專利名稱：功能性體外免疫測定的制作方法
功能性體外免疫測定
本發(fā)明涉及用于體外監(jiān)測物質(zhì)在體內(nèi)過程中的效應(yīng)的方法，以及用于 鑒定免疫調(diào)節(jié)化合物和/或用于檢測免疫調(diào)節(jié)化合物的效應(yīng)及用于鑒定在體 內(nèi)過程中通過免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)調(diào)亡和/或壞死的化合物的體外檢測方法。
近年，在制藥工業(yè)中已經(jīng)開發(fā)了全新類別的物質(zhì)，這些物質(zhì)欲用于很
多不同疾病的治療。這還包括基因治療的手段(Mittel)或已經(jīng)過基因治療 修飾的機體中天然存在的物質(zhì)(例如蛋白質(zhì)或DNA構(gòu)建體)。
因為迄今為止還沒有在疾病的藥物治療中應(yīng)用這些全新類別的物質(zhì)中 的某些物質(zhì)的經(jīng)驗，因此對于在不需直接求助于動物試驗或?qū)颊哌M行臨 床研究的情況下檢測這些手段的效力的方法存在需求。這種使用新的、未 知物質(zhì)的試驗單純由于倫理因素受到禁止。相反，在該步驟的準備過程 中，表明了體外研究能夠獲得反映物質(zhì)的體內(nèi)效力的結(jié)果。在這一點上， 在體外試驗中必須盡可能近地接近體內(nèi)狀態(tài)。
此外，開發(fā)用于對接受治療方法(例如免疫療法或影響免疫系統(tǒng)的治 療)之前、期間和/或之后的患者進行監(jiān)測的簡單方法是重要的，從而可以 在相應(yīng)的治療方法中研究生物體或免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。
同時，用于癌癥的傳統(tǒng)治療方法(例如放療和化療)代表了自19世紀50 年代以來用于治療有轉(zhuǎn)移的晚期癌癥的唯一選擇，本發(fā)明的一個目的是開 發(fā)對患者具有更少副作用但能夠高效地達到治療目的的療法。
其中一種方法是免疫療法，其目標是通過遺傳工程修飾加強對癌癥的 天然免疫應(yīng)答，即影響免疫系統(tǒng)對癌癥細胞的"注意力"從而影響免疫應(yīng) 答以通過機體本身與腫瘤進行斗爭。
當前，大多數(shù)臨床研究是基于腫瘤的去除、隨后通過治療性基因?qū)δ[ 瘤細胞進行離體轉(zhuǎn)染、腫瘤細胞群的放射、并繼以經(jīng)修飾的腫瘤細胞的再 植入。這種腫瘤細胞接種允許抗腫瘤應(yīng)答根據(jù)轉(zhuǎn)染的治療性基因增加至不 同的程度。
然而，除了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染外，也正在開發(fā)用于誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)與腫瘤 細胞進行斗爭的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。這些免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)誘導(dǎo)或"程序化"免疫系統(tǒng)使腫瘤細胞被特異性地攻擊并最終被消滅。在該方法中，癌癥治療中 的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)通過免疫系統(tǒng)直接作用于相關(guān)的腫瘤或潛在的腫瘤細胞類 型。
允許體外研究新物質(zhì)對體內(nèi)過程的效應(yīng)(例如對腫瘤細胞的破壞)的方 法一方面將避免涉及較多倫理限制的體內(nèi)試驗，另一方面將有可能在短時 間內(nèi)以大量不同的腫瘤細胞檢測大量物質(zhì)。此外，應(yīng)用這種方法將有可能 顯示出某種治療在所謂的"治療監(jiān)測"中誘導(dǎo)的體內(nèi)效應(yīng)的進展。
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的這一現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種允許體外研究物 質(zhì)對人或高等哺乳動物的體內(nèi)過程的效力的方法。
這一 目的通過獨立權(quán)利要求的特征實現(xiàn)。
就本發(fā)明而言-
免疫系統(tǒng)的效意指免疫細胞的混合物，例如PBMC ((來自人或高
應(yīng)細胞 等哺乳動物的)外周血單個核細胞、脾細胞(動物模
型)等)，或通過FACS或MACS分選的亞群(例如B、 T和NK細胞、單核細胞、樹突狀細胞等)。
CpG基序 意指非甲基化胞嘧啶鳥嘌呤基序
dSLIM 意指雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核糖核苷酸，其中每個
環(huán)具有CpG基序(優(yōu)選三個)
ODN 意指寡脫氧核糖核苷酸
PBMC 意指外周血單個核細胞
許多一般性概念應(yīng)按如下理解
在本發(fā)明中，免疫調(diào)節(jié)化合物應(yīng)理解為能夠影響免疫系統(tǒng)或僅單獨其 細胞(尤其是效應(yīng)細胞)的反應(yīng)的物質(zhì)。除化合物外，這還包括DNA構(gòu)建 體、蛋白質(zhì)、抗體、糖分子或其他展示出導(dǎo)致免疫系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)細胞發(fā) 生反應(yīng)的特性的物質(zhì)。在本發(fā)明中，這尤其涉及到稱作效應(yīng)細胞的免疫系 統(tǒng)細胞，其能夠?qū)崿F(xiàn)或介導(dǎo)免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。這種介導(dǎo)通過特異性信使物 質(zhì)的釋放而發(fā)生。
因此，本發(fā)明涉及包括以下步驟的方法
a) 分離細胞；
b) 用待研究的物質(zhì)對所述細胞進行初次溫育；C)回收來自所述初次溫育的上清液或細胞與上清液的混合物；
d) 用所述上清液或細胞與上清液的混合物對耙細胞進行第二次溫育；
以及
e) 分析所述靶細胞。
用于鑒定免疫調(diào)節(jié)化合物和/或檢測免疫調(diào)節(jié)化合物的效應(yīng)以及鑒定在 體內(nèi)過程中通過免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)調(diào)亡和/或誘導(dǎo)壞死的化合物的體外檢測方法
的一種替代實施方式，其包括以下順序的步驟
a) 用待研究其免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的、誘導(dǎo)調(diào)亡和/或誘導(dǎo)壞死的物質(zhì)對免疫 系統(tǒng)的效應(yīng)細胞進行初次溫育；隨后
b) 回收來自所述初次溫育的上清液或細胞與上清液的混合物；隨后
c) 用來自初次溫育的上清液或細胞與上清液的混合物對靶細胞進行第 二次溫育；以及最后
d) 通過適當?shù)臋z測方法分析免疫調(diào)節(jié)和/或誘導(dǎo)調(diào)亡和/或誘導(dǎo)壞死的 效應(yīng)。
該方法中所標明的步驟使得有可能體外研究物質(zhì)在體內(nèi)過程中的效 應(yīng)。結(jié)果，可以在非常接近體內(nèi)狀態(tài)的情況下檢測新型化合物，而不危及 動物和/或臨床研究中的患者。
此外，可以(通過對相關(guān)參數(shù)的分析)對已計劃/實施的治療的影響進 行監(jiān)測。本發(fā)明的方法的這一應(yīng)用在本發(fā)明中也稱作"治療監(jiān)測"。該術(shù) 語只應(yīng)用于體內(nèi)療效的體外監(jiān)測。除可以監(jiān)測治療的成功性外，根據(jù)本發(fā) 明的方法本身與治療沒有聯(lián)系。
在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實施方式中，根據(jù)上述定義，分離的細胞 是免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細胞。本發(fā)明的方法特別適用于研究由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的 物質(zhì)對細胞的效應(yīng)。
在初次溫育中免疫系統(tǒng)細胞與物質(zhì)能夠發(fā)揮它們的效應(yīng)之后，在第二 次溫育中通過溫育來自初次溫育的上清液或細胞與上清液的混合物及靶細 胞顯示物質(zhì)的體內(nèi)效應(yīng)，所述來自初次溫育的上清液或細胞與上清液的混 合物還含有免疫系統(tǒng)細胞的分泌產(chǎn)物。
優(yōu)選的靶細胞是人類細胞或來自高等哺乳動物的細胞。在本發(fā)明的方 法的一個特別優(yōu)選的實施方式中，將分離的細胞(尤其是免疫系統(tǒng)的細胞) 用于初次溫育，并將腫瘤細胞或在遺傳上衍生自腫瘤細胞的細胞系作為第二次溫育的靶細胞。在本發(fā)明的方法的這一實施方式中，將后者稱為"功 能性體外免疫測定"。
原則上，任何類型不同來源的腫瘤細胞都可認為是腫瘤細胞。"功能 性體外免疫測定"的目的是鑒定或研究適于通過免疫系統(tǒng)在腫瘤細胞中啟 動調(diào)亡或壞死的物質(zhì)。
然而，本發(fā)明的方法的另一目的是研究通過腫瘤細胞表面的MHC-I (例如HLA-ABC)和粘著分子(例如ICAM-1)的增強表達而觸發(fā)的免疫系統(tǒng) 對腫瘤細胞的識別。本發(fā)明的方法的絕對優(yōu)勢在于可以在無需在動物和/或 臨床研究的患者中進行試驗的情況下檢測體內(nèi)效應(yīng)，也避免了這樣的試驗 所帶來的所有缺點。
本發(fā)明提供了一種用于本發(fā)明的方法的試劑盒，用于研究由免疫調(diào)節(jié) 物質(zhì)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)所致的表面分子的表達變化。所述試劑盒含有用于與 待研究的物質(zhì)一起進行初次溫育的制備好并儲存的等分細胞(優(yōu)選免疫系 統(tǒng)的效應(yīng)細胞)、進行初次溫育和第二次溫育的手段、以及分析來自第二次 溫育的細胞的表面分子的表達模式的適當手段。為了分析第二次溫育的靶 細胞的表面抗原的表達模式，本發(fā)明的試劑盒含有進行RT-PCR的手段， 為此所述試劑盒含有用于對來自表面分子的mRNA進行擴增的適當引物、 用于擴增的酶和所需的緩沖液；和域FACS分析的手段，為此所述試劑盒 含有以適當熒光標記的針對表面抗原和調(diào)亡/壞死標記的抗體；以及額外地 用于制備耙細胞的手段(例如緩沖液和化學制劑)。
進一步地，根據(jù)本發(fā)明的方法也適用于治療監(jiān)測，其中在治療(例如 免疫療法或改變或影響免疫系統(tǒng)的治療)之前、期間和/或之后將患者的全 血、血細胞、血清或血漿用作初次溫育中的待研究的物質(zhì)。
通過上述本發(fā)明的方法的進一步應(yīng)用，有可能對施用給患者的治療劑 (優(yōu)選對免疫系統(tǒng)有刺激作用的治療劑)是否已經(jīng)產(chǎn)生體內(nèi)效應(yīng)進行檢測。 盡管在該方法中，就血液中所含細胞和/或信使物質(zhì)或其一部分(例如血清 和/或血漿或細胞亞群)對患者血液進行了研究，在該實施方式中本發(fā)明的 方法最終用于間接檢測在治療(優(yōu)選免疫療法)中施用給患者的物質(zhì)的體內(nèi) 效應(yīng)。
如果不知道可在本發(fā)明的方法中用于"治療監(jiān)測"的特異性抗體，則 可能通過施用治療劑之后血液(血漿/血清)中細胞因子水平的變化或在免200680039422.3
說明書第5/13頁
疫系統(tǒng)的反應(yīng)后產(chǎn)生特異性抗體的變化對體內(nèi)效應(yīng)進行監(jiān)測。
將本發(fā)明的方法用作用于每一病例的治療劑的效應(yīng)的治療監(jiān)測的治療
優(yōu)選用于例如癌癥、感染、過敏反應(yīng)和自身免疫疾病等疾病。
由于提及的優(yōu)點，因此優(yōu)選將具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)或能夠誘導(dǎo)調(diào)亡或壞
死的化合物用于本發(fā)明的方法中。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選將含有CpG-基序的寡脫氧核苷酸和dSLIM (雙莖環(huán) 免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核糖核苷酸，參見EP 1,196,178 Bl)用作免疫調(diào)節(jié)化合 物。然而，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，也可以使用其它生物分子，例如天然或遺 傳修飾的抗體、基于DNA和/或基于RNA的物質(zhì)(反義寡脫氧核苷酸、si-RNA等)、氨基酸化合物、信使物質(zhì)或其它免疫調(diào)節(jié)劑(例如鋁鹽、咪唑并 喹啉、脂多糖、皂苷衍生物、磷脂、角鯊烯等)。
根據(jù)本發(fā)明，特別地，所述化合物可考慮作為適于永久性地打斷細胞 維持所必須的過程的誘導(dǎo)調(diào)亡和/或誘導(dǎo)壞死的化合物。在本發(fā)明中，可優(yōu) 選考慮基于DNA和/或基于RNA的物質(zhì)(反義寡脫氧核苷酸、si-RNA等)、 抗體或化療劑。
此外，根據(jù)本發(fā)明的方法可用以鑒定在分離的細胞與免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)或 誘導(dǎo)調(diào)亡和/或誘導(dǎo)壞死的物質(zhì)經(jīng)過初次溫育之后由細胞所釋放的信使物 質(zhì)。為此，在添加至第二次溫育的靶細胞之前，將來自初次溫育的上清液 與特異性地識別潛在的信使物質(zhì)的抗體預(yù)溫育?？贵w與信使物質(zhì)的表位間 的相互作用使得后者不能向靶細胞發(fā)送信號，從而其功能被阻斷。根據(jù)本 發(fā)明的方法的該實施方式對于檢測負責誘導(dǎo)效應(yīng)(例如調(diào)亡)的特定信使物 質(zhì)而言很重要。
優(yōu)選將24孔至96孔的多孔板用于實施本發(fā)明的方法的試劑盒中，用于 對所誘導(dǎo)的信使物質(zhì)的釋放進行鑒定，其中用針對信使物質(zhì)(例如IFN-力 的表位的抗體包被板的每個孔的表面，在溫育來自初次溫育物的上清液的 組分和以該方式預(yù)處理的板并隨后溫育所述組分和靶細胞之后，有可能在 短時間內(nèi)檢測大量潛在的信使物質(zhì)以找出它們是否事實上參與了介導(dǎo)免疫 應(yīng)答或誘導(dǎo)調(diào)亡。
因此，本發(fā)明還涉及用于實施本發(fā)明的方法的試劑盒，用于對信使物 質(zhì)進行鑒定，所述信使物質(zhì)隨著初次溫育中的細胞與待研究的物質(zhì)的溫育 反應(yīng)而釋放。這一類型的試劑盒含有用于與待研究的物質(zhì)一起進行初次溫育的制備好并儲存的等分細胞(優(yōu)選免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細胞)、進行初次溫育
和第二次溫育的手段、以及額外的24孔至96孔的多孔板，其中所述孔的表 面以抗體包被，各個不同的孔的表面以不同的抗體包被，但是優(yōu)選至少兩 孔具有相同抗體。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中所必需的溫育步驟優(yōu)選在含有5%<:02的培養(yǎng)箱 中進行。然而，適于各種情況下的待溫育細胞的要求的其它溫育條件也是 可以想到的。
通過離心回收根據(jù)本發(fā)明進行的初次溫育的上清液或上清液與細胞的 混合物。然而，其它適用于分離來自上清液的細胞的方法也可用于本發(fā) 明，例如以僅允許上清液通過而不允許細胞或存在的任何細胞碎片通過的 孔徑對細胞進行過濾。此外，利用特異性抗體及隨后通過磁性活化細胞分 選(MACS)或熒光活化細胞分選(FACS)構(gòu)建細胞分離系統(tǒng)和/或細胞分選 系統(tǒng)。
為對細胞進行分析，將本發(fā)明的方法設(shè)計成能夠顯示靶細胞中蛋白質(zhì) 表達的變化。在本申請中，尤其可考慮FACS測量法(熒光活化細胞分 選)、蛋白質(zhì)印跡、凝膠過濾或細胞離心涂片器。
此外，構(gòu)建了用于分析某些基因表達的變化的方法，例如RT-PCR、 實時PCR、核糖核酸酶保護測定以及RNA和DNA印跡。
最后，在體內(nèi)效應(yīng)的分析中，還構(gòu)建了調(diào)亡測定法，例如用膜聯(lián)蛋白 V進行細胞染色或TUNEL測定法、或例如通過碘化丙啶染色進行細胞周期 分析。
下述的實施例和試驗結(jié)果證明本發(fā)明的方法的應(yīng)用不僅能利用體外研 究表示物質(zhì)在體外過程中的效應(yīng)，而且還適于對通過將本發(fā)明的方法延展 到競爭分析中所發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)的特異性進行檢測和記錄。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式見從屬權(quán)利要求和說明書。利用下述實施 方式的實例和附圖對本發(fā)明包括本發(fā)明的實用性迸行詳述，但并非將本發(fā) 明限制于這些實施例。
單個核細胞的回收
為實施本發(fā)明的方法，從全血或所謂的"血沉棕黃層(buffy coat)"提 取外周血單個核細胞(PBMC)。血沉棕黃層是在從全血制備紅細胞濃縮物的過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。
利用聚蔗糖梯度通過離心分離PBMC以分離紅細胞、粒細胞和死細 胞。聚蔗糖是一種不帶電的蔗糖聚合物，其密度設(shè)置為當其被全血或血沉 棕黃層覆蓋然后離心時，低密度組分通過聚蔗糖層并聚集在底部，而淋巴 細胞和單核細胞聚集在血漿(上層)和聚蔗糖(下層)之間的界面中。
分離離心后含細胞的界面并用PBS洗滌幾遍。之后，將分離的細胞加 入細胞培養(yǎng)基中，并調(diào)節(jié)至l-4xl(^個細胞/mL的濃度。
雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核糖核苷酸(dSLIM)
雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核糖核苷酸是具有CpG序列的分子。它們經(jīng)核 苷酸環(huán)共價地封閉線性寡脫氧核苷酸(ODN)而獲得，從而使它們免遭核酸 外切酶降解。從而獲得了啞鈴狀分子，稱為dSLIM、"雙莖環(huán)免疫調(diào)節(jié) 劑"。它們的免疫調(diào)節(jié)活性基于結(jié)合Toll樣受體的非甲基化CpG序列對免 疫系統(tǒng)的非特異性激活，以及dSLIM分子的上述全部特殊結(jié)構(gòu)。dSLIM的 每個環(huán)含有3個非甲基化CpG基序。
在B類試驗室中，根據(jù)帶有隨后的質(zhì)量控制的標準操作規(guī)程(SOP)合 成ISS30型雙鏈環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑(dSLIM)(例如dSLIM-30Ll)。為此，用T4 DNA連接酶連接單鏈發(fā)夾形5'-磷酸化寡脫氧核糖核苷酸(ODN)。用T7 DNA聚合酶消化剩余的起始材料并進行層析純化之后，通過乙醇/醋酸鎂 鈉沉淀濃縮所得的dSLIM并溶于PBS中。提取程序見WO 01/07055 。
用dSLIM初次溫育免疫細胞(PBMC)
將分離的細胞(PBMC)接種于多孔盤中。選擇各批次的大小及相應(yīng)的 孔的大小，使得隨后收獲的培養(yǎng)物上清液的體積具有與耙細胞進行第二次 溫育所需的精確體積。
第一批次含有未受激細胞(陰性對照)。用O.l - 10 pM dSLIM-30Ll刺 激第二批次。在另外兩個批次中，用O.l - IOMM寡脫氧核苷酸(ODN)刺激 細胞，以產(chǎn)生最大可能的陽性結(jié)果，從而允許在FACS中對裝置進行校準 和補償。在其它的批次中，用O.l-lOpM的其它ODN刺激細胞用于比較。 于37。C，在C02培養(yǎng)箱中溫育各批次48小時。通過離心回收這些批次的上 清液，并冷凍于-80。C用于進一步操作。與靶細胞(例如HT-29)進行第二次溫育
為了與靶細胞進行第二次溫育，預(yù)先測定接種靶細胞的最佳濃度和體 積。目的是在第二次溫育之后，至少有5xl()S個靶細胞/孔可用于分析。在 本發(fā)明中，必須確保所述細胞有3天的最佳生長條件并按所需的密度并盡 可能稀地進行接種，以使3天后細胞基本匯合。非最佳生長條件同樣導(dǎo)致 壞死或調(diào)亡，這將破壞試驗結(jié)果。在本實施例中，將HT-29結(jié)腸癌細胞用 作靶細胞。
在相應(yīng)大小的批次中，以先前測定的最佳密度(例如在24孔板的每孔 700n沖2.4xl()S個細胞)接種細胞，并于37。C、在C02培養(yǎng)箱中溫育過夜。
次日，通過從貼壁細胞除去培養(yǎng)基并將來自初次溫育的上清液("間 接刺激")或直接標明的物質(zhì)(dSLIM-30Ll、 lin30Ll)("直接刺激")添加 到培養(yǎng)基中進行刺激。作為陰性對照，僅將培養(yǎng)基添加到間接批次中。將 這些細胞稱作未處理細胞，以將它們與未受激細胞(添加來次初次溫育的 未受激上清液)區(qū)分開。
于37。C、在C02培養(yǎng)箱中再次溫育各批次(直接刺激和間接刺激)48小 時。之后，可以在細胞上進行所需的分析。為此，首先從細胞除去上清 液，并用PBS洗滌所述細胞。利用胰蛋白酶/EDTA從孔中除去細胞并進行 進一步的洗滌，隨后將它們轉(zhuǎn)移至離心管中用于隨后測定細胞數(shù)目。
表面抗原的染色
從受激批次離心出細胞并用特定的染色緩沖液洗滌。之后將細胞懸浮 液調(diào)節(jié)至l x 1(^個細胞/mL的濃度。將50(Hd (0.5 x 106個細胞)該細胞懸浮 液在FACS管中離心，置于50pl染色緩沖液中后加入抗體(例如與FITC綴合 的ICAM-1 (CD54)、以及與PE綴合的HLA-ABC)。給每種抗體提供一個相 應(yīng)的同型對照，即用于裝置校準和補償?shù)膯稳旧年栃詷颖?。?jīng)過溫度育 步驟后，用PBS洗滌細胞兩遍，并將細胞重懸于500-1000pl PBS中用于測 量。為區(qū)分死細胞，添加7-AAD并再溫育10分鐘。然后進行FACS測量。
調(diào)亡/壞死細胞的染色
用膜聯(lián)蛋白V-PE給調(diào)亡細胞染色，指示細胞中的調(diào)亡過程。用7-AAD 進行復(fù)染以將這些細胞與壞死細胞區(qū)分開。離心出來自受激批次的細胞并用PBS洗滌兩遍。之后，將細胞稀釋在 特異性膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液中，并調(diào)節(jié)至lxl(^個細胞/mL的細胞濃度。每 100pl (1 x 105個細胞)該細胞懸浮液添加5pl膜聯(lián)蛋白V-PE和7-AAD，充分 混合后，將其于室溫下溫育15分鐘。然后，添加400pl結(jié)合緩沖液并立即 進行FACS測量。
以FACS進行流式細胞計數(shù)測量
A. 調(diào)亡/壞死
測量熒光2 (膜聯(lián)蛋白V-PE)和熒光3 (7-AAD)。利用未受激細胞(直接 批次)和/或未處理細胞(間接批次)進行裝置校準。
在FSC (前向散射光=細胞大小)對SSC (側(cè)向散射光=細胞粒度)的點 陣圖中，調(diào)節(jié)細胞群使其位于中央。然后對熒光2和熒光3進行PMT校準和 補償。之后，對所有樣本進行測量(5000個細胞)。
B. 表面抗原
測量熒光l (ICAM l-FITC)、熒光2 (HLA-ABC-PE)和熒光3 (7-AAD)。 利用經(jīng)lin-30Ll刺激的細胞對裝置進行校準，lin-30Ll設(shè)有用于非特異
性結(jié)合的比較的相應(yīng)同型對照(復(fù)染)和熒光標記抗體(單染)。
在FSC對SSC的點陣圖中，調(diào)節(jié)細胞群使其位于中央。隨后利用所述
同型對照對熒光l、 2和3進行PMT校準，并用單染進行補償。之后，對所
有樣本進行測量(10000個細胞)。排除死細胞(7-AAD陽性細胞)(在點陣圖
中熒光3對FSC)。
結(jié)果說明 A.調(diào)亡/壞死
制作顯示7-AAD與膜聯(lián)蛋白V的比較的點陣圖。然后基于未處理細胞 劃分象限。根據(jù)細胞在各象限中的位置，它們分屬于調(diào)亡或壞死組分。 *活細胞為膜聯(lián)蛋白陰性和7AAD陰性(LL象限) *調(diào)亡細胞為膜聯(lián)蛋白陽性和7AAD陰性(LR象限) *壞死細胞為膜聯(lián)蛋白陽性和7AAD陽性(UR象限)，或膜聯(lián)蛋白陰 性和7AAD陽性(JL象限)B.表面標記
以活細胞制作兩張點陣圖(熒光1對FSC、和熒光2對FSC)。根據(jù)細胞 在各點陣圖中的位置，讀出細胞的熒光強度(熒光1/1。貞-1或熒光2/111^-ABC)。然后與相關(guān)的對照進行比較。
*就以下將檢測批次與對照進行比較
o表面標記陽性的細胞的數(shù)目(=具有相應(yīng)的表面標記的細胞的數(shù)目) o表面標記的熒光強度(=細胞表面的表面標記分子的數(shù)目)
實施本發(fā)明的方法的實例的結(jié)果示于附圖中。


如下
圖h根據(jù)本發(fā)明的方法的示意圖。
圖2:通過檢測HT-29腫瘤細胞的調(diào)亡和壞死對dSLIM免疫調(diào)節(jié)劑的體 外效應(yīng)的分析。
圖3:通過檢測HT-29腫瘤細胞中HLA-ABC表面標記的表達對dSLIM 免疫調(diào)節(jié)劑的體外效應(yīng)的分析。
圖4:通過檢測HEK-293腫瘤細胞的調(diào)亡和壞死對dSLIM免疫調(diào)節(jié)劑的 體外效應(yīng)的分析。
圖5:通過檢測HEK-293腫瘤細胞中HLA-ABC表面標記的表達對 dSLIM免疫調(diào)節(jié)劑的體外效應(yīng)的分析。
圖6:通過利用根據(jù)本發(fā)明的方法檢測HT-29腫瘤細胞的調(diào)亡和壞死對 dSLIM的作用機制的分析。
圖7:通過利用根據(jù)本發(fā)明的方法檢測HT-29腫瘤細胞中HLA-ABC表 面標記的表達對dSLIM的作用機制的分析。
圖8:通過檢測RENCA腫瘤細胞中HLA-ABC表面標記的表達對dSLIM 與線性CpGODN的效力的比較。
圖9:通過檢測RENCA腫瘤細胞的調(diào)亡和壞死對dSLIM與線性CpG ODN的效力的比較。
圖10:通過檢測HT-29腫瘤細胞中HLA-ABC表面標記的表達對dSLIM 與線性CpGODN的效力的比較。
圖ll:通過檢測HT-29腫瘤細胞的調(diào)亡和壞死對dSLIM與線性CpG ODN的效力的比較。圖12:在癌癥患者治療期間對存活的腫瘤細胞的體外監(jiān)測。 圖13:在癌癥患者治療期間對調(diào)亡/壞死的腫瘤細胞的體外監(jiān)測。 圖14:在癌癥患者治療期間對腫瘤細胞的表面標記的體外監(jiān)測。
圖l是根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟的順序的示意圖。左側(cè)的A部分記錄了 典型的體內(nèi)應(yīng)用；右側(cè)的B部分表示"功能性體外免疫測定"的實施方式 中根據(jù)本發(fā)明的相關(guān)方法。
圖2顯示應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法的dSLIM免疫調(diào)節(jié)劑的體外效應(yīng)的分析 結(jié)果。從該圖的右邊部分可見，來自與dSLIM—起溫育的PBMC的上清液 的使用在HT-29腫瘤(結(jié)腸癌)細胞中誘導(dǎo)調(diào)亡和壞死。從圖中可見，用 dSLIM直接處理的細胞相對于用上清液處理的細胞，細胞調(diào)亡從17%增加 至46.7%。
在圖3中，分析了dSLIM免疫調(diào)節(jié)劑在HT-29細胞中的體外效應(yīng)。來自 與dSLIM—起溫育的PBMC的上清液的使用誘導(dǎo)了HLA-ABC表面標記的加 強表達。在該圖中的最右端可見細胞群的遷移。
為支持在應(yīng)用本發(fā)明的方法的HT-29中獲得的試驗結(jié)果，在HEK-293 細胞中進行類似試驗。結(jié)果示于圖4和圖5中。
圖4顯示dSLIM誘導(dǎo)了調(diào)亡(膜聯(lián)蛋白V)和壞死(7-AAD)。因此，與無 ODN的上清液處理的細胞相比較，來自用dSLIM處理的細胞的上清液導(dǎo)致 調(diào)亡細胞目從12.1%增加至21.7%。壞死細胞的數(shù)目從9.2%增加至 16%。
圖5顯示了用來自PBMC的dSLIM上清液溫育靶細胞(HT-29)對HLA-ABC表面標記的加強誘導(dǎo)。該圖的上面部分顯示了用源自未經(jīng)ODN處理的 PBMC的上清液處理的細胞群相對于用來自經(jīng)dSLIM處理的PBMC的上清
液溫育的細胞的遷移(=表達的增加)。
圖6顯示了在應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法的HT-29細胞中對dSLIM的作用機
制的分析結(jié)果，以及對調(diào)亡和壞死的檢測結(jié)果。在PBMC的初次溫育步驟 中，添加能夠抵銷dSLIM的效應(yīng)的抗體(抗-IFN-Y、綠框)。為進行比較， 用抗體(抗-IFN-(i、抗-TNFa)進行試驗對特異性進行證實?？梢匀菀椎乜?br> 到(綠框)抗-IFN-Y抗體使得調(diào)亡細胞和壞死細胞的數(shù)目都減少至最少。
在圖7中，對本發(fā)明的方法的應(yīng)用對應(yīng)于圖6中對本發(fā)明的方法的應(yīng)用，但還對靶細胞(HT-29)上的表面標記ICAM-1 (CD54)的表達進行了分 析。細胞群的遷移顯示于該圖的下面部分用于比較。
圖8和圖9顯示了在RENCA腫瘤細胞中應(yīng)用本發(fā)明的方法的試驗結(jié)果， 其中研究了具有線性O(shè)DN的dSLIM的效應(yīng)用于比較。然而，含CpG的線性 寡脫氧核苷酸也與dSLIM具有不同的序列且通過磷硫酰保護其不被分解。
圖8顯示了用dSLIM處理靶細胞導(dǎo)致表面標記HLA-ABC (上面部分)的 加強表達，而線性CpGODN沒有效果。該圖右側(cè)的表顯示了數(shù)值差異。如 圖9中所示，dSLIM在調(diào)亡和壞死的誘導(dǎo)上顯然比線性CpG ODN更有效。 在誘導(dǎo)調(diào)亡上的差異以百分比的形式顯示在該圖的下面部分。
圖10和圖ll對在作為耙細胞的HT-29細胞中應(yīng)用本發(fā)明的方法的 dSLIM和線性CpG ODN進行了比較。這些試驗的結(jié)果對應(yīng)于以RENCA腫 瘤細胞獲得的并示于圖8和圖9中的結(jié)果。圖10和圖11的布置也對應(yīng)于圖8 和圖9。
圖12、圖13和圖14顯示了將本發(fā)明的方法應(yīng)用于體外監(jiān)測存活腫瘤細 胞(圖12)和調(diào)亡/壞死細胞(圖13)的數(shù)目，以及在癌癥患者的治療過程中 ICAM-1/HLA-ABC表面標記的表達的變化(圖14)。在治療第一周的頭五天的每一天，將2.5mg dSLIM施用給患有直腸癌 和肝臟轉(zhuǎn)移的患者。在第一周的第六天進行放療，然后進行化療。
在第一周的頭六天的每一天從患者采取血液樣本用于對體內(nèi)效應(yīng)進行 體外分析。化療的過程中，仍然采取血液樣本直至每一周的結(jié)束。
自血液樣本分離血漿，并與腫瘤細胞系HT-29的細胞進行溫育。之 后，測定活細胞(圖12)和調(diào)亡/壞死細胞的數(shù)目，并研究表面標記ICAM-1/HLA-ABC的表達。
圖12顯示了HT-29細胞與來自8個血液樣本的血漿溫育的結(jié)果。在施用 dSLIM的第二天可以清楚地觀察到存活HT-29細胞的數(shù)目的明顯減少。與 對照組中的活細胞數(shù)目相比較，其活細胞數(shù)目在第二天下降至少于第一天 的細胞數(shù)的一半。
圖13顯示在治療癌癥患者的第1、 2、 5和20天，對調(diào)亡/壞死的腫瘤細 胞的體外監(jiān)測。在體內(nèi)效應(yīng)的這一監(jiān)測中，可以看到施用dSLIM后一天， 調(diào)亡/壞死的細胞的數(shù)目已經(jīng)明顯地增加。
圖14顯示了在癌癥患者的治療過程中，利用來自樣本l、 2、 3和8的血液的血漿對表面標記ICAM-1/HLA-ABC的表達的變化進行研究的結(jié)果。其 中，將樣本l用作表示兩種表面標記的表達的變化的參考值。
在治療的第二天，ICAM-1已經(jīng)更強地表達，這可在圖中下面部分通 過熒光強度位置的遷移看出，這表明ICAM-1被更強地表達。
對于HLA-ABC，在第二天仍未發(fā)生熒光強度的遷移。直至治療的第 三天才發(fā)生熒光強度的遷移，這同樣也表明HLA-ABC被更強地表達。
附圖標記列表
A-體內(nèi)狀態(tài)
B-體外免疫測定
1=患者
2 =耙組織，例如腫瘤 3=免疫細胞
4 =檢測物質(zhì)，例如dSLIM 5=活化免疫細胞
6 =供體
7 =免疫細胞，例如PBMC
8 =檢測物質(zhì)，例如dSUM
9 =活化免疫細胞，例如PBMC
10 =上清液
11=靶細胞，例如腫瘤細胞 12 =分析
權(quán)利要求
1.用于體外研究物質(zhì)在體內(nèi)過程中的效應(yīng)的方法，該方法包括以下順序的步驟a)分離細胞；b)用待研究的物質(zhì)對所述細胞進行初次溫育；c)回收來自所述初次溫育的上清液或細胞與上清液的混合物；d)用所述上清液或細胞與上清液的混合物對靶細胞進行第二次溫育；以及e)分析所述靶細胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中用于初次溫育的分離的細胞是免疫系 統(tǒng)的效應(yīng)細胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中第二次溫育的靶細胞是人類細胞或來自高等哺乳動物的細胞。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中利用患者的血液、血清 或血漿進行步驟l.d)和l.e)。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中所述待研究的物質(zhì)是免 疫調(diào)節(jié)化合物以及誘導(dǎo)調(diào)亡或誘導(dǎo)壞死的化合物。
6. 適于鑒定免疫調(diào)節(jié)化合物和/或檢測免疫調(diào)節(jié)化合物的效應(yīng)及鑒定在 體內(nèi)過程中通過免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)調(diào)亡和/或誘導(dǎo)壞死的化合物的體外檢測方 法，該方法包括以下順序的步驟a) 用待研究其免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的物質(zhì)或誘導(dǎo)調(diào)亡或壞死的物質(zhì)對免疫系 統(tǒng)的效應(yīng)細胞進行初次溫育；隨后b) 回收來自所述初次溫育的上清液或細胞與上清液的混合物；隨后c) 用來自初次溫育的上清液或細胞與上清液的混合物對耙細胞進行第 二次溫育；以及最后d) 通過適當?shù)臋z測方法分析免疫調(diào)節(jié)和/或誘導(dǎo)調(diào)亡和/或誘導(dǎo)壞死的 效應(yīng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中用于初次溫育的細胞是預(yù)先在步驟l.a) 中分離的細胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，其中用于初次溫育的免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細胞優(yōu)選是來自血液的外周血單個核細胞、脾細胞、或利用FACS或MACS分 選的細胞混合物的亞群例如B、 T和NK細胞、單核細胞或樹突狀細胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8中至少一項的方法，其中用于初次溫育的細胞和第 二次溫育的靶細胞是人類細胞或來自高等哺乳動物的細胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6-9中至少一項的方法，其中利用患者的血液、血清 或血漿進行步驟6.c)和6.cl)。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中第二次溫育的靶細胞 是腫瘤細胞或在遺傳上衍生自腫瘤的細胞系。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中其效應(yīng)被研究的免疫 調(diào)節(jié)化合物是含有CpG的寡脫氧核苷酸或在單鏈區(qū)域具有至少l個CpG基序 的部分雙鏈DNA構(gòu)建體。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中其效應(yīng)被研究的誘導(dǎo) 調(diào)亡和/或誘導(dǎo)壞死的化合物優(yōu)選是反義寡脫氧核苷酸、siRNA、抗體或化 療劑。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中在治療之前、期間和/ 或之后將全血、血細胞、血細胞亞群、血清或血漿用作初次溫育中的待研 究的物質(zhì)。
15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中在培養(yǎng)箱中進行溫育。
16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中通過離心回收上清液。
17. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中研究特異性蛋白質(zhì)的 表達用于對靶細胞進行分析。
18. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中研究所定義基因的表 達用于對靶細胞進行分析。
19. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中對靶細胞染色用于分 析，尤其是用膜聯(lián)蛋白V或碘化丙啶染色劑進行染色。
20. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中實施調(diào)亡和/或壞死檢 測方法用于對耙細胞進行分析。
21. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中進行細胞周期分析。
22. 根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其中將抗體或其它競爭性物質(zhì)添加至具有待研究物質(zhì)的初次溫育物中。
23，用于實施適于鑒定免疫調(diào)節(jié)化合物和/或檢測免疫調(diào)節(jié)化合物的效 應(yīng)及鑒定在體內(nèi)過程中通過免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)調(diào)亡和/或誘導(dǎo)壞死的化合物的體外檢測方法的試劑盒，所述試劑盒包含*制備好并儲存的等分免疫系統(tǒng)效應(yīng)細胞；和*進行初次溫育和第二次溫育的手段(Mittel);禾口參24孔至96孔的多孔板，其用于檢測隨著初次溫育中的細胞與待研究的化合物的溫育反應(yīng)而釋放的信使物質(zhì)，其中所述孔的表面以抗體包被；和/或 用于研究由待研究的化合物誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)所致的表面分子表達 的變化的，進行RT-PCR的手段，為此所述試劑盒含有用于擴增表 面分子的mRNA的適當引物、用于擴增的酶和所需的緩沖液；和/ 或FACS分析的手段，為此所述試劑盒含有以適當熒光標記的針對 表面抗原的抗體；以及額外地，用于制備靶細胞的手段，例如緩 沖液和化學制劑。
24，用于在施用之前、期間和/或之后在體外證實免疫調(diào)節(jié)化合物的效 應(yīng)及鑒定在體內(nèi)過程中通過免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)調(diào)亡和/或誘導(dǎo)壞死的化合物的試 劑盒，所述試劑盒至少包含以下組分*用于與患者的血液、血清或血漿一起進行溫育的制備好并儲存的 等分耙細胞；和*進行第二次溫育的手段；和* 24孔至96孔的多孔板，其用于檢測隨著初次溫育中的細胞與待研 究的化合物的溫育反應(yīng)而釋放的信使物質(zhì)，其中所述孔的表面以 抗體包被；和/或*用于研究由待研究的化合物誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)所致的表面分子表達 的變化，進行RT-PCR的手段，為此所述試劑盒含有用于擴增表面 分子的mRNA的適當引物、用于擴增的酶和所需的緩沖液；和/或 FACS分析的手段，為此所述試劑盒含有以適當熒光標記的針對表 面抗原的抗體；以及額外地，用于制備靶細胞的手段，例如緩沖 液和化學制劑。*根據(jù)權(quán)利要求24的試劑盒，其中所含靶細胞是腫瘤細胞或在遺傳上衍生自腫瘤的細胞系。根據(jù)權(quán)利要求24的試劑盒，其中所含靶細胞是腫瘤細胞或在遺傳 上衍生自腫瘤的細胞系。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于體外研究物質(zhì)在體內(nèi)過程中的效應(yīng)的方法，以及用于鑒定免疫調(diào)節(jié)化合物和/或檢測免疫調(diào)節(jié)化合物的效應(yīng)及鑒定在體內(nèi)過程中通過免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)調(diào)亡和/或誘導(dǎo)壞死的化合物的體外檢測方法。本發(fā)明的方法尤其適于研究物質(zhì)對細胞的效應(yīng)，該效應(yīng)通過免疫系統(tǒng)介導(dǎo)。此外，本發(fā)明的方法適于在施用免疫調(diào)節(jié)化合物以及誘導(dǎo)調(diào)亡和/或誘導(dǎo)壞死的化合物之前、期間和/或之后對體內(nèi)效應(yīng)進行體外監(jiān)測。
文檔編號G01N33/50GK101292159SQ200680039422
公開日2008年10月22日 申請日期2006年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月8日
發(fā)明者A·桑德爾, B·維蒂希, M·施密特, Y·陳 申請人:莫洛根股份公司