專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于測(cè)定生物活性血清對(duì)氧磷酶水平的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：和
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及生化診斷，更詳細(xì)地講，涉及用于測(cè)定生物活性血清對(duì)氧磷酶(PON)(例如P0N1)水平的方法和組合物。血清對(duì)氧磷酶(P0N1)是被稱(chēng)為PON酶的大家族中最常見(jiàn)的成員。PONl是HDL相關(guān)酶，具有抗動(dòng)脈粥樣化性質(zhì)及水解例如酯、有機(jī)磷酸酯(例如對(duì)氧磷)和內(nèi)酯等多種底物的解毒性質(zhì)。長(zhǎng)期以來(lái)，PON1被認(rèn)為是芳基酯酶和對(duì)氧磷酶，并因此來(lái)測(cè)定它的活性。然而，最近越來(lái)越清楚的是，PON1主要是既催化多種內(nèi)酯水解[1'2]又催化其形成[3]的內(nèi)酯酶。結(jié)構(gòu)-反應(yīng)性研究[4]和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化實(shí)驗(yàn)[5]表明PON1的天然活性是內(nèi)酯酶，而對(duì)氧磷酶和芳基酯酶的活性是無(wú)選擇性的。PON1的活化研究(通過(guò)與攜帶ApoA-I的HDL顆粒結(jié)合)表明，對(duì)內(nèi)酯底物，特別是親脂性?xún)?nèi)酯的特異性高[6]。決定性的是，內(nèi)酯酶活性是PON家族所有成員都共有的唯一活性，該家族某些成員不具有對(duì)氧磷酶或芳基酯酶活性[2]。人血清中PON1的活性是許多研究的課題，這些研究著重PONl多態(tài)性之間可能的聯(lián)系、調(diào)節(jié)其活性的各種環(huán)境因素和對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和其它疾病的易感性[7]。然而，現(xiàn)有的測(cè)定法卻使用生理上沒(méi)有關(guān)系的乙酸苯酯或?qū)ρ趿?。?交相關(guān)的測(cè)定法必需強(qiáng)調(diào)內(nèi)酯酶活性。用脂族內(nèi)酯測(cè)定內(nèi)酯酶活性的現(xiàn)有方法以pH指示劑[1'4]和HPLC[2'3]為基礎(chǔ)。后者十分費(fèi)力，而pH指示劑測(cè)定法又需要重復(fù)校準(zhǔn)，只有用純酶樣品在其pH和緩沖液規(guī)格可受到嚴(yán)格控制時(shí)才能得到精確的結(jié)果。近來(lái)，Sicard及同事M開(kāi)發(fā)出使用6元和7元被傘形酮取代的環(huán)內(nèi)酯的基于熒光的內(nèi)酯酶測(cè)定法。然而，這些底物聽(tīng)顯不同于包含具有長(zhǎng)烷基側(cè)鏈的5元環(huán)氧代內(nèi)酯的良好PONl底物[2'4'6]。這些底物在最適于PONl的pH(8.0-8.5)下還顯示出高的本底速度。因此，普遍認(rèn)為需要無(wú)上述限制的內(nèi)酯酶活性的新測(cè)定法，獲得這種測(cè)定法也將是十分有利的。發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供生物活性PON酶水平的測(cè)定方法，該方法包括測(cè)定PON酶的內(nèi)酯酶活性，內(nèi)酯酶活性是生物活性PON酶水平的指標(biāo)。本發(fā)明另一方面提供測(cè)定受治療者PON狀況的方法，該方法包括(a)測(cè)定受治療者的PON酶的內(nèi)酯酶活性水平，內(nèi)酯酶活性是受治療者的生物活性PON水平的指標(biāo)；和(b)對(duì)受治療者的PON酶進(jìn)行基因分型，從而測(cè)定受治療者的PON狀況。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，PON酶選自PONl、PON2和PON3。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，生物活性PON酶包括脫脂載脂蛋白結(jié)合的PON酶。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，測(cè)定PON酶的內(nèi)酯酶活性是通過(guò)以下方法實(shí)施的(i)層析分析法；(ii)pH指示劑測(cè)定法；(iii)分光光度測(cè)定法；(iv)偶耳關(guān)測(cè)定法；(v)電化學(xué)測(cè)定法；和/或(vi)量^^則定'法(therm畫(huà)ocalometricassay)。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，在包含至少一種內(nèi)酯并且能夠在內(nèi)酯水解時(shí)形成至少一種分光光度法可檢測(cè)部分的底物存在下，實(shí)施分光光度測(cè)定法。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，分光光度測(cè)定法選自磷光測(cè)定法、熒光測(cè)定法、顯色測(cè)定法、發(fā)光測(cè)定法和映光測(cè)定法(illuminiscenceassay)。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，可檢測(cè)部分與內(nèi)酯連接。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，可^r測(cè)部分形成內(nèi)酯的一部分。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，可4企測(cè)部分包含至少一種硫醇。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，底物包含與內(nèi)酯連接的硫代烷氧基。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，硫代烷氧基含有2-12個(gè)碳原子。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，檢測(cè)是通過(guò)顯色測(cè)定法或焚光測(cè)定法實(shí)施的。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，底物包括5、6或7元內(nèi)酯，具有與內(nèi)酯雜原子相鄰的碳連接的硫代烷氧基。本發(fā)明又一方面提供樣品中內(nèi)酯酶活性的測(cè)定方法，該方法包括(a)使樣品與含有至少一種內(nèi)酯并且能夠在內(nèi)酯水解時(shí)形成至少一種分光光度法可檢測(cè)部分的化合物接觸，其中對(duì)可檢測(cè)部分進(jìn)行選擇，使得化合物具有與內(nèi)酯酶底物基本相同的結(jié)構(gòu)；和(b)用分光光度法測(cè)定此部分的水平，從而測(cè)定樣品中內(nèi)酯酶的活性。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，可^f全測(cè)部分的水平測(cè)定是通過(guò)磷光測(cè)定法、熒光測(cè)定法、顯色測(cè)定法、發(fā)光測(cè)定法和映光測(cè)定法實(shí)施的。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，可檢測(cè)部分與內(nèi)酯連接。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，可檢測(cè)部分形成內(nèi)酯的一部分。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，可4企測(cè)部分包含至少一種硫醇。才艮據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，底物包含與內(nèi)酯連接的硫代烷氧基。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，硫代烷氧基含有2-12個(gè)碳原子。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，檢測(cè)是通過(guò)顯色測(cè)定法實(shí)施的。本發(fā)明再一方面提供用于測(cè)定受治療者的體質(zhì)(predisposition)或者診斷與受治療者的PON酶水平或活性異常相關(guān)疾病的試劑盒，該試劑盒包括至少一種能夠測(cè)定PON酶的內(nèi)酯酶活性的試劑。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，至少一種試劑是包含至少一種內(nèi)酯并且能夠在內(nèi)酯水解時(shí)形成至少一種分光光度法可檢測(cè)部分的化合物。本發(fā)明另外一方面提供包含至少一種內(nèi)酯并且能夠在內(nèi)酯分解時(shí)形成至少一種分光光度法可檢測(cè)的含硫醇部分的化合物。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，含硫醇部分是可通過(guò)選自以下的分光光度測(cè)定法;險(xiǎn)測(cè)的磷光測(cè)定法、熒光測(cè)定法、顯色測(cè)定法、發(fā)光測(cè)定法和映光測(cè)定法。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，可檢測(cè)部分與內(nèi)酯連接。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，可檢測(cè)部分形成內(nèi)酯的一部分。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，可檢測(cè)部分包含硫代烷氧基。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，石危代烷氧基含有2-12個(gè)碳原子。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，內(nèi)酯是5、6或7元內(nèi)酯。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又一個(gè)特征，內(nèi)酯是5元內(nèi)酯。本發(fā)明通過(guò)提供用于測(cè)定生物活性血清對(duì)氧磷酶水平的方法和組合物，成功地克服了現(xiàn)有已知的測(cè)定格局的缺點(diǎn)。除非另有規(guī)定，否則所有本文所用科技術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。盡管在實(shí)踐當(dāng)中或在本發(fā)明檢驗(yàn)中，可以使用類(lèi)似于或等同于本文所述的方法和材料，但是合適的方法和材料記述如下。萬(wàn)一發(fā)生抵觸，則以本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實(shí)施例僅是示例性的，而不是限制性的。附圖簡(jiǎn)述本文僅通過(guò)實(shí)施例并參考附圖描述本發(fā)明。現(xiàn)在具體地參考附圖細(xì)節(jié)，須強(qiáng)調(diào)的是，所給出的細(xì)節(jié)僅僅作為實(shí)例，是為了說(shuō)明性地論述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并且所提供的這些詳細(xì)資料是為了提供我們認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的原理和構(gòu)思方面最有用和最易理解的描述。在這點(diǎn)上，我們沒(méi)有試圖以比基本理解本發(fā)明所必需的更為詳細(xì)的方式來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，附圖中的說(shuō)明，使本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本發(fā)明的幾種形式如何具體體現(xiàn)在實(shí)施中。附圖中圖la-b是表示PONl內(nèi)酯酶活性的比色測(cè)定(圖la)和熒光測(cè)定(圖lb)的曲線圖。圖la-0.2mMTBBL與0.5mMDTNB，在PON1存在(8.375xl(T9M;實(shí)心方塊)或不在(空心圓)時(shí)，在412nm下通過(guò)吸光度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。圖lb-0.25mMTBBL與50nMCPM,在PONl存在(8.375xl(T9M;實(shí)心方塊)或不存在(空心圓)時(shí)，在400nm激發(fā)和516nm發(fā)射下進(jìn)行檢測(cè)。圖2a-b是表示人血清中P0N1的內(nèi)酯酶(圖2a)和芳基酯酶(圖2b)活性的曲線圖。將血清用Tris(pH8.0)稀釋(1:400),反應(yīng)物包括圖2a-0.5rnMTBBL和0.5mMDTNB;圖2b-l.OmM乙酸苯酯。所顯示的是以下情況下所觀測(cè)到的反應(yīng)速率無(wú)抑制劑(實(shí)心圓)、100^iM2-羥基壹啉(空心圓)、或5mMEDTA(實(shí)心三角)和無(wú)血清的本底水解(空心方塊)。用DTNB檢測(cè)TBBL的水解，在412nm下通過(guò)吸光度進(jìn)行監(jiān)測(cè)(圖2a)。通過(guò)270nm下的吸光度直接監(jiān)測(cè)乙酸苯酯的水解(圖2b)。圖3是曲線圖，表示在表達(dá)P0N1的大腸桿菌(五.co/Z)中，用硫代烷基丁內(nèi)酯底物(TBBL)和水包油包水乳劑，通過(guò)FACS分析測(cè)定的PON1內(nèi)酯酶活性。使在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)rePONl的細(xì)胞與TBBL和硫醇檢測(cè)染料CPM—起乳化。所表示的是表達(dá)GFP和P0N1的單個(gè)細(xì)胞(白色)和僅GFP的對(duì)照細(xì)胞(灰色)在530nm下熒光發(fā)射的代表性曲線圖(^危醇-CPM加和物)。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及用于測(cè)定生物活性?xún)?nèi)酯酶水平，更準(zhǔn)確地說(shuō)是血清對(duì)氧磷酶水平的方法和組合物，還涉及一類(lèi)新的合成底物和制備該底物的方法。參照附圖和，可以更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)該了解本發(fā)明在其應(yīng)用以下說(shuō)明書(shū)或?qū)嵤├兴黾?xì)節(jié)時(shí)并無(wú)限制。本發(fā)明可能有其它實(shí)施方案，或者能夠以各種方式實(shí)施或?qū)崿F(xiàn)。同樣，應(yīng)當(dāng)理解本文所用措辭和術(shù)語(yǔ)是為了說(shuō)明目的，不應(yīng)視為限制。對(duì)氧磷酶1(PONl)是還包括PON2和PON3在內(nèi)的蛋白質(zhì)家族的一員。P0N1是HDL相關(guān)酶，具有抗動(dòng)脈粥樣化性質(zhì)及水解例如酯、有機(jī)磷酸酯(例如對(duì)氧磷)和內(nèi)酯等多種底物的解毒性質(zhì)。長(zhǎng)期以來(lái)，P0N1被認(rèn)為是芳基酯酶和對(duì)氧磷酶，并因此來(lái)測(cè)定它的活性。然而，近來(lái)越來(lái)越清楚的是，PON1主要是既催化多種內(nèi)酯水解又催化其形成的內(nèi)酯酶。結(jié)構(gòu)-反應(yīng)性研究和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化實(shí)驗(yàn)表明PON1的天然活性是內(nèi)酯酶，對(duì)氧磷酶和芳基酯酶的活性則是無(wú)選擇性的。當(dāng)前通常認(rèn)為，正是P0N1使有毒的有機(jī)磷酸(包括酯和鹽)降解并促使氧化脂質(zhì)代謝的催化效率，決定了由PON1針對(duì)生理毒素或異生毒素(xenobiotictoxin)(即并非身體或活的生物所原有的化合物)所提供的保護(hù)程度。另外，較高濃度的PONl提供更好的保護(hù)。因此，對(duì)于適度的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，重要的是了解PON的水平和活性。雖然如上所述，最近發(fā)現(xiàn)了PON的內(nèi)酯酶活性，但是卻沒(méi)有提出用于真實(shí)評(píng)價(jià)生物活性PON的PON內(nèi)酯酶活性的分析法。在將本發(fā)明付諸實(shí)施時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)測(cè)定PON的內(nèi)酯酶活性可以用于確定生物活性PON在個(gè)體中的水平。這些發(fā)現(xiàn)可有助于對(duì)與PON活性或水平不足有關(guān)的許多疾病(例如動(dòng)脈粥樣硬化)進(jìn)行正確的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。因此，本發(fā)明一方面，提供測(cè)定生物活性PON酶水平的方法。本文所用術(shù)語(yǔ)"PON酶"是指對(duì)氧磷酶(例如哺乳動(dòng)物對(duì)氧磷酶)，例如人PON1(GenBank檢索號(hào)NP—000437.3)、人PON2(GenBank檢索號(hào)NP—000296.l)和人PON3(GenBank檢索號(hào)NP—000931.1)。本文所用術(shù)語(yǔ)"生物活性PON酶"是指參與生物(例如生理)活動(dòng)(例如氧化脂質(zhì)的水解)的PON酶部分。例如，生物活性PON酶可指與各種脫脂載脂蛋白顆粒(例如HDL-apoA-I)締合的PON酶部分。最近已經(jīng)明確與apoA-IV和apoA-II相比，與邵oA-I締合的PON酶能夠刺激較高的PON內(nèi)酯酶活性[參見(jiàn)Gaidukov和Tawfik(2005)Biochemistry,《寺發(fā)表)。優(yōu)選本發(fā)明的PON酶存在于來(lái)自動(dòng)物受治療者(例如人)的生物樣品中，例如下面的進(jìn)一步描述。本發(fā)明這一方面的方法是通過(guò)測(cè)定PON酶的內(nèi)酯酶活性進(jìn)行的，這種內(nèi)酯酶活性是生物活性PON酶水平的指標(biāo)。本文所用術(shù)語(yǔ)"內(nèi)酯酶活性"是指內(nèi)酯水解活性，根據(jù)本發(fā)明這一方面，這通常是指內(nèi)酯酯鍵的水解。測(cè)定酶的內(nèi)酯酶活性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。這些方法一般通過(guò)已知的生化測(cè)定實(shí)施，例如層析測(cè)定法(例如HPLC、TLC、GC、CPE)、pH指示劑測(cè)定法、偶聯(lián)測(cè)定法(即在這些測(cè)定中，加入一種不是待測(cè)酶的酶以產(chǎn)生可檢測(cè)的產(chǎn)物；例如，由脫氫酶可轉(zhuǎn)換羧酸產(chǎn)物，通過(guò)吸光度或熒光監(jiān)測(cè)NAD/NADH或NADP/NADPH濃度的變化)、量熱測(cè)定法(即監(jiān)測(cè)熱容的變化)、電化學(xué)測(cè)定法(即監(jiān)測(cè)氧化還原電位的變化)和/或分光光度測(cè)定法。典型的酶測(cè)定法以待測(cè)酶特異性催化的化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)?；瘜W(xué)反應(yīng)通常是將底物或其類(lèi)似物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。測(cè)定微小變化水平即底物或產(chǎn)物濃度的能力，能夠定性和定量測(cè)定酶活性，甚至定量測(cè)定具體底物對(duì)于待測(cè)酶的特異性。為了測(cè)定底物和/或產(chǎn)物水平的微小變化，這些化合物應(yīng)當(dāng)具有能夠用化學(xué)或物理方法檢測(cè)的化學(xué)和/或物理性質(zhì)，例如pH、分子量、顏色的變化或其它直接或間接可測(cè)量的化學(xué)和/或物理性質(zhì)的變化。下面是^4居本發(fā)明這一方面，對(duì)能夠應(yīng)用的示例性?xún)?nèi)酯酶測(cè)定法進(jìn)行描述。pH指示劑測(cè)定法-基于pH指示劑的酶測(cè)定法通常用于用脂肪族內(nèi)酯測(cè)定內(nèi)酯酶活性。這可采用SPECTRAmaxPLUS微量板讀板儀(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)，用連續(xù)的pH敏感比色測(cè)定法(也就是測(cè)定由pH指示劑產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度)進(jìn)行，例如參見(jiàn)Billecke等(2000)DrugMetab.Dispos.28:1335-1342。反應(yīng)物(200|11最終體積)含有2mMHEPES(pH8.0)、lmMCaCl2、0.004%(重量/體積)酚紅、含有稀釋/未稀釋PON的樣品(例如血清樣品，稀釋100-1000倍)，與2nl100mM底物的曱醇溶液在37。C下開(kāi)始反應(yīng)3-10分鐘。用/人已知鹽酸含量所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線而得出的速率因子(mOD/jimo1H"")，由558nm下吸光度斜率的降低，用475nm(等消光點(diǎn))進(jìn)行校正，計(jì)算速率。內(nèi)酯的自發(fā)水解和經(jīng)大氣co2的酸化優(yōu)選通過(guò)用相同體積的保存緩沖液替換酶進(jìn)行平行反應(yīng)予以校正?；蛘?，可以用pH指示劑甲酚紫監(jiān)測(cè)由羧酸形成而產(chǎn)生的質(zhì)子釋放。在2.5mMiV-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH8.0-8.3,含有l(wèi)mMCaCl2和0.2MNaCl)中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)混合物含有0.2-0.3mM甲酚紅(得自60mM溶于DMSO的母液)。在底物與酶樣品混合時(shí)，監(jiān)測(cè)到微量滴定板讀板儀中在577nm下吸光度降低。該測(cè)定法需要原位用乙酸(標(biāo)準(zhǔn)酸滴定曲線)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，該標(biāo)準(zhǔn)曲線給出速率因子(-OD/摩爾IT)。HPLC分析-各種內(nèi)酯底物的水解可用HPLC分析法檢測(cè)。因此例如，?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)的水解可以通過(guò)HPLC進(jìn)行分析(例如配備設(shè)置為197nm的Waters2996光二極管陣列檢測(cè)器Waters2695系統(tǒng)，采用SupelcoDiscoveryC-18柱(250x4.6mm,5fim顆粒)。體積為50[il的25mMTris-HCl(pH7.4)、ImMCaCl2、25|iMAHL(例如得自2mM溶于曱醇的母液溶液)和含有稀釋/未稀釋PON的樣品(例如血清樣品，稀釋100-1000倍)中，在室溫下進(jìn)行酶反應(yīng)。用50^1乙腈(ACN)停止反應(yīng)，離心除去蛋白質(zhì)。將上清液(40jil)加到HPLC系統(tǒng)中，用85%CAN/0.2%乙酸(十四高絲氨酸內(nèi)酯)、0.75%CAN/0.2。/o乙酸(十二高絲氨酸內(nèi)酯)、50%CAN/2%乙酸(七高絲氨酸內(nèi)酯)或20%CAN/0.2%乙酸(3-氧代-己酰高絲氨酸內(nèi)酯)等度洗脫。他汀內(nèi)酯類(lèi)(statinlactones)(美伐他汀、洛伐他汀和辛伐他汀)的水解可用高效液相層析(HPLC)進(jìn)行分析，例如用BeckmanSystemGoldHPLC，配有126型可編程溶劑模塊(ProgrammableSolventModule)、設(shè)置為238nm的168型二極管陣列檢測(cè)器、帶有20iil環(huán)路(loop)的7125型Rheodyne手動(dòng)注射閥和BeckmanODSUltrasphere柱(C18，250x4.6mm，5jim)?？上騇erck公司購(gòu)買(mǎi)洛伐他汀(Mevacor)和辛伐他汀20mg片劑，從中用氯仿萃取內(nèi)酯，蒸發(fā)至干，再溶于曱醇。美伐他汀可購(gòu)自Sigma公司。在25。C下，以1ml終體積，將10-200^1酶溶液和10^1底物的甲醇溶液(0.5mg/ml)與50mMTris/HCl(pH7.6)、ImMCaCl2—起溫育。按規(guī)定時(shí)間取出等分量(100pl)，加到乙腈(100W)中，渦旋混合，以最高速度離心1分鐘(Beckmanmicroftige)。將上清液倒入新的管中，加蓋，水浴中保存直到進(jìn)行HPLC分析。以1.0ml/分鐘的流速，用由下列成分組成的流動(dòng)相，對(duì)樣品進(jìn)4亍等度洗脫八=乙酸/乙腈/水(2:249:249,體積/體積/體積)，B二乙腈，對(duì)于美伐他汀、洛伐他汀和辛伐他汀，A/B比分別為50/50、45/55和40/60。分光光度測(cè)定法-在這些測(cè)定法中，可以根據(jù)在酶催化過(guò)程中形成的分光光度法可檢測(cè)部分濃度的變化，測(cè)定底物的消耗和/或產(chǎn)物的形成。分光光度測(cè)定法的實(shí)例包括但不限于磷光測(cè)定法、熒光測(cè)定法、顯色測(cè)定法、發(fā)光測(cè)定法和映光測(cè)定法。磷光測(cè)定法監(jiān)測(cè)在吸收輻射能或其它類(lèi)型的能量后，由分光光度法可檢測(cè)部分所產(chǎn)生的發(fā)光的變化。磷光不同于焚光，因?yàn)樗踔猎谔?起磷光的輻射停止后仍然繼續(xù)發(fā)光。焚光測(cè)定法監(jiān)測(cè)在由光或其它形式的電^i輻射或者由其它方式刺激或激發(fā)下，由分光光度法可檢測(cè)部分所產(chǎn)生的發(fā)光的變化。只有當(dāng)刺激持續(xù)時(shí)才會(huì)發(fā)光；在這個(gè)現(xiàn)象中不同于磷光，其中在其它輻射激發(fā)停止后仍然繼續(xù)發(fā)光。顯色測(cè)定法監(jiān)測(cè)具有特征波長(zhǎng)的分光光度法可檢測(cè)部分所產(chǎn)生的測(cè)定介質(zhì)的顏色變化。發(fā)光測(cè)定法監(jiān)測(cè)在酶反應(yīng)過(guò)程中，化學(xué)發(fā)光以及因此所產(chǎn)生或消耗的分光光度法可檢測(cè)部分產(chǎn)生發(fā)光的變化。發(fā)光是物質(zhì)內(nèi)由較高能量狀態(tài)到較低能量狀態(tài)的電子運(yùn)動(dòng)引起的。本發(fā)明文中所用的術(shù)語(yǔ)"分光光度法可檢測(cè)的"是指一種物理現(xiàn)象，涉及波長(zhǎng)范圍介于紫外線至紅外線的可測(cè)量電磁輻射的作用?？缮?、光照度和紅外線和/或UV的具體特征。因此，術(shù)語(yǔ)"分光光度法可檢測(cè)部分"是指在酶測(cè)定過(guò)程中形成的、以一種或多種上述分光光度法可檢測(cè)性質(zhì)為特征的部分。因此，可以在酶反應(yīng)測(cè)定過(guò)程中，定量測(cè)定與酶活性相關(guān)的這部分的濃度。如上所述，內(nèi)酯是PON酶的天然底物。因此，在上述每個(gè)測(cè)定法中，底物優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)內(nèi)酯部分。正如本領(lǐng)域所眾所周知的是，術(shù)語(yǔ)"內(nèi)酯"是指環(huán)狀羧酸部分(例如環(huán)脂)，它通常是醇與羧酸酯間分子內(nèi)反應(yīng)的縮合產(chǎn)物。羧酸酯在本領(lǐng)域中時(shí)常是指"氧代內(nèi)酯"。術(shù)語(yǔ)"內(nèi)S旨，，通常也是指環(huán)狀硫代羧酸部分，因此還包括硫醇基團(tuán)與羧酸、醇與硫代羧酸和硫醇基團(tuán)與硫代羧酸間分子內(nèi)反應(yīng)物的縮合產(chǎn)物。這類(lèi)內(nèi)酯在本領(lǐng)域中一般統(tǒng)稱(chēng)"硫代內(nèi)酉旨"。另外，正如本領(lǐng)域眾所周知的是，內(nèi)酯環(huán)的大小范圍通常為4-8個(gè)原子。由于環(huán)張力和其它熱力學(xué)原因，普通內(nèi)酯環(huán)的大小范圍通常為5-7個(gè)原子。這樣的內(nèi)酯也纟皮-現(xiàn)為PON酶的良好底物。通常使用的前綴可以用來(lái)表明內(nèi)酯環(huán)的大小(3-內(nèi)酯是指4元環(huán)環(huán)內(nèi)酯，y-內(nèi)酯是指5元環(huán)內(nèi)酯，5-內(nèi)酯是指6元環(huán)。因此，本文所用術(shù)語(yǔ)"內(nèi)酯"包括如上所述的氧代內(nèi)酯和硫代內(nèi)酯，在內(nèi)酯環(huán)中具有4-8個(gè)原子，優(yōu)選5-7個(gè)原子。內(nèi)酯部分可以是取代或未取代的。如果是取代的，則在內(nèi)酯環(huán)上的一個(gè)或多個(gè)碳原子可以被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，取代基例如但不限于烷基、烯基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基(通過(guò)環(huán)碳鍵合)或雜環(huán)基(通過(guò)環(huán)碳鍵合)、烷氧基、硫代烷氧基等等，這些術(shù)語(yǔ)的定義見(jiàn)下文。本文所用術(shù)語(yǔ)"烷基"是指包括直鏈和支鏈基團(tuán)的飽和脂族烴基。優(yōu)選烷基具有1-20個(gè)碳原子。只要是數(shù)字范圍，例如本文規(guī)定的"1-20"，就意味著該基團(tuán)(在本案中為烷基)可含有1個(gè)碳原子、2個(gè)碳原子、3個(gè)碳原子等等，多達(dá)并包括20個(gè)碳原子。更優(yōu)選該烷基是中等大小的烷基，即具有l(wèi)-10個(gè)碳原子。除非另有說(shuō)明，否則最優(yōu)選烷基為低級(jí)烷基，即具有l(wèi)-4個(gè)碳原子。烷基可以是取代或未取代的。術(shù)語(yǔ)"烯基"是指由至少兩個(gè)碳原子和至少一個(gè)碳-碳雙鍵組成的烷基。術(shù)語(yǔ)"環(huán)烷基"是指全碳單環(huán)或稠環(huán)(即共享相鄰碳原子對(duì)的環(huán))基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)環(huán)不具有完全共軛的7l-電子體系。術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)基"是指在環(huán)上具有一種或多種原子(例如氮、氧和硫)的單環(huán)基或稠環(huán)基。環(huán)上還可具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵。然而，該環(huán)不具有完全共軛的兀-電子體系。術(shù)語(yǔ)"芳基"是指具有完全共軛7:-電子體系的全碳單環(huán)或稠環(huán)多環(huán)(即共享相鄰碳原子對(duì)的環(huán))基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"雜芳基"是指在環(huán)上具有一種或多種原子(例如氮、氧和硫)，并且另外具有完全共軛7T-電子體系的單環(huán)或稠環(huán)(即共享相鄰原子對(duì)的環(huán))基團(tuán)。雜芳基的實(shí)例包括但不限于吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、嗯哇、p塞哇、p比哇、吡咬、嘧，定、會(huì)啉、異會(huì)啉和嘌呤。術(shù)語(yǔ)"硫醇基"和"硫代幾基"是指-SH。術(shù)語(yǔ)"羥基"是指-OH。本文所用術(shù)語(yǔ)"烷氧基"是指-O-烷基，烷基如本文中定義。本文所用術(shù)語(yǔ)"硫代烷氧基"是指-S-烷基，烷基如本文中定義。上述內(nèi)酯部分，當(dāng)在上述酶測(cè)定法中用作底物時(shí)，可進(jìn)一步形成物質(zhì)的一部分。因此，例如內(nèi)酯部分可形成脂肪酸、類(lèi)固醇等的一部分。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，測(cè)定PON酶的內(nèi)酯酶活性是通過(guò)分光光度測(cè)定法實(shí)施的。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，該測(cè)定法利用包含一種或多種內(nèi)酯的底物，其能夠形成一種或多種分光光度法可檢測(cè)部分。4吏酶與該底物接觸，測(cè)定可^r測(cè)部分的量。在本文所述分光光度測(cè)定法的一個(gè)實(shí)施方案中，使用其中分光光度法可檢測(cè)部分是形成內(nèi)酯必備部分的底物。在該測(cè)定中，酶將內(nèi)酯水解，在測(cè)定介質(zhì)中產(chǎn)生分光光度法可檢測(cè)部分。因此，底物是在其結(jié)構(gòu)中具有前分光光度法可檢測(cè)部分(pre-spectrophotometricallydetectablespecies)的前分光光度法可4企測(cè)物質(zhì)。本文所用術(shù)語(yǔ)"前分光光度法可檢測(cè)部分或物質(zhì)"用來(lái)指當(dāng)在本文中進(jìn)行酶反應(yīng)時(shí)，能夠在特定條件下形成可檢測(cè)部分的部分或物質(zhì)。形成含內(nèi)酯底物部分的分光光度法可檢測(cè)部分是非常有利的，因?yàn)檫@些底物保持底物對(duì)其天然酶的天然化學(xué)特異性和空間特異性，從而保持酶與底物間天然的化學(xué)相互作用。保持這些相互作用能夠研究和測(cè)定酶的天然生物活性，還允許在酶的其它化學(xué)效應(yīng)物(例如天然和合成抑制劑)之間進(jìn)行生物學(xué)上有意義的比較。在本文所述分光光度測(cè)定法的一個(gè)實(shí)施方案中，使用其中分光光度法可檢測(cè)部分與內(nèi)酯連接的底物。對(duì)這類(lèi)底物進(jìn)行選擇，使得分光光度法可檢測(cè)部分一般在測(cè)定時(shí)所進(jìn)行的酶反應(yīng)中釋放出來(lái)。根據(jù)本發(fā)明這一方面的優(yōu)選實(shí)施方案，分光光度法可檢測(cè)部分包含碌b醇基。硫醇是已知非常便利的可檢測(cè)基團(tuán)。硫醇測(cè)定可通過(guò)例如用基于助染劑(pro-dye)5，5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB，亦稱(chēng)Ellman試劑[Ellman，G.L.,1959，Arch.Biochem.Biophys.82，70-77])經(jīng)硫醇基還原的分光光度法實(shí)施。該反應(yīng)產(chǎn)生可在412納米波長(zhǎng)下檢測(cè)到的有色物質(zhì)，如下所述，并進(jìn)一步在下面的實(shí)施例部分舉例說(shuō)明。如上所述，疏醇基可形成本實(shí)施方案所采用底物內(nèi)酯的一部分。因此，底物中的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)酯部分可在內(nèi)酯環(huán)內(nèi)具有硫原子，在酶水解時(shí)產(chǎn)生碌u醇。如以下流程I所示，可以通過(guò)如上所述與DTNB的典型反應(yīng)，來(lái)檢測(cè)硫醇。流程I<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>生色染料R=例如烷基、烯基和芳基任選含有硫醇的基團(tuán)可與底物的內(nèi)酯部分連接。對(duì)這種含有辟b醇的底物進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得含有硫醇的可檢測(cè)部分在酶反應(yīng)時(shí)釋放出來(lái)。優(yōu)選包含硫醇基的可檢測(cè)部分與這部分連接的是硫代烷氧基。硫代烷氧基可與內(nèi)酯連接使得在酶反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生硫代烷基，如以下流程n所示》流程II<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>R1=例如烷基當(dāng)本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步將本發(fā)明付諸實(shí)施時(shí)，設(shè)計(jì)并成功地制備和使用一系列新的含有內(nèi)酯的化合物，可以在內(nèi)酯酶活性測(cè)定中用作有效的PON底物。這種含有內(nèi)酯的化合物包括一種或多種內(nèi)酯環(huán)，在其分解時(shí)能夠形成一種或多種分光光度法可一企測(cè)的含硫醇部分，全都可用通式I表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>式I其中X和Y各自為氧原子或硫原子，Z為碳原子或硫原子，Y和Z至少一個(gè)為硫，n是介于2-4之間的整數(shù)，R,、112和113的每一個(gè)獨(dú)立地為氫、烷基、烯基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基(通過(guò)環(huán)碳鍵合)或雜環(huán)基(通過(guò)環(huán)碳鍵合)、烷氧基等等。因此，新的內(nèi)酯可以為其中n等于2的5元內(nèi)酯、其中n等于3的6元內(nèi)酯、或其中n等于4的7元內(nèi)酯。優(yōu)選n等于2，形成5元內(nèi)酯。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，X和Y都是氧原子，Z是^L原子。優(yōu)選，R,為具有2-12個(gè)碳原子的烷基。這樣的內(nèi)酯通常進(jìn)行由PON內(nèi)酯酶驅(qū)動(dòng)的酶水解，之后作為在水解時(shí)形成在同一碳原子上取代的硫代烷氧基/硫代羥基-羥基部分快速和自發(fā)分解的結(jié)果，釋放出硫醇。如上述流程II所示，所得硫醇可通過(guò)如上所述與DTNB的典型反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，將在下面的實(shí)施例中舉例i兌明。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，X為氧，Y為硫，因此化合物為硫代內(nèi)酯。在該實(shí)施方案中，Z或可為碳或硫，優(yōu)選為碳，R!可為氫、烷基、烯基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基(通過(guò)環(huán)碳鍵合)或雜環(huán)基(通過(guò)環(huán)碳鍵合)、烷氧基等等，優(yōu)選為具有2-12個(gè)碳原子的烷基。這些硫代內(nèi)酯可以通過(guò)PON進(jìn)行內(nèi)酯酶驅(qū)動(dòng)的酶水解，產(chǎn)生可以隨后才企出的硫醇基。在PON測(cè)定中，使用具有與其5位連接的烷基或硫代烷氧基的5元內(nèi)酯是十分有利的，因?yàn)檫@些化合物與PON1的良好底物(包含具有長(zhǎng)烷基側(cè)鏈的5元環(huán)氧代內(nèi)酯)幾乎相同[2'4，6]。在酶反應(yīng)中產(chǎn)生的含硫醇部分(例如硫代烷基)可以用作分光光度法可檢測(cè)部分，例如上述的磷光測(cè)定法、熒光測(cè)定法、顯色測(cè)定法、發(fā)光測(cè)定法和映光測(cè)定法，這些方法通常是用于^r測(cè)和定量測(cè)定酶活性的相對(duì)簡(jiǎn)單和快捷的技術(shù)。正如下面將證實(shí)和說(shuō)明的一樣，本發(fā)明的發(fā)明人曾使用一系列具有分光光度法可檢測(cè)的硫代烷氧基部分的內(nèi)酯底物，該硫代烷氧基部分與5元環(huán)內(nèi)酯在其5位相連接。如下面的實(shí)施例部分所示，制備下列內(nèi)酯5-乙硫基-二氬-吹喃-2-酮、5-丁硫基-二氬-呋喃-2-酮和5-己硫基-二氫-呋喃-2-酮。下表1所示的這些內(nèi)酯，k^/KM值的范圍介于1.5x105~4.45x105之間，與用內(nèi)酯所觀察到的k^/KM值相當(dāng)，因此被視為對(duì)于酶底物可接受的數(shù)值。酶活性的kca/KM值衡量底物特異性。它允許對(duì)同一酶不同底物的特異性進(jìn)行比較，或者對(duì)用不同酶轉(zhuǎn)化同一底物的催化速率進(jìn)行比較。這一比率具有二級(jí)速率常數(shù)的單位，因此用1/(濃度x時(shí)間)表示。盡管用某些酶觀察到數(shù)值2108M-1秒"，但是k。at/KM比率范圍為104-106NT1秒"的底物一皮視為良好的底物，即在酶測(cè)定中具有合理的親和性、特異性和快速的周轉(zhuǎn)率。在酶反應(yīng)過(guò)程中形成可檢測(cè)部分及結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于生理性?xún)?nèi)酯酶底物(例如上述新的內(nèi)酯)的內(nèi)酯，可以用于測(cè)定樣品中內(nèi)酯酶的活性。因此，根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供測(cè)定樣品中內(nèi)酯酶活性的方法。根據(jù)本發(fā)明這一方面，該方法是通過(guò)以下步驟完成的(a)使樣品與含有一種或多種如上所述的內(nèi)酯并且能夠在一種或多種內(nèi)酯水解時(shí)形成一種或多種如上所述的分光光度法可檢測(cè)部分的化合物接觸，其中對(duì)可檢測(cè)部分進(jìn)行選擇，使化合物具有與內(nèi)酯酶底物基本相同的結(jié)構(gòu)；和(b)用分光光度法測(cè)定分光光度法可檢測(cè)部分的水平，從而測(cè)定樣品中內(nèi)酯酶的活性。本文所用術(shù)語(yǔ)"具有與內(nèi)酯酶底物基本相同的結(jié)構(gòu)"是指幾乎與天然底物結(jié)構(gòu)相同的合成底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，差別在于相對(duì)較小的化學(xué)特征和/或結(jié)構(gòu)特征，例如1個(gè)或2個(gè)原子的置換、側(cè)鏈的延長(zhǎng)等。正如在上述內(nèi)酯酶活性測(cè)定法的具體情況下，任何內(nèi)酯酶活性的測(cè)定優(yōu)選采用分光光度測(cè)定技術(shù)，例如上述磷光測(cè)定法、熒光測(cè)定法、顯色測(cè)定法、發(fā)光測(cè)定法和映光測(cè)定法，因?yàn)檫@些測(cè)定通常需要普遍可獲得的機(jī)器和測(cè)定設(shè)備，用于測(cè)定分光光度法可檢測(cè)部分和其它化學(xué)實(shí)體濃度的微小變化。任何內(nèi)酯酶活性水平的測(cè)定，是按與內(nèi)酯連接的可檢測(cè)部分的濃度水平進(jìn)行的，與內(nèi)酯的連接或是通過(guò)形成內(nèi)酯環(huán)部分，或是通過(guò)作為取代基與之連接，正如上述PON內(nèi)酯酶活性測(cè)定實(shí)例中所述那樣。正如上述PON內(nèi)酯酶活性測(cè)定實(shí)例中所述那4f,可才全測(cè)部分優(yōu)選包括一個(gè)或多個(gè)硫醇基。值得注意的是，上述用于測(cè)定內(nèi)酯酶活性的試劑可包括在試劑盒中，用于測(cè)定受治療者的體質(zhì)或者診斷與受治療者的內(nèi)酯酶(例如PON酶)水平或活性異常有關(guān)的疾病或病癥。本文所用術(shù)語(yǔ)"受治療者"或"個(gè)體"是指受治療者(例如哺乳動(dòng)物)，優(yōu)選疑似患有與PON酶水平或活性異常有關(guān)疾病或者有與PON酶水平或活性異常有關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的受治療的人。本文所用術(shù)語(yǔ)"診斷"是指對(duì)疾病、病癥或癥狀進(jìn)行分類(lèi)，或者確定疾病、病癥或癥狀的嚴(yán)重程度，監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)程，預(yù)測(cè)疾病后果和/或恢復(fù)前景。本文所用術(shù)語(yǔ)"與PON酶水平或活性異常(與自健康受治療者獲取的對(duì)照樣品相比水平偏高或偏低)有關(guān)的疾病或病癥"是指其中PON(例如PONl)活性發(fā)生改變的各種病理和生理病癥和疾病(參見(jiàn)例如Costa等(2005)BiochemicalPharmacology69:541-550，及其中的參考文獻(xiàn))。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在以下疾病中血清PONl活性偏低胰島素依賴(lài)型(I型)糖尿病和非胰島素依賴(lài)型(II型)糖尿病、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)(Dantoine等2002,Paraoxonase1activity:anewvascularmarkerofdementia(只于氧石壽酶1活性癡呆的新血管才示記？)AnnNYAcadSci.2002年11月；977:96-101)以及各種心臟病(包括動(dòng)脈粥樣硬化)[Costa等(2005);Mackness等(2004)Theroleofparaoxonase1activityincardiovasculardisease:potentialfortherapeuticintervention(對(duì)氧磷酶1活性在心血管疾病中的作用用于治療性干預(yù)的可能性).AmJCardiovascDrugs.2004;4(4):211-7;Durrington等(2001)Paraoxonaseandatherosclerosis(對(duì)氧磷酶與動(dòng)脈粥樣硬化).ArteriosclerThrombVaseBiol.200121(4):473-80]。在慢性腎衰竭、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或魚(yú)眼病(以嚴(yán)重角膜混濁為特征)患者體內(nèi)還發(fā)現(xiàn)PON活性降低。曱狀腺機(jī)能亢進(jìn)也伴有血清PON活性較低、肝病、阿爾茨海默病和血管性癡呆。在傳染病(例如在急性期反應(yīng)期間)中也觀察到PON活性較低。異常低的PON水平還與暴露在各種外源化合物中有關(guān)，外源化合物例如周?chē)幕瘜W(xué)品(例如鈷、鎘、鎳、鋅、銅、鋇、鑭、汞等金屬；二氯乙酸、四氯化碳)、藥物(例如膽堿能毒蕈堿拮抗劑、普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、醇)。正如所提及的PON水平降低還是各種生理狀況(例如懷孕和年長(zhǎng))的特征，可以是受治療者一般健康狀況的指標(biāo)。例如吸煙者體內(nèi)的血清P0N1活性低，已知體育運(yùn)動(dòng)可恢復(fù)吸煙者體內(nèi)的P0N1水平。因此，本發(fā)明的試劑(例如上述內(nèi)酯酶底物)可包括在診斷試劑盒中，試劑盒另可包括反應(yīng)緩沖液、保存緩沖液和樣品稀釋緩沖液。優(yōu)選試劑盒還包括印刷品，印刷品包括診斷試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。如上所述，測(cè)定生物活性PON水平的能力可有助于測(cè)定個(gè)體的PON狀況。本文所用術(shù)語(yǔ)"PON狀況"是指PON活性(即內(nèi)酯酶活性)和PON基因型。研究PON1多態(tài)性與疾病關(guān)系的大多數(shù)研究?jī)H探討了核苦酸多態(tài)性，對(duì)于核苷酸記載了160種以上的多態(tài)現(xiàn)象，包括基因的編碼區(qū)(例如Q192R、L55M、C-108T)和內(nèi)含子和調(diào)節(jié)區(qū)的多態(tài)性。然而，越來(lái)越清楚的是，即使在對(duì)所有已知P0N1(或其它PON)多態(tài)性進(jìn)行基因分型時(shí)，這種分析都不能提供PON的活性水平，也不能提供多態(tài)性的相位(也就是哪些多態(tài)性位于個(gè)體兩條染色體的哪一條上)。因此功能基因組分析將提供更多的信息途徑。因此，本發(fā)明另一方面提供測(cè)定個(gè)體PON狀況的方法。本發(fā)明的這一方面是通過(guò)測(cè)定受治療者的PON酶內(nèi)酯酶活性水平實(shí)施的，所述內(nèi)酯酶活性是受治療者的生物活性PON的指標(biāo)；對(duì)受治療者的PON酶進(jìn)行基因分型，從而測(cè)定受治療者的PON狀況。對(duì)PON酶進(jìn)行基因分型可以用本領(lǐng)域眾所周知的分子生物學(xué)方法或生物化學(xué)方法，在核酸水平或蛋白質(zhì)水平(如果多態(tài)性影響翻:^,的蛋白質(zhì)的話)上進(jìn)行。多態(tài)性PON可能是單核苷酸多態(tài)性(SNP)、至少一個(gè)核苷酸的微小缺失和/或微小插入、短的缺失和插入、多核苷酸改變、短串聯(lián)重復(fù)(STR)和數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)的結(jié)果。為了獲得多態(tài)性數(shù)據(jù)，對(duì)包含受治療者PON酶的生物樣品[例如血清樣品、尿樣品、滑液樣品、活組織檢查樣品(例如肝活組織檢查樣品)]進(jìn)行DNA多態(tài)性、RNA多態(tài)性、和/或蛋白質(zhì)多態(tài)性的等位基因測(cè)定。下面是本發(fā)明可使用的多態(tài)性(例如SNP)檢測(cè)方法的非限制性一覽c等位基因特異性寡核苷酸(ASO):在本方法中，設(shè)計(jì)等位基因特異性寡核苦酸(ASOM吏其在接近多態(tài)性核苷酸(polymorphicnucleotide)處雜交，使得引物延伸或連接事件可用作匹配或錯(cuò)配的指標(biāo)。還應(yīng)用與放射性標(biāo)記的等位基因特異性寡核苷酸(ASO)雜交來(lái)檢測(cè)特異性SNP(Conner等，Proc.Natl.Acad.Sci.,80:278-282，1983)。該方法以相差單個(gè)核苦酸的短DNA片段解鏈溫度的差異為基礎(chǔ)。嚴(yán)格的雜交和洗滌條件可將突變型和野生型等位基因區(qū)分開(kāi)來(lái)。PyrosequencingTM分析(Pyrosequencing，Inc.Westborough，MA，USA):本項(xiàng)技術(shù)以測(cè)序引物與單鏈雜交、PCR擴(kuò)增、DNA聚合酶存在下的DNA模板、ATP硫酸化酶、螢光素酶和腺苷三磷酸雙磷酸酶和腺苷5'酰硫酸(APS)和螢光素底物為基礎(chǔ)。在第二步中，將4種三磷酸脫氧核苦酸(dNTP)的第一種加到反應(yīng)物中，如果與模板鏈的堿基互補(bǔ)，則DNA聚合酶催化三磷酸脫氧核苷酸摻入DNA鏈中。每次摻入事件都伴有焦磷酸(PPi)的釋放，釋放量與摻入的核苷酸量是等摩爾的。在最后一步，在腺苷5，酰硫酸存在下，ATP硫酸化酶將PPi定量轉(zhuǎn)化成ATP。該ATP驅(qū)動(dòng)螢光素酶介導(dǎo)的螢光素向氧化螢光素轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生可見(jiàn)光，可見(jiàn)光的量與ATP的量成比例。在螢光素酶催化反應(yīng)中產(chǎn)生的光用電荷耦合攝像裝置(CCD)相機(jī)檢測(cè)，在pyrogramTM中觀察到一個(gè)峰。每個(gè)光信號(hào)與所摻入的核苷酸數(shù)目成比例。AcyeloprimeTM分析(PerkinElmer,Boston,Massachusetts,USA):本項(xiàng)技術(shù)以熒光偏振(FP^企測(cè)為基礎(chǔ)。在含有目標(biāo)SNP的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，通過(guò)與蝦堿性磷酸酶(SAP)和外切核酸酶I溫育除去過(guò)量的引物和dNTP。一旦酶#皮熱滅活，則Acycloprime-FP方法便使用耐熱聚合酶，向在緊接SNP位點(diǎn)上游結(jié)束的引物中，加入兩種熒光終止子中的一種。所加入的終止子通過(guò)其增加FP來(lái)鑒定，表示存在于原始DNA樣品中的等位基因。Acycloprime方法采用AcycloPol(一種得自Archeon家族的新的突變型耐熱聚合酶，用R110和TAMRA標(biāo)記的一對(duì)AcycloTerminators),表示目標(biāo)SNP可能的等位基因。AcycloTerminatorTM非核苷酸類(lèi)似物與多種DNA聚合酶一起是有生物活性的。類(lèi)似于2',3'-二脫氧核苷酸-5'-三磷酸，無(wú)環(huán)類(lèi)似物起鏈狀終止子的作用。該類(lèi)似物被DNA聚合酶按堿基特異性的方式摻入DNA鏈的3'末端，因?yàn)闆](méi)有3'-羥基，所以不能在進(jìn)一步鏈延長(zhǎng)中起作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AcycloPol對(duì)于衍生化AcycloTerminators的親和性和特異性比各種Taq突變型對(duì)于衍生化2',3'-二脫氧核苷酸終止子的高。應(yīng)當(dāng)理解的是，SNP檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展提供了額外精確、容易和便宜的大規(guī)模SNP基因分型技術(shù)，例如動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交(DASH，Howell,W.M.等，1999.Dynamicallele-specifichybridization(DASH)(動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)).NatBiotechnol.I7:8孓8)、微量板陣列對(duì)角線凝膠電泳[MADGE,Day,I.N.等，1995.High-throughputgenotypingusinghorizontalpolyacrylamidegelswithwellsarrangedformicroplatearraydiagonalgelelectrophoresis(MADGE)(應(yīng)用7]c平聚丙烯酰胺凝膠與排列用于微量板陣列對(duì)角線凝膠電泳(MADGE)各孔的高通量基因分型).Biotechniques.19:830-5]、TaqMan系統(tǒng)(Holland,P.M.等，1991.Detectionofspecificpolymerasechainreactionproductbyutilizingthe5'~>3'exonucleaseactivityofThermusaquaticusDNApolymerase(利用水生棲熱菌DNA聚合酶的5'~>3'外切核酸酶活性檢測(cè)特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物).ProcNatlAcadSciUSA.88:7276-80)以及各種DNA"芯片"技術(shù)，例如GeneChip微陣列((例如AffymetrixSNP芯片)，參見(jiàn)Lipshutz等(2001),美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第6，300，063號(hào)，該專(zhuān)利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中)、GeneticBit分析(GBAtm)(參見(jiàn)Goelet，P.等(PCT申請(qǐng)?zhí)?2/15712)、肽核酸(PNA,RenB等，2004.NucleicAcidsRes.32:e42)和鎖定核酸(LNA,LatorraD等，2003.Hum.Mutat.22:79-85)探針、分子信標(biāo)(AbravayaK等，2003.ClinChemLabMed.41:468-74)、嵌入染料[Germer，S.和Higuchi，R.Single-tubegenotypingwithoutoligonucleotideprobes(無(wú)寡核香酸4罙4十的單管基因分型).GenomeRes.9:72-78(1999)]、FRET引物(SolinasA等，2001.NucleicAcidsRes.29:E96)、AlphaScreen(BeaudetL等，GenomeRes.2001，11(4):600-8)、SNPstream(BellPA等，2002.Biotechniques.增刊70-2，74，76-7)、多重微測(cè)序(Multiplexminisequencing)(CurcioM等，2002.Electrophoresis.23:1467-72)、SnaPshot(TurnerD等，2002.HumImmunol.63:508-13)、MassEXTEND(CashmanJR等，2001.DrugMetabDispos.29:1629-37)、GOOD測(cè)定法(SauerS和GutIG,2003.RapidCommun.Mass.Spectrom.17:1265-72)、微陣列微測(cè)序(Microarrayminisequencing)(LiljedahlU等,2003.Pharmacogenetics.13:7-17)、陣列引物延伸(arrayedprimerextension,APEX)(TonissonN等，2000.Clin.Chem.Lab.Med.38:165-70)、孩i陣列引物延伸(Microarrayprimerextension)(O'MearaD等,2002.NucleicAcidsRes.30:e75)、Tag陣列(FanJB等，2000.GenomeRes.10:853-60)、模板指導(dǎo)的摻入(TDI)(AkulaN等，2002.Biotechniques.32:1072-8)、熒光偏振(HsuTM等，2001.Biotechniques.31:560，562，564-8)、寡核苷酸連接比色測(cè)定(Colorimetricoligonucleotideligationassay)(OLA，NickersonDA等,1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87:8923-7)、序列編碼的OLA(S叫uence畫(huà)codedOLA)(GaspariniP等，1999.J.Med.Screen.6:67-9)、微陣列連接、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、持鎖探針、滾環(huán)式擴(kuò)增、侵入檢測(cè)法(Invaderassay)(有關(guān)綜述參見(jiàn)ShiMM.2001.Enablinglarge-scalepharmacogeneticstudiesbyhigh-throughputmutationdetectionandgenotypingtechnologies(通過(guò)高通量突變檢測(cè)和基因分型技術(shù)能夠進(jìn)行大規(guī)模藥物遺傳學(xué)研究).ClinChem.47:164-72)、編碼微球(codedmicrosphere)(RaoKV等，2003.NucleicAcidsRes.31:e66)和MassArray(LeushnerJ,ChiuNH,2000.MolDiagn.5:341-80)。如上所述，細(xì)胞的基因序型還可通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析完成?？捎帽绢I(lǐng)域已知方法測(cè)定本發(fā)明細(xì)胞內(nèi)RNA的表達(dá)水平。RT-PCR分析本方法利用相對(duì)稀有的RNA分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先，用反轉(zhuǎn)錄酶(例如MMLV-RT)和引物(例如寡脫氧胸苷、隨機(jī)六聚體或基因特異性引物)，將RNA分子從細(xì)胞中純化出來(lái)并轉(zhuǎn)變成互補(bǔ)DNA(cDNA)。然后用基因特異性引物和TaqDNA聚合酶，在PCR儀器中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇適于檢測(cè)特異性RNA分子的基因特異性引物的長(zhǎng)度和序列以及PCR條件(即退火溫度、循環(huán)次數(shù)等)。應(yīng)當(dāng)理解的是，可以通過(guò)調(diào)整PCR循環(huán)次數(shù)，將擴(kuò)增產(chǎn)物與已知對(duì)照比較，采用半定量RT-PCR反應(yīng)?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知方法測(cè)定在本發(fā)明培養(yǎng)物的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平和/或活性水平。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA):本方法包括將含有蛋白質(zhì)底物的樣品(例如固定細(xì)胞或蛋白質(zhì)性溶液)固定在表面(例如微量滴定板孔壁)上。使用與酶偶聯(lián)的底物特異性抗體，使之與底物結(jié)合。然后檢測(cè)抗體的存在，用與抗體偶聯(lián)的酶，通過(guò)顯色反應(yīng)進(jìn)行定量分析。一般用于本方法的酶包括辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶。如果用標(biāo)準(zhǔn)曲線適當(dāng)校正，而且在反應(yīng)的線性范圍內(nèi)，樣品中存在的底物含量與所形成的顏色深淺成比例。底物標(biāo)準(zhǔn)一般用以改進(jìn)定量的精確性。蛋白質(zhì)印跡法本方法包括通過(guò)丙烯酰胺凝膠將底物與其它蛋白質(zhì)分離后，將底物轉(zhuǎn)印至膜(例如尼龍或PVDF)上。通過(guò)抗體對(duì)底物的特異性，檢測(cè)底物的存在，抗體對(duì)底物的特異性本身又是通過(guò)抗體結(jié)合試劑進(jìn)行檢測(cè)的。抗體結(jié)合試劑可以是例如A蛋白或其它抗體。抗體結(jié)合試劑可是以如上所述經(jīng)放射性標(biāo)記的或與酶連接的。可以通過(guò)放射自顯影、顯色反應(yīng)或化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。本方法既允許定量測(cè)定底物含量，又允許通過(guò)在膜上的相對(duì)位置測(cè)定其結(jié)構(gòu)特征，相對(duì)位置是電泳時(shí)在丙烯酰胺凝膠中移動(dòng)距離的指標(biāo)。放射免疫測(cè)定法(RIA):在一個(gè)方案中，本方法包括將所需蛋白質(zhì)(即底物)與特異性抗體和放射性標(biāo)記抗體結(jié)合蛋白(例如用I125標(biāo)記的A蛋白)的沉淀固定在可沉淀載體(例如瓊脂糖微珠)上。在沉淀物中的計(jì)數(shù)次數(shù)與底物含量成比例。在另一個(gè)RIA方案中，使用標(biāo)記的底物和未標(biāo)記的抗體結(jié)合蛋白。按不同的量加入含有未知含量底物的樣品。標(biāo)記底物沉淀計(jì)數(shù)的減少與所加入樣品的底物含量成比例。焚光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS):本方法包括通過(guò)底物特異性抗體在細(xì)胞原位檢測(cè)底物。底物特異性抗體與熒光團(tuán)連接。通過(guò)細(xì)胞分選儀進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞分選儀在當(dāng)細(xì)胞通過(guò)光束時(shí)，讀取每個(gè)細(xì)胞發(fā)射出的光波長(zhǎng)。本方法可以同時(shí)卩吏用兩種以上抗體。免疫組織化學(xué)分析本方法包括通過(guò)底物特異性抗體在固定細(xì)胞中原位;險(xiǎn)測(cè)底物。底物特異性抗體可與酶連接或者與熒光團(tuán)連接。通過(guò)顯微鏡術(shù)及主觀評(píng)價(jià)或自動(dòng)評(píng)價(jià)進(jìn)行檢測(cè)。如果使用酶聯(lián)抗體，則可能需要顯色反應(yīng)。應(yīng)當(dāng)理解的是，免疫組織化學(xué)法后常常用例如蘇木精或吉姆薩染液進(jìn)行細(xì)胞核的對(duì)比染色。在檢查下面并非限制性的實(shí)施例時(shí)，本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢(shì)和新的特征對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。另外，本文上述的本發(fā)明各個(gè)不同的實(shí)施方案和方面，以及所附權(quán)利要求書(shū)部分所要求保護(hù)的范圍都可以在下述實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)施例下面參考以下實(shí)施例并結(jié)合上述說(shuō)明書(shū)，以非限制性方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。一般而言，本文所用術(shù)語(yǔ)和本發(fā)明所使用的實(shí)驗(yàn)室方法包括分子技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)和重組DNA技術(shù)。文獻(xiàn)中對(duì)這些技術(shù)進(jìn)行了充分地說(shuō)明。參見(jiàn)例如"MolecularCloning:AlaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南)"Sambrook等(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))"，第I-III巻，Ausubel，R.M.主編(1994);Ausubel等，"CurrentProtocolsinMolecularBiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))"，JohnWiley&Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning(分子克隆實(shí)用指南)"，JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson等，"RecombinantDNA(重組DNA)，，，ScientificAmericanBooks,NewYork;Birren等(主編)，"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries(基因組分沖斤實(shí)-瞼室系列手冊(cè))"，第1-4巻，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,666,828、4,683,202、4,801,531、5，192，659和5,272，057中所述方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook(細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))"，第I-III巻，Cellis，J.E.主編(1994);"CurrentProtocolsinImmunology(現(xiàn)代免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù))"第I-III巻，Coligan,J.E.主編(1994);Stites等(主編)，"BasicandClinicalImmunology(基礎(chǔ)免疫學(xué)與臨床免疫學(xué))"(第8版)，Appleton和Lange，Norwalk,CT(1994);Mishell和Shiigi(主編)，"SelectedMethodsinCellularImmunology(纟田胞免疫學(xué)精選方法)，，，W.H.Freeman及同事，NewYork(1980);專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)中大量記載了可利用的免疫測(cè)定法，參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3，853，987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3，984，533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521;"OligonucleotideSynthesis(寡核苦酸合成)"Gait，M.J.主編(1984);"NucleicAcidHybridization(核酸雜交)"Hames，B.D.和HigginsS.J.主編(1985);"TranscriptionandTranslation(轉(zhuǎn)錄與翻譯)"Hames,B.D.和HigginsS.J.主編(1984);"AnimalCellCulture(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng))"Freshney,R.L主編(1986);"ImmobilizedCellsandEnzymes(固定化細(xì)胞與酶)"IRLPress,(1986);"APracticalGuidetoMolecularCloning(分子克隆實(shí)用指南)"，Perbal，B.,(1984)和"MethodsinEnzymology(酶學(xué)方法)"第1-317巻，AcademicPress;"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications(PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法與應(yīng)用指南)"，AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Marshak等,"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual(蛋白質(zhì)純4b與表征^支術(shù)-實(shí)驗(yàn)室操作指南)"CSHLPress(1996);所有文獻(xiàn)都通過(guò)引用如同全部公開(kāi)于此。本申請(qǐng)全文還提供其它常用參考文獻(xiàn)。我們相信其中的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，是為了方便讀者而提供的。其中所包含的所有信息都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。實(shí)施例15-烷硫基取代的丁內(nèi)酯(txbl)的合成使用4-苯硫基-4-丁內(nèi)酯的合成方法[12]來(lái)合成5-乙硫基丁內(nèi)酯、丁硫基丁內(nèi)酯和己硫基丁內(nèi)酯(流程2)。首先，用相應(yīng)的硫醇打開(kāi)Y-丁內(nèi)酯環(huán)[13]。然后所得4-(烷硫基)-丁酸用高碘酸鈉氧化，得到4-(烷基亞磺?；?-丁酸[14]，通過(guò)普梅雷爾重排(Pummererrearrangement)"23閉合成相應(yīng)的內(nèi)酯。該路線一般用來(lái)使可變長(zhǎng)度的側(cè)鏈(由以下流程3中的R表示)與5-硫-丁內(nèi)酯連接。流程3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>材料與實(shí)驗(yàn)方法材料-化學(xué)試劑購(gòu)自AldrichChemicals公司、Fluka公司和AcrosChemicals公司。5-烷硫基取代丁內(nèi)酯的一般合成法，得到5-丁硫基丁內(nèi)酯(tbbl):4曙(丁硫基)-丁酸將y-丁內(nèi)酯(12.9mmo1，1.11克)滴力口到Affir3(2.2當(dāng)量，28.38mmo1,7.56克)和丁硫醇(約20ml)的混合物中。將所得混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，然后慢慢倒入水(約50ml)中。含水混合物用CH2Cl2(2x50ml)萃取，有機(jī)相用NaCl鹽水洗滌，經(jīng)Na2S04干燥。蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)物經(jīng)真空干燥。產(chǎn)量1.84克，80.9%。NMR(250MHz,CDC13):5(ppm)=0.89-0.94(t，3H)，1.36-1.50(m,2H)，1.53-1.62(m,2H),1.86-1.97(m,2H),2.46-2.60(m，6H)。4-(丁基亞磺?；?-丁酸在(TC下，向21ml(10.5mmol)的0.5M高石典酸鈉溶液中加入4-(丁硫基)-丁酸(1.84克，10.4mmo1)，將反應(yīng)物在0。C下攪拌過(guò)夜。經(jīng)過(guò)濾除去沉淀的高石典酸鈉，使濾液蒸發(fā)。所得固體用CH2Cl2(3x50ml，15分鐘萃取)萃取，通過(guò)蒸發(fā)除去溶劑，得到4-(丁基亞磺?；?-丁酸(1.88克，94%)。顧R(250MHz,CDC13):5(ppm)=0.92-0.98(t，3H)，1.42-1.53(m，2H),1.68-1,80(m，2H)，2.07-2.16(m,2H),2.49-2.64(t，2H),2.69-2.94(m,4H)。5-(丁硫基)丁內(nèi)酯向4-(丁基亞磺?；?-丁酸(630mg，3.2mmo1)的曱苯溶液中加入乙酸酐(3當(dāng)量，lOmmol，1克)和催化量的對(duì)曱苯磺酸。使所得溶液回流數(shù)小時(shí)，使溶劑蒸發(fā)至干。將殘余物溶于乙酸乙酯:己烷(1:3)，用快速色譜法純化(硅膠，乙酸乙酯:己烷(1:3))，得到5-(丁硫基)丁內(nèi)酯(130mg，23.3%)。&畫(huà)R(400MHz，CDC13):S(ppm)=0.86-0.92(t,3H)，1.40-1.48(m,2H),1.62-1.71(m，2H)，2.06-2.18(m，2H),2.49-2.80(m,4H),5.64-5.72(t,IH)。13C麗R(400MHz，CDC13)S(ppm):15.0，23.3,29.4，30.0,32.8，33.0，78.1-79.6。ESI-MS:m/z:174間-。實(shí)施例2TXBL的酶水解動(dòng)力學(xué)分析用DTNB檢測(cè)釋放的有硫醇部分，測(cè)定通過(guò)PON1酶促水解3種TXBL的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。材料與實(shí)驗(yàn)方法材料-CPM染料(7-二乙氨基-3-(4'-馬來(lái)酰亞胺基-苯基)-4-曱基香豆素)購(gòu)自MolecularProbes公司。用與硫氧還蛋白和6xHistag融合表達(dá)的重組PON1變異體rePONl-G2E6進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，按文獻(xiàn)方法純化[19]。用DTNB的動(dòng)力學(xué)測(cè)定_用含有ImMCaCh和50mMNaCl的50mMTris(pH8.0)(活性緩沖液)測(cè)定硫代烷基取代內(nèi)酯的酶水解速率。將酶母液保存在含有0.P/。tergitol的活性緩沖液中，所用的酶濃度為8.375xl(T9M。用乙腈制備100-400mM的底物母液，在臨反應(yīng)前用反應(yīng)緩沖液稀釋。將5-(己硫基)-丁內(nèi)酯(THBL)溶于含有TritonX-100洗滌劑的緩沖液(終濃度為0.03-0.24%)。底物濃度變化的范圍為0.3xKM~(2-3)xKM。在所有反應(yīng)中都將助溶劑百分比保持在1%。使用得自lOOmM溶于DMSO的母液的DTNB染料(Ellman試劑，5'，5-二硫雙(2-硝基苯曱酸)，終濃度為0.5mM。用S4^m-7,000OD/M計(jì)算活性。在微量滴定板讀板儀上(PowerWaveHTTM微量板掃描分光光度計(jì)(MicroplateScanningSpectrophotometer);光學(xué)長(zhǎng)度0.5cm)，用96孔板，反應(yīng)體積為200^1，用分光光度法在412nm下監(jiān)測(cè)產(chǎn)物的形成。每種底物以8個(gè)不同的濃度測(cè)定初速度(vo)。v"直用在酶不存在時(shí)自發(fā)水解的本底速率校正。將數(shù)據(jù)代入Michaelis-Menten公式[v0=keat[E]o[S]。/([S]。+KM)]，運(yùn)用程序Kaleidagraph5.0，獲得動(dòng)力學(xué)參數(shù)(kcat、KM、kcat/KM)。用CPM的動(dòng)力學(xué)測(cè)定-在含有8.375x10-9M酶的活性緩沖液中，測(cè)定4-(丁硫基)丁內(nèi)酯(TBBL)的酶水解速率。使用得自400mM溶于乙腈的母液的底物，臨開(kāi)始反應(yīng)前用反應(yīng)緩沖液稀釋?zhuān)cCPM染料(7-二乙氨基-3-(4'-馬來(lái)酰亞胺基-苯基)-4-曱基香豆素)一起溫育3分鐘，以完成CPM與在測(cè)定前^皮水解的底物之間的反應(yīng)。CPM染料得自5mM溶于DMF的母液，終濃度為50(iM，反應(yīng)混合物中含有0.1%triton用于CPM增溶。在微量滴定板讀板儀(激發(fā)-400nm濾光片，發(fā)射-450nm和516nm濾光片，配有時(shí)間分辨焚光的SynergyH丁tm多功能才全測(cè)孩i:量板讀板4義(SynergyHTTMMulti-DetectionMicroplateReaderwithTime-ResolvedFluorescence);光學(xué)長(zhǎng)度0.5cm)中，用96孑L板，按200(il反應(yīng)體積中的CPM熒光，監(jiān)測(cè)產(chǎn)物形成。結(jié)果5-(丁硫基)丁內(nèi)酯(TBBL)水解的典型顯色測(cè)定如圖la所示，動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)下表1。這些新底物的k^和KM值類(lèi)似于用同源的5-烷基取代的丁內(nèi)酯(下表2)所觀察到的數(shù)值。表1-rePONl與5-烷硫基丁內(nèi)酯的動(dòng)力學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表2-rePONl與5-烷基丁內(nèi)酯的動(dòng)力學(xué)參數(shù)|:<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>[a]-5-烷基丁內(nèi)酯的動(dòng)力學(xué)參數(shù)摘自參考文獻(xiàn)[4]。5-烷硫基內(nèi)酯的酶水解速率也可用熒光硫醇檢測(cè)探針CPM叫跟蹤，如圖lb所示。實(shí)施例3Ajk清和活細(xì)胞中PON1活性的測(cè)定上述顯色測(cè)定法和熒光測(cè)定法用于測(cè)定人血清樣品的PON內(nèi)酯酶活性。材料與實(shí)驗(yàn)方法用TBBL和乙酸苯酯的血清活性-在活性緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，所用血清最終按1:400稀釋。TBBL的反應(yīng)混合物中含有得自400mM溶于乙腈的母液的0.5mMTBBL、得自100mM溶于DMSO的母液的0.5mMDTNB。乙酸苯酯的反應(yīng)混合物中含有得自500mM溶于曱醇的母液的lmM乙酸苯酯。所有反應(yīng)混合物中都含有終濃度為1%的DMSO。使用得自500mM溶于DMSO的母液的2-羥基喹啉，使用得自0.5M溶于水的母液的EDTA。將血清與抑制劑溫育5-10分鐘后，開(kāi)始反應(yīng)。用TBBL通過(guò)FACS檢測(cè)PON1活性-大腸桿菌細(xì)胞的乳化及FACS分析按文獻(xiàn)方法進(jìn)行[16]。結(jié)果用新合成的底物(參見(jiàn)實(shí)施例l-2)檢測(cè)人血清的P0N1水平，如圖2a-b所示。為了證實(shí)所測(cè)的內(nèi)酯酶活性是由P0N1而不是血清中存在的其它水解酶介導(dǎo)的，還另將血清與2-羥基喹啉(PONl活性的選擇性竟?fàn)幰种苿4])和EDTA(使鈣螯合，這對(duì)P0N1活性至關(guān)重要)預(yù)溫育。平行地，用乙酸苯酯(通常用作血清PON1水平的探針)測(cè)定PON1活性。用TBBL的活性與用乙酸苯酯的活性相當(dāng)，同樣被抑制(參見(jiàn)下表3)。這清楚表明，新的內(nèi)酯底物可用于評(píng)價(jià)人血清的PON1水平，>90%的內(nèi)酯酶活性和芳基酯酶活性由P0N1產(chǎn)生。EDTA的抑制率較高(〉99%),可能是由對(duì)金屬螯合劑敏感的血清酶而不是PONl所致。表3-用乙酸苯酯和TBBL的血清活性<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>同樣用FACS(熒光激活細(xì)胞分選儀)和使細(xì)胞與酶活性產(chǎn)物一起分隔的乳滴，對(duì)活細(xì)胞的P0N1活性進(jìn)行檢測(cè)[15'16]。首先，將在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)重組P0N1(rePONl)的大腸桿菌細(xì)胞以及GFP(綠色焚光蛋白)用油包水(w/o)乳劑液滴與內(nèi)酯底物(TBBL)和熒光硫醇檢測(cè)染料CPM—起區(qū)室化。使油包水乳劑再乳化，產(chǎn)生具有適于FACS的連續(xù)水相的水包油包水雙乳劑[15]。FACS觸發(fā)閾值設(shè)為GFP的發(fā)射，選擇與單個(gè)大腸桿菌細(xì)胞發(fā)射水平相應(yīng)的合適門(mén)控[16]。如圖3所示，通過(guò)530nm下硫醇檢測(cè)染料的熒光信號(hào)，檢測(cè)區(qū)室化細(xì)胞的PONl內(nèi)酯酶活性。相對(duì)于不含rePONl的細(xì)胞，觀察到明顯差異(平均熒光>20倍)?？傊鲜鼋Y(jié)果證實(shí)，5-烷硫基內(nèi)酯是用于測(cè)定PONl內(nèi)酯酶活性的非常有用和靈敏的探針。P0N1與這些底物的速率類(lèi)似于PON1的良好底物脂肪族5-烷基取代的內(nèi)S旨，并且與其天然底物非常相似[2]。5-烷硫基內(nèi)酯可與復(fù)雜的生物樣品(例如完整細(xì)胞和血清)一起使用，因此，以高通量方式，提供新的生理上關(guān)聯(lián)的人血清PONl水平的測(cè)定方法。這些底物還提供用FACS和雙乳劑篩選內(nèi)酯酶活性的有效方法，使得在幾小時(shí)內(nèi)篩選出用于指導(dǎo)進(jìn)化和功能基因組的>107的酶變異體文庫(kù)[16'17]。最后，新的5-烷硫基內(nèi)酯可與不是PONl的酶，特別是與無(wú)顯色/熒光底物存在的其它PON家族成員一起使用。例如，可在純化的酶樣品和粗制細(xì)胞裂解物中，用TEBL和TBBL測(cè)定PON3的內(nèi)酯酶活性(數(shù)據(jù)未顯示)。還可檢測(cè)其它酶的內(nèi)酯酶活性(例如缺陷假單胞菌CP化^omw7w^m/"wto)磷酸三酯酶)[18]。應(yīng)當(dāng)了解的是，為了清楚起見(jiàn)在不同的實(shí)施方案內(nèi)容中加以描述的本發(fā)明的某些特征，同樣也可合并起來(lái)在一個(gè)實(shí)施方案中提供。相反，為簡(jiǎn)明起見(jiàn)在一個(gè)實(shí)施方案內(nèi)容中加以描述的本發(fā)明的各種特征，同樣也可單獨(dú)或以任何合適的再合并方式予以提供。盡管本發(fā)明結(jié)合其具體的實(shí)施方案加以描述，但是明顯的是許多替換、修改和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，本發(fā)明包括所有落入所附權(quán)利要求書(shū)精神和大范圍中的這些替換、修改和變動(dòng)。本說(shuō)明書(shū)所提及的所有出版物、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和GenBank檢索號(hào)都通過(guò)引用全部結(jié)合到本說(shuō)明書(shū)中，其程度與每個(gè)獨(dú)立出版物、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和GenBank檢索號(hào)具體而單獨(dú)指明通過(guò)引用結(jié)合到本文中一樣。另外，在本申請(qǐng)任何參考文獻(xiàn)的引用或標(biāo)示都不得解釋為承認(rèn)這樣的參考文獻(xiàn)都可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)獲得。通過(guò)數(shù)字標(biāo)注引用的參考文獻(xiàn)(其它參考文獻(xiàn)已在本申請(qǐng)中引用)S.Billecke,D.Draganov,R.Counsell,P.Stetson,C.Watson,C.Hsu，B.N.LaDu,DragM"a6.■D&jms.2000,2S,1335。[2]D.I.Draganov,J.F.Teiber，A.Speelman,Y.Osawa,R.Sunahara,B.N,LaDu,/2005,M,1239。J.F.Teiber,D.I.Draganov,B.N.LaDu，歷oc&饑尸/zawzaco,.2003,66，887。[4]O.Kh固nsky,D.S.Tawfik,腸c/z簡(jiǎn)勿2005,",6371。[5]A.Aharoni,L.Gaidukov,O.Khersonsky,S.McQ.Gould,C.Roodveldt,D.S.Tawfik,A/a/.2005，J7，73。L.Gaidukov,D.S.Tawfik，說(shuō)0c/^w!'W72005,待發(fā)表。[7]L.G.Costa,A.Vitalone,T.B.Cole,C.E.Furlong,歷oc&肌P/zarwaco/2005,眠541。J.P.Goddard,J.L.Reymond,7>￡油5;ofecAno/2004,",363。[9]R.Sicard，L.S.Chen,A.J.Marsaioli,J.L.Reymond,柚.5>威Qzto/.2005,347，1041。G.L.Ellman，Jrc/z.^'oc/ze肌歷o;/i^.1958,7《443。R.P.Haugland,Zfa"必ooA:o/F/wone"〖尸ro6eya"t/i，arc/zJVo血"s(爽光探針與研究產(chǎn)物手冊(cè))，第9版，Mo/ecw/flr尸ro6化2002,第79頁(yè)。[12]M.Watanabe,S.Nakamori,H.Hasegawa，K.Shirai,T.Kumamoto,5w〃CTzew.■Soc.Ja;aw1981,5《817。[13]M.Node,K.Nishide,M.Sai，E.Fujita,r"ra/ze士o"1978，52,5211。[14]N.J.Leonard,C.R.Johnson,■/Og.C7ze機(jī)1961,27,282。[15]K.Bemath,M.T.Hai,E.Mastrobattista,A.D.Griffiths,S.Magdassi,D.S.Tawfik,^wa/少rtca/5z'oc/ze/w'對(duì)72004,325，151。[16]A.Aharoni,G.Amitai，B.Bemath，S.Magdassi,D.S.Tawfik,交付出版2005。[17]A.Aharoni,A.D.Griffiths,D.S.Tawfik,Cwr.Qp/".C/zew.2005,9,210。C.Roodveldt,D.S.Tawfik,^ocAew/Wry2005,待發(fā)表。[19]A.Aharoni,L.Gaidukov,S.Yagur，L.Toker,I.Silman,D.S.Tawfik,iVoc.Mj".爿cac.Sc!'USA2004,JW，482。權(quán)利要求1.一種測(cè)定生物活性PON酶水平的方法，該方法包括測(cè)定PON酶的內(nèi)酯酶活性，所述內(nèi)酯酶活性是生物活性PON酶水平的指標(biāo)。2.—種測(cè)定受治療者的PON狀況的方法，該方法包括(a)測(cè)定受治療者的PON酶的內(nèi)酯酶活性水平，所述內(nèi)酯酶活性是受治療者的生物活性PON水平的指標(biāo)；和(b)對(duì)所述受治療者的PON酶進(jìn)行基因分型，從而測(cè)定受治療者的PON狀況。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述PON酶選自PONl、PON2和PON3。4.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述生物活性PON酶包括脫脂載脂蛋白結(jié)合的PON酶。5.權(quán)利要求1或2的方法，其中測(cè)定PON酶的內(nèi)酯酶活性是通過(guò)以下方法實(shí)施的(i)層析分析法；(ii)pH指示劑測(cè)定法；(iii)分光光度測(cè)定法；(iv)偶^f關(guān)測(cè)定法；(v)電化學(xué)測(cè)定法；和/或(vi)量熱測(cè)定法。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述分光光度測(cè)定法是在包含至少一種內(nèi)酯并且能夠在所述內(nèi)酯水解時(shí)形成至少一種分光光度法可檢測(cè)部分的底物存在下進(jìn)行的。7.權(quán)利要求5的方法，其中所述分光光度測(cè)定法選自磷光測(cè)定法、焚光測(cè)定法、顯色測(cè)定法、發(fā)光測(cè)定法和映光測(cè)定法。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述可檢測(cè)部分與所述內(nèi)酯連接。9.權(quán)利要求6的方法，其中所述可檢測(cè)部分形成所述內(nèi)酯部分。10.權(quán)利要求6的方法，其中所述可檢測(cè)部分包含至少一種石克醇。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述底物包含與所述內(nèi)酯連接的硫代烷氧基。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述硫代烷氧基含有2-12個(gè)碳原子。13.權(quán)利要求10的方法，其中所述檢測(cè)是通過(guò)顯色測(cè)定法或熒光測(cè)定法實(shí)施的。14.權(quán)利要求6的方法，其中所述底物包括5、6或7元內(nèi)酯，具有與所述內(nèi)酯雜原子相鄰的碳連接的硫代烷氧基。15.—種測(cè)定樣品中內(nèi)酯酶活性的方法，該方法包括(a)使樣品與含有至少一種內(nèi)酯并且能夠在所述內(nèi)酯水解時(shí)形成至少一種分光光度法可^r測(cè)部分的化合物接觸，其中對(duì)所述可檢測(cè)部分進(jìn)行選擇，使所述化合物具有與所述內(nèi)酯酶底物基本相同的結(jié)構(gòu)；和(b)用分光光度法測(cè)定所述部分的水平，從而測(cè)定樣品中內(nèi)酯酶的活性。16.權(quán)利要求15的方法，其中測(cè)定所述部分的水平是通過(guò)以下方法實(shí)施的磷光測(cè)定法、焚光測(cè)定法、顯色測(cè)定法、發(fā)光測(cè)定法和映光測(cè)定法。17.權(quán)利要求15的方法，其中所述可檢測(cè)部分與所述內(nèi)酯連接。18.權(quán)利要求15的方法，其中所述可檢測(cè)部分形成所述內(nèi)酯部分。19.權(quán)利要求15的方法，其中所述可檢測(cè)部分包含至少一種硫醇。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述底物包含與所述內(nèi)酯連接的硫代烷氧基。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述硫代烷氧基含有2-12個(gè)碳原子。22.權(quán)利要求19的方法，其中所述檢測(cè)是通過(guò)顯色測(cè)定法實(shí)施的。23.—種試劑盒，所述試劑盒用于測(cè)定受治療者的體質(zhì)或者診斷與受治療者的PON酶水平或活性異常相關(guān)的疾病，所述試劑盒包括至少一種能夠測(cè)定PON酶的內(nèi)酯酶活性的試劑。24.權(quán)利要求23的試劑盒，其中所述至少一種試劑是包含至少一種內(nèi)酯并且能夠在所述內(nèi)酯水解時(shí)形成至少一種分光光度法可檢測(cè)部分的化合物。25.—種化合物，所述化合物包含至少一種內(nèi)酯并且能夠在所述內(nèi)酯分解時(shí)形成至少一種分光光度法可檢測(cè)的含^L醇部分。26.權(quán)利要求25的化合物，其中所述含^L醇部分是能通過(guò)選自以下的分光光度測(cè)定法檢測(cè)的磷光測(cè)定法、熒光測(cè)定法、顯色測(cè)定法、發(fā)光測(cè)定法和映光測(cè)定法。27.權(quán)利要求25的化合物，其中所述可檢測(cè)部分與所述內(nèi)酯連接。28.權(quán)利要求25的化合物，其中所述可檢測(cè)部分形成所述內(nèi)酯部分。29.權(quán)利要求26的化合物，其中所述可檢測(cè)部分包含硫代烷氧基。30.權(quán)利要求29的化合物，其中所述硫代烷氧基含有2-12個(gè)碳原子。31.權(quán)利要求27的化合物，其中所述內(nèi)酯是5、6或7元內(nèi)酯。32.權(quán)利要求27的化合物，其中所述內(nèi)酯是5元內(nèi)酯。全文摘要本發(fā)明提供測(cè)定生物活性PON酶水平的方法。該方法包括測(cè)定PON酶的內(nèi)酯酶活性，內(nèi)酯酶活性是生物活性PON酶水平的指標(biāo)。本發(fā)明還提供新的化合物，可用于測(cè)定酶的內(nèi)酯酶活性。文檔編號(hào)G01N33/53GK101287842SQ200680038325公開(kāi)日2008年10月15日申請(qǐng)日期2006年8月14日優(yōu)先權(quán)日2005年8月17日發(fā)明者D·S·托菲克,O·赫桑斯基申請(qǐng)人:耶達(dá)研究及發(fā)展有限公司