專(zhuān)利名稱(chēng)：：健康狀態(tài)的測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明通常涉及檢測(cè)樣品中病毒存在的以及檢測(cè)基因組標(biāo)記，作為用于確定受試者健康狀況的一種測(cè)定法。本發(fā)明適合作為具有預(yù)后意義的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)
背景技術(shù)：
：目前多種方法可以用于檢測(cè)特異核酸分子。這些方法通常都依賴(lài)于靶核酸和核酸探針之間的序列依賴(lài)性雜交，其中核酸探針的長(zhǎng)度范圍可以是從短寡核苷酸(20個(gè)堿基或更短)至許多千堿基(kb)的序列。從總的核酸序列中擴(kuò)增特異序列，最廣泛采用的方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(Dieffenbach，CandDveksler，G.eds.PCRPrimer:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborPress,PlainviewNY)。在該擴(kuò)增方法中，在互補(bǔ)DNA鏈上且在待擴(kuò)增區(qū)域的任一端處的長(zhǎng)度通常為20-30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，用于在變性的單鏈DNA上引導(dǎo)DNA合成。變性、引物雜交以及使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的DNA鏈合成的連續(xù)循環(huán)使引物之間的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。通過(guò)首先復(fù)制，可擴(kuò)增RNA序列，該首先復(fù)制使用反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生互補(bǔ)DNA(cDNA)拷貝。擴(kuò)增的DNA片段可通過(guò)多種手段進(jìn)行檢測(cè)，包括凝膠電泳、與標(biāo)記的探針雜交，采用允許后續(xù)鑒定(例如通過(guò)酶聯(lián)反應(yīng))的標(biāo)記引物，以及采用一旦與靶標(biāo)DNA雜交即產(chǎn)生信號(hào)的熒光標(biāo)記引物(例如Beacon和TaqMan體系)。同PCR—樣，多種用于檢測(cè)和擴(kuò)增特異的核苷酸序列的其它技術(shù)己得以發(fā)展。一個(gè)實(shí)例就是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany，F(xiàn).etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88,189-193,1991)。另一個(gè)實(shí)例是1992年首次描述并命名為鏈置換擴(kuò)增(StrandDisplacementAmplification,SDA)的等溫?cái)U(kuò)增(WalkerGT，LittleMC，NadeauJGandShankD.IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem.PNAS89:392-396(1992))。從那時(shí)起，己經(jīng)描述了大量其它等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，包括轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TranscriptionMediatedAmplification,TMA)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NucleicAcidSequenceBasedAmplification,NASBA)，其利用RNA聚合酶來(lái)復(fù)制RNA序列而不是相應(yīng)的基因組DNA。(GuatelliJC，WhitfieldKM,KwohDY,BarringerKJ,RichmannDDandGingerasTR.Isothermal,invitroamplificationofnucleicacidsbyamultienzymereactionmodeledafterretroviralreplication.PNAS87:1874-1878(1990):KievitsT,vanGemenB,vanStrijpD，SchukkinkR,DircksM，AdriaanseH,MalekL,SooknananR,LensP.NASBAisothermalenzymaticinvitronucleicacidamplificationoptimizedforthediagnosisofHIV-1infection.JVirolMethods.1991Dec;35(3):273隱86)其它基于DNA的等溫技術(shù)包括滾環(huán)擴(kuò)增(RollingCircleAmplification,RCA)，其中DNA聚合酶延伸針對(duì)環(huán)狀模板的引物(FireAandXuSQ.Rollingreplicationofshortcircles.PNAS92:4641-4645(1995);利用環(huán)狀探針檢測(cè)靶標(biāo)的分支擴(kuò)增(Ramification,Amplificaiton，RAM)(ZhangW,CohenfordM，LentrichiaB,IsenbergHD,SimsonE,LiH,YiJ,ZhangDY.DetectionofChlamydiatrachomatisbyisothermalramificationamplificationmethod:afeasibilitystudy.JClinMicrobiol.2002Jan;40(l):128-32.);以及最近的解旋酶依賴(lài)的等溫DNA擴(kuò)增(Helicase-DependentisothermalDNAamplification,HDA)，其禾U用解旋酶代替加熱來(lái)使DNA鏈解開(kāi)(VincentM，XuY,KongH.Helicase」dependentisothermalDNAamplification.EMBORep.2004Aug;5(8):795-800.)o最近，已經(jīng)描述了DNA的等溫?cái)U(kuò)增法(WalkerGT，LittleMC,NadeauJGandShankD.IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem.PNAS89:392-396(1992))。傳統(tǒng)的擴(kuò)增技術(shù)依賴(lài)于在擴(kuò)增反應(yīng)每一個(gè)循環(huán)中的耙標(biāo)分子變性和退火的連續(xù)循環(huán)。DNA的熱處理導(dǎo)致DNA分子一定程度的剪切，因此當(dāng)DNA有限，例如從來(lái)自發(fā)育中的胚泡的少量細(xì)胞中分離DNA時(shí)，或者特別是在DNA已經(jīng)是片段的形式如在組織切片、石蠟塊和古代DNA樣品中的的情況下，這種加熱-冷卻循環(huán)可能進(jìn)一步破壞DNA并導(dǎo)致擴(kuò)增信號(hào)的丟失。等溫法不依賴(lài)于模板DNA的連續(xù)變性來(lái)產(chǎn)生單鏈分子作為進(jìn)一步擴(kuò)增的模板，而是通過(guò)特異的限制性?xún)?nèi)切酶在恒溫下酶切DNA分子，或者通過(guò)利用解旋酶解開(kāi)DNA雙鏈體。術(shù)語(yǔ)稱(chēng)為鏈置換擴(kuò)增的技術(shù)依賴(lài)于某些限制性?xún)?nèi)切酶切割半修飾DNA的未修飾鏈的能力以及缺少5'-3'核酸外切酶的DNA聚合酶延伸和置換下游鏈的能力。然后通過(guò)偶聯(lián)有義和反義反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增，其中來(lái)自有義反應(yīng)的鏈置換充當(dāng)反義反應(yīng)的模板(WalkerGT,LittleMC，NadeauJGandShankD.IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem.PNAS89:392-396(1992)。此類(lèi)技術(shù)已經(jīng)成功地用于以下擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌(iV^"6"dm'"m勵(lì)ercw/簡(jiǎn)'"(WalkerGT，LittleMC，NadeauJGandShankD.IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem.PNAS89:392-396(1992));HIV-1、丙型肝炎禾口HPV-16(N雨oG.J"2000)，以及沙目艮衣原體(CM—/a加c/o應(yīng)";y)(SpearsPA,LinnP,WoodardDLandWalkerGT.SimultaneousStrandDisplacementAmplificationandFluorescencePolarizationDetectionofChlamydiatrachomatis.Anal.Biochem.247:130-137(1997))。至今，SDA的應(yīng)用依賴(lài)于修飾的磷硫酰核苷酸，用以產(chǎn)生半磷硫酰DNA雙鏈體，其在修飾的鏈上對(duì)酶切具有抗性，導(dǎo)致酶切代替消化作用來(lái)推動(dòng)置換反應(yīng)。然而，最近己經(jīng)設(shè)計(jì)改造了多種"切口酶"，這些酶不以傳統(tǒng)的方式切割DNA，而是在其中一條DNA鏈上形成一個(gè)切口。"切口酶"包括N.Alwl(XuY，LunnenKDandKongH.EngineeringanickingendonucleaseN.Alwlbydomainswapping.PNAS98:12990-12995(2001)、N.BstNBl(MorganRD，CalvetC，DemeterM，AgraR,KongH.CharacterizationofthespecificDNAnickingactivityofrestrictionendonucleaseN.BstNBl.BiolChem.2000Nov;381(1l):l123-5.)以及Mlyl(BesnierCE，KongH.ConvertingMlylendonucleaseintoanickingenzymebychangingitsoligomerizationstate.EMBORep.2001Sep;2(9):782-6.Epub2001Aug23)。因此，這些酶的應(yīng)用將簡(jiǎn)化SDA步驟。另外，SDA技術(shù)己經(jīng)通過(guò)熱穩(wěn)定的限制性?xún)?nèi)切酶(Aval)和熱穩(wěn)定的外切聚合酶(Bst聚合酶)的組合使用而得到改善。已表明這種組合可以將反應(yīng)的擴(kuò)增效率從108倍擴(kuò)增提高到10"倍擴(kuò)增，因此應(yīng)用該技術(shù)來(lái)擴(kuò)增獨(dú)特的單拷貝分子是可能的。利用熱穩(wěn)定聚合酶/酶組合得到的總擴(kuò)增因子為109的數(shù)量級(jí)(MillaM.A.,SpearsP.A.,PearsonR.E.andWalkerG.T.UseoftheRestrictionEnzymeAvalandExo-BstPolymeraseinStrandDisplacementAmplificationBiotechniques199724:392-396)。目前，所有的等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)都要求起始的雙鏈模板DNA分子在擴(kuò)增開(kāi)始之前變性。另外，每次引發(fā)只啟動(dòng)一次擴(kuò)增。對(duì)于直接檢測(cè)，靶標(biāo)核酸最通常是根據(jù)大小通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分離，并在與耙序列互補(bǔ)的探針雜交(DNA印跡和RNA印跡)前，轉(zhuǎn)移至固相支持體上。該探針可以是天然核酸或類(lèi)似物，例如肽核酸(Peptidenucleicacid，PNA)或鎖核酸(lockednucleicacid,LNA)或嵌入核酸(intercalatingnucleicacid,INA)。該探針可直接標(biāo)記(例如，用32P)，或者可以采用間接檢測(cè)方法，間接方法通常依賴(lài)將"標(biāo)簽"例如生物素或者地高辛結(jié)合至該探針中，然后通過(guò)例如酶聯(lián)底物轉(zhuǎn)化或者化學(xué)發(fā)光的方法來(lái)檢測(cè)該探針。另一種廣泛應(yīng)用的直接檢測(cè)核酸的方法是"夾心"雜交(Sandiwichhybridisation)。在該方法中，將捕獲探針偶聯(lián)到固相載體上，并且溶液中的靶標(biāo)核酸與結(jié)合的探針進(jìn)行雜交，將未結(jié)合的靶核酸洗去，并利用與靶標(biāo)序列雜交的第二探針來(lái)檢測(cè)結(jié)合的核酸。檢測(cè)可以利用上述列出的直接或者間接的方法。這些方法的實(shí)例包括"分支DNA"信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)，其是利用夾心雜交原理的實(shí)例(1991，Urdea，M.S.,etal.,NucleicAcidsSymp.Ser.24,197-200)。利用核酸雜交直接檢測(cè)核酸序列的迅速發(fā)展的領(lǐng)域是DNA微陣列(2002，NatureGenetics,32，[Supplement];2004，Cope,LM.，etal.，Bioinfo畫(huà)tics，20,323-331;2004，Kendall,S丄.，etal"TrendsinMicrobiology,12,537-544)。在該過(guò)程方法中，將單核酸物種類(lèi)別(species)以網(wǎng)格模式固定于固相載體支持體上，或者在固相支持體載體上光刻地合成，其中單核酸類(lèi)別范圍可以從短寡核苷酸(在Affymetrixsystem體系中通常為25-mers)至較長(zhǎng)的寡核苷酸(在AppliedBiosystemsandAgilentplatforms平臺(tái)中通常為60-mers)至更長(zhǎng)的序列例如cDNA克隆。將加標(biāo)簽的或標(biāo)記的核酸群(nucleicacidpopulation)與該陣列進(jìn)行雜交，并將陣列中每個(gè)點(diǎn)的雜交水平加以定量。盡管也可以采用其它檢測(cè)系統(tǒng)，例如化學(xué)發(fā)光，但最常見(jiàn)的是將放射性標(biāo)記的或者熒光標(biāo)記的核酸(例如cRNAs或者cDNAs)用于雜交。最近，人們對(duì)采用分子學(xué)方法診斷感染性疾病很感興趣，因?yàn)檫@些新興的方法提供靈敏而特異的病原微生物檢測(cè)。在此背景下，本發(fā)明涉及人乳頭瘤病毒(HPV)，其DNA基因組以群體水平存在，作為具有單個(gè)HPV類(lèi)型的可變基因庫(kù)(pool)，該HPV類(lèi)型在群體水平水平以及在它們的基因組大小上不同。各種分子實(shí)驗(yàn)的局限性限制了利用分子實(shí)驗(yàn)對(duì)各種臨床樣品中不同HPV型的檢測(cè)和精確鑒別。此外，大量"基因型"、"變體"、"亞型"和"型"存在于定義HPV的傘狀分組(umbrellagrouping)中。例如，目前存在超過(guò)100種公認(rèn)的HPV類(lèi)型，其中一些與人類(lèi)疾病密切相關(guān)。所謂的高度和中度風(fēng)險(xiǎn)型與發(fā)展成癌癥有關(guān)，經(jīng)由最精確的可用的分子方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)是臨床急需優(yōu)先考慮的事情。主要問(wèn)題是單獨(dú)HPV的檢測(cè)未必是發(fā)展成癌癥的優(yōu)良指標(biāo)。盡管宮頸上皮內(nèi)瘤(CervicalIntraepithelialNeoplasia,CIN)能夠發(fā)展為浸潤(rùn)型，但是許多病變退化或者持續(xù)，而沒(méi)有發(fā)展成癌。兩年內(nèi)70%的婦女將清除HPV感染(1998,JournalofPediatrics,132,277-284;Moscicki,A.B.,etal.)。然而，CIN的發(fā)現(xiàn)及其發(fā)展非常易變，以致還沒(méi)有得以治療，其可恢復(fù)常態(tài)或?qū)е峦耆桶?fullblowncarcinoma)。約三分之一至一半的CINI和CINII病例自發(fā)恢復(fù)(19卯，AustralianandNewZealandJournalofObstetricsandGynaecology,30,1-23.，Channen,Wetal.)，,人CINI發(fā)展至UCINII需要10年左右時(shí)間，但是一些女性可能會(huì)是20年或者更長(zhǎng)時(shí)間(2000,CancerResearch,60,6027-6032.，Ylitalo，Eetal.)。細(xì)胞、組織或器官的病毒感染可能會(huì)改變這些實(shí)體的基因組甲基化標(biāo)記，如在Epstein-Barr病毒的情況下，并且其與胃癌相關(guān)(2002,AmericanJ.Pathology,160,787-794,Kang，G.H.,etal)。因?yàn)榧谆蛉ゼ谆窃谠S多細(xì)胞分裂(cdldivisions)中獲得的穩(wěn)定的變化，在某些情況下，如生物體世代通常穩(wěn)定的甲基化譜(methylome)的改變可能是癌前或癌狀態(tài)的先兆。在單個(gè)驗(yàn)定中，實(shí)現(xiàn)識(shí)別所有不同HPV類(lèi)型的可靠穩(wěn)定的基于DNA的檢測(cè)系統(tǒng)是具有挑戰(zhàn)性的，不僅是因?yàn)椴煌琀PV基因組型之間存在交叉雜交問(wèn)題，而且構(gòu)成HPV型的準(zhǔn)確分類(lèi)依賴(lài)于具有顯著的生物信息學(xué)局限性的基因組序列的相似性。因此，當(dāng)將新的HPV型定義為與以前的HPV型小于90%的序列相似性時(shí)，更精細(xì)的分類(lèi)學(xué)細(xì)分(subdivision)成為更有待解決的問(wèn)題。因此，當(dāng)DNA序列同源性相對(duì)于以前的亞型在90-98%范圍內(nèi)時(shí)，被定義為新的HPV"亞型"。當(dāng)序列同源性為以前的變體的98-100%之間時(shí)，被定義為新的"變體"(1993,VanRast,M.A"etal.,PapillomavirusRep,4,61-65;1998,Southern,S.A.andHerrington,C.S.Sex.Transm.Inf.74,101-109)。上述范圍可以進(jìn)一步擴(kuò)大到基于比較單個(gè)分離病毒顆粒的單基因組來(lái)測(cè)量突變。這種情況下，"基因型"可以是任何完全測(cè)序的HPV基因組，其與任何其它完全測(cè)序的HPV基因組最少有一個(gè)堿基的差別，其包括在確定位點(diǎn)的單個(gè)堿基可以G、A、T或C四種狀態(tài)中的一種而存在的所有情況，以及通過(guò)缺失、添加、擴(kuò)增或轉(zhuǎn)座到另一位點(diǎn)來(lái)改變既定位點(diǎn)的堿基的情況。由于上述原因，相對(duì)于HPV16基因組，進(jìn)行了本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)申請(qǐng)中所用的生物信息學(xué)的比較(利用HPV16基因組1至7卯4位作為標(biāo)準(zhǔn)比較物，并利用先前技術(shù)BLAST法(1996，Morgenstern,B.，etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93，12098-12103)。在本文中用作參考目的的標(biāo)準(zhǔn)HPV"型"是乳頭瘤病毒科的HPV16,其是7904個(gè)堿基對(duì)的乳頭瘤病毒(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBIlocusNC一001526;versionNC一001526.1;GI:9627100;references,Medline,91162763and85246220;PubMed1848319and29卯099)。疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中現(xiàn)有的HPV檢測(cè)系統(tǒng)所面臨的困難主要有三方面，第一是技術(shù)系統(tǒng)本身的局限性。第二是對(duì)患病細(xì)胞群的病理學(xué)解釋的局限性。第三是在評(píng)估不同人類(lèi)群體疾病進(jìn)程的臨床水平上的局限性，該群體在遺傳背景和起作用的輔助因素上傾向于有差別。某些HPV型與宮頸癌有關(guān)，而且導(dǎo)致陰道癌、外陰癌、陰莖癌和肛門(mén)癌更不明確的部分。環(huán)狀組織為宮頸變性帶，其是對(duì)HPV致癌力具高度易感性的區(qū)域，通常利用肉眼或顯微鏡可見(jiàn)的標(biāo)準(zhǔn)通，經(jīng)由組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)方法，對(duì)其從完整的細(xì)胞常態(tài)到侵襲性癌的狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。如果有助于確定細(xì)胞群從正常到異常組織所經(jīng)過(guò)的分子軌道,那么對(duì)病毒誘導(dǎo)的異常在病毒水平以及以及有障礙的人類(lèi)細(xì)胞水平上進(jìn)行早期檢測(cè)將有巨大的臨床意義。然而，盡管巴氏涂片己經(jīng)使用了半個(gè)世紀(jì)，異常宮頸的細(xì)胞學(xué)診斷和常態(tài)之間的固相早期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估目前仍然有問(wèn)題。主要問(wèn)題是圍繞定義"初期癌'例如不同等級(jí)的宮頸上皮內(nèi)瘤(CIN1，CIN2和CIN3)的難易理解的標(biāo)準(zhǔn)以及因此涉及治療方案的臨床決策的難易理解的標(biāo)準(zhǔn)。許多臨床醫(yī)生認(rèn)為初期癌的定義是偽精確方式，其是為了避免使用CIN2、CIN3和原位癌。顯微鏡診斷甚至是CIN2的臨床意義上都存在很大的異質(zhì)性(2003,Schiffman，M.,J.Nat.CancerInstit.Monog.31，14-19)。某些CIN2病變顯微鏡觀察具有不良表象，但是能夠被免疫系統(tǒng)克服并消失，而其它病變可能會(huì)發(fā)展成浸潤(rùn)性癌。因此，許多人認(rèn)為CIN2是可疑診斷的緩沖區(qū)，盡管該區(qū)域的邊界條件仍然有爭(zhēng)議。一些臨床醫(yī)生認(rèn)為將CIN2和CIN3組合不可行，而其它臨床醫(yī)生會(huì)治療CIN2或者更壞狀況的所有病變。最后，有文獻(xiàn)表明有三分之一至三分之二被確定為CIN3的婦女會(huì)發(fā)展成浸潤(rùn)性癌，但是其甚至以不可預(yù)知而且依賴(lài)時(shí)間的方式發(fā)生(2003,Schiffman，M.,J.Nat.Cancer.Instit.Monog.31,14-19;1978,Kinlen，L.J.,etal.，Lancet2，463-465;1956,Peterson,0.Am.J.Obstet.Gynec.72,1063-1071)。醫(yī)生今天仍然面臨的重要問(wèn)題是難于定義低度的細(xì)胞學(xué)異常情況，例如無(wú)明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)或鱗狀上皮內(nèi)病變(SILs)。""實(shí)上，ASCUS不是適當(dāng)?shù)脑\斷，而是很少得到了解的變化的'廢紙簍，范疇，其具有不被了解的變化"(1996，Lorincz，A.T.,1996，J.Obstet.Gyncol.Res.22，629-636)。因?yàn)閬?lái)自口服避孕藥的使用，抽煙和HPV以外的病原體例如沙眼衣原體和II型單純皰疹病毒、抗氧化劑營(yíng)養(yǎng)素以及宮頸炎的輔助因素效應(yīng)，癌前期病變的整個(gè)范圍很難去解釋?zhuān)猩鲜鲞@些都聲稱(chēng)能調(diào)節(jié)從重度鱗狀上皮細(xì)胞內(nèi)病變(HSILs)發(fā)展到宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)(2003,Castellsague，X.J.Nat.CancerInst.Monog.31,20-28)。因?yàn)樽畛醢l(fā)現(xiàn)將凹細(xì)胞非典型性和CIN1歸入輕度鱗狀上皮細(xì)胞內(nèi)病變(LSILs)較新的范疇中是沒(méi)有益處的，因此引入Bethesda分類(lèi)系統(tǒng)及其2001年修訂版幾乎沒(méi)有減少臨床醫(yī)生中的上述混淆。引入Bethesda系統(tǒng)的結(jié)果是許多臨床醫(yī)生對(duì)凹細(xì)胞非典型性沒(méi)有進(jìn)行陰道鏡檢査，"但是認(rèn)為對(duì)CIN1患者非得做這項(xiàng)檢査"，(1995,Hatch,K.D.,,Am.J.Obstet.Gyn.172,1150-1157)。顯然，盡管陰道鏡檢査技術(shù)需要多年練習(xí)，但主觀的細(xì)胞學(xué)標(biāo)準(zhǔn)仍然會(huì)導(dǎo)致不一致性和非再現(xiàn)性(1994，Sherman,M.E.，Am.J.Clin.Pathology,102,182-187;1988，Giles,J.A.，Br.Med.J.，296,1099-1102)。連續(xù)診斷的障礙是模糊診斷例如"典型"能占某些背景中診斷的20^或更多(1993,Schiffman，M.ContemporaryOB/GYN,27-40)。一種專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于評(píng)價(jià)病理學(xué)家對(duì)"非典型"涂片的獨(dú)立診斷一致水平的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了這種情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)五位病理學(xué)家對(duì)同樣的一組樣品的準(zhǔn)確一致僅在29%的病例中發(fā)生(1994,Sherman,M.E.,etal.,Am.丄Clin.Pathology,102,182-187)。最終結(jié)果是宮頸細(xì)胞學(xué)繼續(xù)保持高假陰性率(稱(chēng)為低靈敏度)和高假陽(yáng)性率(稱(chēng)為低特異性)。不同病理學(xué)家的細(xì)胞學(xué)解釋產(chǎn)生達(dá)到20%左右的假陰性率以及達(dá)到15%的假陽(yáng)性率(1993,Koss,L.G.，Cancer,71，1406-1412)。假陽(yáng)性結(jié)果導(dǎo)致不必要的陰道鏡檢查、活組織檢查和治療，所有這些都會(huì)增加醫(yī)療費(fèi)負(fù)擔(dān)。假陰性結(jié)果導(dǎo)致潛在的醫(yī)療事故法律訴訟及相關(guān)費(fèi)用。利用HPV檢驗(yàn)對(duì)宮頸異常情況進(jìn)行早期分子診斷向這種領(lǐng)域提供比細(xì)胞學(xué)診斷更少的主觀實(shí)驗(yàn)。生物體不健康的基因組指標(biāo)與許多水平的基因組甲基化狀態(tài)的變化密切相關(guān)。食品添加物對(duì)甲基化和代謝健康具有非故意的并且有害的結(jié)果(Waterland，R.A.,2003,MolecularandCellularBiology,23,5293-5300)，并且，某些基因組啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化，例如reelin基因座的異常甲基化與各種精神狀況例如精神分裂癥有關(guān)(2002，Chen,Y.,etal.,NucleicAcidsResearch,30,2930-2939;Miklos，G丄.G.，andMaleszka，R.，2004,NatureBiotechnology,22,615-621)。甲基化研究的單個(gè)最大領(lǐng)域是在癌癥研究中，其中詳細(xì)記錄了基因組區(qū)域的超甲基化和低甲基化(French,S.W.,etal"2002,ClinicalImmunology,103,217-230;Frigola,J.,etal"2005，HumanMolecularGenetics,14，319-326;BelinskyS.A.,etal.,NatureReviewsCancer,4，1-11)。其中一些研究其目的是揭示用于指示癌癥的預(yù)后生物標(biāo)記(Baker，M.,2005,NatureBiotechnology,23，297-304)，但是生物標(biāo)記領(lǐng)域盡是不一致的結(jié)果。另外，這些基因組研究與對(duì)來(lái)自微生物和病毒感染的細(xì)胞和組織干擾的其它來(lái)源罕有關(guān)聯(lián)。另外，癌基因組通常包含大量的基因組變動(dòng)，例如染色體非整倍性、節(jié)段非整倍性、缺失、擴(kuò)增、倒位、易位和多點(diǎn)突變(Duesberg，P.，2004，CellCycle,3,823-828;Miklos,G丄.G.，2005,NatureBiotechnology,23,535-537)，并且在甲基化變化的情況下，仍然沒(méi)有深入探討這些基因組變動(dòng)對(duì)早期檢測(cè)的重要性(Vogelstein，B.,etal.，2004,NatureMedicine,10,789-799;Lucito,R.,etal.2003,GenomeResearch,13，2291-2305)。鑒于以上所列的所有問(wèn)題和不足，對(duì)于DNA方法的臨床效果尤其是在瘤前病變的篩查中仍然存在爭(zhēng)議。細(xì)胞異常的靈敏早期分子預(yù)后指標(biāo)可能非常有價(jià)值的。本發(fā)明人已經(jīng)研發(fā)了用于檢測(cè)病毒和基因組靶標(biāo)的新的方法、試劑盒以及整合的生物信息學(xué)平臺(tái)，用于確定個(gè)體的健康狀態(tài)。
發(fā)明內(nèi)容總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及一種用于確定受試者健康狀態(tài)的測(cè)定法，其將病毒存在的檢測(cè)和指示健康狀態(tài)的基因組靶標(biāo)或標(biāo)記的存在、缺失或者狀態(tài)的檢測(cè)組合使用。如果需要，可對(duì)相同的測(cè)試、容器或者反應(yīng)中的僅僅一個(gè)樣品實(shí)施本發(fā)明。第一方面，本發(fā)明提供了用于確定受試者健康狀態(tài)的測(cè)定法，包括(a)用能修飾核酸中未甲基化的胞嘧啶的試劑來(lái)處理受試者樣品，其中處理樣品中的病毒核酸和基因組核酸經(jīng)以形成衍生病毒核酸和衍生基因組核酸；(b)測(cè)定處理樣品中衍生病毒核酸的存在；以及(c)確定處理樣品中衍生基因組核酸的基因組標(biāo)記的狀態(tài)，其中一個(gè)或多個(gè)衍生病毒核酸的存在和基因組標(biāo)記的狀態(tài)指示健康狀況。在優(yōu)選的形式中，所述測(cè)定法還包括在分析和確定步驟之前，擴(kuò)增至少部分衍生病毒核酸和衍生基因組核酸。第二方面，本發(fā)明提供了用于確定受試者健康狀態(tài)的測(cè)定法，其包括(a)用修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑來(lái)處理含有病毒核酸和基因組核酸的受試者樣品，以形成具有胞嘧啶數(shù)減少但實(shí)質(zhì)上具有與對(duì)應(yīng)的未處理病毒核酸和未處理基因組核酸的堿基總數(shù)相同的衍生病毒核酸和衍生基因組核酸；(b)獲得病毒特異性核酸分子；(c)獲得具有基因組耙標(biāo)的核酸分子；(d)測(cè)試病毒特異性核酸分子的存在；以及(e)確定處理和擴(kuò)增樣品中基因組靶標(biāo)的狀態(tài)，其中一個(gè)或多個(gè)病毒特異性核酸分子的檢測(cè)和靶標(biāo)的狀態(tài)指示受試者的健康狀況。優(yōu)選地，通過(guò)擴(kuò)增衍生病毒核酸和衍生基因組核酸，獲得病毒特異性核酸分子和具有基因組耙標(biāo)的核酸分子。第三方面，本發(fā)明提供了用于確定受試者健康狀態(tài)的測(cè)定法，其包括(a)用修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑來(lái)處理受試者樣品，以形成衍生核(b)提供能夠允許將期望病毒核酸擴(kuò)增為衍生核酸的引物；(c)提供能夠允許將靶基因組核酸分子擴(kuò)增為衍生核酸的引物；(d)對(duì)衍生核酸實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)；以及(e)測(cè)定擴(kuò)增的期望病毒核酸和擴(kuò)增的耙基因組核酸的存在，其中一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在或者不存在指示受試者的健康狀態(tài)。在優(yōu)選的形式中，步驟(e)包括測(cè)定含有期望的病毒特異性核酸分子的擴(kuò)增核酸產(chǎn)物的存在，其中期望的病毒特異性核酸分子的檢測(cè)指示樣品中存在該病毒。在另一個(gè)優(yōu)選的形式中，步驟(e)還包括測(cè)定含有耙標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增核酸產(chǎn)物的存在，其中靶標(biāo)核酸分子的檢測(cè)指示樣品中基因組或者基因的狀態(tài)。第四方面，本發(fā)明提供了一種用于確定受試者健康狀態(tài)的測(cè)定法，其包括(a)用亞硫酸氫鹽試劑在使病毒和基因組核酸中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的條件下處理受試者樣品，以形成衍生病毒核酸和衍生基因組核酸；.(b)為樣品提供能結(jié)合到衍生病毒核酸區(qū)域的引物，該引物能夠允許衍生病毒核酸中期望的病毒特異性核酸分子的擴(kuò)增；(C)為樣品提供能結(jié)合到衍生基因組核酸區(qū)域的引物；該引物能夠允許衍生基因組核酸中期望的靶標(biāo)基因組特異性核酸分子的擴(kuò)增；(d)對(duì)處理樣品的進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；以及(e)測(cè)定擴(kuò)增的病毒核酸產(chǎn)物和擴(kuò)增的基因組核酸耙標(biāo)的存在，其中該產(chǎn)物和靶標(biāo)中一個(gè)或全部的檢測(cè)指示受試者的健康狀況。在優(yōu)選的形式中，該測(cè)定法還包括(f)測(cè)試存在病毒的樣品，以確定樣品中病毒的型、亞型、變體或者基因型。擴(kuò)增可通過(guò)任何適合的方式進(jìn)行，例如PCR或者等溫?cái)U(kuò)增。如果病毒含有DNA基因組，用試劑處理可以產(chǎn)生衍生核酸。然而，如果病毒含有RNA基因組，基因組可經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶法轉(zhuǎn)化為DNA。轉(zhuǎn)化可在用試劑處理之前或之后進(jìn)行。優(yōu)選地，采用病毒特異性引物以確保沒(méi)有任何其它RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。受試者可以是任何具有顯著頻率的基因組甲基化的高等生命形式。通常，本發(fā)明適于動(dòng)物或人類(lèi)以及病毒感染的植物種。優(yōu)選地，動(dòng)物是農(nóng)場(chǎng)的或家養(yǎng)的哺乳動(dòng)物，但它們可以是健康狀態(tài)需要監(jiān)測(cè)的野生群體。人類(lèi)可以是健康個(gè)體或患者。期望的病毒核酸分子可以是對(duì)病毒家族本身或低等分類(lèi)范疇例如病毒的屬或種、型或亞型、或者變異體或基因型具有特異性的，不論其是否是指示疾病。某些基因組區(qū)的甲基化通常使相關(guān)基因的表達(dá)"關(guān)閉"。然而，在某些情況下，某些基因可能具有相關(guān)的甲基化區(qū)域，但是基因表達(dá)仍然"打開(kāi)(on)"。因此，在優(yōu)選的形式中，甲基化或非甲基化可以作為預(yù)后指標(biāo)，而不是基因本身的表達(dá)。阻斷特異性核酸區(qū)域的擴(kuò)增以確定或耙向期望的甲基化狀態(tài)也是可能的。靶標(biāo)基因組核酸可以是對(duì)一個(gè)基因或多個(gè)基因或調(diào)控區(qū)例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子或者是基因組的任何編碼或非編碼區(qū)、或者靜止或可動(dòng)區(qū)具特異性的。優(yōu)選地，靶標(biāo)具有用于診斷或預(yù)后目的的甲基化特征，其包括可動(dòng)的或者曾經(jīng)是可動(dòng)的元件，例如由重復(fù)DNA序列LINE家族舉例說(shuō)明的那些元件(長(zhǎng)散置元；也稱(chēng)作長(zhǎng)散在核元件，人類(lèi)基因組中廣泛的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族;1996,Smit,A.F.A.,CurrentOpinioninGeneticsandDevelopment,6，743-748;2003,Han,J.S.,etal.，Nature,429,268-274;2004，Brouha,B.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100,5280-5285)以及SINE家族(短散置元件，也稱(chēng)作短散在核元件;Batzer,M.A.,etal.)，它們共同組成了幾乎人類(lèi)基因組的一半。更優(yōu)選地，靶基因組核酸是基因組核酸的甲基化或未甲基化區(qū)域的指標(biāo)。優(yōu)選地，可以利用對(duì)病毒特定型或病毒型的特定族具特異性的引物重復(fù)進(jìn)行測(cè)定，其中擴(kuò)增產(chǎn)物的存在是病毒特定型或病毒型的特定族的指標(biāo)。通常，擴(kuò)增后，每個(gè)衍生核酸形成了與相應(yīng)的未處理的核酸相比胞嘧啶總數(shù)減少的簡(jiǎn)化核酸分子，其中簡(jiǎn)化的核酸分子優(yōu)選地包括對(duì)該病毒或靶標(biāo)具特異性的核酸序列。對(duì)于不含有甲基化的胞嘧啶的雙鏈DNA，上述處理步驟產(chǎn)生兩個(gè)衍生核酸，每個(gè)均包含堿基腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。這兩個(gè)衍生核酸是由雙鏈DNA的兩個(gè)單鏈產(chǎn)生的。這兩個(gè)衍生核酸不含有胞嘧啶，但仍然含有與原始的未處理DNA分子相同的堿基總數(shù)和序列長(zhǎng)度。重要的是，這兩個(gè)衍生物彼此不是互補(bǔ)的，并且形成一個(gè)上游鏈和一個(gè)下游鏈。一個(gè)或多個(gè)鏈可以作為擴(kuò)增的靶標(biāo)來(lái)產(chǎn)生簡(jiǎn)化的核酸分子。通常，在未處理病毒基因組中不天然存在病毒特異性的簡(jiǎn)化核酸序列。病毒株或型能夠賦予特定人或動(dòng)物種族譜系中特定組織以高、中或低水平致癌狀態(tài)或其它疾病狀態(tài)。實(shí)例包括高風(fēng)險(xiǎn)HPV型16、18、45和56;中風(fēng)險(xiǎn)HPV型30、31、33、35、39、51、52、58、59和68;以及低風(fēng)險(xiǎn)HPV型6、11、42、43、44、53、54和55。上述病毒可以來(lái)自任何已描述的人類(lèi)病毒家族(參見(jiàn)；http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/ICD-10.htm)，例如來(lái)自痘病毒科(Poxviridae)，其包括牛痘病毒(Cowpoxvims)、猴痘病毒(Monkeypoxvirus)、痘苗病毒(Vacciniavirus)禾口類(lèi)天花病毒(Vnariolavims)。依賴(lài)于上述病毒，它們能引起皮膚和粘膜損傷、濕疹(eczema)以及傳染性膿皰性皮炎(congagiouspulstulardermatitis)。2003年InternationalStatisticalClassificationofDiseasesandRelatedHealthProblems(ICD)第十版(http:〃www3.who.int/icd/vol1htm2003/navi.htm)概述了各種人類(lèi)疾病。副粘病毒科(Paramyxoviridae)，其包括尼帕病毒(Nipahvirus)、副流感病毒(parainfluenza)和腮腺炎病毒(Mumps)，其與各種呼吸器官疾病(respiratoryillness)、月思腺炎(mumps)、腦膜炎(meningitis)、姨月泉炎(pancreatitis)、腦炎(encephalitis)和麻疹(measles)有關(guān)。尼帕病毒于1999年被首次識(shí)別，其致使70%的感染患者患致命的腦炎，并且具有非常廣泛的宿主范圍包括人類(lèi)、犬(dogs)、貓(cats)、豬(pigs)、馬(ho腦)、倉(cāng)鼠(hamsters)、蝙蝠(bats)和豚鼠(guineapigs)。它是全球健康和經(jīng)濟(jì)的嚴(yán)重威脅(2005，Nature,436，401-405;Negrete,O.A.，etal,);黃病毒科(Flaviviridae)，其包括登革病毒(Dengue)、黃熱病病毒(YellowFever)、丙型肝炎病毒和庚型肝炎病毒(hepatitisCandG)，其與腦炎(encephalitis)、肝炎和休克綜合征(shocksyndrome)有關(guān)。例如，丙型肝炎病毒是具有六個(gè)主要基因型的RNA病毒，它是全世界超過(guò)一億七千萬(wàn)人感染慢性肝病的主要原因，而且無(wú)有效的疫苗(2005,Science,309，623-626;Lindenbach,B.D,，etal，)；皰疹病毒科(Herpesviridae)，其包括人皰疹病毒(herpesvirus)l至8。這些病毒可以引起口腔感染、角膜潰瘍(ulcerationofthecornea)、生殖道感染(genitaltractinfections)、腦膜炎(meningitis)、水痘(chickenpox)、月巿炎(pneumonia)、帶狀皰疹(shingles)、巨細(xì)胞病毒性單核細(xì)胞增多癥(cytomegaloviralmononucleosis)和腦炎。人巨細(xì)胞病毒可以在免疫障礙的個(gè)體包括器官移植的個(gè)體中產(chǎn)生嚴(yán)重的致命疾病。另外，HHV8被認(rèn)為是AIDS相關(guān)病癥Kaposi肉瘤(Kaposisarcoma)的致病因素(2003，Nature,424，456-461;Wang,X.，etal，)；腺病毒科(Adenoviridae)，其包括人類(lèi)腺病毒(adenovimses)A至F。這些病毒可以引起呼吸器官疾病、腎感染、結(jié)膜炎(conjimctivitis)和腹瀉(diarrhoea);乳頭瘤病毒科(Papillomaviridae)，其包括以上介紹的人乳頭瘤病毒類(lèi)型。這些病毒引起病毒性疣(vimlwarts)和宮頸(cervis)、喉(larynx)及膀胱(bladder)的腫瘤(neoplasm)。細(xì)小病毒科(Parvoviridae)，其包括B19病毒，產(chǎn)生風(fēng)疹(Rubella)癥狀但沒(méi)有并發(fā)癥。肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，其包括乙型肝炎病毒(HepatitisB)，與肝硬化(cirrhosisoftheliver)和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(primaryhepatocellularcarcinoma)有關(guān)；逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)，其包括1禾n2型HTLV以及1禾B2型HIV，與急性感染和各種惡性腫瘤例如人T細(xì)胞白血病有關(guān)；呼腸孤病毒科(Reoviridae)，其包括輪狀病毒(rotavirus)，與腹瀉、胃腸炎(gastroenteritis)禾口上呼吸道疾病(upperrespiratorytractillness)有關(guān)；纖絲病毒科(Filoviridae)，其包括馬堡型和埃博拉型病毒((MarburgandEbolatypeviruses)，與出血熱(hemorrhagicfever)有關(guān)；彈狀病毒科(Rhabdoviridae),其包括水皰性口炎病毒(vesicularstomatitis)和狂犬病毒(Rabies)，與發(fā)熱和狂犬病(Rabies)有關(guān)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，其包括A、B和C型流感病毒(influenza)，與普通感冒和肺炎(pheumonia)有關(guān)；本揚(yáng)病毒科(Bunyaviridae)，其包括克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-congohemorrhagicfevervirus)、NewYork病毒(NewYorkvirus)和漢坦病毒(Hantavirus)，與急性發(fā)熱和肺綜合癥(pulmonarysyndromes)有關(guān)；沙粒病毒科(Arenaviridae)，其包括拉沙病毒(Lassavirus)、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocyticchoriomeningitisvirus),與腦炎、腦膜炎禾口出血熱(hemorrhagicfever)有關(guān)；冠狀病毒科(Coronaviridae)，其包括人類(lèi)冠狀病毒(humancoronavirus)，與普通感冒癥狀禾n胃腸道癥狀(gastrointestinalsymptoms)有關(guān)；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，其包括人類(lèi)腸道病毒(humanenteroviruses)A至D禾口脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)，與支氣管炎(bronchitis)、腦膜炎禾卩癱瘓(paralysis)有關(guān)；杯狀病毒科(Caliciviridae)，其包括諾瓦克樣病毒和扎幌樣病毒(Norwalk-likeandSapporo-likeviruses)，與急性胃腸炎(acutegastroenteritis)有關(guān)；未分類(lèi)的"戊型肝炎樣病毒"(HepatitisE-likeviruses,HEV)與急性肝炎有關(guān)；星狀病毒科(Astroviridae)，其包括人星狀病毒(humanastrovirus)，與腸炎(enteritis)和胃腸炎(gastroenteritis)有關(guān)；以及披膜病毒科(Togaviridae)，其包括羅斯河病毒(RossRiver)和風(fēng)疹病毒(RubelIa)，與腦炎、白細(xì)胞減少癥(leucopenia)和疹(rash)有關(guān)。利用本發(fā)明，臨床分類(lèi)為低風(fēng)險(xiǎn)的病毒在特定基因型或種族譜系的個(gè)人或動(dòng)物上實(shí)際上可能是高風(fēng)險(xiǎn)的。核酸分子可以利用任何適宜的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)例包括，但不限于提供能結(jié)合于核酸分子區(qū)域的檢測(cè)配體，并有足夠的時(shí)間使該檢測(cè)配體結(jié)合于該區(qū)域；以及測(cè)定該檢測(cè)配體與核酸分子的結(jié)合，以檢測(cè)該核酸分子的存在情況。應(yīng)了解可以利用本領(lǐng)域中已知的任何適宜的方式來(lái)檢測(cè)核酸分子。當(dāng)任何特定病毒的病毒特異的核酸分子已經(jīng)獲得或得以鑒定，可以設(shè)計(jì)探針或引物以確保在擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增目的區(qū)域。重要的是要注意可以分析所處理的基因組的兩條鏈以及由此轉(zhuǎn)化的基因組(下文稱(chēng)為"衍生物")的兩條鏈兩者以用于引物設(shè)計(jì)，因?yàn)樘幚砘蜣D(zhuǎn)化導(dǎo)致序列的不對(duì)稱(chēng)性(參見(jiàn)下文)，因此為了檢測(cè)同一基因座的上游鏈和下游鏈(也稱(chēng)為"Watson"和"Crick"鏈)需要不同的引物序列。因此，存在兩個(gè)分子群，即如在轉(zhuǎn)化后立即存在的轉(zhuǎn)化基因組，以及在衍生物通過(guò)常規(guī)酶學(xué)方法(PCR)或通過(guò)例如等溫?cái)U(kuò)增的方法復(fù)制后得到的分子群。為了方便，通常針對(duì)轉(zhuǎn)化的上游鏈設(shè)計(jì)引物，但是引物也生針對(duì)下游鏈被而產(chǎn)生。因此，對(duì)樣品實(shí)施臨床或科學(xué)測(cè)定以檢測(cè)生物體基因組中特定類(lèi)型的病毒和革巴標(biāo)是可能的。本發(fā)明可以使用指示代表性病毒類(lèi)型的探針或引物，其可以用于確定特定樣品中是否存在任何病毒。此外，病毒型特異性探針可以用來(lái)實(shí)際檢測(cè)或鑒定病毒的特定型、亞型、變體和基因型實(shí)例。本發(fā)明可以使用指示靶標(biāo)例如甲基化的探針或引物，其可以用于確定特定樣品中是否存在耙標(biāo)。此外，耙標(biāo)特異性探針可以用來(lái)實(shí)際檢測(cè)或鑒定基因組中的耙標(biāo)。本發(fā)明真實(shí)且意想不到的優(yōu)勢(shì)是，其可以在一個(gè)反應(yīng)管或容器中實(shí)施。不僅可以分析病毒而且能夠鑒定基因組靶標(biāo)或靶標(biāo)。在一個(gè)分析中兩種試驗(yàn)參數(shù)的組合允許確定受試者的健康狀態(tài)。健康狀態(tài)可以是疾病例如癌癥、癌前狀態(tài)、高風(fēng)險(xiǎn)疾病狀態(tài)等等。本發(fā)明可以作為疾病狀態(tài)或潛在疾病狀態(tài)的早期指示，其將允許早期醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)或園藝學(xué)的干預(yù)以防止進(jìn)一步發(fā)展或治愈該疾病。本發(fā)明尤其適合檢測(cè)涉及疾病狀態(tài)例如癌癥的病毒。實(shí)例包括，但不限于人類(lèi)乳頭瘤病毒、肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)以及上述各種病毒家族的成員。本發(fā)明尤其適合檢測(cè)涉及疾病狀態(tài)例如癌癥的細(xì)胞中的基因組靶標(biāo)。依賴(lài)于疾病或健康狀態(tài)，基因組中潛在的任何基因、調(diào)控區(qū)或非編碼區(qū)、或者其核外或胞外組分是本發(fā)明所使用的潛在標(biāo)記。本發(fā)明人已經(jīng)獲得資料，其證明某些基因組區(qū)域的甲基化狀態(tài)指示癌進(jìn)展，而且其進(jìn)展在病毒存在情況下更加可靠。利用臨床樣品和細(xì)胞系，本發(fā)明人觀察對(duì)了在幾乎400個(gè)人類(lèi)基因附近的調(diào)控區(qū)的甲基化模式進(jìn)行了觀察，并且，當(dāng)處于癌狀態(tài)并且HPV存在時(shí)，發(fā)現(xiàn)約發(fā)現(xiàn)了超過(guò)60個(gè)具有甲基化改變的基因組標(biāo)記，當(dāng)處于癌狀態(tài)并且HPV存在時(shí)其具有甲基化改變。實(shí)例包括，但不限于一個(gè)或多個(gè)下列基因組區(qū)域CD14、ENDRB、HIC、RARB1、PGR、SFRS8、TMSBIO、ABCG2、MFNG、LAMR1、RAGE、ABL1、CRBP、GPR37、HRK、RARA、SYK、ECE1、MME、TEM、NF2、XIAP、RARRES1、FLIl、HTLF、LDHB、RB1、TGD、CDK4、MMP14、RAB32、BARD1、NF1、LIM2、MMP2、DAB2、BMP6、CDKN1C、DAB2IP、LMNB1、MMP28、HAI2、S0CS1、HIC2、MSH6、RIN2、HMGA1、JUN、S100P*、SRF、VDR、DKK3、KRAS2、PLAU、TNFRSF10B、CDH1、MAC30、DDB2、PAX6、AXL、EIF4A2、SLIT2、RECK、TERC、GATA5、STAT1。其它區(qū)域包括列于下文表8中的區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明人獲得的HPV資料，應(yīng)了解每個(gè)和每種疾病或健康狀態(tài)可具有特定的基因組區(qū)域，其可在本發(fā)明中用作標(biāo)記。當(dāng)樣品是HPV陽(yáng)性并且來(lái)自癌或癌前狀態(tài)時(shí)，約15%經(jīng)檢驗(yàn)的基因組標(biāo)記是陽(yáng)性的(甲基化)，該事實(shí)表明存在大量任何特定疾病或健康狀態(tài)可能的靶標(biāo)。既然人類(lèi)基因組中存在約25000個(gè)編碼蛋白的基因座，那么15%的比例將預(yù)計(jì)約有4000個(gè)利用基因調(diào)控區(qū)的可能的耙標(biāo)。由于在特定疾病或健康狀態(tài)中特異的CpG區(qū)可以被甲基化，因而可能存在許多更加潛在的靶標(biāo)。本發(fā)明因此包括所有此類(lèi)可能的標(biāo)記。應(yīng)了解本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠使用本教導(dǎo)來(lái)確定對(duì)于任何疾病或健康狀態(tài)的任何有用的基因組標(biāo)記。第五方面，本發(fā)明提供了篩選受試者中潛在宮頸癌的測(cè)定法，包括(a)用亞硫酸氫鹽試劑在使人乳頭瘤病毒(HPV)和基因組核酸中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的條件下來(lái)處理受試者樣品，以形成衍生HPV核酸和衍生基因組核酸；(b)提供能結(jié)合至衍生HPV核酸區(qū)域的引物，該引物能夠允許擴(kuò)增衍生HPV核酸中期望的HPV特異性的核酸分子；(c)提供能結(jié)合至衍生基因組核酸區(qū)域的引物，該引物能夠允許擴(kuò)增衍生基因組核酸中期望的基因組特異性的核酸分子；Cd)對(duì)衍生HPV核酸和衍生基因組核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；以及(e)測(cè)定擴(kuò)增的HPV核酸產(chǎn)物和擴(kuò)增的基因組核酸產(chǎn)物的存在，其中一種產(chǎn)物一個(gè)或兩種產(chǎn)物的檢測(cè)指示受試者發(fā)展為宮頸癌狀態(tài)。在一個(gè)優(yōu)選的形式中，該測(cè)定法還包括(f)測(cè)定存在HPV的樣品，以確定樣品中HPV的型、亞型、變異體或者基因型。例如對(duì)于HPV16的檢測(cè)，可以制備能結(jié)合至衍生HPV16病毒核酸的引物。應(yīng)了解如HPV16所進(jìn)行的，可以通過(guò)將各自的基因組序列中所有胞嘧啶改變成尿嘧啶來(lái)確定所有其它HPV型的衍生HPV核酸。上述轉(zhuǎn)化描述了根據(jù)本發(fā)明測(cè)定法的步驟a中所進(jìn)行的處理樣品中病毒核酸的結(jié)果。應(yīng)了解可以設(shè)計(jì)其它適當(dāng)?shù)囊锘蛱结?，其能結(jié)合到其它HPV型來(lái)源的衍生HPV病毒核酸。第六方面，本發(fā)明提供了確定受試者健康狀態(tài)的測(cè)定法中所使用的試劑盒，其包括病毒特異性核酸分子的探針或引物、基因組特異性的核酸分子的探針或引物，以及用于擴(kuò)增反應(yīng)例如PCR的一種或多種試劑或組分。樣品包括，但不限于拭樣(swab)、活組織切片(biopsy)、涂片(smear)、巴氏涂片(Papsmear)、表面刮片(surfacescrape)、壓舌板取樣(spatula)和液體樣品(fluidsample),以及來(lái)自不同存儲(chǔ)介質(zhì)的樣品，例如冷凍材料(frozenmaterial)、石蠟塊(paraffmblocks)、載玻片(galssslides)、法醫(yī)標(biāo)本系統(tǒng)(forensiccollectionsystems)禾卩檔案材料(archivalmaterial)。任何生物種群，包括動(dòng)物和人類(lèi)、以及植物都存在對(duì)長(zhǎng)期病毒效應(yīng)有抵抗作用的個(gè)體。因此，病毒存在和基因組標(biāo)記例如基因組甲基化的組合應(yīng)該可以辨別生物體是否有或可能有疾病狀態(tài)。本發(fā)明適合人類(lèi)應(yīng)用以及獸醫(yī)和其它基于生物體的應(yīng)用。例如，本發(fā)明可以用于所有畜禽，其有充分跡象表明發(fā)生了基因組甲基化，并且本發(fā)明甚至可以作為監(jiān)測(cè)野生種群的管理工具。本質(zhì)上，本發(fā)明涉及在兩種水平上進(jìn)行測(cè)定一個(gè)用于病毒的存在，另一個(gè)是用于從特定擴(kuò)增產(chǎn)物或沒(méi)有擴(kuò)增來(lái)推斷的基因組或核酸靶標(biāo)的存在、缺失或狀態(tài)。靶標(biāo)可以是甲基化狀態(tài)、核酸序列、或缺少核酸序列、或是改變的核酸序列。在某些晚期癌癥中，基因組靶標(biāo)可以完全缺失，因此其存在的缺乏可以用于診斷。其本身可以是優(yōu)秀的診斷工具而且涵蓋于本發(fā)明中。另外，許多癌癥具有稱(chēng)作雙微體(double-minutes)的染色體外擴(kuò)增子(amplicons)，因此嚴(yán)格來(lái)講它們不是基因組，由于其不存在于46條染色體中的一條。相似地，任何線粒體DNA、或細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核細(xì)胞器所含的DNA涵蓋于本發(fā)明中。本發(fā)明人研發(fā)了一種組合技術(shù)，例如當(dāng)在單個(gè)試管中使用時(shí)，該組合技術(shù)比其它任何單獨(dú)用于評(píng)估細(xì)胞群向癌性軌道發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)的技術(shù)更加有效。通常，一個(gè)或少數(shù)基因組靶標(biāo)的基因組甲基化可以在一個(gè)管中進(jìn)行。當(dāng)同時(shí)包含病毒基因組和宿主基因組DNA(或RNA)的患者樣品通過(guò)使用亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化成能夠同時(shí)用于檢測(cè)病毒存在和宿主甲基化模式改變的簡(jiǎn)化形式時(shí)，該測(cè)定法是有效的。修飾核酸可以將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為另一種核苷酸。優(yōu)選地,該試劑將未甲基化的胞嘧啶修飾為尿嘧啶，其隨后在衍生核酸的擴(kuò)增過(guò)程中被替代為胸腺嘧啶。優(yōu)選地，用于修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑是亞硫酸氫鈉。類(lèi)似地修飾未甲基化的胞嘧啶而不是甲基化的胞嘧啶的其它試劑也可用于本發(fā)明的測(cè)定法中。實(shí)例包括，但不限于亞硫酸氫鹽、醋酸鹽或檸檬酸鹽。優(yōu)選地，所述試劑是亞硫酸氫鈉，一種在酸性水溶液存在條件下將胞嘧啶修飾為尿嘧啶的試劑。亞硫酸氫鈉(NaHS03)易與胞嘧啶的5,6-雙鍵反應(yīng)，形成磺酸化的胞嘧啶反應(yīng)中間體，該中間體易于脫氨，并在水存在下生成尿嘧啶亞硫酸鹽。如有必要，可在適度堿性條件下去除亞硫酸鹽基團(tuán)，形成尿嘧啶。因此，潛在地所有胞嘧啶均可被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。然而由于甲基化保護(hù),任何甲基化的胞嘧啶均不能由所述修飾試劑轉(zhuǎn)化。整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，除非上下文另有要求，詞語(yǔ)"包括(comprise)"或其變形如"包含(comprises)"或"包含(comprising)"應(yīng)理解為表示包括所述元件、整體或步驟、或元件、整體或步驟的組合，但不排除任何其它元件、整體或步驟或元件、整體或步驟的組合。對(duì)已包含于本說(shuō)明書(shū)中的文獻(xiàn)、法令(acts)、材料、裝置、文章等的任何討論僅用于為本發(fā)明提供背景。盡管其在本說(shuō)明書(shū)中各項(xiàng)權(quán)利要求的優(yōu)選權(quán)日期之前在澳大利亞已經(jīng)存在，但并不認(rèn)為是對(duì)任何或全部這些內(nèi)容構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分的承認(rèn)，或者成為本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的公知常識(shí)。為了更清楚地理解本發(fā)明，優(yōu)選的實(shí)施例將參照以下附圖和實(shí)例加以闡述。圖l表示各種人樣品的高風(fēng)險(xiǎn)HPV實(shí)驗(yàn)和HPV分型，其中樣品包括Hela細(xì)胞系、來(lái)自?xún)蓚€(gè)被認(rèn)為具有高度鱗狀上皮內(nèi)病變的個(gè)體(l和2)的樣品(被稱(chēng)為HSIL-1和HSIL-2)、具有正常細(xì)胞學(xué)的兩個(gè)個(gè)體(被稱(chēng)為Normal-l和Normal-2)以及沒(méi)有癌癥狀態(tài)的細(xì)胞學(xué)指示,但如病理學(xué)家所確定的,根據(jù)細(xì)胞表型推斷為HPV感染的一個(gè)個(gè)體(被稱(chēng)為HPV+Nor)。A.利用高-中度風(fēng)險(xiǎn)HPV型的通用引物來(lái)確定六份不同樣品的高風(fēng)險(xiǎn)HPV型；B.使用對(duì)HPV型具特異性的復(fù)雜性降低的引物組16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59以及正常組織樣品中的引物組42、43、44、53、54、55、66、68、73、82、83和84來(lái)用于HPV實(shí)驗(yàn)。圖2表示相同LBC樣品中人類(lèi)基因組DNA和HPVDNA的同時(shí)檢測(cè)。圖3表示正常宮頸樣品的代表性凝膠，該宮頸樣品在16個(gè)不同基因座進(jìn)行了擴(kuò)增，然后經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BstUl和Taqal組合消化，并通過(guò)瓊脂糖凝膠進(jìn)行了電泳。從液基細(xì)胞學(xué)樣品(在此編號(hào)為28和29)中提取DNA，用亞硫酸氫鈉進(jìn)行修飾，然后用巢式引物(nestedprimers)擴(kuò)增所鑒定的基因用于進(jìn)一步分析。這些基因從左到右分別是1)TEM2)MME3)ECE14)SYK5)RARA6)HRK7)GPR378)CRBP9)ABL110)RAGE11)LAMR112)MFNG13)ABCG214)TMSBIO15)SFRS8和16)PGR。圖4表示腫瘤樣品的代表性凝膠，該腫瘤樣品在16個(gè)不同的基因座上進(jìn)行了擴(kuò)增、經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BstUl和Taqal組合消化并在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行了電泳。從液基細(xì)胞學(xué)樣品(在此編號(hào)為82、83、84、94、95和96)中提取DNA，用亞硫酸氫鈉進(jìn)行修飾，然后用巢式引物擴(kuò)增所鑒定的基因用于進(jìn)一步分析。這些基因從左到右分別是1)PGR2)SFRS83)TMSBIO4)ABCG25)MFNG6)LAMR17)RAGE8)ABL19)CRBP10)GPR3711)HRK12)RARA13)SYK14)ECEl15)MMEand16)TEM。具體實(shí)施方式定義如在本文中所用的術(shù)語(yǔ)"受試者"意思是指在胞嘧啶上具有基因組甲基化的生物體。其通常包括哺乳動(dòng)物例如動(dòng)物和人類(lèi)以及許多植物物種。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"健康狀態(tài)"意思為根據(jù)易定義的疾病或痛苦，個(gè)體不同于整個(gè)群的程度。對(duì)于人類(lèi)，其被世界衛(wèi)生組織(WorldHeathOrganization)采用國(guó)際疾病分類(lèi)(InternationalClassificationofDiseases)來(lái)定義，其是所有一般流行病學(xué)和健康管理目的的標(biāo)準(zhǔn)診斷分類(lèi)。在臨床術(shù)語(yǔ)中，可以采用《哈里森內(nèi)科學(xué)》Braunwald,Eetal.,eds,McGmwHill,MedicalPublishingDivision,第15版和以后的版本中所列標(biāo)準(zhǔn)對(duì)健康狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"基因組耙標(biāo)狀態(tài)"可包括耙標(biāo)核酸(染色體或染色體外的)存在與否、基因組耙標(biāo)的甲基化或未甲基化，耙標(biāo)可以是生物群內(nèi)特定細(xì)胞類(lèi)型的正?；蚨鄳B(tài)性存在的核酸，或是通過(guò)感染性微生物或病毒引入的耙標(biāo)，或者是通過(guò)擴(kuò)增、修飾、倒位或易位來(lái)對(duì)外部干擾作出反應(yīng)的耙標(biāo)。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"修飾"意思為將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為另一種核苷酸。優(yōu)選地，所述試劑將未甲基化的胞嘧啶修飾為尿嘧啶，其隨后在修飾的核酸擴(kuò)增過(guò)程中被替換為胸腺嘧啶。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"復(fù)雜性降低"在廣義上意思為DNA基因組，無(wú)論其天然存在于真核、原核或病毒/類(lèi)病毒生命形式中，還是人工合成的(或者如果作為RNA病毒/類(lèi)病毒基因組而天然存在，隨后，復(fù)制為cDNA的形式)，其含有四種共同的堿基G、A、T和C，經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽的修飾，其經(jīng)歷了Ts頻率的增加和Cs頻率的減少。上述轉(zhuǎn)化把曾經(jīng)是正常的基因組變成術(shù)語(yǔ)稱(chēng)為"衍生物"的聚合物序列，其沒(méi)有功能的生物學(xué)意義，而且由"假基因組(genomicghosts)"組成。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"復(fù)雜性降低"不是指堿基在衍生物群中存在的順序，例如序列ATATATATATATAT(SEQIDNO:76)與相同長(zhǎng)度的序列之一AAAAAAATTTTTTT(SEQIDNO:77)之間的任何數(shù)學(xué)上的復(fù)雜性差異。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"復(fù)雜性降低"是指兩個(gè)實(shí)體(一個(gè)是原始基因組，另一個(gè)是衍生物)中的堿基的未變位置，該位置是通過(guò)分子探針或引物對(duì)不變位置1至n處都具有目標(biāo)堿基的原始基因組及其衍生物而測(cè)得的。在某個(gè)特定女性的30億個(gè)堿基對(duì)的單倍體人類(lèi)基因組中，上游鏈上所述不變位置定義為從1至n，其中n是位置3,000,000,000。如果在序列l(wèi)至n中，在原始基因組上游鏈中第i個(gè)堿基是C，則在轉(zhuǎn)化的人衍生物中第i個(gè)堿基是U。在7904個(gè)堿基對(duì)的HPV16病毒基因組中，所述不變的位置定義為從1至7904，其中n是7904。如果在序列1至n中，在原始基因組上游鏈中第i個(gè)堿基是C，則在轉(zhuǎn)化的HPV衍生物中第i個(gè)堿基是U。應(yīng)了解當(dāng)不同類(lèi)型的HPV衍生物或型用于比對(duì)并且這些病毒衍生物長(zhǎng)度不同時(shí)，則確定正確的第i個(gè)堿基需要仔細(xì)的生物信息學(xué)多重比對(duì)，如同Morgenstern,B.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93，12098-12103對(duì)標(biāo)準(zhǔn)多重基因組比對(duì)進(jìn)行說(shuō)明的一樣。實(shí)例闡明了上述轉(zhuǎn)化過(guò)程當(dāng)應(yīng)用于個(gè)體病毒基因組或應(yīng)用于存在于含有人類(lèi)細(xì)胞和病毒基因組或其部分的臨床樣品中的病毒基因組混合物時(shí)的結(jié)果。一個(gè)正常10個(gè)堿基的基因組序列("上游"鏈)，其序列為5'GGGGAAATTC3，(SEQIDNO:78)，具有互補(bǔ)的"下游"鏈，其序列為5'GAATTTCCCC3，(SEQIDNO:79)。變性和亞硫酸氫鹽處理之后，上述"上游"鏈變?yōu)?，GGGGAAATTU3，(SEQIDNO:80)，并且上述"下游"鏈變?yōu)?，GAATTTUUUU3，(SEQIDNO:81)。由于胞嘧啶已經(jīng)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而尿嘧啶在DNA聚合酶體外轉(zhuǎn)體內(nèi)機(jī)制的識(shí)別方面與胸腺嘧啶相當(dāng)，所以該上游鏈衍生物基本上是5，GGGGAAATTT5，GGGGAAATTT3，(SEQIDNO:82)，下游鏈衍生物是5，5，GAATTTTTTT3，(SEQIDNO:83)。因此起始正常的基因組從其上下游鏈之間具有5個(gè)Cs和5個(gè)Ts轉(zhuǎn)化為現(xiàn)在上下游鏈之間沒(méi)有Cs而具有10個(gè)Ts的衍生聚合物群。正?；蚪M已從四堿基的基因組降低為三堿基衍生物，復(fù)雜性得以降低。此外，衍生物群中的'基因座'只是指該衍生物中的位置坐標(biāo)。例如，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后，基因座失去了其在任何網(wǎng)絡(luò)水平所具有的所有功能生物學(xué)特征。如果該基因組以前是編碼、調(diào)控或是具有結(jié)構(gòu)的，那么現(xiàn)在其兩條鏈都是生物學(xué)失語(yǔ)(biologkalgibberish)。因此衍生物群是沒(méi)有功能的化學(xué)聚合物的集合，其現(xiàn)在代表基因組以前的互補(bǔ)鏈的兩個(gè)非互補(bǔ)鏈(non-complementaryghost)，該基因組現(xiàn)在是不含有信息的。此外，該衍生物是唯一的，而且不代表在任何細(xì)胞的(或病毒或類(lèi)病毒)生命形式中通過(guò)正常進(jìn)化過(guò)程產(chǎn)生的序列，除非是統(tǒng)計(jì)的意外。探針和復(fù)雜性降低對(duì)于分子探針的正常意義，本發(fā)明人在本文中根據(jù)在兩個(gè)相同大小的實(shí)體中在特定的分子條件下實(shí)現(xiàn)探針對(duì)特異基因座的相同特異性和雜交水平所需的探針長(zhǎng)度的增加(IPL)來(lái)定義'復(fù)雜性降低'，所述的實(shí)體其中第一個(gè)是正?；蚪M，第二個(gè)是'轉(zhuǎn)化的'基因組(衍生物)。出于分子用途的目的，IPL是等于或大于1的整數(shù)。每個(gè)基因座在正?；蚪M以及轉(zhuǎn)化的衍生物中保持相同的位置。實(shí)際上，"復(fù)雜性降低"可以通過(guò)探針長(zhǎng)度來(lái)測(cè)定。例如，平均來(lái)說(shuō)，ll-mer的寡核苷酸探針將具有一個(gè)獨(dú)特的位置，其將與由四種堿基G、A、T禾BC組成的4、194、304個(gè)堿基(411等于4,194,304)的正?；蚪M完美雜交。然而，一旦這種4、194、304個(gè)堿基的正常基因組己經(jīng)由HGS亞硫酸氫鹽法進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，那么現(xiàn)在該轉(zhuǎn)化的衍生物富含T而且復(fù)雜性較低。然而，復(fù)雜性降低的結(jié)果就是之前獨(dú)特的ll-mer探針不再具有可在復(fù)雜性降低的衍生物中可與之雜交的獨(dú)特位置，其它新產(chǎn)生的ll堿基序列的位置，其作為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的結(jié)果而重新出現(xiàn)。這些新產(chǎn)生的序列在本文中稱(chēng)為"誘餌基因座"。因此現(xiàn)在需要約14-mer探針來(lái)找到并與該原始基因座雜交。在該實(shí)例中，探針長(zhǎng)度的增加約是從0至3個(gè)堿基。盡管其看來(lái)可能與直覺(jué)相反，但需要長(zhǎng)度增加的寡核苷酸探針來(lái)檢測(cè)富含T的衍生物中的原始基因座。因此衍生物復(fù)雜性的降低意思是可能需要設(shè)計(jì)基因座的上游和下游鏈的更長(zhǎng)的探針來(lái)尋找衍生物中原始的獨(dú)特位置。然而，如下文所述的，嵌入性核酸(IntercalatingNucleicAcid,INA)探針的使用允許比傳統(tǒng)寡核苷酸探針更短的探針，因此克服了增加長(zhǎng)度的需要。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"復(fù)雜性降低"也可以應(yīng)用于探針序列的不同結(jié)構(gòu)，該探針序列可以用于確定樣品中HPV的存在。此外，這些探針可以含有非常規(guī)主鏈，例如PNA主鏈或?qū)σ粋€(gè)主鏈的修飾性插入，如在INA中所描述的那樣。因此衍生物被認(rèn)為具有降低的復(fù)雜性，與探針是否含有額外的組分例如嵌入性假核苷酸(如在INA中)無(wú)關(guān)。實(shí)例包括，但不限于DNA、RNA、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、MNA、阿卓糖醇核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、嵌入性核酸(INA)、肌醇核酸(CNA)及其混合物和雜交體，以及其磷原子修飾物，例如但不限于磷硫酰、磷酸甲脂、亞磷酰胺、二硫代磷酸酯、膦酸硒、磷酸三酯以及磷酸硼。非天然存在的核苷酸包括，但不限于以下核苷酸，包括DNA、RNA、PNA、INA、麗A、MNA、ANA、LNA、CAN、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA(a-L-Ribo-LNA)、a-L-木糖-LNA(a-L-Xylo-LNA)、卩-D-木糖-LNA(卩-D-Xylo-LNA)、a-D-核糖-LNA(a-D-Ribo-LNA)、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-氨基-雙環(huán)-DNA、5-表-雙環(huán)-DNA、a-雙環(huán)-DNA、三環(huán)陽(yáng)DNA、雙環(huán)[4.3.0]-DNA,雙環(huán)[3.2.1]-DNA，雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、P-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃來(lái)蘇糖基-NA、2'-R-RNA、a-L-RNA或a-D-RNA、(3-D-RNA。另外，非含磷化合物可以用于連接于核苷酸，例如但不限于甲基亞氨基甲基、甲酰乙酸乙酯、硫代甲酰乙酸乙酯以及含有酰胺的連接基團(tuán)。特別地，核酸和核酸類(lèi)似物可以一種或者多種嵌入性假核苷酸(IPN)。IPN的存在不是核酸分子復(fù)雜性描述的一部分，其主鏈也不是該復(fù)雜性的一部分，例如在PNA中。"INA"表示依照WO03/051901、WO03/052132、WO03/052133禾口WO03/052134(HumanGeneticSignaturesPtyLtd)中的教導(dǎo)的嵌入性核酸，其均以引用的方式并入本文中。INA是含有一個(gè)或者多個(gè)嵌入性假核苷酸(IPN)分子的寡核苷酸或者寡核苷酸類(lèi)似物。"HNA"表示核酸例如由VanAetschotetal.，1995所描述的。"MNA"表示核酸例如由Hossainetal,1998所描述的。"ANA"指由Allertetal，1999所描述的核酸。"LNA"可以為任何LNA分子，如在WO99/14226(Exiqon)中所描述的。優(yōu)選地，LNA選自WO99/14226的摘要中所描述的分子。更優(yōu)選地，LNA是如Singhetal,1998、Koshkinetal,1998或Obikaetal"1997中所描述的核酸。"PNA"指的是肽核酸，例如由Nielsenetal，1991所描述的。復(fù)雜性降低是根據(jù)探針長(zhǎng)度和基因座上下游鏈的不同探針序列來(lái)定義的，其原則是適用于不同結(jié)構(gòu)或不同分子環(huán)境中修飾的探針和引物的一個(gè)相對(duì)術(shù)語(yǔ)。INAs的實(shí)例闡明了這種相對(duì)性。INAs相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸探針的顯著優(yōu)點(diǎn)是INAs可以比常規(guī)寡核苷酸更短，其仍然可以實(shí)現(xiàn)相同的雜交結(jié)果(INA長(zhǎng)度<寡核苷酸長(zhǎng)度)。這是由于INA對(duì)互補(bǔ)DNA具有高親和力，其高親和力是由于作為INAs的結(jié)構(gòu)組分的嵌入性假核苷酸(IntercalatingPseudoNucleotides,IPN)。因此如果需要具有特定數(shù)量IPNs的長(zhǎng)度為X個(gè)核苷酸的INA來(lái)實(shí)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)化的基因組的成功且特異性的雜交，那么在相同的分子條件下仍然需要長(zhǎng)度大于X的INA與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的基因組中的相同基因座雜交。也需要特別重要指明的是對(duì)于宿主與病原體的相互作用(在相同臨床樣品中病毒和宿主基因組共存，但是具有顯著不同的濃度)中，"復(fù)雜性降低"和INAS的使用將新的有利條件引入到雜交方案中，尤其是由于INAs優(yōu)先雜交于富含AT的核酸序列。例如，在未轉(zhuǎn)化HPVDNA的純?nèi)芤褐校业讲⑴c7卯4個(gè)堿基的HPV16基因組的獨(dú)特基因座雜交所需要的病毒探針或引物的大概長(zhǎng)度大約是6-mer探針/引物(46等于4096個(gè)堿基)。亞硫酸氫鹽處理產(chǎn)生富含T的HPV衍生物之后，現(xiàn)在需要約8-mer探針或引物以在相同分子條件下找到該獨(dú)特位置(38等于6561個(gè)堿基)。然而，當(dāng)樣品中最初存在兩個(gè)大小顯著不等的基因組時(shí)，例如7904個(gè)堿基對(duì)的HPV基因組和約3，000，000，000個(gè)堿基對(duì)的人類(lèi)基因組，并且這兩個(gè)基因組都'復(fù)雜性降低'到它們各自的衍生物時(shí)，獨(dú)特病毒序列的探針或引物現(xiàn)在與溶液中它們的衍生物靶標(biāo)相雜交，其中溶液中富含T的人類(lèi)衍生物占?jí)旱剐缘亩鄶?shù)。例如，如果樣品中每個(gè)人類(lèi)衍生物都存在一個(gè)HPV衍生物，那么病毒探針或引物將與3，000，007,卯4個(gè)堿基對(duì)的衍生物雜交。因此現(xiàn)在對(duì)于獨(dú)特病毒序列的分析需要約14-mer探針或引物以避免在人類(lèi)序列中新產(chǎn)生的病毒誘餌基因座發(fā)出雜交信號(hào)。除了包含探針和引物長(zhǎng)度的"復(fù)雜性降低"的內(nèi)容以外，當(dāng)PCR反應(yīng)中所使用的簡(jiǎn)并引物數(shù)量適中時(shí)，雜交動(dòng)力學(xué)的變化和檢測(cè)PCR產(chǎn)物的能力也是重要的。由于HPV型間存在廣泛的基因組變異，所以先前擴(kuò)增技術(shù)需要使用大量的簡(jiǎn)并引物來(lái)產(chǎn)生相應(yīng)擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物或來(lái)自多重PCR反應(yīng)的擴(kuò)增子。然而，探針/引物庫(kù)的簡(jiǎn)并性越大，溶液中任何個(gè)體有關(guān)的探針或引物的濃度就越低。上述情況與對(duì)復(fù)雜真核基因組所實(shí)施的驅(qū)動(dòng)-示蹤物反應(yīng)(driver-tracerreactions)中雜交的動(dòng)力學(xué)和保真性相似，其于1966年被首次引入到科學(xué)文獻(xiàn)中，見(jiàn)Waring,M.&BrittenR.J.Science,154，791-794;andin1968byBritten,R.JandKohneDE.，Science,161,529-540，(本文中的早期參考來(lái)自theCarnegieInstitutionofWashingtonYearbookreports)。另外，當(dāng)HPVPCR引物相對(duì)于人類(lèi)衍生物為高濃度時(shí)，雜交反應(yīng)中的優(yōu)勢(shì)力量是HPV引物。例如，如果樣品中病毒負(fù)荷高(數(shù)量級(jí)是100,000個(gè)HPV基因組至單個(gè)人類(lèi)基因組)，如果每個(gè)人類(lèi)衍生物僅有一個(gè)HPV衍生物，那么病毒引物的雜交動(dòng)力學(xué)將比其快100,000倍。在前種情況中，溶液中病毒組分的行為就如同該組分是基因組中高度重復(fù)的組分。然而，為了利用單一PCR反應(yīng)檢測(cè)臨床樣品中不同風(fēng)險(xiǎn)的不同HPV類(lèi)型，通常需要每種HPV類(lèi)型的不同引物，所述每種HPV類(lèi)型必需使用簡(jiǎn)并引物。最終結(jié)果是引物群在混合的正常基因組的常規(guī)多重PCR反應(yīng)中可能會(huì)組合性交叉。可能確實(shí)存在數(shù)千個(gè)不同的引物來(lái)競(jìng)爭(zhēng)雜交位點(diǎn)，其最終結(jié)果是PCR擴(kuò)增的失敗，或擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物的分布嚴(yán)重偏向存在于樣品中的特定的HPV類(lèi)型。其對(duì)于從存在常規(guī)的未轉(zhuǎn)化的基因組的臨床樣品中產(chǎn)生數(shù)據(jù)提出了一個(gè)主要問(wèn)題。本發(fā)明的"復(fù)雜性降低"，其與INA探針和引物的選擇使用相組合，其克服了許多這些現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題的困難。引物和復(fù)雜性降低應(yīng)注意的是復(fù)雜性降低依賴(lài)于已轉(zhuǎn)化的分子群(衍生物)是否保持轉(zhuǎn)化狀態(tài)或是否經(jīng)受了進(jìn)一步擴(kuò)展而有所不同。在上文所討論的實(shí)例中，衍生物群如同其存在于臨床樣品中一樣保持未擴(kuò)增?；叵氲缴嫌捂?5'GGGGAAATTC3，)(SEQIDNO:78)和下游鏈(5，GAATTTCCCC3，)(SEQIDNO:79)分別轉(zhuǎn)化成5，GGGGAAATTU3，(SEQIDNO:80)和5，GAATTTUUUU3，(SEQIDNO:81)。由于胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而尿嘧啶在DNA聚合酶體外轉(zhuǎn)體內(nèi)的機(jī)制識(shí)別方面與胸腺嘧啶相當(dāng)，所以其上游鏈衍生物基本上是5，GGGGAAATTT3，(SEQIDNO:82)，其下游鏈衍生物是5，GAATTTTTTT3，(SEQIDNO:83)。然而，如果現(xiàn)在將衍生物群通過(guò)酶學(xué)方法體外轉(zhuǎn)體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，那么將隨之產(chǎn)生四種不同的衍生物群，它們是[5'GGGGAAATTT3，(SEQIDNO:82)]、[5，AAATTTCCCC3，(SEQIDNO:84)]、[5，AAAAAAATTC3，(SEQIDNO:85)]和[5,GAATTTTTTT3，(SEQIDNO:86)]。這些衍生物確實(shí)都是復(fù)雜性降低的，但未與轉(zhuǎn)化后立即存在的原始的未復(fù)制的衍生物降低至相同的程度。因此當(dāng)PCR引物是針對(duì)原始的未復(fù)制的衍生物的鏈時(shí)，由于針對(duì)上游或下游鏈的引物的選擇將會(huì)影響該結(jié)果，因此有必要明確地決定哪個(gè)是人們希望觀察到的擴(kuò)增核酸產(chǎn)物。處理構(gòu)成轉(zhuǎn)化基因組的產(chǎn)物的兩個(gè)非互補(bǔ)的衍生物群與處理復(fù)制后存在的四個(gè)衍生物群的差別直覺(jué)上是不清楚的，但是可能對(duì)引物的設(shè)計(jì)具有重要意義。最后，較長(zhǎng)探針或引物的問(wèn)題，其早期被引入是為了將"復(fù)雜性降低"形式化和定量化，只是假定當(dāng)尋找分子衍生物群中獨(dú)特序列時(shí)的相關(guān)性。然而本發(fā)明的重要基礎(chǔ)可能是病毒型間具有最大相似性的衍生物基因座的選擇，必要時(shí)其允許在一個(gè)初次檢査中測(cè)定所有病毒型。依賴(lài)于是否選擇上游或下游鏈衍生物，這些所選的基因座可能有所不同，并且與下游鏈相比，這些基因座將會(huì)在上游鏈的不同區(qū)域。由于通過(guò)利用本發(fā)明中HGS亞硫酸氫鹽處理的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有更高序列相似性的基因座，在衍生物群中需要較長(zhǎng)探針和引物的實(shí)際重要性為病毒檢測(cè)所獲得的實(shí)際優(yōu)勢(shì)所掩蓋，其也被比常規(guī)寡核苷酸需要更短的探針和引物分子的INAs的選擇使用所掩蓋。另外，將巢式PCR法應(yīng)用于衍生物群需要兩條引物在相同的鄰近位置結(jié)合以產(chǎn)生擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物。如果其中一條PCR引物與耙標(biāo)鄰近位置以外的誘餌基因座具有序列相似性，那么該引物對(duì)的其它成員在相同的非靶標(biāo)區(qū)域附近也具有誘餌基因座是不可能的。該巢式PCR法的內(nèi)引物在與第一輪引物相同的非靶標(biāo)區(qū)域再次具有誘餌基因座，是更不可能的。假擴(kuò)增的可能性是非常不可能的。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"病毒特異性的核酸分子"意思是已經(jīng)確定或獲得的分子，其具有一個(gè)或多個(gè)對(duì)病毒或病毒型具特異性的序列。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"病毒的分類(lèi)水平"包括型、亞型、變異體和基因型。識(shí)別病毒基因組的流動(dòng)性。不同的病毒群可能對(duì)單個(gè)核苷酸的改變是多態(tài)性的，或是如果它們存在于正常DNA修復(fù)過(guò)程不再起作用的某些癌細(xì)胞中，則可能是高或低可突變性。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"病毒特異性的核酸分子"意思是存在于處理或轉(zhuǎn)化的病毒DNA中特異性的核酸分子，其是該病毒或病毒型的指示。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"病毒型"是指任何現(xiàn)有的或新的病毒群，其與以前分離且表征的病毒型的序列相似性小于90%。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"病毒亞型"是指任何現(xiàn)有的或新的病毒群，相對(duì)于以前的病毒亞型其序列相似性范圍在90-98%之間。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"病毒變異體"是指任何存在的或新的病毒群，其中序列相似性是以前變體的98-100%之間。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"HPV基因型"如下?；蛐褪侨魏瓮耆珳y(cè)序的HPV基因組，其與任何其它完全測(cè)序的HPV基因組有最少為一個(gè)堿基的差別，其包括單個(gè)堿基是否以G、A、T或C中任一個(gè)存在，或者在標(biāo)準(zhǔn)參照(即HPV16從位置1至位置7卯4)中特定位置的堿基是否通過(guò)缺失、添加、擴(kuò)增或轉(zhuǎn)座到其它位置而發(fā)生改變。本發(fā)明人采用現(xiàn)有技術(shù)BLAST法對(duì)所有其它HPV基因型與標(biāo)準(zhǔn)HPV16進(jìn)行了比較。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"HPV特異的核酸分子"意思是存在于處理或轉(zhuǎn)化的病毒DNA中的特異性的核酸分子，其可能是該病毒或病毒型的指示。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"HPV型"是指任何存在的或新的HPV群，其與以前分離且表征的HPV型的序列相似性小于90%(1993,VanRast，M.A.,etal"PapillomavirusRep，4,61-65;1998，Southern,S.A.andHerrington,C.S.,Sex.Transm.Inf.74,101-109)。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"HPV亞型"是指任何現(xiàn)有的或新的HPV群，其中相對(duì)于以前的亞型其序列相似性在90-98%范圍內(nèi)(1993,VanRast,M.A.,etal"PapillomavirusRep，4,61-65;1998,Southern,S.A.andHerrington，C.S.,Sex.Transm.Inf.74,101-109)。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"HPV變體"是指任何現(xiàn)有的或新的HPV群，其中序列相似性為以前的變異體的98-100%之間(1993，VanRast，M.A.,etal.,PapillomavirusRep，4，61-65;1998，Southern,A.andHerrington,C.S.Sex.Transm.Inf.74,101-109)。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"HPV基因型"如下?；蛐褪侨魏瓮耆珳y(cè)序的HPV基因組，其與任何其它完全測(cè)序的HPV基因組有最少為一個(gè)堿基的差別，其包括單個(gè)堿基是否以G、A、T或C中任一個(gè)存在，或者在標(biāo)準(zhǔn)參照中(即HPV16從位置1至位置7904)特定位置的堿基是否通過(guò)缺失、添加、擴(kuò)增或轉(zhuǎn)座到其它位置而發(fā)生改變。本發(fā)明人采用現(xiàn)有技術(shù)BLAST法對(duì)所有其它HPV基因型與標(biāo)準(zhǔn)HPV16進(jìn)行了比較。表l提供了從患者液基細(xì)胞學(xué)樣品中產(chǎn)生HPV特異性產(chǎn)物的寡核苷酸引物的列表。所有引物均針對(duì)不同HPV型的上游鏈衍生物。這些引物的名稱(chēng)如下HPV型特異衍生物的區(qū)域引物編號(hào)如下列的每個(gè)設(shè)計(jì),5'衍生物的上游鏈PCR#1PCR#4PCR#2PCR#3例如首行說(shuō)明了在E7衍生物區(qū)域中HPV16的引物弁1。名稱(chēng)HPV-Uni和HPV-HM代表簡(jiǎn)并寡核苷酸引物。非標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)參見(jiàn)以前的定義。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>名稱(chēng)序列SEQIDNO:HPV-Uni-lGATGGKGATATGRTDSATRTWGGDTWTGG65HPV-Uni-2TAARTATTTWGATTATWTDDRAATG66HPV-Uni-3TATTWTAWCCYTAHRCHYWHTAHAACCA67AMAAAHAMHTAATTHYHMMAACAWAYAC68HPV-Uni-4CHPV-腹-lGATTTDKWDTGTWATGAGTAATTHPV-腿L-1GRKTTDKWDTGTWRKGARTAATTHPV-HM-2RRYRRKTTAGABGADGAHPV-腿L-2RRHRRKTTWGANKWDGAHPV-HM-3YDATACCTWCWMAWWHVDCCATHPV-畫(huà)L-3YDATACCTWHWHHDWHNDCCATHPV-HML-4ACHHHAAACCAHCCHHWACAHCC69707172737475病毒測(cè)定本發(fā)明的測(cè)定法第一部分中所采用的病毒檢測(cè)也可以與其它類(lèi)型非常不同的測(cè)定法相組合，它們分別是用于評(píng)價(jià)細(xì)胞群內(nèi)已發(fā)生變化的細(xì)胞狀態(tài)的測(cè)定法，用于通過(guò)感染細(xì)胞內(nèi)紊亂的代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝物或代謝組學(xué)網(wǎng)絡(luò)所支撐的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的測(cè)定法，和用于監(jiān)測(cè)感染進(jìn)程和評(píng)價(jià)治療方案例如抗病毒療法的測(cè)定法。例如，測(cè)量病毒特異性核酸分子的分子測(cè)定法可以與下列測(cè)定法相組合.一利用模式識(shí)別和高通量自動(dòng)成像技術(shù)例如用于組織切片中熒光信號(hào)自動(dòng)定量的多表位配體制圖系統(tǒng)(Multi-Epitope-Ligand-Kartographie，MELK)的測(cè)定法，一利用光學(xué)顯微鏡、共焦顯微鏡或透射電鏡分析的測(cè)定法，用于熒光原位雜交(FISH)、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)染色體紊亂例如非整倍性或異常細(xì)胞器(數(shù)目、類(lèi)型或形態(tài)外觀等方面)的總體水平的細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)測(cè)定法?！煤怂峄蚨嚯倪m體(aptamers)的測(cè)定法；Spiegdmers(鏡像高親和力寡核苷酸配體)測(cè)定法；多色納米晶體(量子點(diǎn)生物結(jié)合物)測(cè)定法，用于細(xì)胞表面或內(nèi)部組分的分子或生物標(biāo)記的超敏感非同位素檢測(cè)；包含通過(guò)指數(shù)級(jí)富集(ExponentialEnrichment)的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SystematicEvolutionofLigands,SELEX)以及針對(duì)不同細(xì)胞組分的高親和力適配子配體的組合化學(xué)方法。一利用細(xì)胞的激光捕獲或免疫磁性富集技術(shù)或者與流式細(xì)胞儀配套使用的基于微球的技術(shù)或者包含不同核酸或肽/蛋白質(zhì)的膠體懸浮系統(tǒng)的光學(xué)條形碼的測(cè)定法。一利用用于檢測(cè)總體基因組不平衡性例如復(fù)制、缺失、轉(zhuǎn)座、重排的單細(xì)胞比較基因組雜交及其相關(guān)的原位技術(shù)的測(cè)定法。一報(bào)告轉(zhuǎn)錄組調(diào)節(jié)的測(cè)定法，例如robogenomic微陣列技術(shù)(robogenomicmicroarraytechnologies)，包t舌基因表達(dá)系歹ll分豐斤(SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE)、全數(shù)基因表達(dá)分析(TotalGeneExpressionAnalyses,TOGA)、隨機(jī)順序可尋址的高密度光纖傳感器陣列、在微球上應(yīng)用的大規(guī)模平行測(cè)序(MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS)。一報(bào)告蛋白質(zhì)組調(diào)節(jié)的測(cè)定法，其采用各種技術(shù)，包括通過(guò)蛋白芯片細(xì)胞分析、基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(matrixAssistedLaserDesorptionlonization畫(huà)TimeofFlight,MALDI-TOF)、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法(FourierTransformedIonCyclotronResonanceMassSpectrometry,FTICR)、液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜(LCMS-MS)和快速蒸發(fā)冷卻質(zhì)譜(RapidEvaaporativecoolingMassSpectrometry,RapEvapMS)，—利用檢測(cè)水平達(dá)到zeptomole(l(T21)敏感性的多光子檢測(cè)技術(shù)(MultiPhotonDection,MPD)的測(cè)定法，一利用訪問(wèn)臨床樣品來(lái)源的細(xì)胞的甲基化譜的甲基化譜技術(shù)來(lái)確定沿著從常態(tài)到宮頸癌的特定軌道的細(xì)胞群的位置的測(cè)定法；優(yōu)選地來(lái)確定病毒感染細(xì)胞或招募到感染或炎癥位置的免疫細(xì)胞中基因組座改變的甲基化特征。以前曾評(píng)價(jià)過(guò)上述一些技術(shù)(2001，MiklosandMaleszka，Proteomics,1，30-41)。數(shù)據(jù)收集、整合和管理系統(tǒng)與本發(fā)明有關(guān)的公開(kāi)材料的數(shù)據(jù)收集和處理系統(tǒng)可以與臨床患者數(shù)據(jù)相組合，并采用專(zhuān)業(yè)化的算法進(jìn)行分析。自動(dòng)平臺(tái)管理和數(shù)據(jù)收集可以自動(dòng)化存儲(chǔ)，而且所收集的數(shù)據(jù)可以與信息基礎(chǔ)和軟件工具相組合，其與基因本體論(geneontologies,GO)配合使用，正如國(guó)家圖書(shū)館醫(yī)學(xué)主題詞表(NationalLibraryofMedicines'sMedicalSubjectHeadings,MeSH)、孟德?tīng)柸祟?lèi)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(OnlineMendelianInheritanceinMan,OMIM)或例如人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HumanGenomeMutationDatabase,HGMD)或PubMed等知識(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)舉例說(shuō)明的與疾病本體論配合使用一樣。軟件管線與最新的人類(lèi)基因組集合相配合，并且提供從例如基因庫(kù)(Genbank)和RefSeq等資源來(lái)源的信息的訪問(wèn)和下載，其可以與報(bào)告HPV感染細(xì)胞的基因組狀態(tài)或由于體內(nèi)其它部位存在的HPV而被細(xì)胞所影響的基因組狀態(tài)的測(cè)定法組合使用。例如，整合了HPV數(shù)據(jù)與臨床和相關(guān)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)基礎(chǔ)可以利用松散耦合的模塊架構(gòu)，其可以促進(jìn)更好的軟件工程和數(shù)據(jù)庫(kù)管理。關(guān)系型數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)(relationaldatabasemanagementsystem,RDBMS)(例如Postgresql7.3版)是開(kāi)放源和魯棒(robust)，而且作為部分整合系統(tǒng)的一個(gè)范例來(lái)評(píng)價(jià)和更好地預(yù)測(cè)HPV領(lǐng)域的臨床結(jié)果。包括基于網(wǎng)絡(luò)的圖形用戶(hù)界面(GraphicalUserInterfaces,GUI)的附加特征可以將整合的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)分析與分子HPV數(shù)據(jù)庫(kù)連同通過(guò)不同形式獲得的治療和藥用數(shù)據(jù)相組合。用于圖像分析的增強(qiáng)的數(shù)字技術(shù)、病理學(xué)家的遠(yuǎn)程圖像共享和自動(dòng)可視化系統(tǒng)的整合被看作自動(dòng)分子試劑盒平臺(tái)的整合部分。細(xì)胞取樣病毒檢測(cè)方案可以用于在機(jī)體任何部分來(lái)源的樣品上進(jìn)行，包括前胚泡期、胚胎組織、圍產(chǎn)期材料、尸體或法醫(yī)來(lái)源的樣品。優(yōu)選地，樣品來(lái)自宮頸陰道部例如宮頸和陰道，但是也可以可能來(lái)自表皮。優(yōu)選地，樣品來(lái)自宮頸變性轉(zhuǎn)化帶(cervinaltransformationzone)。上述樣品可以使用宮頸刷(CervexBmsh)(TherapakCorp，Irwindale，CA，USA)、Digene宮頸米樣器宮頸刷(DigeneCervicalsamplercervicalbrush)(DigeneCorp.Gaitherburg,MD,USA)、塑料刮伊/刷組合(CooperInstruments,Hollywood,FL,USA)來(lái)收集上述樣品；或者使用滌綸拭子(Dacronswabs)或從男性和女性患者肛門(mén)生殖器區(qū)域獲得樣品的任何適當(dāng)?shù)牟牧希蛘咄ㄟ^(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)活組織檢查方法例如針吸活組織檢查(needlebi叩sy)檢測(cè)。上述樣品可以置于各種培養(yǎng)基中，例如PreserveCyte,(CytycCorp.MA，USA)或來(lái)自TriPathImagingBurlington,NC,USA的AutoCytePREP。優(yōu)選地，采用液基細(xì)胞學(xué)進(jìn)行初次測(cè)試，但是平面平臺(tái)例如石蠟切片和載玻片也是適合的。試劑盒本發(fā)明可以以多種試劑盒或試劑盒組合的形式實(shí)施，并根據(jù)手動(dòng)、半自動(dòng)或自動(dòng)平臺(tái)加以例示。在優(yōu)選的形式中，MethyEasyTM或HighThroughtMethylEasy試齊!j盒(HumanGeneticSignaturesPtyLtd,Austmlia)可以利用自動(dòng)化平臺(tái)例如EpMotion在96或384孔板中進(jìn)行核酸的轉(zhuǎn)化。人乳頭瘤病毒(HPV)成熟的人乳頭瘤病毒DNA包裹在由兩種病毒編碼蛋白組成的二十面體衣殼膜內(nèi)。對(duì)于HPV16，其雙鏈環(huán)狀DNA基因組長(zhǎng)度為7904個(gè)堿基對(duì)，但是在普通的中度風(fēng)險(xiǎn)類(lèi)型中其長(zhǎng)度變化從HPV51的7808個(gè)堿基對(duì)到HPV52的7924個(gè)堿基對(duì)。病毒基因組的這些區(qū)域以在環(huán)狀分子中存在的順序列示于下文。該病毒有一個(gè)稱(chēng)為URR的非編碼區(qū)，隨后是稱(chēng)為E6、E7、El、E2、E4、E、L2和LI的許多編碼區(qū)。某些病毒型可能缺失功能性的E5區(qū)。E4區(qū)產(chǎn)生多種蛋白產(chǎn)物，這些蛋白產(chǎn)物可以引起細(xì)胞質(zhì)角蛋白網(wǎng)絡(luò)紊亂而導(dǎo)致稱(chēng)為凹空細(xì)胞病(koilocytosis)的細(xì)胞質(zhì)"暈輪效應(yīng)(haloeffect)"。不同HPV型都是嗜上皮細(xì)胞的，其感染后可以導(dǎo)致凹空細(xì)胞病、角化不良癥(dyskeratosis)、多核化(multinucleation)以及異常例如核增大和低度鱗狀上皮內(nèi)病變(lowgradesquamousintraepitheliallesions,SILs)，所有上述變化只產(chǎn)生在宮頸。在宮頸癌中病毒感染和染色體異常是相關(guān)的，但是在腫瘤中可以觀察到多參數(shù)的改變，其與病毒感染、病毒基因表達(dá)、病毒整合、細(xì)胞分化和基因組異常的關(guān)系還了角軍甚少(1998,Southern,S.A.etal"SexTransmInf.,74，101-109)。由于上述原因，對(duì)不同病毒型及其在不同遺傳背景中的不同效應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)是非常重要的。另外，盡管現(xiàn)有技術(shù)中承認(rèn)HPV型指定為表皮和粘膜以及高-、中-和低度風(fēng)險(xiǎn)范疇，但是這些范疇甚至在HPV的表皮和粘膜子范疇之間表現(xiàn)出一些沖突和重疊。例如，HPV7與皮膚疣以及口腔病損有關(guān)。在泛發(fā)性疣病和肛門(mén)生殖器損傷中已分離了HPV26。而且，盡管將HPV6和HPV11分類(lèi)為低風(fēng)險(xiǎn)型，但已從Buschke-Lowenstein瘤以及喉癌和外陰癌(vulvalcarcinomas)禾口尖銳濕疣(condylomataacuminata)中分離至U它們(1986,Boshart，M.etal"J.Virology,58，963-966)1992,Rubben，A.,etal"JGenVirol.,73，3147-3153)。病毒整合到宿主基因組上導(dǎo)致El和Ll區(qū)之間的線性化，而保留URR、E6和E7區(qū)，但是基因區(qū)例如El、Ll和L2缺失并且E2失活或者缺失。在宮頸癌中通常保留E6和E7區(qū)，而E2蛋白沒(méi)有表達(dá)。E2的損傷與預(yù)后不良和存活率縮短有關(guān)。患者樣品家庭醫(yī)生利用CytycCorporationUSA提供的宮頸取樣裝置從宮頸癌表面收集細(xì)胞樣品?；颊咄馐占臉悠纷鳛槌Ｒ?guī)癌篩選計(jì)劃的一部分或作為以前宮頸疾病的監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)。醫(yī)生將上述細(xì)胞從收集裝置轉(zhuǎn)移到用于保存細(xì)胞的甲醇/水溶液中，并運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室用于檢驗(yàn)。利用常規(guī)形態(tài)學(xué)制劑來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞樣品由于癌前病變或病毒感染而引起的變化。單獨(dú)的等份細(xì)胞樣品用于本說(shuō)明書(shū)中所概述的DNA實(shí)驗(yàn)。DNA提取病毒DNA可以從任何適當(dāng)?shù)膩?lái)源獲得。實(shí)例包括，但不限于細(xì)胞培養(yǎng)物、肉湯培養(yǎng)物、環(huán)境樣品、臨床樣品、體液、液態(tài)樣品、固態(tài)樣品例如組織。樣品來(lái)源的病毒DNA可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法獲得。一個(gè)適當(dāng)?shù)氖灩潭ㄎ镔|(zhì)的提取實(shí)例如下將目的樣品置于400li1的7M鹽酸胍、5mMEDTA、100mMTris/HCIpH6.4、1%Triton-X-100、50mM蛋白酶K(Sigma)、100"g/ml酵母tRNA中。用一次性1.5ml研棒徹底均質(zhì)化樣品，并在60。C放置48小時(shí)。溫育后，使樣品經(jīng)過(guò)5個(gè)干冰5分鐘/95T:的凍/融循環(huán)5分鐘。然后漩渦樣品并在微型離心機(jī)離心2分鐘使細(xì)胞碎片沉淀。將上清移入干凈管中并稀釋以降低鹽濃度，然后用苯酚-氯仿抽提，乙醇沉淀并重懸浮于50u1lOmMTris/0.1mMEDTA中。令人吃驚的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)沒(méi)有必要將病毒DNA與其它來(lái)源的核酸進(jìn)行分離。上述處理步驟可以用于大量不同DNA類(lèi)型的混合物，然而病毒特異核酸仍然可以通過(guò)本發(fā)明進(jìn)行鑒定。據(jù)估計(jì)，復(fù)雜DNA混合物中的檢測(cè)界限為標(biāo)準(zhǔn)PCR檢測(cè)的界限，其可以低至靶病毒核酸分子的單拷貝。高通量HPV測(cè)定本發(fā)明可以利用96孔板以高通量方式分步使用，96孔板中許多樣品可以同時(shí)進(jìn)行HPV的測(cè)試。下列潛在的商品化試劑盒的說(shuō)明書(shū)對(duì)其進(jìn)行了說(shuō)明HPV高通量DNA亞硫酸氫鹽處理試劑盒的目錄<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>組分名稱(chēng)含量載體DNA平板7:HPV分型平板18x100nl96孑LHPV分型平板8:對(duì)照平板82x96孔注意.個(gè)體高風(fēng)險(xiǎn)分型引物組可從人類(lèi)遺傳標(biāo)記控股有限公司(HumanGeneticSignatures)(咨詢(xún)〈hpv⑨geneticsignatures.com〉)獲得。注意對(duì)照樣品/引物l、2、3A和3B收到后應(yīng)保持在-20。C。所需的材料和設(shè)備(未提供)■采用下列多頭抽真空裝置或者離心機(jī)96孔板多頭抽真空裝置，其帶有在至少-10英寸汞柱(inHg,4.9psi)的壓力下使用的泵。(利用BiomdAunim多歧管進(jìn)行室內(nèi)測(cè)試，但是其它多歧管可以改造使用。)或者離心機(jī)，其帶有與高架式96孔板配套的轉(zhuǎn)子。(利用Eppendorf5810進(jìn)行室內(nèi)測(cè)試)。■與96孔0.2ml低式平板配套使用的熱蓋PCR擴(kuò)增儀■與384孔板配套使用的熱蓋PCR擴(kuò)增儀(用于HPV分型)■80%異丙醇(分子生物學(xué)級(jí))■水(分子生物學(xué)級(jí))■氫氧化鈉顆粒(分析級(jí))■2xPCRmaste淺ix(PromegaCat#M75051000rxn)■E-GelSystemMotherE-BaseTMdeviGe(InvitrogenEB-M03)■E-gels96高通量2%瓊脂糖(InvitrogenCat#G7008-02)■E-gel低分子量標(biāo)準(zhǔn)(InvitrogenCat弁12373031)■試劑容器x5.標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(未提供)■lml體積的多道移液器(200pl-1000pl)■200lil體積的多道移液器(20nl-200pl)■10lil體積的多道移液器(l^-10pl)■無(wú)塵紙巾■計(jì)時(shí)器畫(huà)帶濾芯吸頭(l(Vl-1000pl)■透射儀■凝膠成像系統(tǒng)■GlisonP1000■GlisonP200■GlisonP20方法如果首次使用HPV高通量DNA亞硫酸氫鹽處理試劑盒，強(qiáng)烈推薦在進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化法之前閱讀用戶(hù)指南中的詳細(xì)方法。使用HPV高通量DNA亞硫酸氫鹽處理試劑盒在轉(zhuǎn)化之前不需要預(yù)先消化基因組DNA。上述試劑盒優(yōu)化了起始DNA的濃度從1ng到4的基因組DNA。樣品制備■將總體積的試劑1與試劑2瓶組合，并且輕柔顛倒混勻。將組合試劑置于72°C10分鐘或直到完全溶解。注意試劑1和試劑2—經(jīng)混合便可在4°C暗處穩(wěn)定保存1個(gè)月。從生產(chǎn)之日起，所有試劑在室溫下可穩(wěn)定保存1年。■實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將結(jié)合緩沖液在72。C烘箱或培養(yǎng)箱中放置1小時(shí)?！雒看涡迈r配置0.3MNaOH溶液(例如0.6克NaOH/50.0ml水)■將純化平板置于洗滌平板頂部■將5pL對(duì)照樣品l加入495pL水(分子生物級(jí))中，并且平行處理實(shí)驗(yàn)樣品。對(duì)照樣品1含有未轉(zhuǎn)化HPV模板，其作為過(guò)程對(duì)照(processcontrol)和敏感性對(duì)照。其應(yīng)該置于孔H10內(nèi)。■總是進(jìn)行"無(wú)DNA對(duì)照"，其中用其余實(shí)驗(yàn)樣品處理500nL水，其應(yīng)當(dāng)置于孔Hll?！鲇檬謩×艺袷幰夯鶚悠?PreservCyt⑧)以使任何沉淀細(xì)胞重懸并保證樣品充分混勻?！鰧?00pL重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)移至純化平板/洗滌平板套裝的適當(dāng)?shù)目字?不使用孔HIO、H11或H12)。詳細(xì)記錄樣品放置于哪一個(gè)孔。實(shí)驗(yàn)方案.將純化平板/洗滌平板套裝以2000xrcf離心1min，丟掉流動(dòng)的液體部分。注意不要丟掉洗滌平板。.用底部蓋膜密封純化平板出口，確保所有出口完全密封。確保蓋膜的切角與純化平板切角始終成直線。"每2ml蛋白酶K加入裂解緩沖液并且顛倒混勻。一屯化平板每孔加入10(HiL裂解緩沖液(使用12道移液器)。*取10.5ml結(jié)合緩沖液放到新管中并且加入10(HiL載體DNA。顛倒混勻并且向純化平板的每孔中加入10(HiL結(jié)合緩沖液(使用12道移液器)，然后用提供的平板封口膜密封純化平板頂部。，55。C孵育60分鐘。"J、心地去掉純化平板上的底部蓋膜，并且將純化平板迅速放置在洗滌平板的上面。去掉純化平板的封口膜，然后以2000xrcf離心1分鐘，丟掉流動(dòng)的液體部分。注意不要丟掉洗滌平板。*更換純化平板的底部蓋膜。.向轉(zhuǎn)化平板的每孔中加入50pL新鮮配置的0.3MNaOH溶液，用新鮮的封口膜(提供的)密封純化平板上部。.55。C溫育15分鐘。*去掉封口膜并且使用多道移液器向轉(zhuǎn)化平板的每孔中加入220pL經(jīng)組合的試劑1和試劑2，用新鮮的封口膜(提供的)密封純化平板的頂部。,轉(zhuǎn)化平板在55°C溫育3小時(shí)。，溫育后，去掉封口膜并向轉(zhuǎn)化平板的每孔中加入24(VL結(jié)合緩沖液(參考重要實(shí)驗(yàn)方法制備)，用移液器混合，并用新鮮的封口膜(提供的)密封純化平板頂部。"、心地從純化平板去掉底部蓋膜，并且將純化平板迅速置于洗滌平板上面。.去掉封口膜，2000xrcf離心1分鐘，丟掉流動(dòng)的液體部分。，向每孔加入20(VL80X異丙醇，室溫2000xrcf離心1分鐘。*去掉洗滌平板，丟掉流動(dòng)的液體部分，然后室溫2000xrcf離心1分鐘。*丟掉洗滌平板，將純化平板置于洗脫平板的上面以確保純化平板的頂與洗脫平板正確對(duì)齊。平板在室溫下放置5分鐘。，采用多道移液器向純化平板的每個(gè)樣品孔中加入3(HiL洗脫緩沖液，移液器吸頭靠近膜表面但不要接觸。,室溫溫育1分鐘。,重復(fù)上述步驟一次，總洗脫體積達(dá)到60pL。*室溫1000xrcf將純化平板/洗脫平板組合體離心1分鐘。，去掉洗脫平板并用提供的密封帽密封。*將平板置于熱蓋熱循環(huán)儀的熱蓋PCR儀，95°C溫育30分鐘。去掉密封帽前進(jìn)行短暫離心?！鲇檬謩×艺袷幰夯鶚悠?PreservCyt(R))以使任何沉淀細(xì)胞重懸并且保證溶液均質(zhì)。隨將4ml重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15mlCostar離心管。如果培養(yǎng)基小于4ml，則將全部材料轉(zhuǎn)移到15mlCostar離心管并且補(bǔ)充無(wú)菌蒸餾水使體積達(dá)到4ml。精確測(cè)試需要至少lml體積的樣品?！鰧⑸鲜鲭x心管在吊桶式轉(zhuǎn)頭中3000xg離心15分鐘?！鲂⌒牡貎A倒上清，不要使沉淀細(xì)胞懸起。■用200HL裂解緩沖液將沉淀的細(xì)胞重懸，充分混合直到溶液均質(zhì)?！鱿驕赜桨宓拿靠字屑尤?(HiL蛋白酶K并進(jìn)行溫育?！鰧?(HiL樣品轉(zhuǎn)移到密封帽覆蓋的孵育平板(平板l)并且在55。C溫育l小時(shí)。實(shí)驗(yàn)方案準(zhǔn)備■將總體積的試劑1與試劑2瓶組合，并且輕柔顛倒混勻。注意試劑1和試劑2—經(jīng)混合便可在4。C暗處穩(wěn)定保存1個(gè)月。從生產(chǎn)之日起，試劑l、2、3和4在室溫下可穩(wěn)定保存l年。"每次新鮮配置NaOH溶液(例如1克NaOH/8.3ml水)，而且向轉(zhuǎn)化平板(平板2)的每孔中加入5fiL?！鰧?pL對(duì)照樣品1加入15)iL水(分子生物級(jí))中，平行處理測(cè)試樣品。■將20pL細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化平板(平板2)并且輕柔混勻。■用提供的封口膜將轉(zhuǎn)化平板(平板2)密封，并且在37。C烘箱中溫育15分鐘。溫育后，在去掉封口膜之前將平板短暫離心以在膜上沉淀任何凝結(jié)(condensation)?！鲇锰峁┑拿芊饷睂⒎跤桨?平板l)密封，-20。C保存?！龃_保試劑3沒(méi)有形成固體沉淀。如果有沉淀，則將該溶液加熱(不超過(guò)80。C)并且混勻。離心方案■用多道移液器向轉(zhuǎn)化平板(平板2)的每孔中加入22(HiL組合的試劑1和試劑2，然后用移液器輕柔混勻，并用提供的8條密封帽密封該平板?！鰧⑥D(zhuǎn)化平板(平板2)在55。C烘箱中溫育3小時(shí)。亞硫酸氫鹽處理可能進(jìn)行至少1小時(shí)，然而，減少孵育時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增子中局部的非轉(zhuǎn)化(non-coiwersion)。因此不推薦小于3小時(shí)的溫育時(shí)間?！鰷赜螅蜣D(zhuǎn)化平板(平板2)的每孔中加入24(HiL試劑3(參考重要方案制備)?！鰧⒓兓桨?平板3)置于洗滌平板(平板4)的上面?！鰧悠窂霓D(zhuǎn)化平板(平板2)轉(zhuǎn)移到純化平板(平板3)對(duì)應(yīng)的孔，并且用提供的封口膜密封?！鰧⒓兓桨?平板3)/洗滌平板(平板4)組合體放入離心機(jī)，以1,000rcf室溫離心4-5分鐘?！鰪南礈炱桨?平板4)上丟掉流動(dòng)的液體部分，然后再將其置于純化平板(平板3)的下面。向純化平板(平板3)的每孔中加入0.8ml80%異丙醇(分子生物學(xué)級(jí))?！?,000rcf室溫離心1分鐘。■去掉洗滌平板(平板4)，丟掉流動(dòng)的液體部分，然后再以1,000rcf室溫離心2分鐘?！鰧⒓兓桨?平板3)置于洗脫平板(平板5)的上面以確保純化平板(平板3)的頂位于洗脫平板(平板5)適當(dāng)?shù)目字?。■用多道移液器向純化平?平板3)的每個(gè)樣品孔中加入50pL試劑4，移液器吸頭靠近膜表面但不要與之接觸?！鍪覝販赜齦-2分鐘?！鰧⒓兓桨?平板3)/洗脫平板(平板5)組合體以1,000rcf室溫離心1分鐘?！鋈サ粝疵撈桨?平板5)，并用提供的密封帽密封。■將平板置于熱蓋PCR儀中95。C溫育30分鐘。現(xiàn)在己將DNA樣品經(jīng)轉(zhuǎn)化并且準(zhǔn)備進(jìn)行PCR擴(kuò)增。溫育后，將平板短暫離心以去掉密封帽上的任何凝結(jié)。內(nèi)部對(duì)照PCR反應(yīng)提供有基因組DNA和對(duì)照PCR引物用于簡(jiǎn)單故障的排除。提供有對(duì)照樣品l(紫色)和2(綠色)用于過(guò)程控制。對(duì)照樣品1是提供的足夠用于8個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的未處理的DNA。對(duì)照樣品2是提供的足夠用于20個(gè)PCR擴(kuò)增的亞硫酸氫鹽處理的DNA。對(duì)照引物3A(黃色)和3B(紅色)是PCR引物，其可以用于檢査回收的DNA的完整性(提供的足夠用于20個(gè)PCR擴(kuò)增)。巢式PCR引物可以用來(lái)進(jìn)一步提高檢測(cè)的敏感性，其用HPV高通量DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)照引物是常規(guī)亞硫酸氫鹽PCR引物而且已進(jìn)行了優(yōu)化供用于兩輪的PCR擴(kuò)增。由于在大多數(shù)情況下瓊脂糖凝膠電泳以后沒(méi)有可見(jiàn)的擴(kuò)增子條帶，因此不推薦將這些PCR引物用于單輪PCR。注意上述方案是基于熱蓋熱循環(huán)儀的使用。如果沒(méi)有熱蓋熱循環(huán)儀，外罩會(huì)與礦物油反應(yīng)。對(duì)照反應(yīng)■對(duì)照樣品l(紫色)含有未處理的HPV基因組DNA(50ngl)■對(duì)照樣品2(綠色)含有亞硫酸氫鹽處理的HPV人DNA(20ngl)■對(duì)照引物3A(黃色)含有第一輪PCR引物■對(duì)照引物3B(紅色)含有第二輪PCR引物對(duì)照PCR對(duì)照引物3A(第一輪PCR引物)和對(duì)照引物3B(第二輪PCR引物)是有效的巢式引物，其提供有足夠用于最多20個(gè)對(duì)照PCR反應(yīng)的量。必要時(shí)可提供這些引物樣品用于加快故障檢査過(guò)程，而且其也可以用于估計(jì)你的修飾的DNA的量。注意第二輪PCR反應(yīng)可以與第一輪PCR反應(yīng)同時(shí)準(zhǔn)備并且冷凍直到需要時(shí)。高風(fēng)險(xiǎn)PCR擴(kuò)增第一輪擴(kuò)增■對(duì)于每個(gè)反應(yīng)，向提供的高風(fēng)險(xiǎn)PCR平板上加入12.5plPCRMasterMix(例如PromegaMasterMix)和9.5pl水(分子生物學(xué)級(jí))。如果你將準(zhǔn)備96個(gè)樣品，那么在適當(dāng)?shù)墓苤袑?.25mlMastermix和850|Lil水以及200^1引物混合物組合并且充分混合。然后用多道移液器向提供的高風(fēng)險(xiǎn)HPV平板(平板6)的每孔中加入23|nl反應(yīng)混合物?！鱿蜻m當(dāng)?shù)目讓?duì)照孔H10和H11中加入2nl對(duì)照引物3A?！鰧?^1所需的修飾DNA從洗脫平板(平板5)加到提供的高風(fēng)險(xiǎn)HPV平板(平板6)，并且將2pl對(duì)照樣品2加入孔H11，然后將其余的保存于-20°C用于隨后的HPV分型(參見(jiàn)下文的高風(fēng)險(xiǎn)平板設(shè)計(jì))。■運(yùn)行下列PCR程序。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>■將2^1第一輪擴(kuò)增的DNA加入到第二輪混合物中，與第一輪擴(kuò)增所準(zhǔn)備的完全相同?！鲞\(yùn)行下列PCR程序95。C/3min1個(gè)循環(huán)95°C/1min42°C/2min60°C/2min30個(gè)循環(huán)60°C/10min1個(gè)循環(huán)電泳從鋁箔包裝中取出96孔2XE-凝膠并且去掉紅色的96孔梳子用多道移液器將l(Hil無(wú)菌水加入凝膠的每個(gè)孔中。將lO[ilDNA標(biāo)記加入標(biāo)記孔中。用多道移液器將l(Hil擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到E-凝膠的每孔中。設(shè)定E-base5-7分鐘，并且按pwr/prg。利用紫外透射儀和凝膠成像軟件記錄結(jié)果。HPY分型第一輪擴(kuò)增高風(fēng)險(xiǎn)分型平板(平板8)含有針對(duì)下列高風(fēng)險(xiǎn)HPV型的菌株特異引性物16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68。洗脫平板(平板5)上保留足夠量的DNA用于每個(gè)樣品的所有高風(fēng)險(xiǎn)菌株的分從-20。C冰箱取出洗脫平板(平板5)。高風(fēng)險(xiǎn)通用擴(kuò)增為陽(yáng)性的任何樣品現(xiàn)在可利用菌株特異性引物進(jìn)行分型(參見(jiàn)下文分型平板設(shè)置)。靈對(duì)于每個(gè)反應(yīng)，向提供的PCR平板每孔中加入12.5nlPCRMasterMix(例如PromegaMasterMix)和8.5^1水。如果你有6個(gè)樣品需要分型，那么向適當(dāng)?shù)墓苤屑尤?187.5(ilMastermix和807.5^1水并且充分混合。然后如下文所說(shuō)明的，向HPV分型平板(平板7)的每孔中加入21pl混合物?！鋈缦挛乃f(shuō)明的，向每孔中加入2)il適當(dāng)?shù)囊?。■如果?84孔板中進(jìn)行分型并且有24個(gè)樣品需要分型，則向適當(dāng)?shù)墓苤屑尤?.5mlMastermix和3.42ml水，充分混合，然后如下文所說(shuō)明的，向384孔板每孔中加入21^1混合物。然后如下文所說(shuō)明的，將2pl適合的引物加入每孔中?！鱿蚍中推桨暹m當(dāng)?shù)目字屑尤?pl高風(fēng)險(xiǎn)陽(yáng)性樣品(來(lái)自洗脫平板，平板5)?！鰷?zhǔn)備足夠的管用于你的每個(gè)樣品以及"無(wú)模板"(陰性)對(duì)照。■運(yùn)行下列PCR程序。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>第二輪擴(kuò)增■將2^il第一輪擴(kuò)增的DNA加入到第二輪混合物中，與第一輪擴(kuò)增所準(zhǔn)備的完全相同?！鲞\(yùn)行下列PCR程序<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>電泳■從鋁箔包裝中取出96孔2XE-凝膠并且去掉紅色的96孔梳子?！鲇枚嗟酪埔浩鲗?0^1l無(wú)菌水加入到凝膠的每個(gè)孔中?！鰧?0|alDNA標(biāo)記加到標(biāo)記孔中。■用多道移液器將l(nil擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到E-凝膠的每孔中。顯設(shè)定E-base5-7分鐘，并且按run?！隼米贤馔干鋬x和凝膠成像軟件記錄結(jié)果?！霈F(xiàn)在樣品進(jìn)行了分型。故障排除<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>亞硫酸氫鹽處理的樣品來(lái)源的HPVDNA，當(dāng)采用基因組簡(jiǎn)化引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，引物不論是寡核苷酸還是修飾的核酸例如INAs，其都為發(fā)現(xiàn)樣品中任何型的HPV提供了非常卓越的檢測(cè)系統(tǒng)，其可以是人臨床資料來(lái)源的樣品或是另一極端的環(huán)境來(lái)源。由于臨床相關(guān)病毒(HPV)被認(rèn)為是人類(lèi)癌癥的原因，本發(fā)明因而得到發(fā)展。依據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)測(cè)定法的實(shí)際意義是可變的。雖然利用PCR擴(kuò)增已證明上文所詳細(xì)描述的原則，但是可以利用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行資料解析。當(dāng)前人們以微陣列檢測(cè)系統(tǒng)為重點(diǎn)利用基因組簡(jiǎn)化引物能夠?qū)崿F(xiàn)多種HPV的檢測(cè)，由于亞硫酸氫鹽處理降低了基因組的復(fù)雜性，因此可以在有更少數(shù)量檢測(cè)器的微陣列上實(shí)現(xiàn)更多型HPV的檢測(cè)(特點(diǎn))。總之，HGS基因組簡(jiǎn)化引物法產(chǎn)生了與許多患者的臨床表型相關(guān)的一致性的數(shù)據(jù)。亞硫酸氫鹽處理以下列出了一個(gè)有效的亞硫酸氫鹽處理核酸的示例性方案。該方案可以保留基本上全部處理的DNA。本文中該方法也被稱(chēng)為人類(lèi)遺傳印記(HumanGeneticSignatures,HGS))法。應(yīng)了解樣品或試劑的體積或量可以變化。優(yōu)選的亞硫酸氫鹽處理方法可以t人類(lèi)遺傳標(biāo)記控股有限公司(HumanGneticSgnaturesPtyLtd)為申請(qǐng)人的US10/428310或WO2004/096825(PCT/AU2004/000549)中査到，二者以引用的方式并入本文中。對(duì)于2pgDNA，如果需要可以用適當(dāng)?shù)南拗菩悦高M(jìn)行預(yù)消化，以20ial的終體積加入2pd(l/10體積)的3MNaOH(6g/50ml水，新鮮制備)。該步驟將雙鏈DNA分子變性為單鏈形式，因?yàn)閬喠蛩釟潲}試劑優(yōu)選與單鏈分子反應(yīng)。將該混合物在37。C溫育15分鐘?？捎酶哂谑覝氐臏赜郎囟葋?lái)提高變性效率。溫育后，依次加入208^12M焦亞硫酸鈉(7.6g/20ml水，與416ml的10NNaOH;BDHAnalaR#10356.4D;新鮮制備)以及12(il的10mM對(duì)苯二酚(0.055g/50ml水，BDHAnalR#103122E;新鮮制備)。對(duì)苯二酚是還原劑，并有助于降低試劑的氧化作用。還可以使用其它的還原劑，例如二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙醇、醌(對(duì)苯二酚)或其它合適的還原劑。樣品用20(Hil礦物油覆蓋。礦物油覆蓋可以防止試劑的蒸發(fā)和氧化，但并非必需。隨后將樣品在55。C溫育過(guò)夜?？蛇x擇地，該樣品可以在熱循環(huán)儀中進(jìn)行如下循環(huán)如下溫育約4小時(shí)或整夜第一步，在PCR儀中循環(huán)55。C/2小時(shí)；第二步，95。C/2分鐘。第一步可以在約37°C至約90°C之間的任何溫度進(jìn)行，時(shí)間長(zhǎng)度可以從5分鐘至8小時(shí)之間變化。第二步可以在約70°C至約99°C之間的任何溫度進(jìn)行，時(shí)間長(zhǎng)度可以從1秒鐘至60分鐘或者更長(zhǎng)之間變化。用焦亞硫酸鈉處理后，將油去除，如果DNA濃度低則加入1^1tRNA(20mg/ml)或2nl糖原。這些添加劑是可選的，并且可以用來(lái)通過(guò)與靶標(biāo)DNA共沉淀而提高所獲得的DNA產(chǎn)量，尤其是DNA以低濃度存在時(shí)。當(dāng)核酸量<0.5叫時(shí)，則通常需要使用添加劑作為載體以更加有效的沉淀核酸。異丙醇提純處理如下進(jìn)行將800^1水加入樣品中，混勻，然后加入lml異丙醇。水或緩沖液將反應(yīng)管中的亞硫酸氫鹽濃度降低到該鹽不隨目的靶標(biāo)核酸一起沉淀的水平。稀釋度通常為約1/4至1/1000，只要將鹽濃度稀釋至低于如本文所公開(kāi)的預(yù)期范圍即可。將樣品重新混勻，并置于4。C至少5分鐘。將樣品在微型離心機(jī)中離心10-15分鐘，并將沉淀用70%ETOH洗滌2次，每次均渦旋。該洗滌處理除去任何與核酸一起沉淀的殘余鹽。將沉淀干燥，然后重懸于適當(dāng)體積例如50|il的T/E(10mMTris/0.1mMEDTA)pH7.0-12.5中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)pH10.5的緩沖液特別有效。如懸浮核酸所需要的一樣，將樣品在37°C至95。C孵育1分鐘至96小時(shí)。擴(kuò)增PCR擴(kuò)增利用PromegaPCRmastermix,在25^1包括2(^1亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA以及6ngl的每種引物的反應(yīng)混合物中進(jìn)行。將鏈特異性巢式引物用于擴(kuò)增。用PCR引物1和4進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增(見(jiàn)下文)。第一輪擴(kuò)增后，將^1擴(kuò)增的材料轉(zhuǎn)移至含有PCR引物2和3的第二輪PCR預(yù)先混合液中，并如前所述進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物的樣品在ThermoHybaidPX2熱循環(huán)儀中進(jìn)行擴(kuò)增，條件如下95。C/4分鐘的l個(gè)循環(huán)；隨后是95。C/1分鐘、50°C/2分鐘以及72°C/2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72。C/10分鐘的1個(gè)循環(huán)。完全巢式PCR法的示意圖如下所示PCR#1PCR#4PCR#2PCR#3多重?cái)U(kuò)增將lpl亞硫酸氫鹽處理的DNA加入到在25^120反應(yīng)體積中的下列組分中xlQiagen多重標(biāo)準(zhǔn)混合物(mastermix)、5-100ng每種第一輪INA或寡核苷酸引物、1.5扁4.2nMMgS04、400每種dNTP以及0.5-2單位的聚合酶混合物。所述組分隨后在熱蓋熱循環(huán)儀中進(jìn)行如下循環(huán)。通常，在每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中可以存在多達(dá)200個(gè)單獨(dú)的引物序列第一步94°C15min1個(gè)循環(huán)第二步94°C1min50°C3min35個(gè)循環(huán)68。C3min第三步68°C10min1個(gè)循環(huán)隨后對(duì)第一輪擴(kuò)增的等份試樣進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，將第一輪擴(kuò)增轉(zhuǎn)移到含有酶反應(yīng)混合物和適當(dāng)?shù)牡诙喴锏牡诙喎磻?yīng)管中。然后進(jìn)行如上循環(huán)。HGS"復(fù)雜性降低"引物和探針任何合適的PCR引物或探針，以及特別設(shè)計(jì)用于非PCR擴(kuò)增包括等溫?cái)U(kuò)增法的引物和探針均可用于本發(fā)明。引物或探針通常具有與待擴(kuò)增的序列互補(bǔ)序列。引物或探針通常是寡核苷酸，但可以是核苷酸類(lèi)似物，例如INAs。針對(duì)上游鏈和下游鏈的引物的序列是不同的。探針和引物探針或引物可以是任何合適的核酸分子或核酸類(lèi)似物。實(shí)例包括，但不限于DNA、RNA、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、MNA、阿卓糖醇核酸(altritolnucleicacid，ANA)、己糖醇核酸(hexitolnucleicacid，HNA)、嵌入性核酸(intercalatingnucleicacid,INA)、肌醇核酸(cyclohexanylnucleicacid，CNA)及其混合物和雜交體，以及其磷原子修飾物，例如但不限于硫代磷酸酯(phosphorothiates)、磷酸甲酉旨(methylphospholates)、亞磷酰胺(phosphoramidites)、二硫代磷酸酯(phosphorodithiates)、硒代磷酸酉旨(phosphoroselenoates)、磷酸三酉旨(phosphotriesters)以及石IH戈磷酸酉旨(phosphoboranoates)。非天然存在的核苷酸包括，但不限于以下核苷酸，包括DNA、RNA、PNA、INA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、CeNA、TNA、(2，-NH)-TNA、(3,-NH)-TNA、a-L-Ribo-LNA、a誦L-Xylo-LNA、卩-D-Xylo-LNA、a畫(huà)D畫(huà)Ribo-LNA、[3.2.1]誦LNA、雙環(huán)-DNA、6畫(huà)氨基畫(huà)雙環(huán)畫(huà)DNA、5畫(huà)epi-雙環(huán)畫(huà)DNA、a-雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0]畫(huà)DNA,雙環(huán)[3.2.1]-DNA,雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、卩-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃來(lái)蘇糖基-NA、2'-R-RNA、a-L-RNA或a-D-RNA、卩-D-RNA。另外，非含磷化合物可以用于連接到核苷酸，例如但不限于甲基亞氨基甲基(methyliminomethyl)、甲酰乙酸乙酯(formacetate)、硫代甲酰乙酸乙酯(thioformacetate)以及含有酰胺的連接基團(tuán)。特別地，核酸和核酸類(lèi)似物可能包含一種或者多種嵌入性假核苷酸。探針或引物可以是含有一種或多種形成INA的內(nèi)部IPNs的DNA或DNA寡核苷酸。檢測(cè)方法存在有多種可能的檢測(cè)系統(tǒng)可以用來(lái)確定期望樣品的狀態(tài)。檢測(cè)系統(tǒng)包括，但不限于I.適當(dāng)標(biāo)記的DNA雜交于微陣列型裝置，其可選擇10->200,000的單個(gè)組分。該陣列可以由位于任何合適的固體表面例如玻璃(glass)、塑料(plastic)、云母(mica)、尼龍(nylon)、珠子(bead)、磁珠(magneticbead)、熒光珠(fluorescentbead)或斷membrane)上的INAs、PNAs或核苷酸或者修飾的核苷酸陣列構(gòu)成；II.DNA印跡型檢測(cè)系統(tǒng)；III.標(biāo)準(zhǔn)PCR檢測(cè)系統(tǒng)，例如瓊脂糖凝膠、熒光讀出器(readouts)例如Genescan分析、夾心雜交測(cè)定(Sandwichhybridizationassays)、DNA染色齊!]例如溴化乙錠、Sybr綠、抗體檢測(cè)、ELISA平板讀數(shù)器型裝置、熒光計(jì)裝置；IV.特異性或多種基因組擴(kuò)增片段的實(shí)時(shí)PCR定量或?qū)ζ涞娜魏巫兏?；V.在WO2004/065625中列出的任何檢測(cè)系統(tǒng)，例如熒光珠、酶交聯(lián)物、放射性珠等；VI.利用擴(kuò)增步驟的其它任何檢測(cè)系統(tǒng)，例如連接酶鏈反應(yīng)或等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)例如鏈置換擴(kuò)增(SDA).VII.生物傳感器技術(shù)適用于本發(fā)明，例如以TheTexasA&MUniversitySystem為申請(qǐng)人的US6426231和US6916665以及以UniversityofMassachusetts為申請(qǐng)人的US6824659，其以引用的方式并入本文中。嵌入性核酸嵌入性核酸(INA)是非天然存在的多核苷酸，其可與具序列特異性的核酸(DNA和RNA)雜交。在基于探針或引物的雜交測(cè)定中，INA是作為核酸探針和引物的替換物/替代物的候選者，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出多種合乎需要的特性。INA是多聚物，其與雜交核酸而形成比相應(yīng)天然存在的核酸/核酸復(fù)合物熱力學(xué)更加穩(wěn)定的雜交體，它們不是已知降解肽或核酸的酶的底物。因此，相比天然存在的核酸片段，INA在生物樣品中應(yīng)該更穩(wěn)定，而且比天然存在的核酸片段具有更長(zhǎng)的貯存期。與非常依賴(lài)于離子強(qiáng)度的核酸雜交不同，INA與核酸的雜交完全獨(dú)立于離子強(qiáng)度而且在低離子強(qiáng)度及非常不利于天然存在的核酸與核酸雜交的條件下，仍然有利地進(jìn)行。INA的結(jié)合強(qiáng)度依賴(lài)于分子中設(shè)計(jì)的嵌入基團(tuán)的數(shù)量以及來(lái)自雙鏈結(jié)構(gòu)中以特異性方式聚集的堿基之間的氫鍵的常規(guī)相互作用。INA識(shí)別DNA較之DNA識(shí)別DNA，對(duì)序列區(qū)分的效率更高。優(yōu)選地，INA是(S)-l-0-(4,4'-二甲氧三苯基甲基)-3-0-(l-異戊二烯基甲基)-丙三醇的亞磷酰胺。INA以商業(yè)上可行的形式通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成步驟的改造而合成。INA的完整定義及其合成可以在WO03/051901、WO03/052132、WO03/052133和WO03/052134(HumanGeneticSignaturesPtyLtd)中査到，其均以引用的方式并入本文中。INA探針和引物與標(biāo)準(zhǔn)核酸探針和引物之間的確存在許多差異。這些差異可以很方便地分為生物、結(jié)構(gòu)及其理化差異。如上文以及下文所討論的，當(dāng)在通常已采用了核酸的應(yīng)用中嘗試?yán)肐NA探針和引物時(shí)，這些生物、結(jié)構(gòu)以及理化差異可能導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的結(jié)果。在化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
中，常常觀察到不同組合物的這種不等價(jià)性。關(guān)于生物差異，核酸是在活物種的生命中作為遺傳傳遞和表達(dá)的因子而發(fā)揮重要作用的生物物質(zhì)，已經(jīng)相當(dāng)充分的理解了其在體內(nèi)的性質(zhì)。然而INA是最近開(kāi)發(fā)的完全人工的分子，由化學(xué)家想象而且利用合成有機(jī)化學(xué)制備，其不具備已知的生物學(xué)功能。結(jié)構(gòu)上，INA也與核酸顯著不同。盡管兩者均可利用常規(guī)核苷酸堿基(A、C、G、T禾[IU)，這些分子的組成在結(jié)構(gòu)上是不同的。RNA、DNA和INA的主鏈由重復(fù)的核糖磷酸二酯以及2-脫氧核糖單元構(gòu)成。INA與DNA或RNA的區(qū)別在于具有一個(gè)或多個(gè)大的扁平分子，其借助連接分子連接于多聚體。雙鏈結(jié)構(gòu)中，該扁平分子嵌入到雙鏈結(jié)構(gòu)中與INA相對(duì)的互補(bǔ)DNA鏈中的堿基之間。INA與DNA或RNA之間的物理/化學(xué)差異也很大。INA結(jié)合于互補(bǔ)DNA比核酸探針或引物結(jié)合于相同靶序列更加迅速。與DNA或RNA片段不同，INA與RNA結(jié)合很弱，除非嵌入基團(tuán)位于末端位置。由于嵌入基團(tuán)與互補(bǔ)DNA鏈上的堿基之間的強(qiáng)烈相互作用，INA/DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性高于類(lèi)似的DNA/DNA或RNA/DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性。與其它核酸例如DNA或RNA片段或者PNA不同，INA沒(méi)有表現(xiàn)出自我聚集或結(jié)合的性質(zhì)?？傊?，由于INA與具序列特異性的核酸雜交，所有INA是開(kāi)發(fā)基于探針或引物的測(cè)定的有用候選物，尤其適合于試劑盒以及篩選測(cè)定。然而，INA探針和引物不等于核酸探針和引物。因此，任何可提高基于探針或引物的測(cè)定法的特異性、敏感性以及可靠性的方法、試劑盒或組合物，在含有DNA樣品的檢測(cè)、分析和定量中均有用。INA具有用于本發(fā)明目的的必要特性。HPV和癌基因組標(biāo)記利用臨床樣品和細(xì)胞系，本發(fā)明人對(duì)幾乎400種人類(lèi)基因的調(diào)控區(qū)的甲基化模式進(jìn)行了觀察，并發(fā)現(xiàn)超過(guò)60種當(dāng)處于癌狀態(tài)并且HPV存在時(shí)具有甲基化的改變的基因組標(biāo)記。實(shí)例包括，但不限于一種或多種下列基因組區(qū)域內(nèi)、或附近、轉(zhuǎn)錄單位(基因)，稱(chēng)為CD14、ENDRB、HIC、RARB1、PGR、SFRS8、TMSBIO、ABCG2、MFNG、LAMR1、RAGE、ABL1、CRBP、GPR37、HRK、RARA、SYK、ECE1、MME、TEM、NF2、XIAPHSXll、RARRES1、FLIl、HTLF、LDHB、RB1、TGD、CDK4、MMP14、RAB32、BARD1、NF1、LIM2、MMP2、DAB2、BMP6、CDKN1C、DAB2IP、L麗B1、MMP28、HAI2、S0CS1、HIC2、MSH6、RIN2、HMGA1、JUN、S100P*、SRF、VDR、DKK3、KRAS2、PLAU、TNFRSF腦、CDH1、MAC30、DDB2、PAX6、AXL、EIF4A2、SLIT2、RECK、TERC、GATA5、STAT1。疾病狀態(tài)本發(fā)明人采用HPV和宮頸癌中所選的人類(lèi)基因組區(qū)的甲基化作為證明本發(fā)明的實(shí)例。應(yīng)了解其它狀態(tài)例如各種形式的癡呆(阿爾茨海默病)可以有傳染性的組分，例如單純皰疹病毒類(lèi)型1(2004，NeurobiologyofAging，25，619-627;Itzhaki，R.F.，etal.);與冠狀病毒相關(guān)SARS肺炎有關(guān)的臨床進(jìn)展和病毒負(fù)荷(2003,TheLancet,361，1767-1772,Peiris，J.S.M.metal.,);人免疫缺陷病毒HIV以及免疫系統(tǒng)障礙和幾種基于病毒的出血熱(2004,NatureMedicine,10,570-576，Weiss,R.A.，etal.，)；包括尼帕病毒(Nipahvirus)、副流感病毒(parainfluenza)和腮腺炎病毒(Mumps)的副粘病毒科病毒，其與各種呼吸系統(tǒng)疾病、腮腺炎、腦膜炎、胰腺炎、腦炎和麻疹有關(guān)。1999年被首次識(shí)別尼帕病毒，其在70%的感染患者中引起患致命的腦炎，并且具有非常廣泛的宿主范圍包括人類(lèi)、犬、貓、豬、馬、倉(cāng)鼠、蝙蝠和豚鼠。它是全球健康和經(jīng)濟(jì)的重要威脅(2005,Nature,436,401-405;Negrete，O.A.,etal，)；黃病毒科病毒，其包括登革病毒、黃熱病病毒、丙型肝炎病毒和庚型肝炎病毒，其與腦炎、肝炎和休克綜合征有關(guān)。例如，丙型肝炎病毒是全世界超過(guò)一億七千萬(wàn)人感染的慢性肝病的主要原因，而且沒(méi)有有效的疫苗(2005,Science,309，623-626;Lindenbach,B.D.，etal，)，最后是皰疹病毒科病毒，其包括人皰疹病毒1至8。這些病毒可以引起口腔感染、角膜潰瘍、生殖道感染、腦膜炎、水痘、肺炎、帶狀皰疹、巨細(xì)胞病毒性單核細(xì)胞增多癥和腦炎。人巨細(xì)胞病毒在免疫障礙個(gè)體包括器官移植個(gè)體中引起嚴(yán)重的致命疾病(2003,Nature,424,456-461;Wang,X.，etal,)，其也是在人類(lèi)以及各種動(dòng)物中作為健康狀態(tài)的進(jìn)展的本發(fā)明的候選者，其可以通過(guò)病毒存在和宿主DNA甲基化狀態(tài)的組合來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。相似的實(shí)例來(lái)自植物病毒和類(lèi)病毒。實(shí)施例HPVHPV和宮頸癌將用于下列實(shí)例來(lái)證明本發(fā)明。應(yīng)了解如上文所列的其它病毒和疾病狀態(tài)也可以通過(guò)本發(fā)明進(jìn)行測(cè)定。為了重申本發(fā)明人計(jì)算機(jī)模擬的(insilico)生物信息學(xué)分析所基于的基礎(chǔ)，在本文中用作參考目的的標(biāo)準(zhǔn)HPV型是乳多空病毒科(Papovaviridae)乳頭瘤病毒屬(Papillomavirus)的HPV16,其最初是由國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(ICTV)所如此命名的(1993,VanRast,M.A.,etal.,PapillomavirusRep，4,61-65;seealso,1998Southern,S.A.andHerrington,C.S.Sex.Transm.Inf.74,101-109)。盡管分類(lèi)學(xué)升級(jí)到乳頭瘤病毒科，但是在現(xiàn)有技術(shù)中常常互換使用。為了避免含糊不清，本發(fā)明人用己完全測(cè)序的HPV167卯4個(gè)堿基對(duì)的基因組作為標(biāo)準(zhǔn)比較(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBIlocusNC—001526;版本NC—001526.1;GI:9627100;references,Medline,91162763和85246220;PubMed1848319和2990099)。另外，本發(fā)明人使用所謂的高風(fēng)險(xiǎn)HPV型16、18、45和56的已完全測(cè)序的基因組，其N(xiāo)CBI登錄號(hào)分別是NC-001526、NC-001357、NC掘590和NC-001594。本發(fā)明人使用所謂的中度風(fēng)險(xiǎn)HPV型30、31、33、35、39、51、52、58和66的已完全測(cè)序的基因組，其N(xiāo)CBI登錄號(hào)分別是NC-001585,NC-001527,NC-001528,NC-001529,NC-001535,NC-001533,NC-001592,NC-001443andNC-001695。本發(fā)明人使用所謂的低度風(fēng)險(xiǎn)HPV型6、11、42、43、44、53、54和55的已完全測(cè)序的基因組，其N(xiāo)CBI登錄號(hào)分別是NC-000904、NC-001525、NC-001534、NC-005349、NC-001689、NC-001593、NC-001676和NC-001692。如本發(fā)明人所證實(shí)的，許多技術(shù)、方法和臨床的問(wèn)題阻礙了通過(guò)常規(guī)DNA實(shí)驗(yàn)對(duì)各種臨床樣品中的人乳頭瘤病毒DNA的檢測(cè)。本發(fā)明為現(xiàn)有技術(shù)中所面臨的許多困難提出了解決方案。因?yàn)镠PVDNA的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化降低了HPV衍生物序列庫(kù)(derivativesequencepool)的復(fù)雜性，復(fù)雜性降低使樣品中不同HPV型的初期篩選更加有效，因此可以更加適當(dāng)和準(zhǔn)確的與臨床資料相結(jié)合。利用申請(qǐng)人所開(kāi)發(fā)的方法對(duì)樣品中HPV進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)例可以在人類(lèi)遺傳標(biāo)記控股有限公司為申請(qǐng)人的WO2006/066353(PCT/AU2005/001963)中查到，其以引用的方式并入本文中。圖1表示對(duì)各種正常個(gè)體以及高度鱗狀上皮內(nèi)病變的個(gè)體和存在HPV的細(xì)胞系進(jìn)行測(cè)試結(jié)果。提供的該數(shù)據(jù)補(bǔ)充了圖1中來(lái)自對(duì)患者的數(shù)據(jù)，該患者已測(cè)試了HPV以及400個(gè)人類(lèi)基因組區(qū)域的甲基化狀態(tài)。表2在從三種主要風(fēng)險(xiǎn)類(lèi)型的不同HPV衍生物中產(chǎn)生的擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物堿基對(duì)中預(yù)期片段大小。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>HPV和各種人類(lèi)基因組區(qū)域的甲基化狀態(tài)同時(shí)存在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以證實(shí)HPV的存在連同特定基因組區(qū)域的甲基化狀態(tài)一起與任一單獨(dú)特征比較是更加有效的健康狀態(tài)的預(yù)后指標(biāo)。以此方式，對(duì)樣品的大量基因組區(qū)域的甲基化狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定，所述樣品來(lái)自宮頸細(xì)胞學(xué)正常的個(gè)體，來(lái)自宮頸細(xì)胞學(xué)具有高度鱗狀上皮內(nèi)病變特征的個(gè)體，以及來(lái)自根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)癌指標(biāo)其宮頸細(xì)胞學(xué)是正常的但基于細(xì)胞學(xué)特征推斷是HPV陽(yáng)性的個(gè)體。圖1A表示HeLa細(xì)胞系、如病理學(xué)家所確定的表現(xiàn)出HSIL的兩個(gè)患者(稱(chēng)為HSIL-1和HSIL-2)、具有正常宮頸形態(tài)但是根據(jù)病理表型推斷存在HPV的一個(gè)患者(稱(chēng)為HPV+Nor)，它們都是如利用適當(dāng)?shù)腜CR擴(kuò)增技術(shù)所確定的HPV存在陽(yáng)性。具有正常宮頸形態(tài)的兩個(gè)患者(稱(chēng)為Normal-l和Normal-2)是高等風(fēng)險(xiǎn)HPV型存在陰性的。圖lB表示HeLa細(xì)胞系中存在條帶(擴(kuò)增子)(泳道1)，其含有HPV18型DNA序列。兩個(gè)HSIL樣品(泳道2和#)含有如分子測(cè)定的HPV16。發(fā)現(xiàn)病理學(xué)家確定為形態(tài)正常但其中一些細(xì)胞具有作為HPV感染指標(biāo)的特征性胞質(zhì)特點(diǎn)的宮頸組織為HPV型82(泳道4)陽(yáng)性的。然后在每個(gè)基因座測(cè)試這些臨床樣品的甲基化存在(稱(chēng)為pos)或非甲基化(稱(chēng)為neg)。例如，關(guān)鍵的預(yù)后指標(biāo)是病理正常的患者具有非甲基化基因座，而高度鱗狀上皮內(nèi)病變的患者在相同區(qū)域具有甲基化；簡(jiǎn)言之，在發(fā)展到癌狀態(tài)的過(guò)程中相關(guān)基因區(qū)域已沉默。(反之同樣適用。正常細(xì)胞學(xué)個(gè)體在特定細(xì)胞型中有基因座被甲基化，而在癌狀態(tài)中該基因座變?yōu)槲醇谆?。因?yàn)樘囟ɑ蚪M區(qū)域的甲基化隨細(xì)胞型而變化，所以一些基因組區(qū)域?qū)τ谔囟?xì)胞型中癌狀態(tài)的發(fā)展必然是不具有任何信息的。這些區(qū)域在所有樣品中或者完全未甲基化，或在所有臨床樣品中完全甲基化。表3A和3B表示許多臨床樣品和HeLa細(xì)胞系的HPV狀態(tài)，以及53個(gè)個(gè)體的人類(lèi)基因組區(qū)域的甲基化狀態(tài)。如從表3A和3B所看到的，HeLa宮頸癌細(xì)胞系和高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)兩者都是根據(jù)分子確定的HPVDNA存在陽(yáng)性。一個(gè)非癌但病理學(xué)推斷為HPV感染的宮頸組織樣品(稱(chēng)為HPV+Nor)也被發(fā)現(xiàn)是HPV存在陽(yáng)性。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)來(lái)自不同個(gè)體的正常宮頸組織樣品為如分子所確定的HPVDNA序列存在陰性。上述每個(gè)區(qū)域都經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生的擴(kuò)增子用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶?和/或測(cè)序)以確定特定基因組區(qū)域的甲基化狀態(tài)(表3A和3B)。首先，存在對(duì)于預(yù)后指標(biāo)沒(méi)有任何信息的基因組區(qū)域。在所有樣品(13個(gè)基因組區(qū)域ABCG2至VHL)中這些區(qū)域未甲基化，或者是在所有樣品(4個(gè)基因組區(qū)域，CD34、MAGEA2、MAGEA3和MINT31)中已甲基化。對(duì)表3A和3B的結(jié)果中稱(chēng)為CD14、ENDRB、HIC和RARB的基因組區(qū)域特別有趣。所有上述這些區(qū)域在HeLa宮頸癌細(xì)胞學(xué)和兩個(gè)HSIL樣品中都是甲基化的。有趣的是，在經(jīng)測(cè)試的正常宮頸組織或感染HPV的非癌宮頸組織樣品中，這些區(qū)域都不是甲基化的。最后，32個(gè)基因組區(qū)域ANAX7至TNFRS10B在正常個(gè)體和具有HSIL的個(gè)體之間表現(xiàn)出可變的甲基化模式。該變化極有可能反映患者個(gè)體的遺傳背景與在人類(lèi)基因組的個(gè)體基因座中甲基化狀態(tài)的不同穩(wěn)定性的混合。該結(jié)果表明盡管在幾乎所有HSIL和宮頸癌中己經(jīng)檢測(cè)到HPV存在，但是僅HPV存在不是宮頸高度異常情況的可靠指標(biāo)。然而，將HPV存在與宮頸DNA樣品的甲基化特征譜(methylationprofile)中的變化聯(lián)系起來(lái)時(shí)，其給出了更好的疾病狀態(tài)的預(yù)后指標(biāo)。表3A<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>ND二未確定除了基因組區(qū)域CD14、ENDRB、HIC和RARB甲基化以外，本發(fā)明人還鑒定了其他62個(gè)DNA基因組區(qū)域，其表現(xiàn)出與HSIL樣品中CD14、ENDRB、HIC和RARB相似的甲基化特征譜，但是與來(lái)自384個(gè)候補(bǔ)基因的正常宮頸組織或感染HPV的正常宮頸組織中的不同。這些標(biāo)記物列于表4中。表4經(jīng)測(cè)定作為潛在標(biāo)記物的基因組區(qū)域及其相應(yīng)的基因庫(kù)登錄號(hào)<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>圖2表示利用HGSHR-HPVDNA純化和檢測(cè)試劑盒對(duì)36個(gè)LBC樣品的人類(lèi)基因組DNA和HPVDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。從結(jié)果中可以看出，采用該方法可以同時(shí)測(cè)定存在人類(lèi)基因組改變以及病毒存在與否。圖3表示正常宮頸樣品在16個(gè)不同基因座進(jìn)行擴(kuò)增，然后經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶BstUl和Taqal組合消化，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的代表性凝膠。從液基細(xì)胞學(xué)樣品(在此編號(hào)為28和29)中提取DNA，經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾，然后用所鑒定基因的巢式引物進(jìn)行擴(kuò)增用于進(jìn)一步分析。這些基因從左到右分別是1)TEM2)MME3)ECE14)SYK5)RARA6)HRK7)GPR378)CRBP9)ABL110)RAGE11)LAMR112)MFNG13)ABCG214)TMSBIO15)SFRS8和16)PGR。病理學(xué)家對(duì)樣品的病理學(xué)和HPV感染譜(infectionprofile)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。當(dāng)擴(kuò)增子中CpG二核苷酸未甲基化時(shí)，亞硫酸氫鹽修飾將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基，擴(kuò)增后轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶堿基。因未保留未甲基化的CpG二核苷酸和限制性位點(diǎn)，因此不會(huì)被核酸內(nèi)切酶BstUl(識(shí)別CGCG，如果樣品未甲基化，其在擴(kuò)增后將轉(zhuǎn)化成TGTG，但是如果樣品中含有甲基化的序列，其將會(huì)保持CGCG)或Taqal(識(shí)別TCGA，如果樣品未甲基化，其在擴(kuò)增后將轉(zhuǎn)化成TTGA，但是如果樣品中含有甲基化的序列，其將保持TCGA)識(shí)別。單一條帶表示未消化的PCR產(chǎn)物，因此檢測(cè)到單一條帶則意味著擴(kuò)增子中CpG二核苷酸是未甲基化的。甲基化的CpG二核苷酸對(duì)亞硫酸氫鹽修飾具抗性，因此保留了限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的限制性位點(diǎn)。因此，根據(jù)擴(kuò)增子中可用的CpG位點(diǎn)的數(shù)量，將PCR產(chǎn)物消化成多個(gè)片段(如星號(hào)所示的)。檢測(cè)到空泳道表明PCR反應(yīng)不成功。在這些16個(gè)基因座中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到多條帶。該分析的代表性結(jié)果列于表5。表5從病理學(xué)正常的宮頸樣品中提取的DNA樣品的甲基化特征譜<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>許多代表性的病理學(xué)正常的宮頸樣品(NORM)的甲基化特征譜，其中有一些可能是HPV感染(NORMHPV)。從液基細(xì)胞學(xué)樣品中提取DNA，經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾，然后對(duì)384個(gè)不同的基因進(jìn)行擴(kuò)增。用限制性酶消化擴(kuò)增子并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。檢測(cè)到單產(chǎn)物(未消化的產(chǎn)物)表示所詢(xún)問(wèn)基因的啟動(dòng)子區(qū)為未甲基化(U)。檢測(cè)到多條帶(消化產(chǎn)物)意味著所詢(xún)問(wèn)基因的啟動(dòng)子區(qū)為甲基化(M)。在特異性基因組中(稱(chēng)為"F")沒(méi)有條帶則推斷PCR反應(yīng)不成功。還列出了高度和中度風(fēng)險(xiǎn)乳頭瘤病毒DNA的存在(+)或不存在(-)。包括了擴(kuò)增人GST-P1基因和鼠GST-P1基因兩者(HmGST)的引物，作為PCR反應(yīng)的對(duì)照。檢測(cè)到條帶則推斷DNA已轉(zhuǎn)化并可用于擴(kuò)增。圖4表示腫瘤樣品在16個(gè)不同基因座進(jìn)行擴(kuò)增，然后經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶BstUl和Taqal組合消化，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的代表性凝膠。從液基細(xì)胞學(xué)樣品(在此編號(hào)為82、83、84、94、95和96)中提取DNA，經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾，然后用所鑒定基因的巢式引物進(jìn)行擴(kuò)增用于進(jìn)一步分析。這些基因從左到右分別是1)PGR2)SFRS83)TMSBIO4)ABCG25)MFNG6)LAMR17)RAGE8)ABL19)CRBP10)GPR3711)HRK12)RARA13)SYK14)ECE115)MMEand16)TEM。病理學(xué)家對(duì)樣品的病理學(xué)和HPV感染譜進(jìn)行了評(píng)價(jià)。當(dāng)擴(kuò)增子中CpG二核苷酸未甲基化時(shí)，亞硫酸氫鹽修飾將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基。未甲基化的CpG二核苷酸和限制位點(diǎn)沒(méi)有保留，因此不會(huì)被核酸內(nèi)切酶BstUl或Taqal識(shí)別。檢測(cè)到單一條帶表示未消化的PCR產(chǎn)物，因此意味著擴(kuò)增子中CpG二核苷酸是未甲基化的。甲基化的CpG二核苷酸對(duì)被亞硫酸氫鹽修飾具有抗性，因此保留了限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的限制性位點(diǎn)。因此，根據(jù)擴(kuò)增子中可用的CpG位點(diǎn)的數(shù)量，將PCR產(chǎn)物消化成多個(gè)片段(如星號(hào)所示的)。檢測(cè)到空泳道表明PCR反應(yīng)不成功。與正常樣品(見(jiàn)圖4)相比較，腫瘤樣品中更多比例的基因都是甲基化的。該分析的代表性結(jié)果列于表6中。在表6中，許多代表性的病理學(xué)異常的宮頸樣品(如病理學(xué)家所評(píng)價(jià)的)的甲基化特征譜?；谌巳轭^瘤病毒(HPV)的存在和病變類(lèi)型(低度LG，低度LG乳頭瘤病毒LGHPV，以前的高度PrHG，高度HG，高度原位癌3組分和原位癌3病變CIN3)對(duì)樣品進(jìn)行了分類(lèi)。從液基細(xì)胞學(xué)樣品中提取DNA，經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾，然后對(duì)384個(gè)不同的基因進(jìn)行擴(kuò)增。用限制性酶消化擴(kuò)增子并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。檢測(cè)到單個(gè)產(chǎn)物(未消化的產(chǎn)物)則表示所詢(xún)問(wèn)基因的啟動(dòng)子區(qū)為未甲基化(U)。檢測(cè)到多條帶(消化產(chǎn)物)則代表所詢(xún)問(wèn)基因的啟動(dòng)子區(qū)為甲基化(M)。在特異基因組(稱(chēng)為"F")沒(méi)有條帶則推斷PCR反應(yīng)不成功。表6:從病理學(xué)不利的宮頸樣品中提取的DNA樣品的甲基化特征譜<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>C68C83C85C61C71C82C67C74C84C53C56C62C50C58C89C93C94C96C4C65C95HPVHPVHPVLGLGLGLGLGLGPrPrPrHGHGHGHGHGHGCIN3CIN3HPVHPVHPVH(3H(3H6CIN3CIN3CIN3SLIT2UMUUUUUUUUUFUUFMMMNTUURECKMMUUFMMFMFMMUUUUUUNTUMTERCFFFFFFFFFUUMUFFFFFNTFFGATA5MMUUUMMMMUMMMUMUMMNTMMSTAT1UMUUUUFUUUUFUUUUUUNTUUHPVUni-++++++-+.....+NT-+HmGSTUUUUUUUUUUUUUUUUUUNTUU、表7患者病理學(xué)列表<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>表7表示對(duì)64個(gè)不同基因座的DNA甲基化特征譜進(jìn)行調(diào)査的樣品的病理學(xué)。從預(yù)先確定病理學(xué)的96位患者的液基細(xì)胞學(xué)樣品中提取DNA。病理學(xué)家所評(píng)價(jià)的樣品的相應(yīng)病理學(xué)與病理學(xué)類(lèi)型、發(fā)病程度以及人乳頭瘤病毒感染的存在與否有關(guān)。將樣品標(biāo)記為細(xì)胞學(xué)正常(NORM)、可能有HPV感染(HPV)、細(xì)胞學(xué)正常可能伴有HPV感染(HPVNORM)、低度病變而且伴有HPV感染(LGHPV)、高度病變(LG)、增強(qiáng)的高度病變(INCHG)、以前的高度病變(PrHG)、原位癌1病變可能伴有HPV感染、高度原位癌3病變(HGCIN3)、高度癌(HGCx)、鱗狀上皮細(xì)胞癌(SCQ、鱗狀上皮細(xì)胞癌(carcinoma/cancer)(SCCCx)、腺癌(ACCx)、子宮內(nèi)膜癌(CaEndomet)、腺癌/原位腺癌(AC/AIS)。表8示出了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的基因或基因組區(qū)域，其是用于本發(fā)明的疾病狀態(tài)的適當(dāng)?shù)闹笜?biāo)。應(yīng)了解本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊锘蛱结榿?lái)檢測(cè)上述基因或基因組區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)改變，并且與檢測(cè)病毒核酸的存在相結(jié)合。表8適合本發(fā)明的疾病基因或基因組區(qū)域<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，在不背離廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍的情況下，可以對(duì)如在具體實(shí)施方案中所示的本發(fā)明進(jìn)行多種變化和/或更改，因此，應(yīng)認(rèn)為本實(shí)施方案在所有方面是說(shuō)明性的而非限制性的。權(quán)利要求1.確定受試者健康狀態(tài)的測(cè)定法，包括用能修飾核酸中未甲基化的胞嘧啶的試劑處理受試者樣品，其中樣品中病毒核酸和基因組核酸經(jīng)處理形成衍生病毒核酸和衍生基因組核酸；測(cè)定所述處理樣品中衍生病毒核酸的存在；以及確定所述處理樣品中所述衍生基因組核酸中基因組靶標(biāo)的狀態(tài)，其中一個(gè)或多個(gè)所述衍生病毒核酸的存在和所述基因組靶標(biāo)的狀態(tài)可指示健康狀態(tài)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定法，還包括在所述測(cè)定和確定步驟之前，擴(kuò)增至少部分所述衍生病毒核酸和部分衍生基因組核酸。3.確定受試者健康狀態(tài)的測(cè)定法，包括用修飾未甲基化胞嘧啶的試劑處理含有病毒核酸和基因組核酸的受試者樣品，以形成具有胞嘧啶數(shù)減少但具有與對(duì)應(yīng)的未處理病毒核酸和未處理基因組核酸的堿基總數(shù)基本上相同的衍生病毒核酸和衍生基因組核酸；獲得病毒特異性核酸分子；獲得具有基因組靶標(biāo)的核酸分子；測(cè)試病毒特異性核酸分子的存在；以及確定經(jīng)處理和擴(kuò)增的樣品中基因組耙標(biāo)的狀態(tài)，其中檢測(cè)到一個(gè)或多個(gè)病毒特異性核酸分子和靶標(biāo)的狀態(tài)指示了受試者的健康狀態(tài)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)定法，其中通過(guò)擴(kuò)增衍生病毒核酸和衍生基因組核酸獲得所述病毒特異性核酸分子和具有基因組靶標(biāo)的核酸分子。5.確定受試者健康狀態(tài)的測(cè)定法，包括用修飾未甲基化胞嘧啶的試劑處理受試者樣品以形成衍生核酸；提供能夠允許將期望的病毒核酸分子擴(kuò)增為所述衍生核酸的引物；提供能夠允許將靶基因組核酸分子擴(kuò)增為所述衍生核酸的引物；對(duì)所述衍生核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；以及測(cè)定擴(kuò)增的期望病毒核酸和擴(kuò)增的靶基因組核酸的存在，其中一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在或不存在指示受試者的健康狀態(tài)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測(cè)定法，包括測(cè)定含有所述期望的病毒特異性核酸分子的擴(kuò)增核酸產(chǎn)物的存在，其中檢測(cè)到所述期望的病毒特異性核酸分子指示樣品中存在該病毒。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的測(cè)定法，包括測(cè)定含有所述耙核酸分子的擴(kuò)增核酸產(chǎn)物的存在，其中檢測(cè)到所述靶核酸分子指示樣品中基因組或基因的狀態(tài)。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中所述試劑將未甲基化的胞嘧啶修飾成尿嘧啶。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的測(cè)定法，其中所述試劑選自亞硫酸氫鹽、醋酸鹽或檸檬酸鹽。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的測(cè)定法，其中所述試劑是亞硫酸氫鈉。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中所述靶基因組核酸對(duì)一個(gè)基因或多個(gè)基因或調(diào)控區(qū)例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子、或基因組的任何編碼或非編碼、或靜止或可動(dòng)的區(qū)域是特異性的。12.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的測(cè)定法，其中所述耙標(biāo)具有甲基化特征。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的測(cè)定法，其中所述甲基化特征是基因組核酸的甲基化區(qū)域或未甲基化區(qū)域。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中所述病毒與疾病狀態(tài)例如癌癥有關(guān)。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的測(cè)定法，其中所述病毒選自如下組成的組人乳頭瘤病毒、肝炎病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、人皰疹病毒(HHV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒以及腺病毒。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的測(cè)定法，其中所述基因組靶標(biāo)與疾病狀態(tài)例如癌癥有關(guān)。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的測(cè)定法，其中所述基因組耙標(biāo)選自下列區(qū)域組成的組CD14、ENDRB、HIC、RARB1、PGR、SFRS8、TMSBIO、ABCG2、MFNG、LAMR1、RAGE、ABL1、CRBP、GPR37、HRK、RARA、SYK、ECE1、MME、TEM、NF2、XIAPHSXll、RARRES1、FLIl、HTLF、LDHB、RB1、TGD、CDK4、MMP14、RAB32、BARD1、NF1、LIM2、MMP2、DAB2、BMP6、CDKN1C、DAB2IP、L固B1、MMP28、HAI2、SOCSl、HIC2、MSH6、腿2、固GA1、JUN、S100P承、SRF、VDR、DKK3、KRAS2、PLAU、TNFRSF10B、CDH1、MAC30、DDB2、PAX6、AXL、EIF4A2、SLIT2、RECK、TERC、GATA5以及STAT1。18.確定受試者健康狀態(tài)的測(cè)定法，包括用亞硫酸氫鹽試劑在使病毒核酸和基因組核酸中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶的條件下處理受試者樣品，形成所述衍生病毒核酸和衍生基因組核酸；為樣品提供能夠結(jié)合到所述衍生病毒核酸區(qū)域的引物，所述引物能夠允許擴(kuò)增所述衍生病毒核酸中期望的病毒特異性核酸分子；為樣品提供能夠結(jié)合到所述衍生基因組核酸區(qū)域的引物，所述引物能夠允許擴(kuò)增所述衍生基因組核酸中期望的耙基因組特異性核酸分子；對(duì)所述處理樣品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；以及測(cè)定擴(kuò)增的病毒核酸產(chǎn)物和擴(kuò)增的基因組核酸靶標(biāo)的存在，其中檢測(cè)到產(chǎn)物和靶標(biāo)中的一個(gè)或兩者指示了受試者的健康狀態(tài)。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的測(cè)定法，還包括測(cè)試存在病毒的樣品以確定樣品中病毒的型、亞型、變體或基因型。20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的測(cè)定法，其中所述擴(kuò)增通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或等溫?cái)U(kuò)增來(lái)進(jìn)行。21.篩選受試者潛在的宮頸癌的測(cè)定法，包括用亞硫酸氫鹽試劑在使人乳頭瘤病毒(HPV)和基因組核酸中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶的條件下處理受試者樣品，以形成衍生HPV核酸和衍生基因組核酸；提供能夠結(jié)合到衍生HPV核酸區(qū)域的引物，所述引物能夠允許擴(kuò)增所述衍生HPV核酸中期望的HPV特異性核酸分子；提供能夠結(jié)合到衍生基因組核酸區(qū)域的引物，所述引物能夠允許擴(kuò)增所述衍生基因組核酸中期望的基因組特異性核酸分子；對(duì)所述衍生HPV核酸和衍生基因組核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；以及測(cè)定擴(kuò)增的HPV核酸產(chǎn)物和擴(kuò)增的基因組核酸產(chǎn)物的存在，其中檢測(cè)到該產(chǎn)物中的一種或兩者指示受試者發(fā)展為宮頸癌的狀態(tài)。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的測(cè)定法，還包括測(cè)定存在HPV的樣品，以確定樣品中HPV的型、亞型、變體或基因型。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的測(cè)定法，其中所述樣品選自如下組成的組拭樣、活組織切片、涂片、巴氏涂片、表面刮片、壓舌板取樣和液體樣品，以及來(lái)自各種貯存介質(zhì)，例如冷凍材料、石蠟塊、載玻片、法醫(yī)標(biāo)本系統(tǒng)和檔案材料的樣品。全文摘要本發(fā)明涉及用檢測(cè)病毒的存在與檢測(cè)指示健康狀態(tài)的基因組靶標(biāo)或標(biāo)記的存在的組合來(lái)檢測(cè)確定受試者健康狀態(tài)的測(cè)定法。文檔編號(hào)G01N33/574GK101292046SQ200680038845公開(kāi)日2008年10月22日申請(qǐng)日期2006年9月14日優(yōu)先權(quán)日2005年9月14日發(fā)明者喬治·L·加博爾·米克洛斯,約翰·R·梅爾基,道格拉斯·斯潘塞·米勒申請(qǐng)人:人類(lèi)遺傳標(biāo)記控股有限公司