòu)成，其細 胞體位于黑質(zhì)中，伸出的軸突和神經(jīng)末梢可見于紋狀體中(Vila and Przedborski, 2004)。PD的最佳表征模型已經(jīng)通過使用神經(jīng)毒素MPTP而開發(fā)出來(Bloem et al., 1990， Flint Beal， 2001)。對MPTP的發(fā)現(xiàn)發(fā)生在1982年，當時加利 福尼亞的一群吸毒者表現(xiàn)出嚴重帕金森綜合征的急性發(fā)作。研究發(fā)現(xiàn)該 綜合征是由于自身注射一種合成的海洛因類似物而引起，而這種海洛因 類似物在制造過程中被副產(chǎn)物MPTP污染。隨后，MPTP給藥顯示在小 鼠和靈長類動物中模擬PD。 MPTP為高度親脂的，其可容易地穿過血腦 屏障。隨后，其被B型單胺氧化酶轉(zhuǎn)化為其活性代謝物一l-曱基-4-苯基吡啶鑰(MPP+)，然后該活性代謝物被高親和性多巴胺和去曱腎上腺素攝 取系統(tǒng)攝取，并由此在黑質(zhì)紋狀體多巴胺能細胞的線粒體內(nèi)聚集。這可 導致對細胞功能的多種有害作用，引起神經(jīng)細胞死亡(Tatton and Kish， 1997， Tanji et al., 1999)。在小鼠中，2'-CH3-MPTP是比常規(guī)MPTP更為有 效的神經(jīng)毒素，顯示嚴重的組織病理學變化，包括細胞質(zhì)膨脹、間質(zhì)水 腫、多巴胺能神經(jīng)元減少以及反應性小神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖和神經(jīng)膠質(zhì)增 生(Abdel-Wahab， 2005)。盡管對PD的大部分研究集中于成體進行， 一些報告令人信服地證實 對新生小鼠的全身MPTP注射導致永久的腦損傷，在成年期也還有痕跡。 發(fā)育中的腦對MPTP損傷敏感的事實還值得進一步研究。除了 MPTP,也已報道了多種其它的化學品在成體小鼠腦的不同區(qū)域 引起神經(jīng)損傷。這些化學品包括一系列結(jié)構(gòu)和功能上不同的化合物，從 工業(yè)上有毒的化合物、農(nóng)業(yè)殺蟲劑到食品添加劑。同樣，迄今為止進行 的大部分神經(jīng)毒性研究基于成體模型。但是，值得注意的是，具有較不 完整血腦屏障的發(fā)育中的腦更易于受到已知神經(jīng)毒素的損傷，更關(guān)鍵的 是，該施加的損傷不能由發(fā)育中的腦完全和正確地代償。因此，對于測 試化合物在發(fā)育中的腦中的潛在神經(jīng)毒性而言，其重要性無論如何強調(diào) 也不過分，尤其是在處理沉默神經(jīng)毒性(即，早期暴露于神經(jīng)毒劑，但是 直至成年期才有臨床癥狀)的問題時。美國環(huán)保局的發(fā)育神經(jīng)毒性測試指 南(Developmental Neurotoxicity Testing Guideline, DNTG)進一步強調(diào)了 這點。最近，歐委會采納了用新的歐盟管理框架來通過嚴格制度測試所 有的化學品的建議，據(jù)估計新措施耗資高至70億歐元并需要至少10年 來實施。O'Callaghan(O'Callaghan， 1988)已提出，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS )的 星形細胞中優(yōu)勢表達的中間纖維蛋白 一膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP),為監(jiān) 測成體嚙齒類動物腦中由各種神經(jīng)毒劑(包括l-曱基-4-苯基-l,2,3,6-四氫 吡啶(MPTP))引起的神經(jīng)損傷的早期和靈敏的生物標記(Reinhard et al., 1988， Araki et al.， 2001， Chen et al., 2002， Fields and tevens-Graham, 2002, Kurosaki et al., 2004)。 GFAP表達上調(diào)與神經(jīng)學損傷增加相關(guān)。用于分析內(nèi)源GFAP表達的常規(guī)方法主要包括免疫細胞化學、Northern印跡、 Western印跡和ELISA (O'Callaghan, 1991， Eng et al.， 2000)。GFAP基礎(chǔ)啟動子包括TATA和CAAT盒。增強子和沉默子序列可 見于-250和-80 bp之間以及-1980和-1500 bp之間。這些正調(diào)節(jié)區(qū)含有很 多轉(zhuǎn)錄因子的共有序列，包括cAMP應答元件和Sp-l、 NF-1、 AP-1以及 AP-2轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。組織特異性由位于-1980至-1500bp區(qū)域的人 GFAP共有序列所賦予。反應性神經(jīng)膠質(zhì)增生(星形膠質(zhì)增生)在應答對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的 幾乎任何物理或化學損傷中產(chǎn)生，以星形細胞體及其細胞突的肥大為特 征，伴隨有GFAP表達的增加。反應性神經(jīng)膠質(zhì)增生伴隨有GFAP的上 調(diào)。在外周神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷和毒性損傷后發(fā)生類似的GFAP增加。隨著小鼠轉(zhuǎn)基因?qū)W的進展和新的報告基因的獲得，包括/3-半乳糖苷 酶(lacZ)、綠色熒光蛋白(GFP)和熒光酶(LUC)在內(nèi)的幾種報告基因被引入 轉(zhuǎn)基因小鼠中在GFAP啟動子控制下，并被證實是體內(nèi)研究神經(jīng)M增 生過程中GFAP轉(zhuǎn)錄活性的有用替代手段(Brenner et al., 1994， Zhuo et al.， 1997, Zhuetal., 2004)。WO 00/02997和US 6,501,003描述了在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中表達綠色焚 光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生。作者描述了在全包埋組織或者其切片中體 外檢測視神經(jīng)、腦、視網(wǎng)膜、坐骨神經(jīng)和角膜中的焚光。發(fā)明內(nèi)容出于有助于研究PD的發(fā)育方面和神經(jīng)毒性的目的，本發(fā)明人建立了 非侵入性系統(tǒng)，其包括GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠模型和可購得的成像系統(tǒng)， 其使得能夠在活體動物中研究神經(jīng)學疾病、損傷和毒性的各個方面。該 系統(tǒng)還使以有效方式篩選大量化學品對發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)毒性危險 成為可能。通過采用表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因動物(其中該熒光蛋白位于來自通常 在動物神經(jīng)系統(tǒng)中表達的蛋白的啟動子控制下)，本發(fā)明人已證實在整體 活體轉(zhuǎn)基因動物中的熒光4企測可用于監(jiān)測刺激物和測試物對來自該啟動子的熒光蛋白表達的影響。這相對于現(xiàn)有技術(shù)有顯著改進，其使得能在 體內(nèi)實時或接近實時地監(jiān)測測試物對完整動物神經(jīng)系統(tǒng)的影響。最概括而言，本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)基因動物中非侵入性檢測來自熒光蛋 白的萸光的方法。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種涉及檢測動物中目的熒光蛋白 表達的方法，其中所述動物為轉(zhuǎn)基因動物，在其基因組中具有編碼所述 熒光蛋白的核酸，所述編碼所述熒光蛋白的核酸可操作地連接來自通常 在所述動物神經(jīng)系統(tǒng)中表達的蛋白的啟動子核酸，所述方法包括非侵入 性檢測在所述動物中表達的所述蛋白的焚光的步驟。相應地，還提供了轉(zhuǎn)基因動物在非侵入性檢測在所述動物中表達的 所述熒光蛋白的熒光的方法中的用途，其中所述轉(zhuǎn)基因動物在其基因組 中具有編碼所述熒光蛋白的核酸，所述編碼所述熒光蛋白的核酸可操作 地連接來自通常在該動物神經(jīng)系統(tǒng)中表達的蛋白的啟動子核酸。所述方法優(yōu)選用于研究向所述動物給予測試物或施用測試刺激物的 作用，其中所述方法包括在非侵入性檢測熒光的步驟之前向所述動物給 予所述測試物或刺激物的步驟。優(yōu)選地，所述方法用于研究測試物或刺 激物對動物的神經(jīng)學狀況的影響。因此，本發(fā)明的方法可以提供用于篩 選神經(jīng)學調(diào)節(jié)劑的方法。該方法優(yōu)選包括將從不給予所述測試物的對照動物檢測的熒光和給較的步驟。對不給予測試物情況下的焚光的檢測使得能提供對照值或基礎(chǔ)讀數(shù) (例如自體焚光)，其可以與給予測試物后的焚光檢測一起使用，出于標準 化的目的計算相對熒光值。所述對照值可以在轉(zhuǎn)基因動物例如其中待測 試測試物的相同類型轉(zhuǎn)基因動物中檢測，或者在非轉(zhuǎn)基因動物中檢測。 所述動物優(yōu)選為相同類型，例如小鼠，最優(yōu)選相同品系。為了獲得對照 值，可以向?qū)φ談游锝o予安慰劑，例如鹽水。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括以下步驟 (i)在給予測試物之前非侵入性檢測所述轉(zhuǎn)基因動物中的熒光以提 供對照；(ii) 在給予測試物之后非侵入性檢測所述相同動物中的熒光；以及(iii) 將在(i)中檢測的熒光與在(ii)中檢測的熒光進行比較。 在另一可選的優(yōu)選實施方案中，所述方法包括以下步驟(i) 非侵入性檢測第一動物中的熒光以提供對照；(ii) 向第二轉(zhuǎn)基因動物給予測試物，接著非侵入性檢測所述動物中的 熒光；以及(iii) 將在(i)中檢測的熒光與在(ii)中檢測的熒光進行比較。 所述第一動物可以為轉(zhuǎn)基因的或非轉(zhuǎn)基因的。 在一個優(yōu)選的實施方案中，提供了本發(fā)明的方法用于確定測試物的神經(jīng)毒性。在另 一優(yōu)選的實施方案中，提供了本發(fā)明的方法用于測試測試物促 進治療或調(diào)節(jié)神經(jīng)學損傷。相應地，所述方法包括以下步驟(i) 在所述轉(zhuǎn)基因動物中誘導神經(jīng)學損傷；(ii) 在給予測試物之前非侵入性檢測來自(i)的所述神經(jīng)學損傷動物 中的熒光，以提供對照；(iii) 在給予測試物之后非侵入性檢測來自(ii)的所述相同動物中的熒 光；以及(iv) 將在(ii)中檢測的熒光與在(iii)中檢測的熒光進行比較。 或者，所述方法可以包括以下步驟(i) 在第一動物中誘導神經(jīng)學損傷并且非侵入性檢測所述神經(jīng)學損 傷動物中的熒光，以提供對照；(ii) 在第二動物中誘導神經(jīng)學損傷，并且向所述動物給予測試物，接 著非侵入性檢測所述動物中的熒光；以及(iii) 將在(i)中檢測的熒光與在(ii)中檢測的熒光進行比較。 所述第一動物可以是轉(zhuǎn)基因的或者非轉(zhuǎn)基因的。 所述神經(jīng)學損傷可以是對神經(jīng)系統(tǒng)的任何損傷或傷害，無論是如何產(chǎn)生的。優(yōu)選地，所述損傷是針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)，更優(yōu)選針對腦。 所述神經(jīng)學損傷可以是反應性神經(jīng)膠質(zhì)增生。所述神經(jīng)學損傷可以是通過向動物給予選擇的化學品而化學誘導的，所述化學品例如神經(jīng)毒素，如MPTP、 2'-CHrMPTP、 6-羥基多巴胺 (6-OHDA)、紅藻氨酸(Kainic acid， KA)、三曱基錫(Trimethytin)，農(nóng)藥 (pesticides),如毒死蜱(CPF)，殺真菌劑，如亞乙基雙二硫代氨基曱酸錳(代 森錳或MB),殺蟲劑(insecticides),如魚藤酮，除草劑，如百草枯(N，N',-二曱基_4-4'-聯(lián)吡咬総)，有機氯，如聚氯聯(lián)苯(PCBs),食品添加劑，如谷 氨酸單鈉鹽(MSG)、工業(yè)化學品，如3，3'-亞氛基二丙腈(IDPN)、曱苯(曱 基苯)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇合適量的化學品用于向動物給藥并且能 夠設(shè)計適合的給藥方案，以便誘導神經(jīng)學損傷。舉例而言，可以給予單 一或多(如2、 3、 4、 5或更多)劑量的所選化學品。多劑量可以以預定的 時間間隔給藥，例如l、 2、 3、 4、 5、 6或更多個小時。還是通過舉例， 每一劑量可以選自2、 4、 6、 7、 8、 12或14mg/kg?；蛘撸梢酝ㄟ^對動物的頭和/或頸和/或背部施以物理力來誘導神經(jīng) 學損傷，例如擠壓傷。可以通過減少對動物神經(jīng)系統(tǒng)的供氧導致中風和/ 或大腦缺血來誘導神經(jīng)學損傷。其它的誘導神經(jīng)學損傷的手段可以包括 環(huán)境刺激、機械力、暴露于病毒粒子或遺傳因子。在優(yōu)選的實施方案中，所述神經(jīng)學損傷會提供所選疾病的動物模型。 例如，所述疾病可以選自帕金森病、阿耳茨海默病或亨廷頓病。帕金森 病的動物模型可以通過給予MPTP(l-曱基-4-苯基-l， 2, 3, 6-四氫吡咬)或 2'-CH3-MPTP來化學誘導。在其它的實施方案中，提供了本發(fā)明的方法用于測試測試物促進神 經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的能力。相應地，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括以下步驟(i) 提供所述轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物也是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動物模型；(ii) 在給予測試物之前非侵入性檢測來自(i)的所述動物中的熒光；(iii) 在給予測試物之后非侵入性檢測來自(ii)的所述相同動物中的焚 光；以及(iv) 將在(ii)中檢測的熒光與在(iii)中檢測的熒光進行比較。 或者，所述方法包括以下步驟(i) 提供第一和第二動物，其中兩動物均為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動物模型；(ii) 在來自(i)的第一動物中，非侵入性檢測所述動物中的熒光以提供 對照；(iii) 在來自(ii)的第二動物中，向所述動物給予測試物，接著非侵入 性檢測所述動物中的熒光；以及(iv) 將在(ii)中檢測的焚光與在(iii)中檢測的焚光進行比較。 所述第一動物可以是轉(zhuǎn)基因的或非轉(zhuǎn)基因的。在其它優(yōu)選的實施方案中，提供了本發(fā)明的方法用于測試對神經(jīng)系 統(tǒng)的治療。相應地，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括以下步驟(i) 提供所述轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物也是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動物模型；(ii) 在實施治療之前，非侵入性檢測來自(i)的所述動物中的熒光，以 提供對照；(iii) 在實施治療之后，非侵入性檢測來自(ii)的所述相同動物中的熒 光；以及(iv) 將在(ii)中檢測的熒光與在(iii)中檢測的熒光進行比較。 或者，所述方法可以包括以下步驟(i) 提供第一和第二動物，其中兩動物均為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動物模型；(ii) 在來自(i)的第一動物中，非侵入性檢測所述動物中的熒光，以提 供對照；(iii ) 在來自(i)的第二動物中，對所述動物進行治療，接著非侵入性 ;險測所述動物中的熒光；以及(iv) 將在(ii)中檢測的熒光與在(iii)中檢測的熒光進行比較。 所述第一動物可以是轉(zhuǎn)基因的或者非轉(zhuǎn)基因的。優(yōu)選地，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病為神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其可以選自神經(jīng)膠質(zhì) 瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)纖維瘤、室管膜瘤、神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、星形細胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤。神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的動物^f莫型 可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的腫瘤異種移植技術(shù)產(chǎn)生。適合地，所進行的治療可以包括應用放射治療，例如X射線或7射線，或者化療藥物。當本發(fā)明的方法包括使用具有神經(jīng)學損傷或神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動物這種情況下，所述方法不涉及這類動物的產(chǎn)生，而涉及其用途。所述動物(轉(zhuǎn)基因的和非轉(zhuǎn)基因的)優(yōu)選為非人哺乳動物，例如兔、豚 鼠、大鼠、小鼠或其它嚙齒類動物(包括嚙齒目中的任何動物)、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛、馬、非人靈長類動物；或任何其它非人脊推動物。 最優(yōu)選地，所述動物(轉(zhuǎn)基因的和非轉(zhuǎn)基因的)為小鼠。在任何給定的方法 中，相同類型的動物如小鼠優(yōu)選用作對照和測試動物。這些動物的區(qū)別 可以在于， 一個可以為轉(zhuǎn)基因的，另一個為非轉(zhuǎn)基因的，但測試動物總 是轉(zhuǎn)基因的。對照和測試動物都可以是轉(zhuǎn)基因的。啟動子核酸來自通常在動物神經(jīng)系統(tǒng)中表達的蛋白。盡管啟動子的 核酸序列可以相對于野生型被加以改變，例如通過核苷酸的置換、添加、 刪除(截短)、插入或替換，但是啟動子核酸的特征在于當可操作地連接編 碼蛋白的核酸時能夠調(diào)節(jié)所述蛋白的神經(jīng)系統(tǒng)表達。最優(yōu)選地，與野生 型啟動子相比，所述啟動子保留了調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)組織中轉(zhuǎn)錄(以及因而蛋 白表達)的相應能力。在本說明書中，術(shù)語"可操作地連接"可以包括這樣的情況，其中 所選擇的核苷酸序列(如蛋白編碼序列)和調(diào)節(jié)核苷酸序列(如啟動子)如此 共價連接，以使得將所選的核苷酸序列的表達置于調(diào)節(jié)序列的影響或控 制下。因而，當調(diào)節(jié)序列能夠影響形成所選核苷酸序列的一部分或全部 的蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄時，所述調(diào)節(jié)序列可操作地連接所選的核苷酸序 列。如果需要，得到的轉(zhuǎn)錄本可以被翻譯成需要的蛋白或多肽。最優(yōu)選地，所述啟動子為GFAP啟動子。GFAP啟動子序列為本領(lǐng)域 技術(shù)人員所熟知。Bre皿er和Messing, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 10, 351-364 (1996)中描述了 GFAP啟動子的實例和它們在構(gòu)建GFAP轉(zhuǎn)基因中的用途，其中蛋白的表達被置于GFAP轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域 的控制下，通過引用將該文獻并入本文。所述熒光蛋白可以是任何熒光蛋白。很多適合的熒光蛋白為本領(lǐng)域 技術(shù)人員所知，如綠色、藍色、青藍色、黃色、橘色和紅色熒光蛋白(例 如，參見 http: 〃www.microscopvu.com/articles/livecellimaging/fi3intro. html)。最優(yōu)選地，所述熒光蛋白為綠色熒光蛋白(GFP),如hGFP-S65T 綠色熒光蛋白基因、EGFP-1熒光蛋白基因、或EYFP-1綠色熒光蛋白基 因，或具有哺乳動物相容性或人源化的序列(例如，密碼子改變，其使得 構(gòu)建體與哺乳動物核糖體翻譯更具有相容性)并具有增加其光發(fā)射系數(shù)的 突變的任何其變體。在本說明書中，"轉(zhuǎn)基因動物"包括其中編碼熒光蛋白的核酸通過 使用重組核酸技術(shù)被引入生物體基因組的動物，所述編碼焚光蛋白的核 酸可操作地連接來自通常在所述動物神經(jīng)系統(tǒng)中表達的蛋白的啟動子核 酸。產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在本發(fā) 明的方法中，所述動物優(yōu)選為新生的，即從出生起不超過四周齡。更優(yōu) 選地，所述新生動物從出生起不超過三周齡，更優(yōu)選從出生起不超過14 天齡。任選地，所述新生動物可以為從出生起l至14天齡，優(yōu)選從出生 起1至7天齡，或者從出生起7至14天齡。新生動物可以為從出生起1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11,12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27或28天齡。通過使用新生動物，可以監(jiān)測神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，尤其是測試物對發(fā) 育中的神經(jīng)系統(tǒng)的影響。在本發(fā)明的方法中，通過非侵入性成像檢測熒光。所述成像技術(shù)為 非侵入性的，這是因為所述動物從所述動物的外部成像，在萸光的檢測 中不涉及任何手術(shù)介入。因此所述動物在成像期間保持完整和完好。盡 管為了檢測熒光所述動物可任選地被麻醉，但是所述動物優(yōu)選在熒光檢 測中為可活動的。用于非侵入性熒光成像的適合儀器和技術(shù)為本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知，例如IVIS⑧成像系統(tǒng)100系列(Xenogen Corp., Alameda, USA)?？梢栽诮o予測試物之前或之后的任何方{更時間點進行焚光沖企測，以 得到對照或測試值。通常，優(yōu)選進行一系列的給藥后檢測，以便監(jiān)測熒 光隨時間的變化。任選地，可以例如從給予了安慰劑而不是測試物的動 物在每一對應時間點進行對照讀數(shù)。例如，可以在給予測試物之前立即 或不久例如最多至1小時進行檢測，接著進行定期檢測，例如每隔1小 時。或者，給予測試物之后的檢測可以每天一次、每天兩次、每天三次或每天四次，且持續(xù)研究者所希望的天H例如1、 2、 3、 4、 5或更多天。優(yōu)選對來自動物的目的區(qū)域(ROI)進行焚光檢測。所述ROI優(yōu)選為研 究者感興趣的區(qū)域。優(yōu)選的ROI為中樞神經(jīng)系統(tǒng)或其部分，最優(yōu)選腦或 其部分。任選地，ROI可以不包括視神經(jīng)、視網(wǎng)膜、坐骨神經(jīng)、角膜或 哺乳動物眼的任何部分中的一種或多種。對應的ROI優(yōu)選用于比較在對 照和測試動物中的焚光檢測的目的。檢測對照動物中的熒光提供了動物自體熒光的基礎(chǔ)讀數(shù)。可以進行 基礎(chǔ)讀數(shù)與測試讀數(shù)之間的直接比較。但是，在一個尤其優(yōu)選的實施方 案中，可以計算相對熒光(RF)值，并用于比較目的。RF值優(yōu)選作為在給 予測試物后的時間點在轉(zhuǎn)基因小鼠中從ROI檢測的總熒光與在對照小鼠 中檢測的組織自體熒光(任選地，在相同時間點，例如在給予安慰劑的情 況下)的比值來計算，所述對照小鼠可以為轉(zhuǎn)基因的或非轉(zhuǎn)基因的。在優(yōu)選的實施方案中，所檢測的熒光的增加表明神經(jīng)學損傷的增加， 神經(jīng)毒性或神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進展。在其它實施方案中，熒光的減少可以 表明神經(jīng)學損傷的增加。熒光的4企測可以為定量和/或定性的。在本說明書中，對動物神經(jīng)系統(tǒng)的提及可以包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)或外 周神經(jīng)系統(tǒng)。更優(yōu)選地，其為中樞神經(jīng)系統(tǒng)，更優(yōu)選腦和/或脊髓。測試物可以為任何物質(zhì)、材料、組合物、化合物、藥物、藥劑、蛋 白、肽、抗體、核酸、小分子、工業(yè)化學品、殺蟲劑、食品添加劑或防 腐劑。測試物可以為手術(shù)才直入測試動物的材料或組織，例如人造生物材 料。本發(fā)明的方法可以用于監(jiān)測測試物對動物的影響，并且可以用于-設(shè)計疾病的診斷； -"i:殳計疾病的預后；-監(jiān)測和/或定量腦內(nèi)化學誘導的神經(jīng)膠質(zhì)增生和/或損傷的進展；-診斷和預測帕金森病的進展；-開發(fā)治療劑，例如抗帕金森病藥物或基因治療藥物；-監(jiān)測和定量腦內(nèi)神經(jīng)毒劑誘導的神經(jīng)膠質(zhì)增生和/或損傷的進展；-測量用于移植和組織工程的人造生物材料的發(fā)育神經(jīng)毒性；-在藥物開發(fā)期間測量藥物化合物的發(fā)育神經(jīng)毒性；-測量測試物的藥物動力學和/或藥效學性能。本發(fā)明包括所描述的各方面和優(yōu)選特征的組合，除非這種組合顯然不可能或者明確避免的?，F(xiàn)在將通過舉例以及參照附圖對本發(fā)明的各方面和實施方案進行解釋。其它的方面和實施方案對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。通過引用將在本文中提到的所有文獻并入本文。優(yōu)選實施方案的詳細說明在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因動物的基因組具有可操作 地連接GFAP啟動子的編碼綠色熒光蛋白的核酸。這種類型的轉(zhuǎn)基因小 鼠在Zhou et al 1997 Developmental Biology 187, 36-42,和WO 00/02997 和US 6,501,003中有描述，通過引用將它們都整體并入本文。所述GFAP 啟動子驅(qū)動該熒光蛋白在諸如星形細胞、Schwann細胞和Mueller細胞的 神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的表達。轉(zhuǎn)基因小鼠被改造為表達編碼人源化綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因，所述 轉(zhuǎn)基因可操作地連接膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動子。在所述轉(zhuǎn)基因小鼠中， 在應答神經(jīng)學損傷時，綠色焚光蛋白特別在諸如星形細胞、Schwann細 胞和Mueller細胞的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中上調(diào)。通過將遺傳構(gòu)建體插入哺乳動物受精卵的前核并使穩(wěn)定的基因組整 合天然發(fā)生來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠。然后將受精卵轉(zhuǎn)移至接納子宮，并使其 發(fā)育成熟。所述遺傳構(gòu)建體包括提供神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異表達的全長膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動子。所述啟動子位于編碼綠色熒光蛋白的突變基因的5'，并 與其可操作地連接，位于所述綠色焚光蛋白編碼基因3'的DNA片段含有 用于正確RNA剪接和多腺香酸化的信號序列。進行動物的非侵入性成像以獲得針對自體熒光的對照值和在給予測 試物后的測試值一例如參見實施例1的材料和方法。熒光的增加表明神經(jīng)毒性或神經(jīng)學損傷的增加。附圖簡要i兌明以下將參照附圖討論解釋本發(fā)明原理的實施方案和實驗，其中

圖1.(A) —對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因新生小鼠的體內(nèi)熒光成像。從轉(zhuǎn)基因小 鼠腦中ROI檢測總的GFP熒光，從非轉(zhuǎn)基因小鼠檢測組織自體熒光。采 用Living Image⑧軟件(Xenogen Corp.)以光子/秒/cm2/球面度(sr)對輻射 定量。(B) —對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因新生小鼠的離體腦熒光成像。圖2.GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因新生小鼠的非侵入性體內(nèi)神經(jīng)成像。采用鹽水(對 照)和12 mg/kg的2'-CH3-MPTP處理小鼠，并如文中所述成<象。在給予2' -CH3- MPTP之前0小時對小鼠成像。熒光成像的采集時 間為10秒。對于每對小鼠，轉(zhuǎn)基因小鼠位于右側(cè)，非轉(zhuǎn)基因小鼠位于左 側(cè)。圖3.比較經(jīng)2' -CH3-MPTP處理組和對照組(均值士標準誤，11=5)之間 從轉(zhuǎn)基因小鼠中ROI檢測的總GFP熒光與從非轉(zhuǎn)基因小鼠中ROI檢測的 組織自體熒光的比例，所述表示為相對熒光(RF)。將RF標準化至0小時。 *表明2'-CH3-MPTP處理組相對于對照組有統(tǒng)計學顯著性(P0.05)。 ** (P<0.01),與對照組相比。斯氏(Student's)雙尾配對t檢驗。圖4.海馬中GFAP免疫染色的共聚焦成像，顯示(A)在nTg小鼠中無 GFP表達，刻度條=100 /mi; (B， C) 2'-CH3-MPTP處理后6小時Tg小鼠 中GFP表達增加，采用10x物鏡，刻度條二200/mi; (D， E)采用40x物鏡，刻度條=50 jixm。 GFAP免疫陽性星形細胞和內(nèi)源GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因標記 星形細胞的細胞突定位以箭頭表示。 圖5.黑質(zhì)致密區(qū)(SNC)中TH免疫染色的共聚焦成像，顯示(A)在nTg 小鼠中無GFP表達，刻度條=100 /mi; (B, C) 2'-CHrMPTP處理后6小時 Tg小鼠中GFP表達增加，采用20x物鏡，刻度條=100 /xm; (D, E)采用 40x物鏡，刻度條-50/xm。圖6,GFAP-GFP成年小鼠的體內(nèi)皮瓣成^f象(Skin flap imaging)。 (A)腦；(B)肝。圖7.轉(zhuǎn)基因(Tg)和非轉(zhuǎn)基因(nTg)小鼠的離體成像(A)腦，(B)肝，(C)坐 骨神經(jīng)，(D)腎。 圖8,GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因新生小鼠的非侵入性體內(nèi)神經(jīng)成像。釆用鹽水(對 照)和8mg/kg的MPTP處理小鼠，并按文中所述成像。在給予MPTP之 前0小時對小鼠成像。熒光成像的采集時間為10秒。對于每對小鼠，轉(zhuǎn) 基因小鼠位于右側(cè)，非轉(zhuǎn)基因小鼠位于左側(cè)。圖9.對以1 x 12 mg/kg、4x8 mg/kg MPTP處理組和各自對照組(均值士標 準誤，11 = 5)之間從轉(zhuǎn)基因小鼠中ROI檢測的總GFP熒光與從非轉(zhuǎn)基因小 鼠中ROI檢測的組織自體焚光的比例進行比較，所述比例表示為相對熒 光(RF)。將RF標準化至O小時。*表明MPTP處理組相對于對照組有統(tǒng) 計學顯著性(PO.Ol)。斯氏雙尾配對t檢驗。圖10.(A)采用Western印跡研究MPTP(4 x 8mg/kg)對GFAP和GFP表達 的影響。道(a)未處理的轉(zhuǎn)基因小鼠。道(b)MPTP處理后24小時，轉(zhuǎn)基因 小鼠。道(c)未處理的非轉(zhuǎn)基因小鼠。道(d)MPTP處理后24小時，非轉(zhuǎn)基 因小鼠。(B)采用Western印跡膜的IVIS成像研究MPTP對GFAP和GFP表 達的影響。 圖11,(A) 采用實時RT-PCR檢測的MPTP(4 x 8mg/kg)對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基 因小鼠中GFAP基因表達的影響。結(jié)果為相對對照(未經(jīng)處理)的標準化 值，以獲得增強倍數(shù)土標準誤。*p<0.01; n = 4;雙尾樣品t檢驗。(B) 采用實時RT-PCR檢測的MPTP (4 x 8mg/kg)對轉(zhuǎn)基因小鼠中 GFP基因表達的影響。結(jié)果為相對對照(未經(jīng)處理)的標準化值，以獲得增 強倍數(shù)士標準誤。圖12.給予MPTP(4 x 8 mg/kg)之前和之后新生腦中不同區(qū)域的內(nèi)源GFP。 圖13.8-10周齡成體轉(zhuǎn)基因小鼠中IHC抗TH結(jié)果(黑質(zhì)致密區(qū)) 圖14.(A) 采用Western印跡研究MPTP(l x 12 mg/kg)對GFAP和GFP表 達的影響。道(a)未處理的轉(zhuǎn)基因小鼠。道(b)MPTP處理后6小時，轉(zhuǎn)基 因小鼠。道(c)未處理的非轉(zhuǎn)基因小鼠。道(d)MPTP處理后6小時，非轉(zhuǎn) 基因小鼠。(B) 采用Western印跡膜的IVIS成像研究MPTP對GFAP和GFP表達的影響，單位以光子/秒/cmV球面度表示。 圖15.采用實時RT-PCR檢測的MPTP(l x 12 mg/kg)對轉(zhuǎn)基因小鼠中GFAP 和GFP基因表達的影響。結(jié)果為相對對照(未經(jīng)處理)的標準化值，以獲 得增強倍數(shù)士標準誤。*p<0.01 **p<0.001; n = 5;雙尾樣品"企驗。圖16.GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因新生小鼠的非侵入性體內(nèi)神經(jīng)成像。采用鹽水(對 照)和2 mg/kg的KA處理小鼠，并如文中所述成像。在給予KA之前0小 時對小鼠成像。熒光成像的采集時間為10 s。對于每對小鼠，轉(zhuǎn)基因小 鼠位于右側(cè)，非轉(zhuǎn)基因小鼠位于左側(cè)。圖17.將2 mg/kg KA處理組和對照組(均值士標準誤，n = 4)之間從轉(zhuǎn)基因小 鼠中ROI檢測的總GFP熒光與從非轉(zhuǎn)基因小鼠中ROI檢測的組織自體熒 光的比例進行比較，所述比例表示為相對熒光(RF)。將RF標準化至0小 時。*表明KA處理組相對于對照組有統(tǒng)計學顯著性(P0.05)。 ** (PO.01), 與對照組相比。斯氏雙尾配對U企-驗。圖18.(A) 采用Western印跡研究KA(l x 12 mg/kg)對GFAP和GFP表達的 影響。道(a)未處理的轉(zhuǎn)基因小鼠。道(b)KA處理后6小時，轉(zhuǎn)基因小鼠。 道(c)未處理的非轉(zhuǎn)基因小鼠。道(d)KA處理后6小時，非轉(zhuǎn)基因小鼠。(B) 采用Western印跡膜的IVIS成像研究KA對GFAP和GFP表達 的影響。單位以光子/秒/cm々球面度表示。圖19.采用實時RT-PCR檢測的KA(lx 2 mg/kg)對轉(zhuǎn)基因小鼠中GFAP和 GFP基因表達的影響。結(jié)果為相對對照(未經(jīng)處理)的標準化值，以獲得增 強倍數(shù)士標準誤。*p<0.05 **p<0.01; n = 5;雙尾樣品t檢驗。圖20.海馬區(qū)域中GFAP免疫染色的共聚焦成像，顯示CA1(A， B); CA2 和CA3(C, D)。 (B,D)顯示，與未經(jīng)處理的小鼠(A, C)海馬區(qū)域相比，KA 處理后6小時轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠中GFP表達增加，采用20x物鏡?？潭葪l =50 /mi,采用20x物鏡。GFAP免疫陽性星形細胞和內(nèi)源GFAP-GFP轉(zhuǎn) 基因標記星形細胞的細胞突定位以箭頭表示。發(fā)明詳細說明以下將通過舉例來說明本發(fā)明人認為的用于實施本發(fā)明的最佳模式的具 體細節(jié)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，本發(fā)明的實施不限于這 些具體細節(jié)。實施例1為了開發(fā)用于上述篩選目的的非侵入性熒光成像系統(tǒng)，我們將 2'-CH3-MPTP用作轉(zhuǎn)基因GFAP-GFP小鼠新生腦中的模型神經(jīng)毒劑，這 種小鼠先前由Zhuoetal., 1997建立。這里，我們證實，當與適合的體內(nèi)光學成像系統(tǒng)聯(lián)合時，轉(zhuǎn)基因GFAP-GFP小鼠模型可可靠地檢測轉(zhuǎn)基因 小鼠中的GFAP-GFP標記，并且可對其應答MPTP誘導時以劑量和時間 依賴方式的上調(diào)定量。這種具有適度處理量的非侵入性光學熒光系統(tǒng)會 在研究帕金森病和其它神經(jīng)變性疾病、發(fā)育神經(jīng)毒理學以及在臨床前化 合物篩選方面有廣泛應用。材料和方法轉(zhuǎn)基因GFAP-GFP小鼠按先前所描述的(Zhuo et al., 1997)進行轉(zhuǎn)基因GFAP-GFP小鼠的建 立和基因分型。在本項研究中使用4天齡、重2.0 g - 2.5 g的FVB/N背 景的新生小鼠。動物飼養(yǎng)由新加坡國立大學實驗動物維持單位動物房 (animal holding unit facility)提供。涵蓋本研究的實驗方案獲得實驗動物管 理及4吏用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee )的i午可。神經(jīng)毒劑和給藥從(Sigma-Aldrich, M-103)購得測試化合物2'-CHrMPTP——種比常 步見MPTP (Abdel-Wahab, 2005)更有效的類似物。新生小鼠在0小時接受 2'-CH3-MPTP (12 mg/kg，鹽水中)單次皮下(sc)注射。將鹽水用作對照組 的載體。隨后在處理后2小時、4小時、6小時和8小時進行神經(jīng)成像。體內(nèi)神經(jīng)成像采用IVIS成像系統(tǒng)100系列(Xenogen Corp., Alameda, CA, U.S.A.)進 行非侵入性成像。包括轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因新生小鼠的2'-CH3-MPTP處理 對并排放置并通過使用帶子物理限制小鼠下背來使其保持在適當位置， 不麻醉。這是根據(jù)一項最近的研究，其報道廣泛用于兒科麻醉的氯胺酮 (ketamine)通過增加神經(jīng)元凋亡的速率而顯示在新生大鼠中的發(fā)育神經(jīng)毒 性(Scallet et al., 2004)。然后，該對新生小鼠用配備有IVIS系統(tǒng)的GFP 濾境組熒光成像。圖像釆集時間為10秒。相同的操作也應用于注射有鹽 水的對照對。2'-CH3-MPTP對小鼠的神經(jīng)毒性作用結(jié)果表示為相對熒光 (RF)，即從轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠中目的區(qū)域(ROI)檢測的總GFP熒光信號與從非轉(zhuǎn)基因(nTg)小鼠中ROI檢測的組織自體熒光信號之間的比例 (TgROI/nTgROI)。兩種小鼠的ROI區(qū)域完全相同并且在定量輻射的研究中 所用的所有ROI始終相同。為了使成像系統(tǒng)引起的任何波動最小化，對 每對處理的小鼠和對照小鼠獲取三個圖像，所得到的均值用作該特定對 的定量讀數(shù)。對照組(n = 5對小鼠)和處理組(n = 5對小鼠)的值表示為均 值士標準誤，采用斯氏雙尾配對t檢驗來評估統(tǒng)計學顯著性。免疫組織化學為了確定光子是否是從CNS中星形細胞發(fā)出的，收集腦并在4。C使 用于0.1 M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS， pH 7.4)中的4%多聚曱醛固定4小時。 然后將腦在PBS中洗滌三次，每次孵育時間是15 min,接著于4。C在30% 蔗糖中浸泡過夜。在封固和釆用恒冷切片才幾(Leica Microsystems, Nussloch GmbH; CM-3050S)將它們切片之前，將組織浸入液氮后，所有的腦被包 埋在冷凍介質(zhì)中。根據(jù)Atlas of Mouse brain (Franklin and Paxinos， 2001)， 將黑質(zhì)(前囪-3.16mm,耳間0.64 mm)的20/xm厚度的冠狀冷凍切片用于 免疫組織化學。對照組和處理組各含有4個動物(n = 3)。對于酪氨酸羥化酶(TH)和GFAP免疫染色，采用了兔抗TH多克隆 抗體(Chemicon International, Temecula, CA, USA; Ab-152)和兔抗GFAP多 克隆抗體(DakoCytomation, Denmark; Z-0334)。將冷凍切片在0.15 M 1 x PBS中洗滌5 min,接著于4°C在含有0.1% (v/v) Triton X-100和10%未 免疫山羊血清的PBS封閉液中孵育4小時。然后在0.15MlxPBS中洗 滌冷凍切片三次，每次15 min。接著，于4°C將腦切片與抗TH抗體(1:200) 和抗GFAP抗體(1:200)—起在含有0.01% (v/v) Triton X-100和1%未免疫 山羊血清的1 x PBS中孵育過夜。在1 x PBS中洗滌三次(每次15 min)后， 在室溫下，將切片與1:100稀釋度的德克薩斯紅偶聯(lián)的山羊抗兔多克隆第 二 IgG抗體一起在含有0.01% (v/v) Triton X-100和1%未免疫山羊血清的 PBS中孵育2小時。再次在1 xPBS中洗滌三次(每次15min)后，用蓋玻 片使切片位于10 Jul的熒光介質(zhì)中，并在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察 (Olympus Optical Co. Ltd. Tokyo, Japan; IX-71)。結(jié)果
2'-CH3-MPTP對GFP熒光水平的影響
從小鼠腦中ROI 4企測固有GFP焚光，并采用Living Image IW+ (Xenogen Corp.)將來自神經(jīng)區(qū)域的輻射以光子/秒/cmV球面度(sr)定量，如 圖1A所示。為了確定光子是否是從CNS中星形細胞發(fā)出的，在最后的 體內(nèi)成像時間點后取出腦并離體成像(圖1B)。采用這個平臺，使對照和 經(jīng)處理的轉(zhuǎn)基因小鼠的GFP熒光間的定性和定量比較成為可能。
如圖2中的體內(nèi)成像顯示的，在處理后6小時，接受了單次劑量 2'-CH3-MPTP(12 mg/kg sc)的轉(zhuǎn)基因新生小鼠相對于其非轉(zhuǎn)基因?qū)∈?以及轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈箫@示了 ROI中GFP焚光(光子/秒/cmV球面度)的最顯 著增加。圖3中顯示的GFP熒光定量進一步加強了在之前圖中得到的觀 察結(jié)果，其中在處理后4小時、6小時和8小時時記錄了 2'-CHrMPTP 處理組和對照組之間相對焚光(RF)的顯著差異，處理組在處理后6小時 時顯示了相對于對照組的22。/。均值的最顯著增加(P0.01)。類似地，在 2'-CH3-MPTP組中，與0小時相比，在處理后4小時、6小時和8小時， 出現(xiàn)了 RF的顯著增加，其中在處理后6小時時出現(xiàn)了 17%均值的最顯 著增加(PO.0001)。在對照組中，不同時間點之間未出現(xiàn)RF的顯著差異(圖 3)。
GFAP免疫組織化學
海馬中GFAP免疫染色的代表性圖像顯示在圖4中。在一次 2'-CH3-MPTP(12 mg/kg sc)處理后6小時時，在腦室和海馬中星形細^^的 GFP表達顯著增加。在非轉(zhuǎn)基因小鼠中不存在GFP表達(圖4A)。為了證 實GFP表達細胞確實是星形細胞，我們在相同切片上進行了 GFAP免疫 染色，發(fā)現(xiàn)GFAP免疫陽性的海馬溝處血管周圍星形細胞與內(nèi)源GFP標 記的星形細胞之間的共定位主要發(fā)生在細胞突而不是細胞體中(在圖4D 和4E中雙標記細胞突的實例用箭頭指出)。
TH免疫組織化學染色黑質(zhì)致密區(qū)(SNC)中TH免疫染色的代表性圖像顯示在圖5中。帶有 TH抗體的多巴胺能神經(jīng)元(約20 /mi)在尺寸上比非IHC染色的內(nèi)源GFP 標記星形細胞(約10 /mi)大，在經(jīng)2'-CH3-MPTP處理的新生小鼠SNC中 可容易地檢測到。多巴胺能細胞的細胞體或細胞纖維與SNC中明顯的免 疫陽性細胞突一起被密集染色。在2'-CH3-MPTP (12 mg/kg sc)處理后6小 時未觀察到TH免疫陽性纖維和細胞體中的可見減少。但是，與0小時 相比，處理后6小時，可明顯看到星形細胞中GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因表達的 上調(diào)。如圖5A中所顯示的，非轉(zhuǎn)基因小鼠的SNC中多巴胺能神經(jīng)元對 TH是免疫陽性染色，但是神經(jīng)膠質(zhì)細胞不產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的表達。TH免疫 陽性多巴胺能神經(jīng)元和非IHC染色的內(nèi)源GFP標記星形細胞之間沒有共 定位。
實施例2 -轉(zhuǎn)基因GFAP-GFP成體小鼠的成像 皮瓣體內(nèi)成像
在麻醉的轉(zhuǎn)基因GFAP-GFP成體小鼠上制做皮瓣(從身體撕下的一 塊皮膚，該皮膚的一側(cè)仍保持連接)。
采用IVIS成像系統(tǒng)100系列(Xenogen Corp., Alameda, CA, U.S.A.), 在腦和肝的皮瓣區(qū)成功進行了體內(nèi)成像。將低熒光的黑色紙用于阻擋來 自小鼠其它部分的組織自體熒光，僅暴露腦(圖6A)和肝(圖6B)的皮瓣區(qū)。
離體成像
如在圖2A-2D的圖像中所顯示的，取出轉(zhuǎn)基因(Tg)和非轉(zhuǎn)基因(nTg) 成體小鼠的腦、肝、腎和坐骨神經(jīng)并采用IVIS成像系統(tǒng)離體成像。從對 應于發(fā)射的光子數(shù)的數(shù)值的假彩色圖像，可觀察到Tg和nTg小鼠間的顯 著差異。目前，正在進行成體小鼠替代性的成像方式的可行性研究。
實施例3 -在新生轉(zhuǎn)基因小鼠中研究帕金森病和神經(jīng)毒性的非侵入性腦 成4象方法實驗操作 動物
本項研究在4天齡新生小鼠上進行(實驗時3-5 g體重)。動物自由進 食和飲水，盡量使所使用的動物數(shù)量和它們的痛苦減至最小。
毒素注射
所用的神經(jīng)毒素為2'-CH3-MPTP。每隔2小時進行8 mg/kg MPTP的 皮下給藥，進行4次，在處理后24小時、48小時和72小時獲得體內(nèi) 神經(jīng)圖像。
BCAtm蛋白測定和Western印跡
對于進行BCAtm蛋白測定和Western印跡，將小鼠在處理后24小時 處死。取出腦，然后在含有磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和蛋白酶抑制劑的樣品 緩沖液中裂解。采用牛血清白蛋白(BSA)作為標準品，通過二辛可寧酸 (BCA)法測定總蛋白。然后采用NuPAGE Novex Bis-Tris凝膠(4%-12%) 對樣品進行NuPAGE Bis-Tris電泳。每個樣品含有15 /ig蛋白。電泳后， 將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將膜在4。C下用于PBS中的5%脫脂奶 粉和0.1% Tween 20(PBS-T)封閉過夜。然后將膜在室溫下于1:1000稀釋 度的多克隆兔抗GFAP抗體(Dako)/多克隆兔抗GFP抗體(abcam)孵育1 小時，然后洗滌并與PBS-T—起孵育3 x 15 min。在室溫下與1:2000稀 釋度的山羊抗兔IgG-HRP第二抗體(SantaCruz)—起孵育1小時后，重復 5分鐘的孵育和洗滌過程3次。通過使用化學發(fā)光檢測試劑(ECL Plus, Amersham)和放射自顯影膜觀察第二抗體。進行Western印跡后，將硝酸 纖維素膜置于IVIS儀器下成像。當采用ECL Plus檢測試劑時，組合的 HRP和過氧化物催化的Lumigen PS-3 Acridan底物的氧化每分鐘產(chǎn)生數(shù) 千的吖啶鎗酯中間體。這些中間體在輕度堿性條件下與過氧化物反應， 產(chǎn)生持續(xù)的高密度化學發(fā)光，最大發(fā)射在430 nm。這種化學發(fā)光信號可 采用IVIS成像系統(tǒng)采集。獲得了具有描繪發(fā)光密度的顏色的膜圖像。實時RT-PCR
對于實時RT-PCR,在處理后24小時處死小鼠。取出腦，然后在緩 沖液RA1和/3-巰基乙醇中裂解。采用NucleoSpin RNAII試劑盒分離來 自腦的總RNA。用隨沖幾六聚物進4亍總RNA逆轉(zhuǎn)錄，對cDNA進行實時 RT-PCR以定量基因表達。
實驗結(jié)果
MPTP (4x8 mg/kg) 體內(nèi)神經(jīng)圖像
如圖8所示，檢測來自小鼠腦中目的區(qū)域(ROI)的固有GFP熒光，并 采用Living 11^經(jīng)6@軟件(乂611(^611 Corp.)對來自神經(jīng)區(qū)域的輻射以光子/秒 /cmV球面度(sr)定量。如在體內(nèi)圖像中顯示的，接受了 4劑MPTP (8 mg/kg sc)的轉(zhuǎn)基因新生小鼠相對于對照小鼠在處理后24小時顯示了 ROI中GFP 熒光(光子/秒/cmV球面度)的最顯著增加。對顯示在圖9中的GFP熒光的 定量顯示，在處理后24小時記錄到MPTP處理組和對照組之間的相對熒 光(RF)的顯著差異，與對照組相比有15%均值的統(tǒng)計學顯著性增加 (pO.Ol)。對于接受了單劑量MPTP(12 mg/kg sc)的轉(zhuǎn)基因新生小鼠以及 對照組中，不同時間點之間未出現(xiàn)RF顯著差異(圖9)。 Western印跡結(jié)果
從顯示在圖10A中的western印跡結(jié)果可見，在約51 kDa處檢測到 帶，其與采用Dako抗兔GFAP抗體報告的小鼠GFAP分子大小相對應。 在約27 kDa處也檢測到帶，其與采用Abeam抗兔GFP抗體報告的小鼠 GFP分子大小一致。從帶的濃度可看出在轉(zhuǎn)基因小鼠中GFAP和GFP蛋 白的量從0至24小時是增加的(比較道a和b)。在非轉(zhuǎn)基因小鼠中，GFAP 蛋白的量從0至24小時也是增加的(比較GFAP western印跡中道c和d)。 由于沒有轉(zhuǎn)基因，在非轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有檢測到GFP蛋白(GFP western 印跡中道c和d)。當采用IVIS對western印跡膜成像時，彩色描繪的蛋白存在量給出了相同結(jié)果(參考圖IOB)。這支持了這樣的事實，即在給千 MPTP后GFAP被上調(diào)，其又導致GFP的上調(diào)。
實時RT-PCR結(jié)果
mRNA的研究與BCA和western印跡中的蛋白研究結(jié)果是一致的， 就更長的研究周期而言，與體內(nèi)神經(jīng)成像也是一致的。如圖IIA所示， 發(fā)現(xiàn)MPTP處理后24小時GFAP基因表達的增強對于轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因 小鼠都具有統(tǒng)計學顯著性，相對于未經(jīng)處理的小鼠分別為約91。/。(p0.01) 和88%(p<0.01)。但是，發(fā)現(xiàn)MPTP處理后24小時GFP的基因表達與未 處理小鼠相比沒有統(tǒng)計學顯著的增強(圖IIB)。這解釋了 MPTP處理后 48小時和72小時神經(jīng)圖像的相對熒光的減弱(參見圖8和9)。
內(nèi)源GFP和TH免疫iE織4匕學 結(jié)果顯示在圖12和13中。
實施例4 -在新生轉(zhuǎn)基因小鼠中研究帕金森病和神經(jīng)毒性的非侵入性腦 成寸象方法
實驗操作
動物
;Mf究在4天齡新生小鼠上進行(實驗時3-5 g體重)。動物自由進食 和飲水，盡量使所使用的動物數(shù)量和它們的痛苦減至最小。
毒素注射
所用的神經(jīng)毒素為2'-CH3-MPTP和卡因酸(KA)。 MPTP以12 mg/kg 的劑量給藥，注射一次。KA以2mg/kg的劑量使用，注射一次。所有的 注射均為皮下注射。
BCAtm蛋白測定和Western印跡對于經(jīng)MPTP (1 x 12 mg/kg)處理的小鼠，在處理后6小時處死。取 出腦，然后在含有磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和蛋白酶抑制劑的樣品緩沖液中 裂解。采用牛血清白蛋白(BSA)作為標準品，通過二辛可寧酸(BCA)法測 定總蛋白。然后采用NuPAGE Novex Bis-Tris凝膠(4%-12%)對樣品進行 NuPAGEBis-Tris電泳。每個樣品含有15/xg蛋白。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移 至硝酸纖維素膜上。將膜在4°C下用于PBS中的5%脫脂奶粉和0.1% Tween 20(PBS-T)封閉過夜。然后將膜在室溫下于1:1000稀釋度的兔抗 GFAP多克隆抗體(Dako)/兔抗GFP多克隆抗體(abcam)孵育1小時，然后 洗滌并與PBS-T—起孵育3 x 15 min。在室溫下與1:2000稀釋度的山羊 抗兔IgG-HRP第二抗體(Santa Cruz)—起孵育1小時后，重復5分鐘的孵 育和洗滌過程3次。通過使用化學發(fā)光檢測試劑(ECLPlus， Amersham)和 放射自顯影膜觀察第二抗體。對于以KA (1 x 2mg/kg)處理的小鼠，進行 相同的操作。進行Western印跡后，將硝酸纖維素膜置于IVIS儀器下成 像。當采用ECL Plus檢測試劑時，組合的HRP和過氧化物催化的Lumigen PS-3 Acridan底物的氧化每分鐘產(chǎn)生數(shù)千的吖啶鑰酯中間體。這些中間體 在輕度堿性條件下與過氧化物反應，產(chǎn)生持續(xù)的高密度化學發(fā)光，最大 發(fā)射在430nm。這種化學發(fā)光信號可采用IVIS成像系統(tǒng)采集。獲得了帶 有描繪發(fā)光密度的顏色的膜的圖像。
實時RT-PCR
對于以MPTP(l x 12mg/kg)處理的小鼠，在處理后2小時將它們處死。 取出腦，然后在緩沖液RA1和/3-巰基乙醇中裂解。采用NucleoSpin RNA II試劑盒分離來自腦的總RNA。用隨機六聚物進行總RNA逆轉(zhuǎn)錄，對 cDNA進行實時RT-PCR以定量基因表達。對于以KA (1 x 2mg/kg)處理 的小鼠，進行同樣的操作。
實驗結(jié)果
MPTP(l x 12mg/kg) Western印跡結(jié)果從顯示在圖14A中的western印跡結(jié)果可見，在約51 kDa處檢測到 帶，其與采用Dako抗兔GFAP抗體報告的小鼠GFAP分子大小相對應。 在約27 kDa處也檢測到帶，其與采用Abeam抗兔GFP抗體報告的小鼠 GFP分子大小相對應。從帶的濃度可看出在轉(zhuǎn)基因小鼠中GFAP和GFP 蛋白的量從0至6小時是增加的(比較道a和b)。在非轉(zhuǎn)基因小鼠中，GFAP 蛋白的量從0至6小時也是增加的(比較GFAP western印跡中道c和d)。 由于沒有轉(zhuǎn)基因，在非轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有檢測到GFP蛋白(GFP western 印跡中道c和d)。當采用IVIS對western印跡膜成像時，彩色描繪的蛋 白存在量給出了相同結(jié)果(參考圖14B)。這支持了這樣的事實，即在注射 MPTP后GFAP被上調(diào)，其又導致GFP的上調(diào)。 實時RT-PCR結(jié)果
mRNA的研究與BCA和western印跡中的蛋白研究結(jié)果是一致的。 當GFAP和GFP蛋白上調(diào)在6小時達到峰值時，發(fā)現(xiàn)GFAP和GFP mRNA 的上調(diào)在早至MPTP處理后2小時就出現(xiàn)了 。這個時間差異說明了 mRNA 被翻譯成蛋白所需的時間。如圖15所顯示的，發(fā)現(xiàn)在MPTP處理后2小 時GFAP和GFP基因表達的增加均具有統(tǒng)計學顯著性，分別為約47% (pO.OOl)和20% (p<0.01)。
KA (1 x 2mg/kg)
體內(nèi)神經(jīng)成4象
如圖16所示，檢測來自小鼠腦中ROI的固有GFP熒光，并采用Living 111^§6@軟件(乂61108611 Corp.)對來自神經(jīng)區(qū)域的輻射以光子/秒/cmV球面度 (sr)定量。如在體內(nèi)圖像中顯示的，接受了單次劑量KA(2mg/kgsc)的轉(zhuǎn) 基因新生小鼠相對于其非轉(zhuǎn)基因?qū)∈笠约稗D(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笤谔幚砗?6小時顯示了 ROI中GFP熒光(光子/秒/cm"球面度)的最顯著增加。對顯 示在圖17中的GFP熒光的定量顯示，在處理后4小時和6小時記錄到 KA處理組和對照組之間的相對熒光(RF)的顯著差異，與對照組相比，在 處理后6小時處理組有25。/。均值的最顯著增加(p0.01)。類似地，KA組 中與0小時相比時，處理后6小時出現(xiàn)了 RF的顯著增加，在處理后6小時出現(xiàn)最顯著的22。/。均值增加(P0.05)。對照組內(nèi)，不同時間點之間未 出現(xiàn)RF的顯著差異(圖17)。 Western印跡結(jié)果
/人顯示在圖18A中的western印跡結(jié)果可見，在約51 kDa處檢測到 帶，其與采用Dako抗兔GFAP抗體報告的小鼠GFAP分子大小相對應。 在約27 kDa處也4企測到帶，其與采用Abeam抗兔GFP抗體才艮告的小鼠 GFP分子大小相對應。從帶的濃度可看出在轉(zhuǎn)基因小鼠中GFAP和GFP 蛋白的量從0至6小時是增加的(比較道a和b)。在非轉(zhuǎn)基因小鼠中，GFAP 蛋白的量從0至6小時也是增加的(比較GFAP western印跡中道c和d)。 由于沒有轉(zhuǎn)基因，在非轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有檢測到GFP蛋白(GFP western 印跡中道c和d)。當采用IVIS對western印跡膜成像時，彩色描繪的蛋 白存在量給出了相同結(jié)果(參考圖18B)。這支持了這樣的事實，即在注射 KA后GFAP ^皮上調(diào)，其又導致GFP的上調(diào)。
實時RT-PCR結(jié)果
mRNA的研究與BCA和western印跡中的蛋白研究結(jié)果是一致的。 當GFAP和GFP蛋白的上調(diào)在6小時達到峰值時，發(fā)現(xiàn)GFAP和GFP mRNA的上調(diào)在早至KA處理后2小時就出現(xiàn)了 。這個時間差異說明了 mRNA被翻譯成蛋白所需的時間。如圖19所顯示的，發(fā)現(xiàn)在KA處理后 2小時GFAP和GFP基因表達的增加具有統(tǒng)計學顯著性，分別為約21% (p〈0.01)和22% (p<0.05)。
GFAP免疫組織化學
海馬CA1、 CA2和CA3亞區(qū)域中GFAP免疫染色的代表性圖像顯示 在圖20A-D中。在一次KA (2 mg/kg sc)處理后6小時，海馬各個區(qū)域星 形細胞中GFP表達明顯增加。為了證實GFP表達細胞確實是星形細胞， 我們對相同切片進行了 GFAP免疫染色，發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)域GFAP免疫 陽性細胞和內(nèi)源GFP標記星形細胞之間的共定位主要出現(xiàn)在細胞突而不 是細胞體中(如圖20B中，雙標記的細胞突的實例以箭頭指出)。實施例討論
在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子驅(qū)動綠色熒 光蛋白(GFP)的表達。GFAP是主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)星形細胞中表 達的中間纖維蛋白。這些神經(jīng)膠質(zhì)細胞的變化可用于監(jiān)測神經(jīng)元活性。 對CNS中神經(jīng)元的損傷是GFAP的有效誘導者。但是，通過體外測定來 監(jiān)測GFAP需要處死動物。我們已經(jīng)證實GFAP-GFP表達的非侵入性體 內(nèi)神經(jīng)成像使得能夠長期監(jiān)測GFAP,并且減少了該過程中所處死動物的 數(shù)量。
2'-CH3-MPTP是引起黑質(zhì)致密區(qū)中多巴胺能神經(jīng)元變性的神經(jīng)毒素。 卡因酸是引起興奮性腦中毒損傷的神經(jīng)毒素。已知這兩種神經(jīng)毒素均使 GFAP表達升高。這可被開發(fā)成非侵入性體內(nèi)成像模型，用于診斷和篩選 治療，即候選藥物和療法；以及用于研究發(fā)育神經(jīng)毒性。向新生小鼠注 射這些神經(jīng)毒素，并采用IVIS成像系統(tǒng)研究隨后由于神經(jīng)毒素的作用新 生腦中GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因的萸光增加。為了支持非侵入性體內(nèi)神經(jīng)成像 模型在研究神經(jīng)發(fā)育方面是可靠的這個結(jié)論，還進行了體外測定。進行 了 BCATM蛋白測定(GFP)和westem印跡以定量蛋白表達，而實時RT-PCR 用于定量基因表達。這些測定可用于跟蹤在新生小鼠中由于給予神經(jīng)毒 素而發(fā)生的變化，其結(jié)果可與體內(nèi)神經(jīng)成像的結(jié)果進行比較。
在過去的半個世紀，細胞生物學和分子生物學分析是針對在培養(yǎng)皿 中生長的細胞并通過細胞外分析包括基因和蛋白在內(nèi)的細胞組分而進行 的。使用光學探針來體內(nèi)跟蹤和報告分子、蛋白和細胞的功能信息是新 的和快速發(fā)展的技術(shù)。這項技術(shù)有廣泛應用，包括研究傳染性疾病、腫 瘤學、藥物動力學、藥效學、毒理學以及轉(zhuǎn)基因動物中生物發(fā)光或焚光 才艮告子的基因表達(Contag et al.， 2000, Rehemtulla et al., 2000， Yang et al.， 2000， Zhang et al" 2001, Bhaumik and Gambhir， 2002, Bouvet et al., 2002， Ntziachristos et al., 2002)。如Hoffinan(Hoffinan， 2004)所闡述的，GFP作 為報告基因的來臨使細胞和分子生物學發(fā)生范式轉(zhuǎn)變成為可能。引入快 速和可進入臨床前研究的成像技術(shù)將使每次實驗設(shè)計產(chǎn)生更多和更高質(zhì) 量的實驗數(shù)據(jù)，這通過增加可收集定量數(shù)據(jù)的次數(shù)來實現(xiàn)。通過在多個 時間點對整體完好的活體動物成像，研究者可在完好器官背景下分析生物分子過程。額外的優(yōu)點是，采用這些方法，較少的動物就可產(chǎn)生具有
更高統(tǒng)計學顯著性和更低壓力(lower stress)的數(shù)據(jù)。非侵入性方法可用于 產(chǎn)生更具有預測性的動物模型，它們共有縱向研究設(shè)計、內(nèi)部實驗性對 照、分子信息和定量數(shù)據(jù)的特征，這些方法有益于科學調(diào)查和人道的動 物使用。此外，成像可通過指導用于組織學或生化分析的合適的終點組 織取樣而進一 步改進這些方法。
本研究所面對的一個問題是自體熒光源。通常，由動物組織中包括 彈性蛋白、膠原、色氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、卟啉和黃素 在內(nèi)的內(nèi)源生色團引起的組織自體熒光比儀器的自體熒光高得多，尤其 是在可見光范圍內(nèi)(Troyeta1.，2004)。對于體內(nèi)成像，組織自體焚光是主 要問題，這是由于其影響了檢測目的熒光探針的能力。如在這項研究中 所看到的，來自新生小鼠的自體熒光隨著小鼠從出生發(fā)育至成體而增加。 于是，本發(fā)明人設(shè)計了安全防護系統(tǒng)來監(jiān)測信噪(s/n)比，其通過使用來自 非轉(zhuǎn)基因小鼠的自體熒光將來自轉(zhuǎn)基因小鼠的總GFP熒光標準化而產(chǎn)生 相對熒光(RF)來實現(xiàn)。如果RF突破了從轉(zhuǎn)基因小鼠檢測的GFP信號的 閾值以下1.3或30%,則該特定數(shù)據(jù)可被認為是具有過低的s/n比，因而 過于不可靠而不能用于產(chǎn)生精確的定量結(jié)果。
采用2'-CH3-MPTP作為模型化合物，通過非侵入性體內(nèi)神經(jīng)成像模 型獲得的數(shù)據(jù)與組織學測定的存在上調(diào)的星形細胞一致。有大量文獻才艮 道，MPTP在體內(nèi)可特異地誘導中腦多巴胺神經(jīng)元的神經(jīng)變性死亡，導致 動物的帕金森病或人類帕金森病(Damier et al.， 1999， German et al., 1999, Olanow and Tatton， 1999)。之前的證據(jù)提示了星形細胞在MPTP誘導的帕 金森病病理過程中的可能作用。例如，全身注射了 MPTP的成體小鼠顯 示了星形細胞中顯著的GFAP升高，同時腦紋狀體區(qū)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元 中多巴胺減少(Reinhard et al" 1988, Chen et al" 2002, Dervan et al., 2004， Kurosaki et al.， 2004)。值得注意的是，在相同遺傳背景的較老小鼠中觀察 到腦更易受到MPTP傷害(Ali etal.， 1993)。與成體小鼠腦中MPTP作用的 研究相比，只有有限量的關(guān)于新生腦中星形細胞如何對MPTP作出反應 的文獻，推測是由于缺乏允許在腦發(fā)育過程中反復非侵入性測量GFAP 轉(zhuǎn)錄活性的合適方法。但是，少數(shù)報道確實證實對新生小鼠全身MPTP注射導致在成年期的7Jc久腦損傷，如所測量的(Ali et al., 1993, Fredriksson etal., 1993, Schwartz and Nishiyama， 1994)。盡管如此，這些早期的才艮道產(chǎn) 生了這樣的觀點，即發(fā)育中的腦也易受到MPTP傷害，值得仔細研究。 因此，本文描述的模型提供了在活體動物中研究神經(jīng)元變性的新的可能 性。在本發(fā)明中，現(xiàn)在可能監(jiān)測各種藥物的作用，以防止由于活體動物 中中風和擠壓傷導致的神經(jīng)損傷。此外，由于GFAP上調(diào)出現(xiàn)在阿爾茨 海默病(Vanzani et al.， 2005)和亨廷頓病(Ishiguro et al.， 2001)的各個模型 中，可使用這種GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因新生小鼠來研究GFAP上調(diào)，并且非 侵入性監(jiān)測各種藥物治療的神經(jīng)保護作用。除了神經(jīng)變性，這些小鼠還 可以用于研究腦腫瘤的治療。Kalamarides等人最近的文章(Kalamarides et al.， 2002)描述了小鼠腦膜瘤模型，其中Nf2基因在蛛網(wǎng)膜細胞中是失活 的。當GFAP侵入腦組織并生長時，其表達在圍繞該腫瘤的星形細^<中 被上調(diào)(Pekny and Nilsson， 2005)。本發(fā)明的其它優(yōu)點是沒有麻醉劑被引入 到新生小動物，因而避免了對小鼠任何可能的神經(jīng)毒性作用。在2' -CH3-MPTP處理小鼠的SNC和腹側(cè)被蓋區(qū)中沒有檢測到TH樣免疫反應 性的明顯變化，提示黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元的變性在2'-CH3-MPTP注 射后6小時仍不明顯。這與Araki等人的觀察(在MPTP處理后5天出現(xiàn) 多巴胺能神經(jīng)元的減少)和Kurosaki等人的發(fā)現(xiàn)(僅在MPTP處理后1天 紋狀體和黑質(zhì)中TH免疫陽性纖維和細胞體減少)很好地相符。集中于2' -CH3- MPTP的全身給藥以及處理后24、 48和72小時期間對GFAP和 TH免疫染色的影響的其它研究將擴展我們對該領(lǐng)域的認識。
除了 MPTP，還報道了導致成體小鼠腦各個區(qū)域中神經(jīng)元損傷的多種 其它化學品，如通過GFAP升高所證實的。這些化學品包括一系列結(jié)構(gòu) 和功能上不同的化合物，從工業(yè)上有毒的化合物如三曱基錫(O'Callaghan, 1988)和曱基汞(0'Callaghan， 1988, Barone Jr. et al., 1998， Garcia et al.， 2002)、農(nóng)業(yè)殺蟲劑(Garcia et al., 2002)到食品添加劑(Ostergren et al., 2005)。與成體中經(jīng)發(fā)育的腦相比，具有較不完整血腦屏障的發(fā)育中腦更 易于受到已知神經(jīng)毒素的傷害，更關(guān)鍵的是受多種化合物的傷害，這些 化合物可進入人類食物鏈和環(huán)境而未經(jīng)首先適當?shù)貦z測其神經(jīng)毒性。對 于測試化合物在發(fā)育中的腦中的潛在神經(jīng)毒性而言，其重要性無論如何強調(diào)也不過分(Olney, 2002)，尤其是在處理沉默神經(jīng)毒性(Costa et al., 2004))的問題時。(Tilson， 2000)評述過的美國環(huán)保局的發(fā)育神經(jīng)毒性測試 指南(Developmental Neurotoxicity Testing Guideline, DNTG)進一步強調(diào)了 這點。最近，歐委會采納了用新的歐盟管理框架來通過嚴格制度測試所 有的化學試劑的建議，據(jù)估計新措施耗資高至70億歐元并需要至少10 年來實施(European， 2003)。但是，對于使用常規(guī)的GFAP技術(shù)試圖評估 大量化合物在體內(nèi)對發(fā)育中CNS的神經(jīng)毒性風險來說，是個難以克服的 挑戰(zhàn)，尤其是考慮到該測定方法必須以適當?shù)奶幚砹恳约肮I(yè)(Kaufinann，
2003) 和管理機構(gòu)(Hass， 2003)都可接受的成本提供合理的科學依據(jù)時。 由于在腦的所有主要區(qū)域中顯示獨特的神經(jīng)膠質(zhì)細胞表達模式(Suetal.,
2004) 的經(jīng)證實的GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠模型(Zhuo et al.， 1997)與合適的 體內(nèi)光學生物成像系統(tǒng)的整合，有可能非侵入性研究神經(jīng)變性疾病、發(fā) 育神經(jīng)毒理學，實時篩選化學化合物，以及對諸如創(chuàng)傷后傷口愈合、中 風和腫瘤生長的其它CNS病理學的潛在治療介入。
參考文獻
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權(quán)利要求
1. 涉及檢測動物中目的熒光蛋白表達的方法，其中所述動物為轉(zhuǎn)基因動物，在其基因組中具有編碼所述熒光蛋白的核酸，所述編碼所述熒光蛋白的核酸可操作地連接來自通常在所述動物神經(jīng)系統(tǒng)中表達的蛋白的啟動子核酸，所述方法包括非侵入性檢測在所述動物中表達的所述蛋白的熒光的步驟。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述啟動子為GFAP啟動子。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述熒光蛋白為綠色熒光蛋 白(GFP)。
4. 如權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述方法用于研究 向所述動物給予測試物的影響，所述方法包括在非侵入性檢測焚光的步 驟之前向所述動物給予所述測試物的步驟。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述方法包括以下步驟將來自 未給予所述測試物的對照動物的熒光與向所述轉(zhuǎn)基因動物給予所述測試 物后來自所述轉(zhuǎn)基因動物的熒光進行比較。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述方法包括以下步驟(i) 在給予所述測試物之前非侵入性檢測所述轉(zhuǎn)基因動物中的熒光， 以提供對照；(ii) 給予所述測試物之后非侵入性檢測所述相同動物中的熒光；以及(iii) 將在(i)中檢測的熒光與在(ii)中檢測的熒光進行比較。
7. 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述方法包括以下步驟 (i)非侵入性檢測第一動物中的熒光，以提供對照；(ii) 向第二轉(zhuǎn)基因動物給予測試物，接著非侵入性檢測所述動物中的焚光；以及(iii) 將在(i)中檢測的熒光與在(ii)中檢測的熒光進行比較。
8. 如權(quán)利要求4至7中任一項所述的方法，其中所述方法用于確定 所述測試物的神經(jīng)毒性。
9. 如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述方法用于測試 測試物促進神經(jīng)學損傷的治療或調(diào)節(jié)神經(jīng)學損傷的能力，其中所述方法 包括以下步驟(i) 在所述轉(zhuǎn)基因動物中誘導神經(jīng)學損傷；(ii) 在給予所述測試物之前非侵入性檢測來自(i)的所述神經(jīng)學損傷 動物中的熒光，以提供對照；(iii) 在給予所述測試物之后非侵入性檢測來自(ii)的該相同動物中的 焚光；以及(iv) 將在(ii)中檢測的熒光與在(iii)中檢測的熒光進行比較。
10. 如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述方法用于測試 測試物促進神經(jīng)學損傷的治療或調(diào)節(jié)神經(jīng)學損傷的能力，其中所述方法 包括以下步驟(i) 在第一動物中誘導神經(jīng)學損傷，且非侵入性檢測所述神經(jīng)學損傷 動物中的熒光，以提供對照；(ii) 在第二轉(zhuǎn)基因動物中誘導神經(jīng)學損傷，并向所述動物給予所述測 試物，接著非侵入性檢測所述動物中的熒光；以及(iii) 將在(i)中檢測的熒光與在(ii)中檢測的熒光進行比較。
11. 如權(quán)利要求9或IO所述的方法，其中所述神經(jīng)學損傷是通過向 所述動物給予選擇的化學品而誘導的。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中給予所述化學品以便提供所選 疾病的化學誘導動物模型。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述疾病選自帕金森病、阿爾 茨海默病或亨廷頓病。
14. 如權(quán)利要求11至13中任一項所述的方法，其中所述化學品選自 MPTP、 2'-CH3-MPTP、 6-羥基多巴胺(6-OHDA)、紅藻氨酸、三曱基錫、 毒死蜱(CPF)、乙烯雙二疏代氨基曱酸錳(代森錳或MB)、魚藤酮、百草 枯(N，N'-二曱基-4-4'-聯(lián)吡啶鑰)、聚氯聯(lián)苯(PCBs)、 3,3'-亞氨基二丙腈 (IDPN)、曱苯(曱基苯)。
15. 如權(quán)利要求9或IO所述的方法，其中所述神經(jīng)學損傷是通過對 所述動物的頭和/或頸和/或背施加物理力而誘導的。
16. 如權(quán)利要求9或IO所述的方法，其中所述神經(jīng)學損傷是通過減 少對所述動物神經(jīng)系統(tǒng)的供氧導致腦缺血而誘導的。
17. 如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述方法用于測試 測試物促進神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的能力，其中所述方法包括以下步驟(i) 提供所述轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物也是所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動 物模型；(ii) 在給予所述測試物之前非侵入性檢測來自(i)的所述動物中的熒 光，以提供對照；(iii) 在給予所述測試物之后非侵入性檢測來自(ii)的該相同動物中的 熒光；以及(iv) 將在(ii)中檢測的熒光與在(iii)中檢測的熒光進行比較。
18. 如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述方法用于測試 測試物促進神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的能力，其中所述方法包括以下步驟(i) 提供第一和第二動物，其中這兩動物均為所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動 物模型；(ii) 在來自(i)的第一動物中，非侵入性檢測所述動物中的熒光，以提 供對照；(iii) 在來自(i)的第二轉(zhuǎn)基因動物中，向所述動物給予所述測試物， 接著非侵入性檢測所述動物中的熒光；以及(iv) 將在(ii)中檢測的焚光與在(iii)中檢測的焚光進行比較。
19. 如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述方法用于測試 對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，其中所述方法包括以下步驟(i) 提供所述轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物也是所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動 物模型；(ii) 在進行所述治療之前非侵入性檢測來自(i)的所述動物中的焚光， 以提供對照；(iii) 在進行所述治療后非侵入性檢測來自(ii)的所述相同動物中的焚 光；以及(iv) 將在(ii)中檢測的焚光與在(iii)中檢測的熒光進行比較。
20. 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述方法用于測試對神經(jīng)系 統(tǒng)疾病的治療，其中所述方法包^r以下步驟(i) 提供第一和第二動物，其中這兩動物均為所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動 物模型；(ii) 在來自(i)的第一動物中，非侵入性檢測所述動物中的焚光，以提 供對照；(iii) 在來自(i)的第二轉(zhuǎn)基因動物中，對所述動物進行治療，接著非 侵入性檢測所述動物中的熒光；以及(iv) 將在(ii)中檢測的熒光與在(iii)中檢測的焚光進行比較。
21. 如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中所述治療包括應用X射 線或7射線。
22. 如權(quán)利要求17至21中任一項所述的方法，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)疾 病是神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述肺瘤選自神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成 神經(jīng)管細胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)纖維瘤、室管膜瘤、神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)纖維 肉瘤、星形細胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
24. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述動物為哺乳動物。
25. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述動物為新生動物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種涉及檢測動物中目的熒光蛋白表達的方法，其中所述動物為轉(zhuǎn)基因動物，在其基因組中具有編碼所述熒光蛋白的核酸，所述編碼所述熒光蛋白的核酸可操作地連接來自通常在所述動物神經(jīng)系統(tǒng)中表達的蛋白的啟動子核酸，所述方法包括非侵入性檢測在所述動物中表達的所述蛋白的熒光的步驟。
文檔編號G01N33/68GK101287365SQ200680038231
公開日2008年10月15日 申請日期2006年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日
發(fā)明者何炎坤, 朗 卓 申請人:科技研究局